수축 활동의 시험 관 약리학적 평가를 위한 분리된 토끼 십이지장 평활근의 표준화 준비

요약

여기서는 수평 일정 온도 평활근 실험 시스템을 활용하여 수축 활동의 실시간 데이터 기록을 위한 시험관 내 약리학적 평가를 위한 토끼 십이지장 평활근 준비 프로토콜을 제시합니다.

초록

위장관 평활근의 협동 수축 활동은 정상적인 소화, 흡수 및 수송 기능을 유지하는 생리학적 기초를 형성하며, 이 기능 장애는 운동성 장애와 밀접하게 연관되어 있습니다. 분리된 장기 관류 기법은 신경, 내분비, 혈역학 요인과 같은 복잡한 생체 내 간관을 제거하여 약리학 연구의 고전적 모델로 활용됩니다. 이를 위해 본 연구는 토끼 분리 십이지장 평활근의 표준화된 준비 프로토콜을 상세히 설명합니다. 절차 과정은 용액 준비, 토끼 안락사, 신속한 조직 절제를 위한 정밀 무균 복부 복부 개강술, 평활근 스트립 부정, 실시간 긴장 기록을 위한 트랜스듀서 보정 등 중요한 단계를 강조합니다. 이 기술 플랫폼을 바탕으로 우리는 화향정기(HXZQ-OL)가 자발적 수축과 아세틸콜린/염화물에 의한 파상병에 미치는 효과를 평가하여 방법을 더욱 검증하였습니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 위장관 운동성을 표적으로 하는 치료제의 약리학적 평가를 위한 폭넓게 적용 가능한 시험관 내 스크리닝 플랫폼을 제공하는 견고하고 재현성이 높은 방법론적 틀을 제공합니다.

서론

위장관 평활근의 협동 수축 활동은 정상적인 소화, 흡수, 수^{송 기능을 유지하는} 생리학적 기초 역할을 합니다. 이 질환의 기능 장애는 과민성 대장 증후군², 기능성 소화불량³, 수술 후 위장 운동성 장애⁴ 등 다양한 흔한 임상 질환과 밀접하게 연관되어 있습니다. 평활근 활동을 조절하는 분자적·약리학적 기전을 밝히는 것은 새로운 운동성 또는 항경련 치료 개발에 매우 중요합니다. 이 연구 분야에서 분리된 장기 관류 기법이 고전적인 모델로 작용합니다. 신경, 내분비, 혈역학 요인과 같은 복잡한 생체 내 간관을 제거함으로써 약물이나 활성 물질이 평활근 긴장도에 미치는 영향을 직접적이고 정밀하게 평가할 수 있게 하여 실용적 가치를 제공합니다 ^5,6.

시험관 내 조직 준비 및 데이터 기록을 위한 안정적이고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 확립하는 것은 재현 가능하고 고품질의 결과를 얻는 데 필수적입니다. 기존의 시험관 내 장근육 실험 방법은 실험동물의 표준화된 관리, 조직 채취를 위한 세밀한 외과 기법, 관류 시스템의 일관된 환경 제어, 자동화된 데이터 수집과 표준화된 분석의 결합 등 여러 분야에서 추가적인 최적화와 표준화가 필요합니다. 예를 들어, 관류액 온도와 pH 수준, 조직 채취 중 기계적 손상, 조직 사전 부하 설정은 모두 조직 생존력에 큰 영향을 미치고 실험적 오류를 초래할 수 있습니다. 이러한 요인들은 결과의 신뢰성을 저하시키고 서로 다른 연구 간 비교 가능성을 저해합니다 ^7,8.

따라서 본 연구는 토끼로부터 분리된 십이지장 평활근 표본을 준비하고 실시간 장력 기록을 수행하는 표준화된 프로토콜을 확립하고 발전시키는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 실험동물 윤리 및 복지, 무균 복리 절개술, 정밀한 장 구간 분리부터 환경 제어, 표준화된 장력 전부하 설정, 통합 수평 상온 관류 시스템과 다중 채널 생리학적 신호 획득 시스템을 통한 고충실도 데이터 수집에 이르기까지 전체 과정을 체계적으로 설명합니다. 이 표준화된 기술 플랫폼을 바탕으로, 우리는 누적 투여 방식을 적용하여 중국 약전(2025년^판)의 품질 기준을 충족하는 화상정기액(HXZQ-OL)의 효과를 정량적으로 평가하였으며, 이는 고립된 십이지장 평활근에서 자발적 수축과 아세틸콜린 및 바륨 염화로 인한 파상막 수축에 미치는 영향을 평가하였습니다. 화향정기 경구용액(HXZQ-OL)은 고전적인 화상 정기 전통 중의학 공식의 경구 제약으로, 중국에서 위장 질환 치료에 널리 사용되며, 고립된 장 평활근에 미치는 직접적인 효과를 평가하는 근거가 됩니다. 이 연구는 HXZQ-OL의 위장관 평활근 조절 효과를 설명하는 직접적인 실험적 약리학적 증거를 제공할 뿐만 아니라, 실험 프로토콜은 위장관 평활근의 약리학적 스크리닝 및 시험관 내 조직 연구를 위한 표준화되고 재현 가능한 방법론 모델 역할도 합니다.

프로토콜

이 연구에는 건강한 성체 뉴질랜드 백토끼(2.0–2.5kg)를 사용했습니다. 모든 동물 실험 절차는 실험동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며, 청두 중의학대학교 실험동물윤리위원회(승인 번호: [2026070])의 승인을 받았습니다. 동물의 고통을 최소화하고 사용되는 동물 수를 줄이기 위한 모든 노력이 이루어졌습니다. 워크플로우 다이어그램은 그림 1에 나와 있습니다.

1. 용액 준비

참고: 타이로드 용액, 아세틸콜린(ACh), 염화바륨, 아트로핀, 베라파밀을 포함한 모든 작동 용액은 실험 직전에 신선하게 준비해야 합니다.

1. 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 0.4 mM NaH₂PO₄, 1.0 mM MgCl₂, 12 mM NaHCO₃, 5.6 mM D-포도당을 용해하여 타이로드 용액 1L 준비합니다. 사용 전에 95% O₂ / 5% CO₂ 혼합물로 15–30분간 포화시키고, pH를 7.3–7.4로 조절합니다(재료표 참조).
2. 1 mM ACh 정액을 준비하세요. 20 μL 용액을 20 mL에 추가하세요. 충분히 혼합하여 1 μM ACh 용액을 얻습니다.
3. 1M 바륨 클로라이드(BaCl₂) 스톡 용액을 준비합니다. 20 μL를 20 mL의 타이로드 용액에 추가하세요. 충분히 혼합하여 1 mM BaCl₂ 용액을 얻습니다.
   참고: BaCl₂는 매우 독성이 강하고 자극적입니다. 취급 시 배기구 후드에서 개인 보호 장비를 착용하고 폐기물을 규정에 따라 처리하십시오.
4. 10 mM 아트로핀 황산염 스톡 용액을 준비하세요. 20 μL를 20 mL의 타이로드 용액에 추가하세요. 충분히 혼합하여 10 μM 아트로핀 황산염 용액을 얻습니다.
5. 1 mM 베라파밀 염산 용액을 준비합니다. 2 μL을 20 mL의 타이로드 용액에 추가하세요. 0.1 μM 베라파밀 하이드로클로라이드 용액을 얻기 위해 충분히 혼합합니다.
   참고: 준비된 용액의 농도는 이전 연구^{6, 10, 11}을 참고하여 결정되었으며, 예비 실험을 통해 최적의 실험 조건을 확보하기 위해 추가로 최적화되었습니다.

2. 시험관 내 토끼 십이지장 평활근 표본 준비

1. 토끼 안락사
   1. 토끼를 토끼 구속 장치에 고정하세요(그림 2A, B, 그림 3A). 토끼의 이방정맥을 통해 펜토바르비탈나트륨(120mg/kg)을 과다 투여하여 안락사를 시행합니다(그림 2C 및 그림 3B).
      참고: 완전 사망은 다음 기준으로 확인해야 합니다: 동공 확장, 동공 광반사 부재, 호흡 및 심장 박동 중단, 족저 반사 상실.
2. 수술 부위의 준비 및 소독
   1. 토끼를 수술대 위에 누운 상태로 고정하세요 (그림 2D 및 그림 3C). 수술용 가위 (그림 2E) 나 전기 면도기를 사용해 복부의 모든 털을 철저히 제거하여 수술 부위의 피부를 노출시킵니다 (그림 3D).
   2. 스펀지 겸자(그림 2E)를 사용해 요오드에 적신 면봉을 잡으세요(그림 2F,G). 계획된 수술 절개 부위 중심부에서 시작하여 안쪽에서 원형으로 소독액을 바릅니다(그림 3E).
      참고: 소독 부위는 절개 가장자리를 넘어 수술 현장 피부 전체를 완전히 덮어야 합니다. 소독 후에는 최소 3분간 기다려 소독제가 피부 표면에서 자연스럽게 마를 때까지 기다려 주세요.
   3. 소독된 복부 부위에 멸균 드레이프(그림 2H)를 덮어 수술 부위를 노출시키세요(그림 3F).
3. 복부 절개 위치 및 절개
   1. 메스(칼날 #23 )(그림 2E)를 사용해 흉골 접기 아래에서 치골 결합 위쪽까지 복부 중앙선을 따라 8cm 길이의 종방향 절개를 합니다.
   2. 피부와 피하 조직을 층층이 하나씩 해부하세요. 백선을 따라 복직근의 전방 칼집, 근섬유, 복막을 층별로 해리하여 복강으로 들어가세요(그림 3G).
   3. 참고: 시술 중에는 복부 장기를 손상시키지 않으면서 수술 부위와 복부 장기의 혈액 오염을 방지하기 위해 지혈을 반드시 하세요.
4. 십이지장 분리
   1. 절개 부위를 따라 복강을 열어주세요(그림 3H). 젖은 식염수 거즈(그림 2I)를 사용해 간엽 두부를 부드럽게 젖혀 위와 십이지장을 완전히 노출시킵니다(그림 3I).
   2. 십이지장의 초기 구간(구형, 상부 하강부)을 유문에서 2–3cm 떨어진 곳을 조직 채취 부위로 선택하세요.
   3. 참고: 기계적 손상을 최소화하기 위해 가능한 한 목표 장 구간을 직접 견인하거나 클램프로 고정하는 것을 피하십시오. 대신 둔탁한 겸자를 사용해 인접한 장간막을 부드럽게 잡거나, 식염수에 젖은 면봉으로 조직을 섬세하게 조작하고 위치를 잡으세요.
   4. 멸균 안과 가위(그림 2E)를 사용하여 십이지장관의 1–2cm 구간(그림 2J)을 빠르고 정확하게 절제합니다(그림 3J,K).
   5. 즉시 절제된 장 구간을 미리 냉각된(4°C) 타이로드 용액이 혼합된 가스(95% O₂ / 5% CO₂)로 지속적으로 주입한 배양 접시(그림 2K)로 옮깁니다.
5. 장 구간 절단, 세척 및 임시 보관
   1. 안과 겸자 (그림 2E)를 사용하여 장벽에 부착하는 장간막과 주변 지방 조직을 부드럽게 해리합니다.
   2. 차가운 타이로드 용액이 채워진 주사기(무딘 끝 바늘이 장착됨)(그림 2L)를 사용해 관장액을 부드럽게 장강에 주입합니다. 장 내부를 2–3번 천천히 세척하여 내용물을 완전히 깨끗이 제거하세요.
   3. 깨끗한 장 구간을 신선한 산소가 포함된 차가운 타이로드 용액에 담가, 이후 실험 때까지 임시 보관하세요.

3. 수평 일정 온도 평활근 실험 시스템 시작 및 용액 주입

1. 타이로드의 해를 DSQG-1 수평 상온 평활근 실험 시스템의 예열 접시에 추가하세요(그림 4B; 재료표 참조).
2. 시스템 전원을 켜고, 작동 패널을 터치해 욕조 온도를 37 °C로 설정한 후 예열을 시작합니다(그림 4C).
3. 인퓨전 버튼을 누르면 시스템이 자동으로 20mL의 타이로드 용액을 욕조 탱크에 분배합니다.
4. 배수 버튼을 눌러 액체를 완전히 폐기물 수거 용기로 배출하세요.
5. 헹구기 버튼을 누르면, 시스템이 먼저 내용물을 빼내고 다시 액체를 채우는 과정을 자동으로 완료합니다.
6. 중단 버튼을 눌러 즉시 모든 주입, 배액, 세척 과정을 종료하세요.
7. 인플레이션 버튼을 눌러 혼합된 가스(95% O₂ / 5% CO₂)를 욕조에 지속적으로 주입합니다. 가스 유속을 5단계로 조정하여 이후 실험 조직의 산소 공급을 보장하세요.
   참고: 스케일 5는 가스 유량이 100 mL/분임을 나타냅니다. 지나치게 높은 가스 유량은 용액 난류를 증가시켜 장력 기록의 안정성에 영향을 줄 수 있습니다.

4. 다채널 생리학 기록 및 처리 시스템을 소프트웨어 작동과 연결

1. 수평 상온 평활근 실험 시스템 트랜스듀서의 데이터 케이블을 다중 채널 생리 기록 및 처리 시스템의 채널 1에 연결하세요(그림 4D).
2. 다중 채널 생리 기록 및 처리 시스템의 외부 전원 공급 장치를 켜고 컴퓨터를 켭니다. 데스크톱에서 RM6240XC 다중 채널 생리 기록 및 처리 시스템 아이콘을 더블 클릭하면 실험 소프트웨어 시스템을 실행하세요(재료표 참조).
3. 메뉴 바에서 실험 | 소화 | 해당 실험 모듈에 로드를 위한 장 평활근의 생리학적 특성 .
4. 다음 매개변수를 설정하세요: 채널 모드는 텐션으로, 샘플링 주파수는 400 Hz로, 감도는 1.5g, 시간 상수는 DC로, 필터 주파수는 30 Hz로 설정하세요.
5. 소프트웨어 인터페이스 오른쪽 상단의 시작 버튼을 클릭하면 실시간 신호 획득 및 표시가 시작됩니다. 녹화 버튼을 클릭하면 동시에 오실로스코프를 표시하고 획득한 신호를 실시간으로 하드 드라이브에 저장할 수 있습니다.
6. 메뉴 바에서 실험 | 긴장 신호를 기준선 수준으로 조정하기 위해 빠른 제로닝을 합니다.
   참고: 신호가 기준선에서 수직 좌표 단위 이상으로 벗어나면, 드라이버를 사용해 텐션 트랜스듀서의 제로 포인트를 수동으로 조정하세요.
7. 메뉴 바에서 실험 | 실시간 데이터 표시 방법 | 떠다니는 판. 나타나는 대화상자에서 '정상 실시간 측정-Fast'를 선택하여 플로팅 창에서 장 근육의 실시간 장력 데이터를 표시합니다.

5. 십이지장 근육 스트립의 현각 및 장력 전부하 설정

1. 십이지장 근육 스트립의 길이에 따라 수평 나사 노브를 회전시켜 조직 후크의 앞뒤 간격을 조절하여 스트립 길이와 일치하도록 하세요.
2. 장 구간을 자연스러운 원통형 상태로 유지하고, 시선을 장 내강의 원형 단면 개구부와 일치시킵니다.
3. 안과 겸자를 사용해 장 개구부를 부드럽게 당겨 개폐를 유지하세요.
4. 조직 훅 끝을 부드럽게 장 내강에 삽입하세요.
5. 장 경계에서 2–3mm 떨어진 곳에서 조직 훅 끝을 이용해 윗 단층 장벽을 안쪽에서 바깥쪽으로 찌릅니다.
   참고: 조직 훅은 근육층을 뚫고 고정해야 하며, 혈관층에 표면적으로만 부착되지 않도록 해야 합니다. 이는 프리로드 시 훅이 장벽을 기계적 절단과 찢어버리는 것을 방지하기 위함입니다.
6. 장벽의 다른 쪽은 첫 번째 면과 동일합니다. 평행한 해당 지점을 확인한 후, 그 지점의 단일층 장벽만 관통합니다(그림 3L).
7. 수평 나사 노브를 다시 돌려 후크 간격을 조절하여 십이지장 근육 스트립이 자연스럽게 이완되도록 하세요.
8. 십이지장 근육 스트립의 평균 장력이 0.8 ± 0.1g으로 안정될 때까지 1차원 미세 조절기를 점차 조절하여 장력을 가합니다(그림 4A).
   참고: 장 전체 길이를 시각적으로 점검하여 비틀림, 회전, 나선형 접힘이 없고 곧고 원통형인지 확인하세요. 만약 그렇지 않다면, 즉시 장력을 줄이고 한쪽 끝의 장착 지점을 다시 조정하세요.
9. 실험을 시작하기 전에 십이지장 근육 스트립을 관류실에서 60분간 평형으로 유지하세요. 이 평형 기간 동안, 타이로드의 용액을 15–20분마다 새로운 완충제로 교체하여 자발적 수축성 리듬이 안정될 때까지 유지합니다.
   참고: 60분간의 평형 기간은 고립된 장 구간이 최소 15분 연속 안정된 자발적 수축 활동을 보일 때에만 완료된 것으로 간주되었습니다. 안정화의 객관적 기준은 다음과 같이 정량적으로 정의되었습니다: (1) < ±5%의 기초 안정 긴장 드리프트, (2) 연속된 5분 간격 간 평균 수축 진폭 분산 < ±10%, (3) 분당 1사이클 < ± 빈도 변동.
10. 십이지장 근육 스트립의 자발적 수축 활동 곡선을 후속 실험의 기준 참고 데이터로 기록하세요.

6. 실험적 데이터 수집

1. 진행 중인 실험을 원하시면, 메뉴 바에서 도구 | 캡처된 파형 데이터에 대한 실시간 통계 분석을 수행하기 위한 분할 뷰.
2. 저장된 데이터 파일은 툴바의 열기 버튼을 클릭하고, .lsd 확장자로 저장된 데이터 파일을 선택한 후 과거 실험 기록을 불러오세요.
3. 툴바에서 측정 아이콘을 클릭하고 지역 모드를 선택하세요. 마우스 커서를 파형 영역 위로 이동시키고, 왼쪽 버튼을 누르고 있으면 임의의 두 지점을 선택하면 해당 세그먼트 내 평균 장력 값을 보여주는 데이터 패널이 표시됩니다.
4. 툴바에서 측정 아이콘을 클릭하고, Period 모드를 선택하세요. 왼쪽 마우스 버튼을 사용해 파형을 따라 연속된 다섯 개의 뚜렷한 파동 피크(피크 포인트)를 클릭하세요. 마우스를 우클릭하면 데이터 패널이 수축 주파수(bpm 단위)를 계산하고 표시합니다 (보충 그림 S1).

결과

이 실험 프로토콜은 분리된 토끼 십이지장 근육 스트립의 표준화된 준비 방법과 분리된 장기 관류 시스템을 이용해 실시간으로 동적 장력 및 주파수 변화를 기록하는 과정을 설명합니다. 이 프로토콜에 따라 HXZQ-OL은 누적 투여를 통해 순차적으로 20 mL 타이로드 용액 배스에 첨가되어 최종 부피 농도는 10, 20, 30, 40, 50 μL/mL로 달성되었습니다. 중국 약전(2025년판) 기준을 참고하면, 이 농도는 각각 조약 조각 6.6, 13.2, 19.8, 26.4, 33.0 mg/mL에 해당합니다. 최고 HXZQ-OL 농도(33.0 mg/mL)에서 타이로드 용액의 pH(7.37 ± 0.08)와 삼투압(297 ± 4 mOsm/L)은 대조군 타이로드 용액(pH 7.38 ± 0.05; 삼투구 295 ± 3 mOsm/L; n = 3 독립 준비물)과 유사했다; P > 0.05, 학생 t-검정). 이 결과는 농도에 따른 수축 장력 감소가 비특이적 pH 또는 삼투압 변화 때문이 아님을 나타냅니다(

토론

분리된 장기 관류 및 긴장 기록 기법은 평활근 생리학과 약리학을 연구하는 고전적인 방법입니다. 그들의 발견은 위장 운동 장애, 혈관 질환, 자궁 기능 장애의 병태생리학적 기전을 밝히는 데 중요한 의미를 지닙니다 12,13,14,15. 표준화된 토끼 체외 십이지장 모델을 사용하여 HXZQ-OL이 장 평활근의 농도 의존적 이완을 유도함을 입증했습니다. HXZQ-OL이 아세틸콜린과 바륨 염화로 인한 수축을 모두 감소시켰기 때문에, 이 결과는 콜린성 및 칼슘 의존성 수축 반응 억제와 일치합니다 16,17,18....

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5-10 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101004
10 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-10
10 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043804
100 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043807
100-1000 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101014
1250 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-1250
20 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-010105
200 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-200
50 mL Conical centrifuge tube	LABSELECT	CT-002-50A
5-50 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101006
Acetylcholine chloride	Supelco	PHR1546
All-in-One Lab Computer	Lenovo	R5-3500U
Atropine sulfate	Macklin	A822893
Barium chloride	Sigma-Aldrich	342920
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	499609
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
Freezing point osmometer	Shanghai Precision Instruments Co., Ltd.	BS100
Horizontal Constant-Temperature Smooth Muscle Experiment System	Chengdu Instrument Factory	DSQG-1
Huoxiang Zhengqi Oral Liquid	Taiji Group Co., Ltd.	Z50020409
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Multi-Channel Physiological Recording and Processing System	Chengdu Instrument Factory	RM6240XC
New Zealand White rabbits	Pizhou Dongfang Breeding Co., Ltd. (License No.: SCXK[Su]2022-0004)	either sex (weighing 2.0–2.5 kg)
pH meter	Shanghai Leici	PHS-25
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Povidone-iodine	H&H Medical Co., Ltd.	3180132
Precision balance (0.1 mg)	Sartorius	BCE64i
Saline solution	H&H Medical Co., Ltd.	100014438029
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium dihydrogen phosphate	Supelco	1063700250
Sodium Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Verapamil Hydrochloride	Macklin	V820460
Vortex mixer	Kylin-Bell	XW-80A

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