리뷰 논문

아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터의 분석 특성 분석의 표준화

DOI:

10.3791/71152

⸱

2026년 7월 10일

 ,  , 
1Trellis Research Group, Department of Cellular and Molecular Medicine, Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, KU Leuven, 2Virus-Host Interactions & Therapeutic Approaches Research Group, Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, KU Leuven

이 논문에서

요약

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아데노 관련 바이러스(AAV) 유전자 치료는 실험실 내외에서 정확하고 재현 가능한 분석 측정을 보장하기 위해 잘 특성화된 참조 표준 재료(RSM)가 필요합니다. 본 리뷰는 RSM의 중요성을 검토하고, 이용 가능한 상업적 및 약경 표준을 평가하며, 안전하고 효과적인 AAV 치료제를 발전시키기 위한 사내 RSM 개발을 위한 실질적인 전략을 제시합니다.

초록

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아데노 관련 바이러스(AAV)는 현재 8개의 제품이 시판 승인을 받은 생체 내 유전자 치료의 선도적 매개체가 되었습니다. 이 분야가 빠르게 발전함에 따라, 캡시드 역가, 유전체 역가, 캡시드 함량(빈/완전 비율), 동일성, 순도 등 핵심 품질 속성(CQA)을 특성화하기 위한 견고한 분석 방법의 필요성이 계속 증가하고 있습니다. 참조 표준 재료(RSM)는 보편적 벤치마크 역할을 하는 잘 특성화되고 표준화된 AAV 배치를 제공함으로써 중요한 역할을 합니다. RSM은 신흥 분석 기술의 검증을 촉진하고, 일상적인 분석의 정확성과 재현성을 보장하며, 실험실 간 비교를 가능하게 합니다. 그러나 범용 AAV RSM 개발은 복잡한 생물학, 혈청형의 다양성, 벡터 유전체, 그리고 설계된 캡시드 변이체에 의해 근본적으로 제약을 받으며, 이는 혈청형 특이적 및 응용 특화 표준이 필요합니다. 최근 발전, 즉 여러 직교 방법을 특징지어지는 약경적 AAV8 기준 발표는 측정 조화를 향한 의미 있는 진전을 나타냅니다. 본 리뷰는 AAV 유전자 치료에서 RSMs의 중요한 필요성을 다루고, 현재 이용 가능한 약전 및 상업 표준을 평가하며, 사내 RSM 개발을 위한 실용적 전략을 제시합니다. 견고하고 혈청형별 AAV RSM과 조화로운 표준 운영 프로토콜(SOP)을 수립하는 것은 AAV 유전자 치료의 발전과 연구, 개발, 임상 제조 전반에 걸쳐 정확성, 재현성, 안전성을 보장하는 데 필수적입니다.

서론

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유전자 치료는 유전 및 후천성 질환 치료에 변혁적 전략을 제공하며, 유전자 발현을 교정하거나 조절하기 위해 환자 세포에 전달합니다. 이 중 아데노 관련 바이러스(AAVs)는 서로 다른 혈청형에서 다양한 조직 트로피스를 보이고 에피소말 형질전환유전자 발현이 지속되기 때문에 생체 내 적용에서 두드러집니다.

AAV는 파르보바이러스과(Parvoviridae)의 Dependoparvovirus 속에 속하는 콤팩트(~25nm) DNA 바이러스입니다. 이 바이러스들은 비병원성 및 복제 결함이 있어 복제를 위해 아데노바이러스나 단순포진 바이러스와 같은 보조 바이러스가필요합니다. AAV 게놈은 rep과 cap 두 유전자를 가지고 있으며, 그 양옆에는 역말단 반복(ITR)로 알려진 두 개의 145염기쌍 회문 반복 반복이 있습니다. 재조합 AAV(rAAV) 벡터는 프로모터, 형질전환유전자, 조절 요소가 포함된 치료용 카세트로 바이러스 코딩 서열을 대체하여 ITR로 둘러싸여 생성됩니다. 생산 과정에서 rep과 cap 유전자는 trans로 전달되어, 치료용 카세트가 바이러스 캡시드로 복제되고 포장되어, 야생형 바이러스 복제를 방지하면서도 강력한 전도 능력을 유지하는 비통합 복제 결핍 입자를생성합니다. 8개의 rAAV 기반 유전자 치료제가 유럽의약품청(EMA) 또는 미국 식품의약국(FDA)으로부터 시판 승인을 받았으며, AAV를 이용한 임상시험도 증가하고 있습니다. 2025년 1월 기준으로 전 세계적으로 343건의 AAV 임상시험이 등록되었으며, 이는 2022년 중반 255건에서 34% 증가한 수치입니다. 이러한 급속한 임상 확장은 환자 안전을 보장하기 위한 강력한 품질 관리의 필요성을 더욱 강화합니다.

rAAV 제품이 인간 사용에 안전하고 효과적인지 확인하려면 양, 효능, 순도, 정체성, 안전성, 안정성 등 중요한 품질 속성(CQA)에 대한 철저한 특성화가 필요합니다. 그러나 AAV의 특성 분석은 이러한 벡터의 구조적 복잡성 때문에 여전히 본질적으로 어렵습니다. AAV는 세 가지 바이러스 캡시드 단백질(VP1, VP2, VP3)으로 구성된 이십면체 입자로, 대략 1:1:10 비율로 조립되며, 단백질 조립의 변화는 전도 효율에 영향을 줄 수 있습니다. 치료용 DNA 탑재체는 고충실도로 캡시드에 포장되어야 하며; 이질적인 캡시드 집단은 rAAV 생성 과정에서 본질적으로 생성되며, 완전한 유전체를 가진 캡시드(완전 캡시드), 부분 게놈(부분적으로 채워진 캡시드), 또는 유전 물질이 없는 캡시드(빈 캡시드)로 구성됩니다. 여기에 더해, 서로 다른 AAV 혈청형은 뚜렷한 포장 효율, 조직 트로피즘, 면역학적 프로필을 나타내므로, 혈청형에 맞춘 분석법 개발이 필요합니다. 이러한 생물학적 도전 과제 외에도, 측정 수행 방식에는 중대한 문제가 존재합니다. 서로 다른 실험실은 동일한 CQA를 측정하기 위해 서로 다른 분석법, 프로토콜 및 데이터 분석 방식을 사용합니다. 따라서 동일한 샘플에 대한 보고된 값은 사이트8 간에 수십 배 차이가 있을 수 있습니다. 단일 실험실 내에서도 시약, 기기, 운영자 또는 분석 환경의 시간이 지남에 따라 변화하면 동일한 배치9에서 결과가 달라질 수 있습니다. 측정값이 비교 불가능할 때, CQA와 전임상 또는 임상 결과 간의 신뢰할 수 있는 연관성을 확립하는 것이 어려워져 규제 의사결정이 복잡해집니다 10,11.

표준화는 측정 비교 가능성을 보장함으로써 이 문제를 해결하는 것을 목표로 합니다. 제약 분석에서 표준화는 두 가지 핵심 측면을 포함합니다: 공통 물리적 기준 표준 물질(RSM) 사용과 조화롭게 상세한 표준 운영 절차(SOP) 준수로, 서로 다른 실험실이 일관되게 역가, 식별, 품질, 효능 및 순도를 측정하도록 보장하는 것입니다. RSM은 벤치마크 역할을 하는 잘 특성화된 샘플입니다. 동일한 RSM에 대해 분석법을 검증함으로써 실험실은 측정을 공통 기준점에 고정합니다. 이로 인해 실험실 간 변동성이 줄어들고, 다양한 연구, 제품, 제조 현장의 결과를 신뢰성있게 비교할 수 있습니다. 더 나아가, 이 시스템은 자체 제어 기능으로도 작용하여 분석의 성능을 모니터링하고 시간에 따른 일관성을 모니터링합니다. SOP는 또한 분석 방법이 실험실 전반에 걸쳐 일관되게 실행되도록 보장하여, 샘플 전처리, 계측, 교정 전략, 데이터 처리 및 운영자 실무의 차이로 인한 변동성을 최소화합니다 8,9,12. 이 두 구성 요소가 함께 견고한 분석 표준화 프레임워크의 토대를 이룹니다.

이 검토는 AAV 분석에서 표준화의 핵심 측면을 체계적으로 다룹니다. RSM의 유형과 분석 응용을 검토하고, 현재 사용 가능한 AAV 특화 RSM의 적합성을 평가하며, 사내 RSM 생산, 정제, 특성화 및 저장에 대한 통합 실무 지침을 제공합니다. 또한 현재의 제조 문제와 분석 한계를 파악합니다. RSM만으로는 충분하지 않음을 인식하여, 우리는 보완적이고 동등하게 중요한 표준화 구성 요소로서 조화된 SOP도 논의합니다. 이 리뷰는 AAV 유전자 치료에서 측정 조화를 진전시키고 과학적 기반 규제 의사결정을 지원하고자 하는 분석 과학자, 품질 전문가, 제조업체를 위한 실질적인 참고서로 목적을 가지고 있습니다.

리뷰 및 관점

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1. RSM: 정의와 필요

RSM은 계층적으로 조직되며, 주요 RSM과 보조 RSM의 두 가지 유형으로 구성됩니다. ISO 가이드 30에 따르면, 1차 표준은 "동일한 양의 다른 표준과 비교하지 않고 특정 맥락 내에서 가장 높은 계량적 특성을 가진 것으로 지정되거나 널리 인정받는 표준"으로 정의됩니다. 예를 들어, 미국 약전(USP), 유럽 약전(Ph. Eur.), 영국 약전(BP) 등에서 다실험실 연구를 통해 광범위하게 특성화된 RSM이 1차 RSM으로 자격을 갖추게 됩니다. 개별 제조업체들은 이후 이 1차 RSM을 사용하여 자체 독점 작업 기준 물질을 교정하고 인증하며, 이는 일상적인 품질 관리 테스트의 보조 RSM으로 사용됩니다12,15. 따라서 ISO는 보조 RSM을 "동일한 수량의 기본 표준과 비교하여 가치가 부여되는 표준"으로 정의합니다. 이러한 계층적 접근법은 추적성을 보장합니다: 내부 측정은 1차 기준으로 추적되며, 이는 최신 분석 방법으로 특성화됩니다16. RSM을 사용하면 제조업체가 동일한 기준점에 맞춰 분석 방법을 교정하고 검증할 수 있는 공통 벤치마크를 제공하여 더 정확한 측정을 가능하게 합니다. 따라서 규제 당국은 자체 RSM을 보정하고 시험 방법을 검증하기 위해 1차 RSM의 사용을 권장하여 AAV 제조 전반의 일관성을 개선합니다17,18. 이로 인해 다양한 분석 기법 간 표준화가 가능해져 실험실 간 rAAV 특성화 결과를 더 잘 비교할 수 있습니다17,19. 향상된 비교 가능성은 고용량 또는 빈 캡시드 및 부분 채워진 캡시드와 같은 제품 관련 불순물과 관련된 안전 위험에 대한 이해를 높입니다. 궁극적으로 이러한 통찰은 체세포 치료제의 ≥70% 생존 세포 기준과 유사하게 완전 캡시드의 최소 기준과 같은 과학 기반 규제 정책 수립에 기여할 수 있으며, 이는 더 안전하고 신뢰할 수 있는 유전자 치료 제품 13,20,21

rAAV의 경우, 여러 CQA는 표준화의 필요성을 명확히 보여줍니다. 벡터 게놈 역가는 환자 용량을 직접 결정하며; 부정확한 역가는 과다 또는 과다 투여의 위험이 있습니다. 정량적 PCR(qPCR)과 디지털 PCR(dPCR)은 역가 측정에 널리 사용되지만, 동일한 샘플에서 서로 다른 표준 곡선 캘리브랜트나 프로토콜을 사용할 경우 결과가 다를 수 있습니다. 캡시드 함량(가득 찬 캡시드, 부분적으로 채워진 캡시드, 빈 캡시드의 비율)도 매우 중요한 CQA로, 빈 캡시드와 부분적으로 채워진 캡시드는 면역원성에 기여하거나 효능을 저하시킬 수있습니다. 캡시드 함량 측정에는 분석 초원심분리(AUC), 다각도 광산란과 결합된 크기배제 크로마토그래피(SEC-MALS), 질량 광도법(MP), 전하 검출 질량분석법(CDMS), 전자현미경(EM), 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피, 모세관 등유 집합법(cIEF), 자외선-가시광선 분광법(UV/Vis) 등이 포함됩니다. 또한, 캡시드 함량은 벡터 게놈 역가와 바이러스 입자 역가의 비율을 이용해 간접적으로 추정되는 경우가 많으며, 이는 qPCR 또는 dPCR 및 ELISA로 각각 결정됩니다(PCR/ELISA)22. 각 기법은 서로 다른 물리적 특성을 측정하며, 동일한 샘플에 대해 서로 다른 캡시드 함량 값을 보고할 수 있습니다. 최근 NIST에서 UV/Vis, AUC, SEC-MALS, PCR/ELISA를 비교한 실험실 간 연구에서는 방법 간 및 실험실 간 변이가 크게 나타나며, 특히 PCR/ELISA는 재현성이 매우 낮았고 AUC는 참조 방법으로 널리 인정받고 있음에도 불구하고 실험실 간 상당한 차이를 보였습니다8. 이 결과는 AAV 분석의 변동성을 줄이기 위해서는 공유 RSM과 조화로운 분석 워크플로우가 필요함을 시사하며, 이는 5절에서 논의됩니다.

2. rAAV RSM 지형

AAV용 RSM 설립 노력 결과 두 곳의 주요 AAV RSM이 제공되었습니다. 약전 출처 중 USP는 현재 1차 AAV RSM의 유일한 제공자입니다. USP 외에도 주요 AAV RSM은 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구할 수 있습니다. AAV 특성화에 내재된 표준화 부족을 해결하기 위한 지속적인 노력을 반영하여 다중 혈청형에 대한 상업용 2차 RSM도 점점 더 다양하게 공급되고 있습니다. 표 1은 현재 이용 가능한 AAV RSM 자료와 주요 특성을 요약합니다.

  1. ATCC 표준
    rAAV용 RSM을 구축하려는 최초의 국제적 노력은 2010년에 시작되었으며, AAV 참조 표준 작업 그룹(AAVRSWG)이 rAAV2용 1차 RSM을 제작했고, 2014년에는 rAAV8을 제작했습니다. 이 자원봉사 단체는 미국, 프랑스, 독일, 일본 4개국을 대표하는 5개 산업 단체, 13개 대학, 식품의약국(FDA), 국립보건원(NIH), 윌리엄스버그 생물공정재단(WilBio) 회원으로 구성되어 있습니다. 주요 RSM은 비임상 및 임상 연구 간 투여량 비교를 용이하게 하기 위한 지역사회 전체 표준 역할을 하도록 설계되었습니다. 연구자들은 보건 당국에 데이터를 출판하거나 제출할 때 이 주요 RSM과 관련된 역가를 보고할 것을 권장합니다. 최종 1010 12 벡터 유전체(vg·mL-1)×의 최종 역가를 달성하고, 각19 19 mL 중 약 5,000–10,000 바이알을 생산하는 것이 목표였습니다. 이 재료들은 전 세계 16개 실험실이 참여한 다중 실험실 연구를 통해 벡터 게놈 역가(qPCR), 입자 역가(ELISA), 형광 현미경 전도(transducing tinter), 감염성 입자 역가(TCID50), 순도(도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-PAGE)), 벡터 동일성(겔 전기영동)에 대해 특성화되었습니다. 추가로 마이코플라즈마, 바이오하중, 무균, 내독소가 평가되어 제품 안전성을 보장하였다23, 24, 25. 주요 분석법과 각 분석법이 제공하는 정보를 포함한 AAV 분석 특성화에 대한 심층 개요는 4절에서 제시되어 있습니다.
    ATCC RSM은 AAV 분야에서 선구적인 재료였지만, 현재 AAV 특성화 분석 접근법이 널리 채택되기 전 10년 이상 전에 생산되었기 때문에 그 유용성은 제한적입니다. 예를 들어, 원래 특성 분석에는 빈/완전 캡시드 프로파일링이 포함되어 있지 않아, 현재 rAAV의 중요한 CQA로 여겨지는 캡시드 성분 분석 표준화에 직접적인 적용이 제한됩니다. 또한, 공유 프로토콜과 시약을 사용했음에도 불구하고 벡터 게놈 역가, 캡시드 역가, 감염성 역가에 대해 상당한 실험실 간 변이가 보고되었으며, 이는 공통 재료만으로는 조화로운 측정을 보장하지 못하며, 상세한 SOP가 포함된 더 성숙한 분석법이 똑같이 중요함을 강조합니다. 현재 공급업체 정보에 따르면, 이 자재들의 가용성도 제한되어 있어 더 넓은 구현에 제약이 있을 수 있습니다11. 현재 공급업체 제품 정보에 따르면, AAV2(ATCC VR-1616)는 고객당 연간 3바이알로 공급이 제한되며, 공급은 보급 대기 상태로 표기되어 있습니다. AAV8(ATCC VR-1816)은 12바이알이 제공됩니다. 이러한 제한은 필연적으로 이 자료들을 지역사회 전반에 걸쳐 일상적으로 사용하는 것을 제한합니다26,27.
  2. USP 표준
    약전 이니셔티브 측면에서 USP는 현재 AAV용 1차 RSM을 생산한 유일한 기관입니다. 다음 특성화 데이터는 USP 적용 노트28, 29, 30을 기반으로 합니다. 2025년, USP는 캡시드 내용 분석을 표준화하기 위해 완전 및 빈 캡시드에 대한 AAV8 RSM을 발표했습니다. 이를 위해 USP는 고농도(> 3.0E+12 바이러스 입자 역가/밀리리터(vp·mL-1))와 상당한 부피(300 μL)를 가진 RSM을 구축하여 다양한 캡시드 내용물 분석 접근법에 적용할 수 있게 했습니다. USP AAV RSM을 완전히 평가하고 측정 정확도와 정확성을 보장하기 위해 종합적인 다실험실 협력 연구가 수행되었습니다. 이 연구는 다섯 개의 독립 실험실이 참여했으며, AUC, SEC-MALS, CD-MS, MP, UV/가시드 등 여러 캡시드 성분 분석 기법을 사용했습니다. AAV 샘플에는 펩타이드 매핑, 차세대 시퀀싱(NGS), DPCR, 모세관 겔 전기영동(CGE) 등 추가적인 생물물리학적 특성 분석 방법이 적용되어 입자 특성화 데이터가 추가로 제공되었습니다28.
    더 나아가, USP는 AAV5 기반 정량적 PCR 대조제를 개발했으며, 여기에는 대세포바이러스(CMV) 강화제, 닭 β액틴(CBA) 촉진제, 녹색 형광 단백질(GFP), 유전체 역가 측정에 표준 곡선 측정 또는 분석 대조제로 사용될 예정이었습니다. 캡시드 함량은 SEC-MALS로 결정되었고, 바이러스 게놈 역가는 여러 서열을 표적으로 하는 dPCR로 정량되었습니다. 4개 실험실을 포함한 다실험실 dPCR 연구에서 SV40 표적이 ITR 표적화(CV 36.1%)에 비해 실험실 간 변이성이 낮은 것으로 나타났으며, 이는 ITR 2차 구조 간헐 때문인 것으로 보입니다. 따라서 할당된 기준값은 SV40 표적 역가를 기준으로 하며, 7 x 1010 vg·mL-1,32와 같습니다. 캡시드 역가 분석의 참조 물질과 관련하여, USP는 AAV1, AAV5, AAV8, AAV9에 대한 캡시드 역가 참조 물질을 제공합니다. SEC-MALS로 절대 캡시드 입자 정량화를 위해 특성화되는 이 물질들은 1x1011 에서 1x1012 vg·mL-1까지 다양하며, 캡시드 역가 분석법 30에서 표준 곡선 교정 또는 양성 대조군으로 활용될 수 있습니다.
  3. 상업용 표준
    여러 상업 회사에서는 PROGEN, AAVnergene, Revvity와 같은 여러 혈청형에 대한 AAV 완전 및 빈 RSM을 제공합니다. 다음 특성화 데이터와 제품 사양은 공급업체가 제공한 정보, 제품 시트 및 적용 노트31, 32, 33, 34, 35를 기반으로 합니다. 보조 RSM으로서 이 재료들은 종종 ATCC RSM과 벤치마킹됩니다. 약경 RSM과 비교할 때, 이 RSM들은 더 넓은 혈청형을 포함하며, 일부 공급업체는 AAV1–13 및 엔지니어링 변형을 공급합니다. 상업용 RSM은 일반적으로 캡시드 역가(ELISA 또는 SEC-MALS), 벡터 게놈 역가(qPCR 또는 dPCR), 캡시드 함량(종종 단일 분석 방법으로) 같은 기본 품질 속성에 따라 특성화됩니다.
    그러나 일부 상업용 재료는 소량으로만 제공되어 다양한 분석법이나 다중 부지 연구의 광범위한 방법 개발에 제한적입니다. 더욱이, 안정성 평가를 포함한 여러 직교 기법을 포함한 다중 실험실 협력 연구를 통한 광범위한 특성 분석이 부족하여 할당값에 대한 신뢰도와 실험실 간 적용성이 제한됩니다. 이러한 한계에도 불구하고, 상업용 RSM은 분석 개발, 검증 및 공정 최적화에서 중요한 역할을 하며, 특정 혈청형에 대해 1차 RSM이 없을 때 임시 RSM 역할을 할 수 있습니다.
    일부 공급업체는 RSM 제품의 유용성을 높이기 위해 보다 엄격한 특성화 프로토콜과 투명성 향상을 위해 노력하고 있습니다36,37.
  4. 자체 표준
    개별 실험실은 자체 RSM을 개발할 수도 있는데, 이는 캡시드 엔지니어링 혈청형이나 특정 바이러스 게놈 구조체와 같은 독특한 AAV 제품에 자주 사용되는 전략입니다. 1차 및 상업용 2차 참조 자료가 비용이 많이 들 수 있기 때문에, 자체 RSM은 비용 절감을 위해 선호될 수 있습니다. 가능할 경우, 이러한 사내 RSM은 1차 RSM과 비교하여 이후 분석법 개발, 검증, 제조 중 일상 시험 또는 품질 관리를 위해 사용되어야 합니다. 사내 RSM을 사용할 때 몇 가지 중요한 고려사항이 있습니다: 이 물질들은 철저히 특성화되어야 하며, 충분한 양을 비축해야 하며, 시간에 따른 안정성을 모니터링할 프로토콜을 수립해야 합니다. 더불어, 새로운 RSM 배치 생산 계획을 세우는 것이 매우 중요하며, 이전 배치에서 충분한 재료를 보유하여 측정을 연결하고제품 개발 전반에 걸쳐 연속성을 보장하는 것이 포함됩니다. 3절에서는 상류 및 하류 공정과 분석적 특성화를 포함한 사내 RSM 생산 전략에 대한 상세한 개요가 제공됩니다. 이 두 접근법은 함께 사내 RSM을 생성하는 실용적인 틀을 제공합니다.

3. RSM 제조 전략:

고순도 AAV RSM을 생산하는 데는 본질적인 도전 과제가 있습니다. 100% 빈 캡시드 준비를 달성하는 것은 '빈' 캡시드에 잔류 유전 물질이 포함될 수 있다는 사실 때문에 복잡합니다. 마찬가지로, 순수 완전 캡시드 준비물을 얻는 것은 어렵습니다. 비어 있고 부분적으로 채워진 캡시드는분리 과정에서 완전한 캡시드와 유사한 물리적 특성을 공유하고 공동 정제되기 때문입니다. 이러한 도전에도 불구하고, 생산 기술의 상당한 발전으로 이제 주로 가득 찬 또는 빈 캡시드 개체군의 농축이 가능해졌습니다. 다음 절에서는 현재의 생산 및 분리 기술, AAV RSM의 생산, 특성화 및 저장에 적용될 수 있는 특성화 방법 및 제형 조건에 대한 포괄적인 개요를 제공합니다.

  1. 상류 처리
    rAAV는 다른 생물치료제들과 마찬가지로 살아있는 세포에서 생성되어야 하며, 대부분은 일시적 형질전환이나 바이러스 감염 기반 플랫폼을 사용합니다. 임상용 물질의 주요 접근법은 HEK293 현탁 세포에서 세 개의 별도 플라스미드를 사용하여 ITR 측면 형질유전자, rep/cap 유전자, 보조 기능을 수행하는 삼중 플라스미드 일시적 전환입니다; 이 유연하고 보조 바이러스가 없는 시스템은 빠른 혈청형과 형질전환 교환을 지원하며 대부분의 임상 프로그램과 승인된 제품에 사용됩니다38. 하지만 생산이 확대될수록 플라스미드 DNA 비용이 크게 증가하여 상당한 단점이 됩니다. 원자재 비용을 줄이기 위해 생산 시스템은 3개의 플라스미드에서 2개(한 플라스미드에는 rep/cap/helper 유전자, 다른 플라스미드에는 트랜스유니)나 1개(모든 유전자가 하나의 플라스미드에 있음)로 간소화되었습니다39,40. HEK293 세포는 부착형 또는 현탁 형태로 유사한 생산성으로 배양할 수 있으나, 현탁 배양이 확장성 때문에 선호됩니다41.
    대체 생산 플랫폼으로는 Sf9 또는 기타 곤충 세포 내 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS), 안정 생산자 세포주, 단순포진 바이러스 기반 시스템, 유도 발현 시스템 등이 있습니다. 특히, 동일한 혈청형에서도 공허/완전 비율이 상당히 달라질 수 있으며, 플랫폼과 특정 AAV 혈청형에 따라 8%에서 39% 이상까지 보고된 비율이 있습니다42.
    적절한 생산 플랫폼을 선택하고 RSM 생성을 위한 상류 조건을 최적화하려면 목표 캡시드 집단에 대한 신중한 고려가 필요합니다. 임상 재료 및 현재 사용 가능한 RSM에서 가장 널리 사용되는 생산 시스템인 HEK293 과시 형질전환(HEK293)과 관련하여, 다양한 공정 매개변수를 최적화하여 수율과 빈/완전 캡시드 비율을 모두 향상시킬 수 있습니다. 완전 캡시드 RSM의 경우, 상류 공정 최적화는 부분 또는 빈 캡시드 형성을 최소화하기 위해 수율과 유전체 패키징 효율을 극대화하는 것을 목표로 합니다. 이는 초기 원시 용해액의 빈/완전 비율이 하류 공허/완전 비율에 직접적인 영향을 미치기 때문입니다. 주요 매개변수에는 트랜스펙션 시 세포 밀도, 플라스미드 몰 비율, 트랜스펙션 시약과 DNA 비율, 수확 시기, 소분자 첨가제(예: 세포주기 정지 억제제), 그리고 트랜스유전자 카세트 설계 40,43,44,45,46이 포함됩니다.
    빈 캡시드 RSM은 일반적으로 형질전환 과정에서 형질전환 플라스미드를 생략하여 생성되어, 캡시드 조립 후 DNA 포장을 방지합니다. 그러나 실제로는 이러한 '빈' 제제에도 오염 DNA가 포함되어 있어 조성적으로 이질적이며, 철저한 분석 특성 분석의 필요성을 강조합니다47,48.
  2. 하위 처리
    하위 공정(DSP)은 벡터의 수확, 정제, 정제를 포함하며, 높은 벡터 수율과 최적의 공중/완전 비율을 보장하는 동시에 매우 순도의 AAV 산물을 얻습니다. 하류 처리는 형질전환 후 72시간 후 세포 용해를 통해 세포 내 rAAV를 회복하기 시작한다49. 바이러스 배출은 혈청형에 따라 다르지만, 세포 용해는 완전한 세포 내 회복을 보장합니다50. 용해는 동결-해동 사이클을 통해 기계적으로 이루어지거나, 세제 기반 완충제(예: Triton X-100, Tween-20/80, CHAPS)를 사용하는 화학적으로 이루어지며, 확장성을 높이기 위해 화학적 방법이 선호됩니다49,51. 용해 과정에서 뉴클레아제 처리(예: 벤조나제)는 캡시드되지 않은 벡터 게놈과 오염된 플라스미드 DNA를 퇴화시켜 유전체 적정의 편향을 방지하고 추가 DSP 단계에 필요한 DNA 점도를 감소시킵니다. HEK293 유래 rAAV의 일반적인 용해 완충제는 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, Benzonase 25–50 U.mL-1,51. 용해액은 심층 여과 또는 원심분리를 통해 정제되어 세포 잔해를 제거합니다. 접선 유동 여과(TFF)는 수확물을 농축하고 버퍼를 교환하여 하류 정제를 수행하지만, 대량의 정제 단계가 가능하다면 이 단계를 생략할 수도 있습니다. 추가 정제는 초원심분리(UC) 또는 크로마토그래피 기반 방법을 통해 진행됩니다52.

    구배 밀도 UC는 주로 세슘 클로라이드(CsCl) 구배 또는 아이오딕사올을 통해 전통적으로 rAAV 정제에 사용되어 전체 캡시드를 공정 및 제품 관련 불순물로부터 높은 수율과 효과적으로 분리해 왔습니다53. UC는 혈청형 독립성과 높은 순도를 제공하지만, 수작업 처리, 대량 대량 적용 시 확장성 제한, 노동 집약적 처리 등 상당한 단점이 있습니다. 컬럼 크로마토그래피는 확장성, 더 빠른 처리 시간, 자동화 기능을 제공하며 선호되는 대안으로 부상했으며, 임상용 rAAV 및 rAAV RSM 생산에 성공적으로 적용되고 있습니다. rAAV의 컬럼 크로마토그래피는 일반적으로 캡처와 연마 두 단계로 수행됩니다52,54.

    친화성 크로마토그래피는 주요 포획 단계로, 수지에 고정된 리간드를 사용해 AAV 캡시드에 결합하고 대부분의 공정 관련 불순물을 제거합니다. 단일 도메인 항체 조각(VHH)는 최근 혈청형 간 다양성과 높은 특이성 덕분에 선호되는 리간드 선택지가 되었습니다. 일반적으로 사용되는 항체 기반 컬럼으로는 POROS CaptureSelect AAVX, AVB Sepharose High Performance, Capto AVB가 있습니다51. POROS CaptureSelect AAVX는 AAV1–9, rAAV-10 및 엔지니어링 변이체를 결합하는 가장 광범위한 특이성을 제공하여 혈청형에 구애받지 않는 정제에 적합합니다55​. 대부분의 상업용 rAAV RSM 정제에 일반적으로 사용됩니다 (표 1). 친화성 컬럼은 에피토프가 두 변종 모두에 존재하기 때문에 완전 캡시드와 빈 캡시드를 구분할 수 없으므로, 추가적인 연마 단계가 사용됩니다. 연마 단계에서는 일반적으로 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 사용하여 완전 캡시드와 빈 캡시드를 분리합니다. 이 방법은 완전(~5.9)과 빈(~6.3) 캡시드 집단 간의 미세한 등전점(pI) 차이를 활용합니다52. 상업적으로는 세 가지 고정상 형식이 있습니다: 포장된 수지, 모놀리스, 멤브레인 컬럼53. AAV의 세 가지 포맷 모두에 걸친 비교 성과 데이터는 제한적입니다. 하지만 모놀리스와 멤브레인 컬럼은 더 높은 대류 기반 유량을 지원하므로, 처리 시간이 줄어드는 대규모 대규모에서는 선호됩니다. 패킹 수지는 확산 제한 질량 전달과 높은 역압에 의존하여 유량을 제한합니다56,57. 상업적으로 이용 가능한 AEX 칼럼 목록은 Jungbauer 등의 리뷰에서 확인할 수 있습니다51. 용출에서는 고정된 염 단계가 펌프 혼합, 유량 등 기기적 변동에 덜 민감하여 반복 변화 구배보다 재현성을 높이고 버퍼 소모를 줄이는 점차 소금 구배가 점점 선호되고 있습니다52. 최적화된 AEX 프로토콜은 여러 혈청형에서 >90%의 완전한 캡시드 순도를 달성할 수 있습니다58. 그러나 UC와 달리 AEX는 아직 부분적으로 채워진 캡시드의 신뢰성 있는 분리를 입증하지 못했으며, 각 혈청형은 전하 프로파일이 혈청형에 따라 달라지기 때문에 최적화가 필요합니다51. 특히, 대부분의 상업용 RSM 정제 공정은 친화성 포집 크로마토그래피와 UC(아이오딕사놀 또는 CsCl)를 연마 단계로 결합하여, 초기 친화성 기반 불순물 제거 후 UC의 높은 순도 이점을 활용합니다(표 1).
  3. 공식화
    AAV 제형 최적화는 RSM의 안정성과 유통기한을 보장하는 데 중요합니다. 제형 설계에는 부활성 선택, 삼투압 조절, 완충제, 계면활성제 선택, 그리고 응집을 최소화하기 위한 이온 강도 조절이 포함됩니다. 가장 일반적인 완충 시스템으로는 인산염 기반, 삼산, 아세테이트, 시트레이트, 락테이트 등이 있으며, 일반적으로 7.4± 0.3 사이에서 다양한 혈청형에서 작동합니다. 부활제는 AAV 제형에서 흔히 발견되는 안정제로, 여기에는 NaCl, KCl, 폴록사머 188(Px188), MgCl₂, CaCl₂, 자당, PS20, 소르비톨, 만니톨, 글리세롤, 인체 혈청 알부민 등이 포함됩니다. ~0.001%의 Px188은 일반적으로 인터페이스 및 기계적 응력을 줄여 다루기 및 동결-해동 시 캡시드 파열과 역가 손실을 제한하는 데사용됩니다. 삼투압은 인간 내 투여에서 중요한 고려사항이지만, 연구용RSMs 60에서는 덜 중요하다. 대부분의 상업용 RSM은 PBS 기반 버퍼를 사용하며, 때때로 추가 염을 보충하기도 합니다. 공급업체들은 -80 °C에서의 저장과 여러 번의 동결-해빙 과정을 피할 것을 권장하는데, 이는 얼음-물 경계면에서 캡시드 파열을 촉진하여34,61 역가 손실로 이어질 수 있기 때문입니다.

4. 분석적 특성화: 표준 정의

RSM이 생산, 정제 및 제형화되면, 포괄적인 분석 특성 분석이 수행됩니다. 이 단계는 RSM의 품질과 다양한 분석 방법 전반에 걸쳐 참조 자료로서의 적용성을 보장합니다. 동일한 품질 속성을 평가하기 위해 직교 분석 기법을 사용하는 것이 견고성을 보장하는 데 특히 중요하며, 따라서 강력히 권장됩니다. AAV RSM에 특화된 주요 품질 속성은 표 2에 나열된 것처럼 역가, 동일성, 순도의 세 가지 범주로 나눌 수 있습니다.

  1. 역가
    RSM 특성화는 벡터 게놈 역가와 캡시드 입자 역가로 정량화되는 역가 측정을 포함하며, 존재하는 벡터 유전체 및 캡시드 수에 대한 정보를 제공합니다. 게놈 역가는 일반적으로 qPCR 또는 dPCR로 측정되며, 형질전환유전자, ITR 또는 기타 형질전환유전자 카세트 요소를 표적으로 하며, 분석법 설계와 프라이머/프로브 배치가 결과에 큰 영향을 미칩니다. ITR 기반 분석법은 혈청형에 의존하지 않고 널리 적용 가능하지만, ITR의 헤어핀 구조는 프라이머 결합을 방해할 수 있으며, ITR 서열을 부분적으로 채운 캡시드가 존재할 경우 이러한 분석법이 역가를 과대평가할 수 있습니다; ITR 표적 qPCR은 발현 카세트 표적 분석법에 비해 AAV2 및 AAV8 RSMs의 게놈 역가를 과대평가하는 것으로 나타났습니다11. qPCR의 또 다른 편향 원인은 이중 가닥 플라스미드 DNA 캘리브런트의 사용으로, 이는 단일 가닥 rAAV 게놈과 증폭 동역학이 다릅니다29.
    dPCR은 포아송 통계를 통한 절대 정량화를 통해 이 두 한계를 모두 해결하여 표준 곡선 의존성을 제거하고, ITR 2차 구조 간섭에 덜 취약한 것으로 나타났습니다. 특히, qPCR은 플라스미드 기반 캘리브런트가 아닌 rAAV 기반 캘리브런트를 기준으로 보정할 때 동등한 정확도를 달성할 수 있어 비용 효율적인대안 63을 제공합니다. 적절한 샘플 전처리도 똑같이 중요합니다. DNase 처리는 외부 DNA를 제거하여 캡슐화된 게놈만 정량하도록 하며, 캡시드 파괴 전에 단백질나제 K 또는 열처리 64, 65, 66을 사용하여 비활성화를 시행해야 합니다. 정제 벡터 샘플에서 ddPCR 기반 게놈 정량을 위한 최적화 및 검증된 프로토콜이 우리 연구 그룹67에 의해 발표되었습니다.
    캡시드 입자 역가는 일반적으로 ELISA 또는 SEC-MALS(핵 추출 물가)를 사용하여 측정됩니다. ELISA는 매트릭스 효과에 대한 높은 특이성과 강인성을 제공하지만, 혈청형 특이적이고, 표준 곡선에 의존하며, 노동 집약적입니다. SEC-MALS는 혈청형에 의존하지 않고 더 빠르지만 특수 기기가필요합니다.
  2. 정체성
    동일성 평가는 생성된 AAV가 의도된 혈청형과 유전체 서열에 부합하는지 확인하며, 단백질과 DNA 수준에서의 의도치 않은 변형을 제외하는 것을 목표로 합니다. 캡시드 단백질 동일성은 혈청형 식별을 의미합니다. 일반적인 방법으로는 혈청형 특이적 항체를 이용한 ELISA와 웨스턴 블롯(WB)이 있습니다. 최근에는 질량분석법이 고성능 액체 크로마토그래피(LC-MS)와 결합되어 높은 재현성, 정확성, 견고성 덕분에 혈청형 식별과 캡시드 조성 분석에 있어 고차수의 보완적 접근법으로 부상하고 있습니다. 다만 일반적으로 사내 RSM 특성 분석에는 사용되지 않습니다 6,22. 벡터 유전체 동일성은 나노포어 시퀀싱과 같은 시퀀싱 기법을 사용하여 평가할 수 있습니다. 이 접근법은 완전한 AAV 게놈의 장기 독기 커버리지를 제공하여 서열 동일성을 정확히 결정할 수 있게합니다.
  3. 순수
    AAV RSMs의 세 번째 중요한 품질 매개변수는 순도로, 단백질 순도, 캡시드 및 유전체 무결성, 캡시드 함량, 집합을 포함합니다. 캡시드 무결성은 도데실황산-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-PAGE), 모세관 전기영동(CE-SDS), WB를 사용하여 VP 화학양론(VP1:VP2:VP3 ≈ 1:1:10)을 검증하여 평가하며, WB는 추가로 캡시드 단백질 식별 확인을 제공합니다22.
    전형도유전자가 전체 길이인지 절단형인지에 관계없이 유전체 완전성은 아가로스 겔 전기영동(AGE), 다중화 ddPCR, 또는 나노포어 시퀀싱과 같은 시퀀싱 기반 접근법을 통해 평가할 수 있습니다. AGE는 단순하지만 해상도와 구체성은 제한적입니다. 다중화 ddPCR은 겔 기반 방법으로는 제공하지 못하는 정량적이고 영역별 특이적 데이터를 제공하지만, 더 광범위한 분석법 개발 비용이 필요하다 22,68.
    캡시드 함량은 종종 유전체 역가를 캡시드 역가로 나누어 추정합니다; 그러나 이는 두 개의 독립적인 분석법에 의존하므로 추가적인 변동성을 초래할 수 있으므로 RSM의 특성 분석에는 권장되지 않습니다. 변동성이 낮은 이 속성에 더 적합한 기법으로는 AUC, SEC-MALS, MP, CD-MS, 그리고UV/Vis 8,69,70,71,72,73이 있습니다. 최근 발전은 AUC와 SEC-MALS의 다중 속성 방법으로서의 가치를 더욱 높였습니다. 특히, 다중 파장 AUC(MWL-AUC)는 빈 캡시드, 부분적으로 채워진 캡시드뿐만 아니라 유전체 역가, 캡시드 역가, 집계71,74의 평가도 가능하게 합니다. 마찬가지로, SEC-MALS는 단일 분석법 내에서 캡시드 역가, 유전체 역가, 순도, 집집, 완전 대 빈 캡시드 비율73,75에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 집계는 동적 빛 산란(DLS)을 사용해 모니터링할 수도 있습니다. 특히, 전통적으로 부분적으로 채워진 캡시드를 정량화할 수 있는 해상도를 제공한 것은 AUC, MP, CDMS뿐입니다. 하지만 최근에는 SV-AUC와 MP76에 비해 부분적으로 채워진 캡시드도 정량화할 수 있는 향상된 TEM 방법이 개발되었습니다. 캡시드 함량에 대한 단일 방법으로 골드 스탠다드가 등장하지 않았고, 이 기법들은 서로 다른 분석 원리에 의존하기 때문에, 전체 순도10의 포괄적인 평가를 위해서는 여러 상호 보완적 접근법을 사용하는 것이 권장됩니다.
  4. 안정성
    RSM의 장기 안정성은 매우 중요하며, 참조 값은 일정하게 유지되어야 신뢰할 수 있는 교정을 보장합니다. AAV RSM은 일반적으로 캡시드와 유전체의 무결성을 유지하기 위해 ≤-70°C에 보관됩니다. AAV8 RSM(ATCC VR-1816)에 대한 다중 실험실 안정성 연구에서 최소 2년간 < -70 °C77에서 벡터 게놈 역가, 감염성 역가, 캡시드 역가가 안정적으로 유지됨을 입증하였습니다. 안정성 시험 절차는 ICH Q1A 지침을 따라, 주요 속성을 정해진 간격으로 평가할 수 있습니다: 3개월마다(1년차), 6개월마다(2년차), 그리고 그 이후로는 매년 78개월마다. 가속 저장 조건(2–8 °C)에서의 단기 안정성은 일반적으로 1주, 2주, 4주79주에 평가됩니다. 안정성을 나타내는 중요한 속성으로는 유전체 역가, 캡시드 역가, 캡시드 함량, 캡시드 단백질 무결성, 그리고 집집이 포함됩니다. RSM은 동결-해동 민감도80도 평가해야 합니다.

5. AAV 분석 표준화의 두 번째 축으로서의 조화된 SOP

잘 특성화된 RSM의 가용성 외에도, AAV 분석에서 의미 있는 표준화를 위해서는 조화롭고 충분히 상세한 SOP가 필요합니다. 동일한 분석 방법을 적용하더라도, 샘플 전처리, 기기 설정, 보정 전략, 데이터 처리 및 해석 기준의 차이로 인해 실험실 간 결과가 크게 다를 수 있으며, 이러한 요인들은 분석 플랫폼 자체와 독립적으로 실험실 간 변동성에 기여하는 것으로 밝혀졌습니다 8,9.

이는 NIST, 국립 생명공학 제조 혁신 연구소(NIIMBL), USP 간의 공동 실험실 간 연구에서 6개 연구소가 동일한 AAV5와 AAV8 샘플의 캡시드 함량을 네 가지 방법으로 평가한 결과에서 잘 드러납니다. SEC-MALS와 UV/Vis를 포함한 광학 방법은 실험실 간 일치가 가장 강했으나, PCR-ELISA는 재현성이 낮아 추가 조화 없이는 정량적 사용에 적합하지 않다고 판단되었습니다. SV-AUC는 금본위로 널리 인정받지만, SEC-MALS보다 실험실 간 변동성이 더 컸으며, 표준화된 SV-AUC 절차 개발을 위한 후속 노력이 중요한 다음 단계로 확인되었습니다 8,81.

dPCR을 이용한 유전체 역가 결정에 대해서도 유사한 결론이 도출되었으며, 샘플 전처리, 추출 전략, 기기 플랫폼, 희석 조건, 캡시드 용해 타이밍, 동결-해빙 이력 등이 보고된 값에 영향을 미칠 수 있습니다. 특히, 절차적 통제가 변동성을 크게 줄여 조화된SOPs 9의 가치를 더욱 강조했습니다.

따라서 RSM과 SOP는 AAV 분석 표준화의 상호 보완적 기둥으로 간주되어야 합니다. RSM은 추적성과 교정에 필요한 측정 기준점을 제공하는 반면, SOP는 절차적 변동성을 줄이고 할당된 값이 분석가, 기기, 실험실 전반에 걸쳐 일관되게 재현되도록 돕습니다.

결론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

rAAV 유전자 치료는 품질 특성을 일관되게 특성화하는 분야 내 능력보다 빠르게 발전하고 있습니다. 이 리뷰는 비교 가능한 AAV 특성화의 주요 장벽이 분석 도구 부족이 아니라, 공유 측정 앵커와 조화로운 워크플로우의 부재임을 보여줍니다. RSM은 방법에 의존하는 측정값을 추적 가능하고 비교 가능한 값으로 변환하여 이 문제를 해결합니다. RSM은 방법 검증을 가능하게 하고, 실험실 간 재현성을 향상시키며, 분석기 드리프트를 지속적으로 감지하는 통제 기능을 제공합니다. 그러나 순수한 빈 및 완전 캡시드 개체군 확보의 어려움, 포괄적인 직교 특성 분석, 그리고 정해진 저장 조건에서의 장기 안정성 요구로 인해 고품질 AAV RSM 생산은 기술적으로 여전히 까다롭습니다. 최근 제조 및 정제 기술의 발전으로 주로 빈 캡시드 및 완전 캡시드 제제 생산이 가능해졌으며, 이는 자체 RSM을 생성하는 데 사용될 수 있습니다. 현재 약사 기관(USP), 협력 컨소시엄(ATCC), 상업 공급업체의 제품들은 의미 있는 진전을 나타냅니다. 그러나 범용 AAV RSM 개발은 혈청형, 벡터 게놈, 그리고 점점 더 많은 인공 캡시드 변이의 다양성에 의해 근본적으로 제약을 받습니다. 단클론 항체와 달리, AAV의 이질성 때문에 혈청형 특이적 및 응용 특이적 RSM이 필요합니다. 이러한 복잡성은 하이브리드 및/또는 엔지니어링 캡시드로 인해 더욱 증폭되는데, 이로 인해 개발자들은 독점적인 내부 1차 RSM을 유지해야 하므로 측정 환경이 분산됩니다. 또한, 번역 후 변형(PTM)과 같은 다른 품질 속성들은 잠재적 CQA로 부각되었으나, PTM에 대한 잘 특성화된 RSM이 부족해 이 벡터 속성 이해에 중요한 공백이 생겼습니다. RSM 가용성 외에도 조화로운 SOP도 똑같이 중요합니다. 이 분야는 약경 기관에서 발표하는 표준화되고 상세한 프로토콜인 종합 방법(compendial methods)의 혜택을 누릴 수 있으며, 이는 모든 실험실이 AAV CQA에 대해 일관되고 통제된 검사를 수행하도록 보장합니다. 일반적으로 사용되는 방법의 모범 사례를 상세히 담은 서면 지침 문서는 실험실 간 변동을 더욱 줄이고 분석 워크플로우를 조화시킬 것입니다. 추적 가능한 AAV 측정 RSM을 확립하고 일관되고 정확한 특성 분석 관행을 시행함으로써, 커뮤니티는 CQA를 안전성 및 효능과 연결하는 과학적 기반을 강화하고, 자신 있는 규제 의사결정을 지원하며, 궁극적으로 환자에게 더 안전하고 신뢰할 수 있는 유전자 치료를 제공할 수 있습니다.

표 1: 현재 사용 가능한 rAAV RSM과 그 특성

이 표는 사용 가능한 rAAV 기준 자료와 그 주요 특성을 요약합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 2: 사내 RSM 특성 분석을 위한 권장 분석 방법 모음

이 표는 사내 RSM 특성 분석에 권장되는 분석 방법을 요약합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 이해 충돌이 없음을 선언합니다

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로젝트는 유럽연합의 연구 및 혁신 프레임워크 프로그램인 Horizon Europe의 보조금 협정 No. 101119880에 따라 자금을 지원받았습니다. 이 프로젝트는 플랑드르 정부의 "플랑드르 회복력" 보조금으로 자금을 지원받았으며, 이는 "유럽 회복 및 회복력 시설"(RRF)(VV021/13)에서 시작되었습니다.

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