본 연구에서는 항원 검출법과 디지털 PCR법을 사용하여 얻은 24종의 Helicobacter pylori (H. pylori) 배양 세균 현탁액의 검출 결과를 비교함으로써, 이들 간의 상관관계를 분석하여 H. pylori 표준 물질의 특성 분석 및 in vitro 진단 평가에서의 유의성을 조사하였습니다.
연구 논문
H. pylori 항원 역가와 디지털 중합효소 연쇄 반응 정량의 상관관계: 배양된 불활성화 분리주의 분석적 평가
이 논문에서
요약
초록
Helicobacter pylori (H. pylori) 진단의 표준화는 서로 다른 검출 분석법들 사이에서 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 면역크로마토그래피는 H. pylori 특이적 항원을 검출하지만 정성적 결과만을 제공하며, 비특이적 결합이나 경쟁적 억제를 통해 표적 외 수용성 박테리아 단백질의 간섭을 받기 쉽습니다. 이와 대조적으로, 디지털 PCR (dPCR)은 게놈 DNA 복제 수를 정밀하게 정량화하여 생존 및 비생존 박테리아를 모두 식별할 수 있게 합니다. 본 연구에서는 면역크로마토그래피 기반의 엔드포인트 역가(최고로 검출 가능한 2배 연속 희석 배수의 역수로 계산된 반정량 값)와 dPCR로 정량화된 핵산 복제 수를 비교하였습니다. 미호기성 조건(85% N2, 10% CO2, 5% O2) 하에서 5% 탈섬유소 양 혈액이 첨가된 Brucella agar 상에서 37 °C로 72시간 동안 배양한 24개의 H. pylori 박테리아 현탁액을 대상으로 항원 검사와 dPCR 측정을 병행하였습니다. 통계적 평가를 위해 피어슨 상관 분석과 선형 회귀 분석을 적용하였습니다. 분석 결과, 항원 역가와 게놈 복제 수 사이에 유의미한 양의 상관관계가 관찰되었습니다 (r = 0.536, n = 24, P = 0.007). 그러나 낮은 결정계수 (R2 = 0.287)는 항원 역가가 dPCR로 측정된 분산의 단 29%만을 설명한다는 점에서 예측력이 제한적임을 보여주었으며, 단일 샘플에 대한 강력한 예측을 뒷받침할 수 없습니다. dPCR 수치는 높으나 역가가 낮은 불일치 프로파일은 비생존 박테리아 파편이나 유리 게놈 DNA에서 기인했을 가능성이 있습니다. 항원 기반 분석과 핵산 기반 분석은 생물학적으로 연관되어 있으나 서로 대체 불가능한 분석물을 정량화합니다. 따라서 표준 물질 개발 및 진단 분석법 검증을 위해 집락 형성 단위, 항원 역가 및 게놈 복제 수를 결합한 다중 파라미터 특성 분석이 제안됩니다. 본 연구는 진단적 불일치를 해결하기 위한 H. pylori 특이적 합의 지침의 필요성을 강조합니다.
서론
Helicobacter pylori (H. pylori)는 주로 인간의 위장관, 특히 위의 유문전에 서식하는 미호기성 그람 음성 간균입니다. 이 균은 만성 위염, 소화성 궤양 및 위암의 주요 원인이 됩니다1,2. 인간 사이에서 H. pylori의 전염은 주로 구강-구강 또는 분변-구강 경로를 통해 발생하며, 전 세계적으로 널리 퍼져 있으며 감염률은 지역마다 다르게 나타납니다. 선진국의 감염률은 약 50%인 반면, 일부 개발도상국에서는 최대 80%에 달할 수 있습니다3. 1994년, 세계보건기구(WHO)는 H. pylori를 위암을 유발하는 1군 발암물질로 분류했습니다4. CagA (cytotoxin-associated antigen A) 및 VacA (vacuolating cytotoxin A)와 같은 주요 독성 인자들은 만성 염증과 상피 세포 손상을 유도하며, 이는 1군 발암물질로 분류되는 근거가 되는 병원성 기전에 기여합니다. 2018년, H. pylori 감염으로 인한 암 발생 건수는 810,000건에 달했으며, 이는 인유두종 바이러스(HPV), B형 간염 바이러스(HBV) 및 C형 간염 바이러스(HCV)에 의해 발생하는 자궁경부암과 간암의 합산 건수를 초과하는 수치입니다5. 이러한 통계는 H. pylori가 초래하는 상당한 암 위험을 강조하며, 일부 연구에 따르면 치료하지 않고 방치할 경우 약 1%–3%의 확률로 위암으로 이어질 수 있습니다. H. pylori 감염의 높은 전 세계적 유병률로 인해 단순한 검출을 넘어 정확한 정량이 공중 보건의 우선 과제가 되었으며, 정확한 세균 부하량 평가는 치료 결정의 지침이 되어 불필요하거나 실패한 제균 치료를 피하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 H. pylori의 정확한 검출과 정량은 역학 조사, 치료 계획의 선택 및 치료 효능 평가에 있어 매우 중요한 의미를 갖습니다.
~로 인한 상당한 암 부담을 고려할 때 H. pylori정확한 검출과 정량 분석은 역학적 감시, 치료법 선택 및 치료 모니터링에 있어 매우 중요합니다. 현재의 비침습적 방법에는 대변 항원 검사(SAT), 요소 호기 검사 및 분자 진단법이 포함됩니다. 디지털 PCR(dPCR)은 높은 정밀도와 절대 정량 분석 능력을 제공하지만, SAT와 비교했을 때 높은 비용, 기술적 복잡성 및 장비 요구 사항으로 인해 임상 적용에 제약이 있습니다. 이러한 차이로 인해 두 방법 간의 상관관계 연구가 필요하며, 이는 dPCR을 정량적 기준으로 활용하여 SAT의 표준화를 개선하는 것을 목표로 합니다.
최신 절대 정량 기술인 디지털 PCR(dPCR)은 표준 곡선에 의존하지 않고 표적 유전자의 절대 복제 수를 직접 검출할 수 있습니다. H. pylori 연구에서 dPCR은 위점막, 타액 및 분변 시료 내의 박테리아 정량 분석에 활용되어 왔습니다6,7.
in vitro 진단 시약의 개발, 품질 평가 및 규제에 있어 참조 표준물질의 조제와 교정은 결과의 정확성, 비교 가능성 및 소급성을 보장하는 데 필수적입니다. 박테리아 in vitro 진단 시약(H. pylori 항원/항체 검출 시약 등)의 경우, 참조 표준물질은 일반적으로 농도나 활성 단위가 명확하게 정의된 균주 또는 임상 검체를 포함해야 합니다. 전통적인 박테리아 정량 방법은 집락 형성 단위(CFU/mL)로, 이는 증식 능력이 있는 생존 박테리아의 수를 직접적으로 반영하며 박테리아 표준 물질의 값 결정, 시약 민감도 평가 및 방법론적 비교에 빈번하게 사용됩니다8. CFU는 여전히 널리 사용되고 있으나, 검출 시간, 재료 소모 및 인건비 측면에서 뚜렷한 한계가 있습니다9.
in vitro 진단 기술의 활용 범위가 넓어짐에 따라, dPCR과 같은 분자 진단법은 이제 더 높은 정확도와 민감도로 병원체를 정량화하고 있습니다. 동시에 항원 적정법과 같은 면역학적 방법들이 임상 현장에서 점점 더 많이 적용되고 있습니다. 하지만 실제 운영 면에서, 수집된 대부분의 임상 분리주나 준비된 표준 시료는 불활성화된 시료 또는 장기 보존된 시료여서, 살아있는 박테리아 배양 및 CFU 계수가 어렵거나 불가능합니다10. 참조 물질을 준비할 때, 생물 안전 요구 사항을 충족하고 물질의 장기 안정성을 보장하기 위해서는 반드시 불활성화 과정을 거쳐야 합니다. 따라서 항원이나 핵산을 기반으로 하는 정량법은 값 결정을 위한 필수적인 수단이 됩니다8,11.
이는 두 가지 서로 다른 정량적 접근 방식의 상관관계와 등가성에 관한 실질적인 질문을 제기합니다. 즉, 표준 물질을 평가하기 위해 항원 검출과 dPCR을 사용할 때, 이 두 방법의 결과 사이에 안정적이고 정량화 가능한 관계가 존재하는가 하는 점입니다. 한정된 세트의 불활성화된 H. pylori 샘플을 이용한 예비 실험에서는 면역크로마토그래피 분석의 신호 강도와 dPCR을 통해 정량화된 DNA 복제수 사이에 일관된 양의 상관관계가 있음이 입증되었습니다. 우리는 불활성화된 박테리아 샘플에서 면역크로마토그래피 분석으로 측정된 H. pylori 항원 역가와 dPCR로 정량화된 DNA 복제수 사이에 유의미하고 일관된 양의 상관관계가 있을 것이라는 가설을 세웠습니다. 이러한 상관관계가 존재한다면, 항원 기반의 정성적 결과를 정량적인 핵산 등가물로 변환할 수 있게 될 것입니다. 이는 전통적인 배양이 불가능한 경우에 시약의 성능 평가, 표준의 설정, 참조 물질의 지정 및 임상 시험 결과의 해석을 위한 중요한 근거를 제공할 것입니다.
현재 H. pylori 항원 결과와 핵산 함량 사이의 관계에 대한 연구가 부족하며, 검토, 규제 및 표준화 작업을 뒷받침할 체계적인 데이터가 결여되어 있습니다. 이 가설을 검증하기 위해, 본 연구에서는 24종의 H. pylori 배양 균액에 대해 병행 테스트를 실시하여 콜로이드 면역 크로마토그래피법으로 검출된 항원 역가와 dPCR의 절대 정량 결과 사이의 상관관계를 체계적으로 분석하였습니다. 이러한 연구 결과를 바탕으로, H. pylori 검출 시약의 성능 평가 및 표준 물질 값 할당에 대한 참고 의견을 제시하였습니다.
프로토콜
본 연구에 포함된 모든 Helicobacter pylori 분리주는 정저우 대학교 제5부속병원에서 인간 위 생검 및 분변 검체로부터 처음 분리하였으며, 해당 병원은 in vitro 실험을 위해 완전히 처리되어 익명화된 세균 현탁액을 제공하였습니다. 모든 초기 절차(임상 검체 수집, 세균 분리 및 초기 냉동 보존)는 정저우 대학교 제5부속병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(윤리 승인 번호: KY2026080). 검체 수집 전 모든 참여자로부터 고지된 동의를 얻었으며, 모든 절차는 헬싱키 선언 및 관련 국가 생의학 연구 윤리 지침을 엄격히 준수하였습니다. 모든 환자 식별 정보는 샘플 전달 전 제공 병원에 의해 영구적으로 제거되었으며, 본 연구에서 보고된 실험 재료나 결과로부터 개별 환자의 신원을 추론할 수 없습니다.
본 연구는 추가적인 독립적 윤리 승인이나 고지된 동의를 필요로 하지 않습니다. 모든 실험은 익명화된 박테리아 현탁액을 이용한 in vitro 분석만을 포함하며, 원래의 인체 시료, 환자 임상 기록 또는 개인 정보에 접근하지 않았습니다. 국가 생물의학 연구 윤리 규정에 따라, 완전히 익명화된 미생물 분리물을 이용한 비중재적 in vitro 연구는 윤리적 면제 기준을 충족합니다. 정저우 대학교 제5부속병원의 기존 윤리 승인은 이러한 익명화된 균주들의 모든 정당한 2차 학술적 응용을 이미 포괄하고 있으며, 이는 기관 윤리 위원회에 의해 공식적으로 확인되었습니다.
모든 H. pylori in vitro 실험은 기관 표준 작업 절차를 준수하고 모든 생물안전성 검토 및 승인 요구 사항을 충족하며, 유효한 생물안전 인증(생물안전 2등급, BSL-2, Beijing Dongcheng District Health Commission Laboratory Biosafety Filing [2020] No. 059)을 받은 실험실에서 수행되었습니다. 본 연구에 대한 생물안전성 승인은 완전히 불활성화되지 않은 재료(즉, viability PCR로 특성화된 잔류 생존 미생물을 포함하는 재료)를 이용한 작업을 포함하여, 열 불활성화된 H. pylori 재료와 관련된 모든 절차를 포괄합니다. 연구 전 과정에서 표준 미생물학적 관행, 개인 보호 장구(PPE) 요구 사항 및 폐기물 오염 제거 절차를 엄격히 준수하였습니다. 모든 박테리아 샘플은 생물학적 위험 폐기물 관리에 관한 기관 지침에 따라 폐기 전 적절하게 불활성화되었습니다. 사용된 모든 시약, 장비 및 통계 분석 소프트웨어의 상세 내용은 재료 표(Table of Materials)에 나열되어 있습니다.
균주 및 배양
주의: H. pylori는 위험군 2(Risk Group 2) 인간 병원체입니다. 생균 배양액의 모든 취급 과정(접종, 배양 및 현탁액 준비)은 실험복, 장갑, 보안경을 착용한 상태에서 BSL-2 시설 내 인증된 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 수행해야 합니다.
56 °C에서 25분 동안 열 불활성화를 수행하면 생존 생물체의 수가 급격히 감소하지만 완전히 제거되지는 않습니다(섹션 1 참조). 따라서 부분적으로 불활성화된 현탁액은 계속해서 BSL-2 조건 하에서 취급해야 합니다. 모든 생물학적 폐기물과 오염된 소모품은 폐기 전 오토클레이브(121 °C, ≥30분) 처리하거나 기관의 생물안전 절차에 따라 소독해야 합니다. 본 문서에 기술된 BSL-2 작업은 동일한 생물안전 신고(Beijing Dongcheng District Health Commission Laboratory Biosafety Filing [2020] No. 059) 하에 승인되었습니다.
그 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 본 연구에 사용된 균주는 24종의 배양된 세균 현탁액으로, 정저우 대학교 제5부속병원에서 인체 위생검사 및 분변 검체로부터 처음 확보한 후 세균 현탁액 형태로 균주 수집처로 이전되었습니다. 인비트로 (In Vitro) 국립약물통제연구소 감염병 진단부 (NIDC), 중국 베이징)에서 수행되었으며, 본 연구의 모든 실험 작업은 NIDC(중국 베이징)에서 진행되었습니다. 이 균주들을 5% 탈섬유소 양 혈액이 첨가된 Brucella 배지 플레이트에 접종하고 미好기성 조건(85% N₂, 10% CO2₂, 5% O2₂) 에 37 °C 72시간 동안 배양합니다. 이 배양 시간은 각 균주의 항원 발현이 비교적 안정적인 정지 성장기에 해당합니다. 이후 세균 현탁액을 수집하였습니다.
열 불활성화는 디지털 항온수조를 사용하여 56 °C에서 25분 동안 수행되었습니다. 이 처리는 생물안전 요건을 충족하고 표준 물질의 장기 안정성을 보장하기 위해 실시되었습니다. 56 °C에서 25분간의 열 불활성화는 박테리아의 생존력을 급격히 감소시키지만, 모든 생존 유기체를 완전히 제거하지는 않습니다. 이는 후속 생존력 PCR 분석을 통해 확인되었으며, 24개의 배양된 박테리아 현탁액 전체에서 잔류 생존 분율의 중앙값은 4.6%(범위 0.00%–33.00%)로 측정되었습니다(결과 섹션 6 및 고찰 참조). 본 연구에 대한 생물안전 승인은 완전히 불활성화되지 않은 물질을 사용하는 작업을 포함합니다(윤리 및 생물안전 성명서 참조). 열 처리가 대부분의 H. pylori 표면 항원의 변성 임계값보다 낮기 때문에 항원 검출에 미치는 잠재적 영향은 최소한으로 간주되지만, 일부 열에 취약한 단백질 항원의 무결성에는 영향을 줄 수 있습니다. DNA 정량의 경우, 열 불활성화는 게놈 DNA를 분해하지 않으며 오히려 세포막을 파괴하여 추출 효율을 향상시킬 수 있습니다.
항원 검출
수집된 24개의 박테리아 현탁액을 PBS로 100배 희석하여 항원 검출 시료를 준비하였다. 100배의 1차 희석은 항원 농도를 상용 키트의 선형 검출 범위 내로 조정하고 매트릭스 간섭을 최소화하여 신뢰할 수 있고 정확한 검출 결과를 보장한다. 또한, 이러한 희석은 시료의 양을 보존한다. 이 시료들을 콜로이드 금법, 라텍스법, 면역크로마토그래피법을 포함하여 등록된 8종의 H. pylori 항원 검출 키트로 테스트하였다(표 1). 결과가 양성인 경우, 희석된 시료를 연속 희석(1:2, 1:4, 1:8 등)하여 결과가 음성이 될 때까지 테스트하였다. 양성으로 유지된 가장 높은 희석 배수를 기록하고 이를 "항원의 최종 양성 희석 배수"(예: 1:64)로 정의하였다. 2배 연속 희석은 인산완충식염수(PBS, 0.01 M, pH 7.2–7.4)로 준비하였다. 시료 도포 후, 각 스트립을 상온에서 15–20분 동안 배양한 후 판독하였다. 결과는 훈련된 작업자가 대조선과 비교하여 육안으로 판독하였으며, 가시적인 테스트 선이 나타나는 가장 높은 희석 배수를 종점으로 기록하였다. 콜로이드 금 스트립은 육안으로 판독하므로, 컷오프 값은 작업자에 따라 달라질 수 있다.
여러 상용 항원 검출 키트를 사용하여 테스트한 각 샘플의 경우, 종말 타이터(endpoint titer)는 모든 개별 키트 타이터의 중앙값으로 정의됩니다. 본 연구에 사용된 8종의 키트는 서로 다른 표적 항원 및 검출 원리로 설계되었으므로, Cohen's Kappa 또는 CV%는 사용되지 않았습니다. 이러한 지표들은 공통 참조 표준의 존재를 가정하기 때문입니다. 따라서 키트 간에 관찰된 변동성은 측정 오차가 아니라 실제 생물학적 및 분석적 이질성을 반영합니다. 중심 경향성의 강건한 측정치인 중앙값은 키트 특유의 편차를 효과적으로 배제할 수 있습니다. 24개 샘플 전체에서 가장 높은 키트 타이터와 가장 낮은 키트 타이터 사이의 샘플 내 편차는 2배에서 16배(중앙값 4배) 범위였습니다. 구체적으로 6개 샘플은 2배, 14개 샘플은 4배, 3개 샘플은 8배, 1개 샘플은 16배의 키트 간 차이를 보였습니다. 각 샘플에 대한 키트별 최소, 중앙 및 최대 타이터는 부록 표 1(Supplementary Table 1)에 나열되어 있습니다.
Digital PCR 정량 분석
수집된 24개의 박테리아 현탁액을 PBS로 500배 희석하여 dPCR 정량 검출용 샘플로 사용하였다. 이 희석된 샘플의 절대 정량은 4곳의 dPCR 실험실에서 수행되었다(Table 2). dPCR은 보존된 H. pylori 게놈 서열을 표적으로 하는 플랫폼별 전용 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 수행되었다. 본 연구에 사용된 dPCR 검출 키트는 여러 병원체와 여러 표적에 적용 가능한 범용 시약 키트이다. 각 플랫폼은 핵심 지적 재산인 특정 프라이머/프로브 서열과 표적 유전자 영역을 독립적으로 설계하고 최적화하였다. 이러한 서열은 최종 사용자에게 공개되지 않았다. 우리는 H. pylori의 특정 검출 표적이 특이적 검출이 가능함이 검증된 보존적 게놈 영역이라는 점만 안내받았다. 24종의 Helicobacter pylori 균주의 23S rRNA 유전자 서열은 BioProject 등록 번호 PRJNA1520048로 NCBI GenBank에 제출되었다. 이 서열들은 균주 정체 확인을 위해 제출된 것이며 dPCR 정량 표적은 아니다. 프라이머/프로브 설계, 증폭 화학 반응 및 Poisson 기반의 파티션 카운팅은 각 플랫폼의 전용 기술이므로, 이러한 단계들은 플랫폼에 따라 다르며 제조업체의 접근 권한 없이는 재현할 수 없다. 반면, 위에서 설명한 샘플 희석, 추출 반복 및 데이터 집계 절차는 플랫폼과 무관하며 상세히 명시되어 있다. 절대 복제 수는 기기의 전용 분석 소프트웨어에 구현된 Poisson 분포 알고리즘을 사용하여 계산되었다. 구체적인 계산 파라미터와 소스 코드는 제조업체의 소유이며 최종 사용자에게 공개되지 않았다. 마지막으로, Poisson 분포와 희석 배수를 기반으로 원래 용액 내 표적 유전자의 절대 복제 수(copies/mL)를 계산하였다.
4개의 독립적인 dPCR 실험실(Sniper, Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd., Ustar Biotechnologies Ltd., TargetingOne)이 본 연구에 참여하였으며, 각 실험실은 자신의 기기 플랫폼에 최적화된 독자적인 추출 키트와 dPCR 시약을 사용하여 보존된 H. pylori 게놈 서열을 표적으로 분석하였다. 각 플랫폼은 희석하지 않은 박테리아 현탁액을 제공받아 자체 프로토콜에 따라 샘플을 준비하였다. Ustar는 희석하지 않은 현탁액을 직접 사용한 반면, Sniper, Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd., TargetingOne은 추출 전 이를 PBS로 500배 희석하였다. 각 플랫폼에서 각 분리주에 대해 동일한 500배 희석 박테리아 현탁액으로부터 두 번의 독립적인 핵산 추출을 수행하였고, 각 추출물은 3회 반복 테스트하여 분리주당 플랫폼별로 6개의 측정값을 얻었다(Ustar의 경우 한 번의 추출에서 유효한 반복 실험 결과가 2개만 도출된 사례 한 건이 제외됨). 양성 드롭렛 수가 기기의 검출 하한치보다 낮거나, 템플릿 없는 대조군(no-template control)에서 비특이적 증폭이 나타난 경우 해당 반응은 무효로 분류하여 제외하였다. 무효 반응은 한 번 더 반복 수행하였으며, 계속해서 실패하는 경우 해당 추출물 전체를 제외하였다. 플랫폼별 원시 데이터는 Supplementary Table 1에 제공된다.
데이터 집계는 2단계 절차를 따랐습니다. 먼저, 각 플랫폼 내의 모든 유효한 원시 측정값(copies/µL)을 평균한 후, 플랫폼별 변환 공식을 사용하여 원래의 희석되지 않은 박테리아 현탁액 농도(copies/mL)로 변환하였습니다. 둘째, 각 분리주에 대해 네 가지 플랫폼에서 도출된 농도를 산술 평균하여 최종 단일 카피 수 값을 산출하였습니다. 이러한 체계는 플랫폼 내 반복 실험의 편차와 관계없이 각 플랫폼이 동일하게 기여하도록 보장하는 동시에, 개별 기기나 시약 시스템에 내재된 계통 오차를 완화합니다.
배양된 각 세균 현탁액을 4개의 dPCR 플랫폼에서 병행하여 정량하였으며, 실험실 간 변동성을 평가하기 위해 각 분리주에 대해 플랫폼 간 log₁₀ 변환 복제 수의 변동 계수(CV)를 계산하였습니다. 해당 결과는 결과 섹션에 보고되어 있습니다.
통계 분석
그 H. pylori 항원 역가는 양성 결과가 관찰된 가장 높은 시료 희석 배수의 역수로 정의하였다(예: 1:64 희석은 64의 역가에 해당함). 이후의 상관관계 분석을 위해 각 분리주당 하나의 대표값을 도출하고자, 각 분리주에 대해 8가지 키트별 항원 역가는 중앙값으로 합산하였고, 4가지 플랫폼별 dPCR 농도는 산술 평균으로 합산하였다. 이러한 데이터 축소 전략은 다음과 같은 방법론적 근거를 갖는다. (i) 8종의 항원 키트는 유사한 면역 분석 원리를 사용하여 동일한 분석물을 검출하며, 중앙값은 산발적인 이상치 측정값에 영향을 받지 않는 강건한 추정치를 제공한다. (ii) 4가지 dPCR 플랫폼 각각은 보존된 H. pylori 유전적 궤적(genomic locus), 그리고 로그-정규 분포된 농도 추정치의 산술 평균은 편향되지 않은 중심 경향성을 제공한다; (iii) 이러한 집계는 키트 간 또는 플랫폼 간 분석 성능을 평가하는 것이 아니라, 분리주 수준에서 항원가 기반 정량법과 DNA 기반 정량법 사이의 일치도를 평가한다는 본 연구의 주된 목적과 부합한다. 항원가와 dPCR 정량값(copies/mL) 사이의 상관관계는 먼저 피어슨 상관 분석을 사용하여 평가되었다. 두 변수 모두 로그 변환 후 대략적인 정규 분포를 나타냈다(왜도: log10 dPCR = −0.66; log2 항원 역가 = −0.60; 회귀 잔차 왜도 = −0.16), 피어슨 상관분석의 가정을 충족하였다. 항원 역가는 2배 연속 희석의 선형화를 반영하기 위해 log2 변환하였고, dPCR 결과는 세균 부하 표준 보고 형식에 맞게 log10 변환하였다. 이후 선형 연관성을 평가하기 위해, log2 변환된 항원 역가와 log10 변환된 dPCR 결과를 사용하여 피어슨 상관분석 및 선형 회귀 분석을 수행하였다. 모든 분석에서 유의 수준(αP < 0.05를 적용하였다. < 0.05를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다. 모든 통계 분석은 SPSSPRO 온라인 통계 분석 플랫폼을 사용하여 수행되었다.
결과
비교 H. pylori 항원 타이터 및 dPCR 절대 정량 결과
총 24건의 배양된 세균 현탁액 중에서 항원 적정은 8에서 256까지의 범위를 나타냈으며, 중앙값은 32였다(표 1). dPCR 정량 결과는 2.67에서 2.67까지 범위를 나타냈다. × 107 2.04 copies/mL × 109 복사수/mL, 중앙값은 log₁₀ = 8.61 (≈4.09 × 108 복사본/mL) (표 2). 원시 데이터에서 관찰된 관계는 비선형 특성을 나타내며, 이는 거듭제곱 법칙 또는 지수적 관계를 시사하였고, 항원 타이터와 dPCR 정량 값 모두에 후속적으로 로그 변환을 적용한 근거가 되었다.
로그 변환된 항원 타이터와 dPCR 정량 결과 간의 선형적 상관관계
두 검출 방법의 결과 간에 유의미한 상관관계가 있는지를 검정하기 위해, 두 변수가 로그 변환 후 대략적으로 정규분포를 따르므로 로그 변환을 실시하고 피어슨 상관분석을 수행하였다. 아래와 같이 나타낸 바 그림 1, 형질전환 후 항원 타이터(log2 변환)와 dPCR의 절대 정량 결과(log10 변환)는 유의한 중간 정도의 양의 선형 상관관계를 나타내었다(r = 0.536, n = 24, P = 0.007).
항원 티터와 디지털 PCR 복제 수 간의 관계에 대한 정량적 모델링
두 검출 방법 간의 관계를 정량화하고 상호 예측 가능성을 평가하기 위해, 향후 항원 타이터를 통해 세균 부하를 예측할 수 있도록 로그 변환된 데이터에 선형 회귀 분석을 적용하였다. 분석 결과, 로그 변환된 두 변수 간에 선형 관계가 나타났다.2 (항원 희석 농도) 및 로그10 (dPCR), 다음 방정식을 산출함: log10(dPCR) = 0.1588 × 로그2(타이터) + 7.7988 (R2 = 0.287). 회귀 계수(표준오차 및 95% 신뢰구간 포함)는 기울기 0.1588이었다. ± 0.053(95% CI 0.048–0.270 및 절편 7.7988 ± 0.292(95% 신뢰구간 7.193–8.404); 잔차 표준 오차는 0.318 log였다10 단위, 전체 회귀는 유의미하였다(F(1,22) = 8.84, P = 0.007). 이는 항원 티터가 2배 증가할 때마다 dPCR 복제 수가 1.441배 증가함을 나타낸다(100.1588). 그러나 특정 항원 희석도에 대해 dPCR 결과의 95% 예측 구간은 거의 두 자릿수 범위에 이를 수 있다(예: 1:32 희석도에서 예측 구간은 약 8.3 × 107 1.85까지 × 109복사본/mL). 이는 실용적인 응용에서 항원 티터만으로는 단일 샘플의 핵산 복사 수를 정확하게 예측할 수 없음을 나타내며, 본 모델을 사용하면 집단 수준 비교 시 수량의 차수(order of magnitude)에 대한 대략적인 추정은 가능하겠지만, 설명력이 중간 수준(R2 = 0.287).
디지털 PCR 정량 및 상관관계의 감수성 분석에서의 플랫폼 간 변동성
다중 실험실 간 변동성은 로그에서 평가되었다.10- 미생물 정량 데이터의 로그 정규 분포를 반영하기 위해 농도를 로그 변환함. 네 가지 플랫폼에서 산출된 로그 변환 농도의 변동계수(CV%)10 농도는 24개의 분리주에서 0.9%에서 8.3% 범위였으며(중앙값 1.8%, 평균 2.5%)였다. 하나의 이상치(Hp06, CV = 8.3%)는 다음을 나타내었다. >30배의 차이가 나타났으며, 스나이퍼(Sniper)에서는 5.93 × 108 복사/mL) 및 타겟원(1.50 × 107 복사/mL); 이 분리를 제외할 경우, 변동계수(CV)는 0.9%에서 6.4% 범위였다. 관찰된 항원 결과에 이 이상치가 영향을 미치지 않도록 하기 위해–dPCR 상관관계 분석에서 Hp06을 제외한 민감도 분석을 수행한 결과, r = 0.479, R2 = 0.230, 그리고 P = 0.021 (n = 23) — 모든 24개 분리주를 포함한 주요 분석과 유사함 — 이 상관관계가 특정 분리주에 의존하지 않음을 확인하였다. 이 산포는 추출 효율, 시약 감도 및 기기 교정 면에서 플랫폼 간에 존재하는 체계적인 차이를 반영하는 것이며, 단순한 무작위 측정 오차를 반영하는 것은 아니다. 따라서 플랫폼 간 편향을 줄이기 위해 플랫폼 간 평균값을 사용하는 것이 타당하다.
이중 방법 기준을 사용하여 결과 정의 및 분류하기
위의 분석과 탐색적이고 데이터 세트 특이적인 기준에 근거하여, 본 연구는 항원 검출 역가 데이터의 비정규 분포로 인해 항원 검출 역가의 중앙값을 1:32로 하여 높은 항원 검출의 기준치로 설정하였으며, 실제 중앙값 로그를 선택하였다.₁₀(dPCR) = 8.61 (≈4.09 × 108 복사본/mL)을 높은 핵산 함량의 기준치로 설정하였다. 이러한 기준치는 배양 격리 균주 데이터로부터 도출된 탐색적이고 데이터셋 특이적인 절단값이며, 검증된 임상 진단 기준을 의미하지 않는다. 따라서 이러한 절단값을 다른 샘플 모집단이나 분석 맥락에 적용할 경우 직접 이전하는 것이 아니라 해당 데이터로부터 다시 도출해야 한다.
탐색적 임계값 사용(항원 적정도 ≥ 1:32만큼 높게, ≤ 1:16이 낮음; dPCR 로그₁₀ ≥ 8.61로 높은 핵산 농도를 나타냄), 24종의 배양된 박테리아 현탁액의 4분면 분류 (그림 2, 표 3)은 다음과 같다: 9개 샘플(Hp03, Hp04, Hp11, Hp13, Hp18, Hp19, Hp21, Hp22, Hp25)이 고항원군에 속한다.–고농도 핵산 범주(37.5%); 3개 샘플(Hp09, Hp26, Hp27)은 저농도 항원으로 분류됨–고농도의 핵산(12.5%); 8개 샘플(Hp01, Hp02, Hp05, Hp08, Hp10, Hp14, Hp15, Hp17)이 고농도의 항원을 나타냄–낮은 핵산 함량(33.3%); 그리고 4개 샘플(Hp06, Hp07, Hp12, Hp20)은 낮은 항원에 속함–낮은 뉴클레산 농도 범주(16.7%)에 속했다. 24개의 분리주들이 평균적으로 그룹당 단지 4개의 샘플에 불과한 6개의 티터 그룹으로 나뉘었기 때문에, 그룹 간 공식적인 비교(예: 크루스칼-월리스 검정)는 충분한 통계적 검정력이 부족하다. 따라서 티터 그룹 간의 디지털 PCR 정량 결과에 대한 기술적 요약만을 제시한다.
열불활성화 후 잔존 생존율 (생존성 PCR)
열 불활성화 후 잔존하는 생존 세균을 정량화하기 위해, 24개의 분리균주 전부에 대해 생존성 PCR 시약 시스템을 사용하였다. 간단히 말해, 각각의 열 불활성화된 현탁액(200 µL)을 2,000 × g에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 이후 세균 펠렛을 생존성 PCR 시약 시스템에 부착된 세균 용해 버퍼 200 µL와 함께 재현탁시켰다. 재현탁된 펠렛은 56°C에서 10분 동안 배양한 후, 100°C에서 5분 동안 열처리하여 완전한 DNA 방출을 유도하였다. 그 후, 열처리된 샘플을 실온에서 1분간 식힌 다음, 생존성 PCR 시약 시스템에 포함된 DNA 제거용 정제 1정을 첨가하고, 37°C에서 1시간 동안 배양하여 DNA 분해를 수행하였다. 이후 정제를 제거하고, 200 µL의 탈염수를 첨가하여 세균 펠렛을 재현탁시켰다. 이 재현탁액을 2,000 × g에서 10분 동안 원심분리한 후, 상등액을 제거하고, 남은 펠렛을 200 µL의 생존성 PCR 시약 시스템에 포함된 세균 용해 버퍼로 재현탁시켰다. 이 재현탁액을 56°C에서 10분 동안 배양한 후, 100°C에서 5분 동안 열처리하고, 실온에서 1분간 식힌 후, 생존성 PCR 시약 시스템에 따라 실시간 PCR을 수행하였다. µL)에 막 비투과성 생존성 PCR 시약(10 µM 최종 농도)에서 37 °75분 동안 37°C에서 반응시킨다. 병행하여 시약 생략 대조군을 설정한다(−VR)과 동일한 방식으로 처리하였다. 이후 시약을 화학적으로 비활성화하기 위해 Viability PCR Neutralization Buffer(20 µL, 10×) 하고 실온에서 15분간 반응시켰다. Genomic DNA는 +VR 및 −VR 알리쿼트를 준비하고 각 추출물에 대해 dPCR을 수행하였으며, 생존 가능 분획은 +VR 대 −VR 복제 수 × 100%. 중간 생존 분율은 4.6% (범위 0.00%)였다.–33.00%; 분리주별 전체 결과 보충 자료 표 2). 생존율은 항원 적정치와 유의한 상관관계를 나타내지 않았다(r = 0.03, P = 0.90) 또는 dPCR 사본 수와(r = 0.37, P = 0.08).
데이터 이용 가능성:
24개의 23S rRNA 유전자 서열 헬리코박터 파일로리 균주들은 NCBI GenBank의 BioProject 접수 번호 PRJNA1520048에 등록되어 있다. 이러한 서열들은 균주 동정 확인을 위해서만 사용되었으며, dPCR 정량 분석의 표적은 제조사가 독점적으로 보유한 보존된 유전체 영역으로, 프로토콜에 설명된 바와 같다.
상용 콜로이드 골드 면역크로마토그래피 키트 8종의 원시 항원 역가 값과 CE 인증/국가의약품관리국 승인을 받은 디지털 PCR 장비 4종의 플랫폼별 정량 dPCR 수치는 상업적 민감성, 제조업체의 기밀유지 계약 및 규제 제한으로 인해 공개 저장소에 보관할 수 없다. 시험관 내 진단 제품
필요한 경우, 적용 가능한 기밀유지 및 규제 제한 조건에 따라 추가적인 제한 데이터를 기밀적으로 제공받을 수 있습니다.
그림 1: 상관관계 헬리코박터 파일로리 항원 타이터 및 디지털 중합효소연쇄반응(dPCR) 정량화 24개의 배양된 박테리아 현탁액(n = 24)에서 항원 티터와 DNA 복제 수 사이의 관계를 설명하기 위해 회귀선이 포함된 산점도를 제시하였다. 항원 티터는 시각적 판독이 가능한 콜로이드 금 면역크로마토그래피 검사를 통해 측정하였다. 각 시료의 연속 희석액을 검사하였으며, 티터는 양성 결과를 나타내는 가장 높은 희석 인자로 나타내었고(x축에 log 형태로 제시함)2-변환된, 무차원 값). DNA 복제 수는 dPCR을 통해 정량화되었으며, y축에는 로그 스케일로 표시됨10-변환된 농도 (로그10 복사수/mL). 각 점은 개별 박테리아 현탁액 샘플을 나타낸다. 파란색 실선은 선형 회귀 적합선을 나타낸다. 회귀선 주위의 음영 영역은 적합된 평균 반응의 95% 신뢰구간을 나타낸다. 점선의 수직선과 수평선은 탐색적 분류 기준값(log₂ 역가 = 5, 즉 1:32; 로그₁₀ dPCR = 8.61, 즉, 4.09 × 108 그림 2 및 표 3에서 사용된 copies/mL)이다. 상관관계는 피어슨 상관계수를 사용하여 평가하였으며, r = 0.536의 결과를 얻었다. P = 0.007, R2 = 0.287로, 두 방법 간에 통계적으로 유의미한 양의 상관관계가 있음을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 분석적 분류 프레임워크 H. pylori 항원 검사 결과와 디지털 PCR(dPCR) 정량을 통합하는 검사 이 그림은 면역크로마토그래피 항원 적정치와 dPCR 정량 결과 간의 일치성에 기반하여 24종의 배양된 박테리아 현탁액(n = 24)을 네 구간으로 분류한 것을 보여준다. 탐색적이고 데이터셋 특유의 기준치(항원 적정치 ≥ 1:32만큼 높음, ≤ 1:16이 낮음; dPCR 로그₁₀ ≥ 8.61의 높은 핵산 부하로, 샘플은 고농도 항원으로 분류됨–높은 뉴클레산산 (n = 9, 37.5%), 높은 항원–낮은 핵산 (n = 8, 33.3%), 낮은 항원–고농도 핵산 (n = 3, 12.5%), 저농도 항원–낮은 핵산 양 (n = 4, 16.7%). 이러한 기준값은 배양된 분리주 데이터에서 도출된 탐색적 절단값이며, 검증된 임상 진단 기준을 의미하지 않는다. 이 분류 체계는 면역학적 방법과 분자학적 검출 방법 간의 일치 및 불일치를 보여준다. 일치하지 않는 범주들은 항원 안정성, 박테리아 생존력 또는 DNA 복사 수 변이와 같은 요인들을 반영할 수 있다. 이 체계는 분석적 비교 목적을 위한 것이며, 임상 진단이나 치료 권고를 의미하지 않는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 아니오. | 검출 시약 | 제조업체 |
| 1 | 헬리코박터 파일로리 항원 검출 키트(콜로이드 금 방법) | Bioneovan Co., Ltd |
| 2 | 위 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 항원 검출 키트(콜로이드 골드법) | 상하이 케미트론 바이오테크 주식회사 |
| 3 | 헬리코박터 파일로리 항원 검출 키트(콜로이드 골드법) | 강소 몰 바이오사이언스 유한회사 |
| 4 | 헬리코박터 파일로리 항원 검출 키트(콜로이드 골드법) | 항저우 제네시스 바이오디텍션 & 바이오컨트롤 유한회사 |
| 5 | 헬리코박터 파일로리 항원 검출 키트(콜로이드 골드법) | JIANGSU COWIN BIOTECH CO., LTD |
| 6 | 헬리코박터 파일로리 항원 검출 시약(라텍스 방법) | ABON 바이오팜(항저우) 유한회사 |
| 7 | 헬리코박터 파일로리(HP) 항원 검출 시약(면역크로마토그래피법) | 광저우 원드포 바이오테크 유한회사 |
| 8 | 헬리코박터 파일로리 항원 검출 키트(콜로이드 골드법) | 베이징 코어 테크놀로지 유한회사 |
표 1: 목록 헬리코박터 파일로리 항원 검출 시약 및 제조업체 표는 8가지의 상업적으로 이용 가능한 면역크로마토그래피 검사법을 나열하며, 이들은 검출을 위한 것이다. H. pylori 항원으로, 본 연구에서 평가되었다. 각 제품에 대해 제조업체에서 제공한 번호(No.), 검출용 시약의 상업적 명칭 및 제조업체'제조사로부터 수집된 모든 정보를 바탕으로, 임상 진단 및 현장 진단 검사(point-of-care testing)에서 광범위하게 사용되어 온 키트들의 이름을 제시한다.' 제품 삽입문서 및 공식 웹사이트(2026년 3월 방문)를 참조하였다. 이러한 시약들의 포함은 추천을 의미하지 않으며, 제공 가능한 검사법의 다양성을 대표적으로 보여줄 뿐이다.
| 번호 | 기기 모델 | 디지털 PCR 플랫폼 |
| 1 | DQ24 | 스나이퍼 |
| 2 | 바이오 라드 QX200 드롭릿 디지털 PCR | 강소 바이오퍼펙터스 테크놀로지스 유한회사 |
| 3 | DQ24 프로 | 우스타 바이오테크놀로지(항저우) 유한회사 |
| 4 | TD-1 디지털 PCR 시스템 | 타겟팅원 |
표 2: 디지털 PCR(dPCR) 플랫폼 및 기기 모델 목록 이 표는 dPCR 시스템을 갖춘 네 가지 실험실 플랫폼과 각각의 테스트에 사용된 장비 모델을 나열한다. 이러한 플랫폼들은 기술적 다양성과 현재 dPCR의 실제 적용 사례를 대표한다는 점을 고려하여 선정되었다. 모든 정보는 각 플랫폼에서 자체적으로 제공한 것이다. 이들 플랫폼의 포함은 추천을 의미하는 것은 아니며, 기존 dPCR 시스템의 범위를 나타내기 위한 예시일 뿐이다.
| 유형 | 증례 수 | 비율 | 표본 번호 |
| 고항원 - 고핵산 | 9 | 37.5% | Hp03, Hp04, Hp11, Hp13, Hp18, Hp19, Hp21, Hp22, Hp25 |
| 낮은 항원 - 높은 핵산 | 3 | 12.5% | Hp09, Hp26, Hp27 |
| 낮은 항원 - 낮은 핵산 | 4 | 16.7% | Hp06, Hp07, Hp12, Hp20 |
| 높은 항원 - 낮은 핵산 | 8 | 33.3% | Hp01, Hp02, Hp05, Hp08, Hp10, Hp14, Hp15, Hp17 |
표 3: 본 연구에서 항원 검사 및 핵산 검사 결과의 분류 및 비율 이 표는 항원 티터(면역크로마토그래피 분석법으로 측정하며, 양성 결과가 나타나는 가장 높은 희석 인자로 표시)와 절대정량적 디지털 중합효소연쇄반응(dPCR) 결과(log로 표시) 사이의 일치 여부에 따라 24종의 배양된 박테리아 현탁액을 분류한다.₁₀ 복사본/mL). 1:32(고농도) 이상의 항원 티터를 커프오프 값으로 사용함 ≥ 1:32, 낮음 ≤ 1:16 및 dPCR 정량 기준값 4.09 × 108 복제/mL (로그₁₀ = 8.61)을 탐색적이고 데이터 세트 특이적인 기준으로 삼아, 시료를 네 가지 하위 그룹으로 분류하였다: 항원 고발현-핵산 고발현, 항원 저발현–고농도 핵산, 고농도 항원–낮은 뉴클레산산, 낮은 항원-낮은 뉴클레산산. 24개 샘플 중 9개는 고항원으로 분류됨–고농도 핵산(37.5%; Hp03, Hp04, Hp11, Hp13, Hp18, Hp19, Hp21, Hp22, Hp25), 3개는 저항원–고농도 핵산(12.5%; Hp09, Hp26, Hp27), 8을 고농도 항원으로 분류–낮은 뉴클레산 산물 (33.3%; Hp01, Hp02, Hp05, Hp08, Hp10, Hp14, Hp15, Hp17) 및 4개를 낮은 항원으로 분류–낮은 뉴클레산 양 (16.7%; Hp06, Hp07, Hp12, Hp20). 각 범주에 대해 표는 사례 수(n), 전체 표본 수 대비 비율(%), 및 각 범주 내 표본 번호를 나타낸다. 이 분류는 면역학적 방법과 분자학적 검출 방법 간의 일치 및 불일치를 보여주며, 불일치를 나타내는 범주는 항원 안정성, 세균 생존력 또는 DNA 복사 수 변이와 같은 요인을 반영할 수 있어 분석 검사 결과 해석에 유용한 통찰을 제공한다.
보충 테이블 1: 24개 샘플에 대한 항원 검출 및 디지털 PCR 정량의 통합 데이터 세트 헬리코박터 파일로리 분리주 시트 1 (항원 검출): 각 분리주에 대해 8종의 상용 콜로이드 골드 면역크로마토그래피 키트에서 얻은 키트별 종결점 역가 및 각 샘플의 최소, 중앙값, 최대 역가와 샘플 내 역가 범위(배수). 시트 2 (디지털 PCR 정량 검출): 각 분리주에 대한 플랫폼별 dPCR 농도(복제수/mL) 및 플랫폼 간 요약 통계치(로그 기준 중앙값, 최소값, 최대값, 변동계수%)₁₀- 변환된 농도). 시트 3 (상관 및 회귀 분석): 균주 수준 로그₂변형된 항원 타이터 및 로그₁₀변환된 dPCR 농도, 피어슨 상관 및 선형 회귀 결과(r, R)2, 회귀 방정식), 이상치 Hp06를 제외한 감수성 분석, 그리고 상세한 회귀 통계치(표준 오차, 95% 신뢰 구간, 잔차 표준 오차, F-통계량, 및 P-값). 키트 및 플랫폼 고유 식별자는 상업적 기밀을 위해 익명화되어 있으며, 데이터셋에는 그림 1을 재현하는 데 필요한 모든 값이 포함되어 있다.–2 및 표 3.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 테이블 2: 24종의 생존성 PCR 결과 헬리코박터 파일로리 분리주 생존성 시약의 개별 분리주별 dPCR 복제수–처리함 (+VR) 및 시약 생략함 (−VR) 56도에서 열불활성화한 후 알리코트 °25분 동안 C에서 반응 후, 계산된 생존 분율(%) 및 상당량 Δ각 분리주에 대한 Cq. 모든 분리주에서의 중간 생존 비율은 4.6%였다(범위 0.00%)–33.00%).이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
배양된 24종의 H. pylori 분리주를 대상으로 한 이번 연구에서, 면역크로마토그래피 항원 역가와 dPCR 게놈 복제 수는 중간 정도의 유의미한 양의 상관관계(r = 0.536, P = 0.007)를 보였습니다. 그러나 항원 역가는 dPCR 복제 수 분산의 29%만을 설명하였으므로(R2 = 0.287), 두 측정법은 서로 연관되어 있으나 대체 가능하지는 않습니다. 본 연구의 주요 한계점은 소규모 표본 크기(n = 24)이며, 이는 통계적 검정력을 제한하므로 아래에서 사용된 분류 임계값이 탐색적 성격을 띠게 된 원인이 됩니다.
본 연구에서는 H. pylori 배양액 내의 항원가와 dPCR로 검출된 핵산 복제 수를 정량적으로 분석하였으며, 이 두 방법의 검출 결과 사이에 중간 정도의 유의미한 상관관계(r = 0.536, P = 0.007)가 있음을 밝혀냈습니다. 인구 집단 수준에서는 두 방법 간에 유의미한 상관관계가 관찰되지만, 임상 실제에서는 개별 수준에서의 불일치가 빈번하게 발생합니다. 이는 서로 다른 검출 대상이 병원균의 서로 다른 생물학적 특성을 반영하기 때문입니다. 구체적으로, 항원 검사는 박테리아 제거 후에도 남아 있을 수 있는 단백질을 검출하는 반면, 핵산 검사는 생존 박테리아가 제거된 후에도 낮은 수준으로 지속될 수 있는 DNA를 검출합니다. 이러한 불일치는 다양한 감염성 질환에서 잘 문서화되어 있습니다. 예를 들어, Clostridioides difficile 감염의 임상 진단에서 일부 보균자는 독소 유전자 검출에서는 양성 반응을 보이지만 독소 단백질 항원 검출에서는 음성 반응을 보여, 감염자로 오진되어 과잉 치료 및 약제 내성 발생을 초래합니다. 따라서 미국감염학회(IDSA)12는 가이드라인에서 Clostridioides difficile에 대한 "독소 검출"과 "독소 유전자 검출"의 임상적 의미를 명확히 구분하였습니다. 핵산 검사만으로 감염을 진단하는 것은 불충분하며, 활성 독소 단백질을 직접 검출할 수 있는 방법을 채택할 것을 권장합니다. 또한, 항생제 치료 후의 지역사회 획득성 폐렴의 경우, 환자의 객담 내 박테리아 DNA 부하는 빠르게 감소하는 반면, 요중 항원은 회복 후에도 양성으로 유지되며 수 주에서 수 개월 동안 지속됩니다13. 유사한 현상이 H. pylori 감염의 진단 및 치료에서도 관찰됩니다. 2022년 Mayo Clinic Laboratories는 항생제 치료 후 추적 관찰 중인 223명의 환자를 평가한 결과, 분변 시료 내의 낮은 수준의 잔류 DNA를 검출하는 데 PCR이 상대적으로 민감하다는 점을 확인하였습니다. 일부 환자는 임상적으로 회복되고 항원 음성임에도 불구하고 수 주 동안 PCR 양성 결과가 지속되었습니다14. 이 모든 결과는 서로 다른 검출 대상의 생물학적 차이를 더욱 뒷받침합니다.
본 연구에서 면역크로마토그래피법으로 검출된 H. pylori 항원가와 dPCR 정량 값 사이의 정량적 상관관계 및 등가성을 확인한 것은 H. pylori 표준 물질의 특성화와 in vitro 진단 시약의 평가를 위한 실질적인 지침을 제공합니다. 1) 제품 성능 평가 모델의 고도화 촉진: 현재 H. pylori 항원 검출 시약의 임상 시험 평가는 조직학적 검사, 배양 또는 요소 호기 검사와 같은 임상 "골드 표준"과의 맹검 동시 비교 방식을 채택하고 있습니다15. 본 연구는 규제 기관이 심사 과정 중 신청 서류 제출 시 기업이 테스트 결과와 핵산 정량 방법 간의 관련 상관관계 데이터를 제공하도록 의무화하고, "불일치 결과 범위" 내에서의 제품 성능을 명확히 정의함으로써, 복잡한 임상 시나리오에서 제품의 검출 능력을 더욱 현실적으로 반영하고 시약의 LOD를 보다 포괄적으로 정의할 것을 제안합니다. 2) 이는 세균 표준 물질 지정의 새로운 접근 방식을 제공합니다. 품질 관리 및 교정용 표준 물질은 단일한 "CFU"에서 항원가와 핵산 복제 수를 포함하는 "다차원 특성 값"으로 전환될 수 있습니다8. 본 연구에서 확립된 회귀 모델은 이 두 값 사이의 관계에 대한 대략적인 크기(order of magnitude) 추정치를 제공할 수 있으며, 이는 표준 물질의 사용 및 실험실 간 비교를 위한 정량적 근거가 됩니다.
제조업체는 분석 단위(예: CFU/mL 또는 항원 역가)로 된 검출 한계(LOD)뿐만 아니라, 실험실 및 플랫폼 간에 결과를 비교하고 일치시킬 수 있도록 digital PCR(dPCR)로 결정한 게놈 복제수(genomic copies) 환산 수치를 함께 포함할 것을 권장합니다. 이러한 이중 단위 보고는 ISO 175118의 측정 소급성 요구 사항 및 CLSI EP17-A216의 검출 능력 평가 프레임워크와 일치합니다.
"저항원-고핵산" 샘플이 발생하는 잠재적 이유는 다음과 같습니다: 1) 균주의 유전적 변이: 항원 결정기의 아미노산이 교체되거나, 분비 단백질이 수송 및 분비 과정에서 차단되면 항원 검출에서 "회피" 현상이 나타날 수 있습니다17. 2) dPCR은 보존된 유전자 서열을 표적으로 하여 증폭하도록 설계되었습니다. 본 연구에서 dPCR이 표적으로 삼은 특정 유전자는 제조사의 문서에 공개되지 않았습니다. 그러나 상용 항원 검출 키트는 서로 다른 H. pylori 항원(예: VacA, urease, 편모 단백질 또는 전세포 항원)을 표적으로 삼을 수 있으며, dPCR 표적 유전자와 특정 키트가 인식하는 항원 사이의 불일치는 이진법적인 양성/음성 불일치보다는 산점도의 네 가지 사분면(고 dPCR/저항원, 저 dPCR/고항원, 고-고 일치 또는 저-저 일치)에 걸친 정량적 불일치로 나타날 수 있습니다18. 3) 검출 방법의 한계: 항원 검출 기술은 항원 농도가 극도로 낮거나 높을 때 제한을 받는데, 이는 항체와의 친화력 부족 또는 과포화로 인해 신호가 약해지기 때문이며, 샘플 매트릭스의 영향도 받습니다. 4) 검출 한계 성능의 비대칭성: dPCR의 검출 한계(LOD)는 10–100 copies/mL에 도달할 수 있는 반면, urease에 대한 콜로이드 면역크로마토그래피법의 검출 한계는 약 104–105 CFU/mL입니다. 박테리아 양이 임계값에 있을 때 "저항원-고핵산" 현상이 발생하기 쉽습니다. 5) 감염 상태가 임상 결과에 미치는 영향은 특히 세균성 감염과 바이러스성 감염을 구별할 때 상당합니다. 감염 과정에서 유전자 복제 수와 항원 발현 수준은 일정한 대응 관계를 보이지 않습니다. 성공적인 치료 후, 핵산 수치는 빠르게 감소할 수 있지만, 항원 제거는 일정 기간 지연될 수 있습니다19.
본 연구에 사용된 박테리아 현탁액은 위 생검 표본과 분변 샘플 모두에서 추출되었으며, 이는 서로 다른 간섭 프로파일을 가진 뚜렷한 매트릭스 환경을 나타냅니다. 위 생검 유래 분리주는 대개 대변 관련 PCR 억제제로부터 자유로우나, 표본 처리 과정에서 잔류 펩신에 노출될 수 있습니다. 반면, 분변 표본에는 증폭 효율을 감소시켜 dPCR 정량값을 저평가하게 만들 수 있는 PCR 억제제(예: 담즙산, 복합 다당류, 헤모글로빈 분해 산물)와 박테리아 DNA가 온전하더라도 표적 항원을 분해할 수 있는 장내 프로테아제가 포함되어 있습니다. 이러한 매트릭스 특이적 효과는 앞서 설명한 표적 영역 불일치 메커니즘과는 독립적으로 작용하며, 임상 표본 간의 정량적 불일치를 해석할 때 표본 유형에 맞는 준비 프로토콜과 방법 검증이 이루어져야 함을 시사합니다.
열 불활성화 후 생존 박테리아와 비생존 박테리아의 비율을 실험적으로 정량화하기 위해, 24종의 배양 분리주 모두에 대해 생존 PCR 시약 시스템을 이용한 생존 PCR을 수행하였다. 이 시약은 propidium monoazide (PMA)와 유사하게 작동하며, 막이 손상된 세포에 선택적으로 침투하여 게놈 DNA를 공유 결합으로 변형함으로써 이후의 증폭을 차단한다. 생존 박테리아의 비율은 다음과 같은 공식으로 계산하였다: 생존 % = (생존 시약(VR) 처리 후의 DNA copies/µL) / (VR 미처리 시의 DNA copies/µL) × 100. 모든 분리주에서 열 불활성화 후 생존 분율의 중앙값은 4.6% (범위: 0.00%–33.0%)였으며, 이는 56 °C에서 25분간 진행한 열 불활성화가 박테리아의 생존력을 급격히 감소시키지만 생존 유기체를 완전히 제거하지는 못함을 확인시켜 준다. 이러한 생존 데이터는 dPCR 수치는 높고 항원 역가는 낮은 불일치 프로파일이 온전한 생존 H. pylori보다는 주로 잔류 세포 외 DNA 및 비생존 박테리아 입자 내의 DNA에서 기인한다는 본 연구의 해석을 강력하게 뒷받침한다. 24개 균주 전체에 대한 상세한 생존 정량 결과는 Supplementary Table 2에 요약되어 있다.
본 연구에서 (탐색적이고 데이터 세트에 특이적인 임계값을 기반으로 한) 4분면 분류 결과, 8개 샘플은 고항원-저핵산 양상을 보였으며, 4개 샘플은 저항원-저핵산 범주에 속하였고, 이와 함께 9개는 고항원-고핵산, 3개는 저항원-고핵산의 일치 범주에 속하는 것으로 나타났습니다. 고항원-저핵산 샘플(n = 8)의 존재는 순수 배양에서도 항원 발현과 핵산 함량이 항상 일치하지는 않는다는 점을 시사합니다. 24개 분리주 모두 정지 성장기(72 h 배양; 프로토콜 섹션 1 참조)에 수확되었습니다. 정지기에는 DNA 복제가 대부분 중단되는 반면, 구조적 및 대사적 항원은 유지되거나 심지어 계속 축적될 수 있습니다. 이러한 성장 단계의 디커플링은 다수의 고항원-저핵산 군(n = 8)과 소수의 저항원-고핵산 군(n = 3) 사이의 비대칭성에 대한 타당한 생물학적 근거를 제공하지만, 이것만으로 항원 발현의 균주 간 차이나 열 불활성화 과정 중의 부분적 용해와 같은 다른 메커니즘을 배제할 수는 없습니다. 저항원-고핵산 샘플(n = 3)의 존재는 낮은 항원 역가가 반드시 낮은 핵산 부하로 이어지지는 않는다는 것을 확인해주며, 이는 특정 시나리오에서 핵산 검사가 항원 검사를 보완한다는 것을 보여줍니다. 이러한 임계값은 탐색적이며 데이터 세트에 특이적인 것으로, 검증된 임상 진단 기준을 나타내지는 않습니다.
본 연구는 소규모 표본 크기(n = 24)로 인해 제한점이 있으며, 이로 인해 견고한 하위 그룹 분석을 뒷받침할 통계적 검정력이 부족합니다. 표본이 6개의 타이터 그룹으로 나뉘어 각 그룹당 평균 4개의 표본만 포함되었으므로, 공식적인 그룹 간 비교를 통해 의미 있는 차이를 검출하기에는 통계적 검정력이 충분하지 않습니다. 따라서 검정력이 부족한 상태에서 추론 통계 결과를 제시하는 것을 방지하기 위해 Kruskal-Wallis 검정을 적용하지 않았습니다. 또한, 모든 표본은 배양 분리물이었으며 위점막, 분변 또는 타액과 같은 임상 표본에서 발견되는 더 복잡한 매트릭스 효과를 반영하지 못했습니다.
공개 사항
저자들은 공개할 사항이 없습니다.
본 원고의 작성, 편집, 통계 분석, 코드 개발 또는 도표 작성 과정에서 AI 도구는 사용되지 않았습니다.
저자 기여도:
모든 저자는 본 연구에 대한 각자의 기여도를 확인하였습니다. 개별 저자의 역할은 다음과 같습니다. 모든 저자는 최종 제출된 원고를 읽고 승인하였으며, 연구 데이터의 정확성과 무결성에 대해 전적인 책임을 집니다. Wenwen Sun: 조사, 데이터 큐레이션, 정식 분석, 방법론, 초안 작성, 연구비 수집; Xiaona Han: 조사, 방법론; Jin Zhang: 조사, 방법론; Xinxin Duan: 조사, 방법론; Tingting Li: 개념화, 감독; Manyu Li: 개념화, 감독, 검토 및 편집 작성; Haiwei Zhou: 개념화, 감독, 검토 및 편집 작성.
감사의 글
본 연구는 국립약물관리국(NIDC)의 청소년 발달 연구 재단(지원 번호 2025C5)의 지원을 받았습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2X dPCR Probe Master Mix Plus (Rox) | Sniper | RT021096A | 디지털 PCR 정량 검출 시약 |
| 박테리아 게놈 DNA 추출 키트 | Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd. | Y2213/DP302-02 | 박테리아 핵산 추출 |
| Bio-Rad QX200 Droplet Digital PCR 시스템 | Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd. | QX200 | 디지털 PCR 정량 검출 |
| 디지털 PCR 통합 장비 | Sniper | DQ24 | 디지털 PCR 정량 검출 |
| 디지털 PCR 통합 장비 | Ustar Biotechnologies (Hangzhou) Ltd. | DQ24 | 디지털 PCR 정량 검출 |
| 디지털 항온수조 | Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | DK-8D | 56 °C에서 박테리아 현탁액의 열 불활성화 |
| 정방향 프라이머 | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | 디지털 PCR 핵산 증폭 |
| 위 Helicobacter pylori 항원 검출 키트 (콜로이달 금법) | Shanghai Chemtron Biotech Co., Ltd. | B202301020 | H. pylori 항원 검출 |
| Helicobacter pylori 한천 배지 (고체) | Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd. | HB8647 | H. pylori 배양 배지 |
| Helicobacter pylori 항원 검출 키트 (콜로이달 금법) | Bioneovan Co., Ltd. | 202403001 | H. pylori 항원 검출 |
| Helicobacter pylori 항원 검출 키트 (콜로이달 금법) | Jiangsu Mole Bioscience Co., Ltd. | 20240310 | H. pylori 항원 검출 |
| Helicobacter pylori 항원 검출 키트 (콜로이달 금법) | Hangzhou Genesis Biodetection & Biocontrol Ltd. | GG230601021 | H. pylori 항원 검출 |
| Helicobacter pylori 항원 검출 키트 (콜로이달 금법) | Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd. | 28223 | H. pylori 항원 검출 |
| Helicobacter pylori 항원 검출 키트 (콜로이달 금법) | Beijing Core Technology Co., Ltd. | 2415810 | H. pylori 항원 검출 |
| Helicobacter pylori 항원 검출 시약 (면역크로마토그래피법) | Guangzhou Wondfo Biotech Co., Ltd. | W028402001 | H. pylori 항원 검출 |
| Helicobacter pylori 항원 검출 시약 (라텍스법) | ABON Biopharm (Hangzhou) Co., Ltd. | 0000805308 | H. pylori 항원 검출 |
| Heracell Tri-Gas 배양기 | Thermo Fisher Scientific | N/A | 미호기성 배양; 가스 조성: 5% O2, 10% CO2, 85% N2 |
| 마이크로 원심분리 튜브 (1.5 mL / 2 mL) | Axygen Scientific Inc. | MCT-150-C / MCT-200-C | 시료 희석 및 핵산 추출 |
| 핵산 추출 또는 정제 시약 | Jiangsu Bioperfectus Technologies Co., Ltd. | SDK60105 | 박테리아 핵산 추출 |
| 핵산 추출 시약 | TargetingOne | Pathogens TNA-B1 (11019) | 박테리아 핵산 추출 |
| PBS, 1X (pH 7.2-7.4, 0.01 M, 세포 배양용) | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | P1020 | 시료 희석 |
| 페트리 접시 (90 mm) | Beekman Biotech | N/A | 박테리아 분리 및 계대 배양용 멸균 배양 접시 |
| 피펫 팁 (10 uL / 200 uL / 1000 uL) | Axygen Scientific Inc. | T-300 / T-200-Y / T-1000-B | 시료 희석 및 시약 분주용 멸균 필터 팁 |
| 프로브 | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | 디지털 PCR 핵산 증폭 |
| 역방향 프라이머 | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | 디지털 PCR 핵산 증폭 |
| SPSSPRO 온라인 통계 분석 플랫폼 | SPSSPRO | 웹 기반 (https://www.spsspro.com/; 2026년 8월 접속) | 통계 분석: 피어슨 상관 분석, 선형 회귀 분석 |
| 멸균 탈피브린 양 혈액 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | TX0030-100 mL | H. pylori 배양 접시용 보충제 |
| TD-1 디지털 PCR 시스템 | TargetingOne | TD-1 | 디지털 PCR 정량 검출 |
| 생존력 PCR 시약 시스템 | Promega | A8881 | 열 불활성화된 H. pylori의 생존력 PCR 평가 |
| 볼텍스 믹서 | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | 박테리아 현탁액의 균질화 |
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