미세조류 오일은 고지방 식이 유도 마우스 모델에서 간 지질 대사를 개선하다

요약

대사 기능 장애 관련 스테어토틱 간 질환의 고지방 식이 유도 마우스 모델을 사용하여 본 연구는 도코사헥사엔산(DHA) 풍부한 미세조류 오일 보충의 효과를 평가하고, 이 개입이 간 지질 프로필을 개선하고 장내 미생물 구성 변화와 연관됨을 보여줍니다.

초록

대사적으로, 기능 장애성 스테어토틱 간 질환은 장내 미생물군 불균형과 간 지질 불균형과 관련된 흔한 대사 질환입니다. 본 연구에서는 DHA가 풍부한 미세조류 오일 보충의 효과를 평가하기 위해 고지방 식이 유도 마우스 모델을 구축하였습니다. 쥐(n=그룹당 4마리)는 8주간 고지방 식단을 먹이고 매일 미세조류 오일, 프로바이오틱스 또는 DHA가 풍부한 미세조류 오일과 프로바이오틱스의 조합을 경구 투여했습니다. 대사 지표, 장내 미생물군 구성(16S rRNA 시퀀싱), 미생물 기능 경로, 간 대사 프로필을 평가하였습니다. 결과는 DHA가 풍부한 미세조류 오일이 혈청 LDL-c 및 간 중성지방 감소와 고밀도 지단백(HDL-c) 증가로 나타나는 지질 항상성을 개선하며, 간 손상 및 산화 스트레스 완화와 연관됨을 보여주었습니다. 마이크로바이옴 분석 결과, 장내 미생물 구성에 선택적 변화가 나타나며, 락토바실러스 와 비피도박테리움 의 농축과 클로스트리듐 , 루미노코커스와 같은 고지방 식이 관련 분류군의 감소가 관찰되었습니다. 기능적 프로파일링 결과, L-메티오닌 회수 주기와 페닐에틸아민 분해를 포함한 미생물 대사 경로의 변화가 확인되었습니다. 통합 마이크로바이옴-대사체 분석을 통해 미생물 분류군과 지방산 대사, 담즙산 교체, 아미노산 경로에 관여하는 간 대사산물 간의 연관성이 추가로 밝혀졌습니다. 이 결과들은 DHA가 풍부한 미세조류 오일 보충이 이 모델에서 간지질 대사 및 장내 미생물군 구성 개선과 연관되어 있음을 시사하지만, 직접적인 인과적 기전을 암시하지는 않습니다.

서론

대사 기능 장애 관련 스테아토성 간 질환(MASLD)은 전 세계 인구의 약 32.4%에 영향을 미치는 매우 흔한 전 세계 질환입니다^. MASLD는 간 내 과도한 지방으로 정의되며, 이는 다양한 관련 건강 문제에 기여합니다. 인간의 소화관에는 박테리아, 바이러스, 곰팡이, 기^{생충 등} 정교하고 균형 잡힌 미생물 군집이 존재합니다. 이 미생물 군집과 간 간의 상호작용으로 인해, 프로바이오틱스는 이^{중요한 연결을 조절}하여 MASLD를 예방하고 치료하는 유망한 방법으로 여겨집니다. 최근 연구들은 프로바이오틱스가 장내 미생물군을 조절하고 염증을 줄여 MASLD에 긍정적인 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 구체적으로, 프로바이오틱스 투여는 장내 미생물군의 균형을 회복하고 간 염증을 줄이는 것으로 나타났습니다. 더불어, 특히 담즙산 대사를 촉진할 수 있는 프로바이오틱스는 간지방간(지방간)을 완화하고 MASLD ^5,6 환자들의 전반적인 대사 건강을 지원하는 것으로 입증되었습니다. 더욱이, 강력한 근거는 MASLD 환자들이 장내 환경에 유의미한 변화를 보이는 것으로 나타났으며, 이를 불균형(dysbiosis)이라고 합니다 ^7,8. 중요한 발견 중 하나는 알파 다양성 감소로, 이는 미생물 종의 총 수와 다양성이 감소한다는 의미입니다. 더불어, MASLD 환자의 장내 미생물군은 종종 Firmicutes 9^{, 10, 11} 박테리아문 우성으로 특징지어집니다. MASLD 환자는 일반적으로 포화지방 섭취가 많고 필수 미량 영양소 섭취가 적은 식습관을 보입니다^12,13. 이러한 건강하지 않은 식습관은 도시 인구에서 자주 관찰되며, 농촌 지역에 거주하는 사람들과 비교했을 때 Firmicutes와 Bacteroidetes의 비율이 더 높다는 상관관계가 있습니다¹⁴. 더불어, 고지방 식단은 더 심각한 장 불균형을 유발하는 데 직접적으로 연관되어 있습니다. 특히, 동물 모델 연구와 진행성 간 질환 환자 MASLD 연구 모두 고지방 섭취가 장 내 바이러스 변형과 연관됨을 보여주었습니다. 이러한 변화에는 용해성 파지 활성의 증가가 포함되었으며, 이는 기존의 장내 불균형을 악화시켰다^15,16.

오메가-3 다중불포화지방산(PUFA)은 어유에 흔히 포함되어 있어 지질 대사를 개선하고 장내 미생물군을 조절할 수 있습니다. 미세조류 오일은 오메가-3 PUFA의 유망하고 지속 가능한 공급원으로 떠올랐습니다. 구체적으로, Schizochytrium 미세조류 오일은 순수 도코사헥사엔산(DHA)이 높은 농도를 함유하고 있어 상업적으로 유망한 공급원입니다. 이 그룹의 이전 연구들은 고지방 식단(HFD) 유도 비만 마우스 모델에서 미세조류 오일의 체중 감량 촉진 효과가 생선 기름과 체중 감량 약물 오를리스타트와 유사하다고 보고했습니다. 중요한 점은, 미세조류 오일이 어유나 Orlistat¹⁷보다 더 먼저 이러한 체중 감량 효과를 보였다는 것입니다. 이전 연구 결과는 미세조류 오일이 상업용 어유와 올리스타트와 비교해 장내 미생물군에 뚜렷하고 유익한 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 미세조류 오일은 전체 박테리아 다양성에 현저한 변화를 주지 않았지만, 유익한 단쇄 지방산(SCFA) 생성 박테리아의 풍부도 증가와 비만과 관련된 Desulfovibrio 속을 포함한 병원성 분류군의 감소와 관련이 있었습니다. 더 나아가, 미세조류 오일은 장내 미생물군의 대사 능력을 놀라울 정도로 회복시켜 아미노산, SCFA, 담즙산 대사 경로 개선과 지지다당류(LPS) 생합성을 크게 감소시켰습니다. 이러한 조절은 지질 대사 개선과 대장 점막 장벽 강화에 기여한 것으로 보이며, 미세조류 오일이 비만 완화에 더 우수한 영양 보충제임을 시사한다¹⁷.

장내 미생물군 이질이 MASLD 발병과 연관성이 진전이 있었음에도 불구하고, 미생물 구성, 미생물 대사 기능, 간 지질 대사 간의 구체적 관계는 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 특히 미생물군 변화와 질병 진행 간의 인과관계는 명확하지 않으며, DHA가 풍부한 미세조류 오일과 같은 식이 개입이 장내 미생물 군집과 숙주 대사 프로필의 조정된 변화와 연관되어 있는지는 체계적으로 조사되지 않았습니다. DHA가 풍부한 미세조류 오일은 지속 가능하고 효율적인 오메가-3 지방산의 공급원으로, DHA가 풍부한 미세조류 오일 함량은 어류 유래 보충제와 견줄 만합니다. 이전 연구들은 DHA가 풍부한 미세조류 오일 보충이 간지방증과 대사 지표를 개선할 수 있음을 시사했습니다^18,19. 그러나 MASLD 맥락에서 장내 미생물군 구성 및 미생물 대사 기능과의 연관성은 아직 명확하지 않습니다.

따라서 본 연구에서는 DHA가 풍부한 미세조류 오일 보충이 대사 지표, 장내 미생물 구성 및 간 대사체 프로필에 미치는 영향을 평가하기 위해 고지방 식이 유도 마우스 모델을 사용했습니다. DHA가 풍부한 미세조류 오일 보충이 간 지질 대사 개선과 장내 미생물 구성 및 미생물 대사 경로의 변화와 연관될 것이라는 가설이 제기되었습니다.

프로토콜

이 프로토콜에서 사용되는 모든 동물, 사료, 시약, 키트, 기기, 소프트웨어 및 서비스 제공자에 대한 자세한 내용은 재료표에 제공되어 있습니다. 모든 동물 연구는 국립보건원(NIH)의 실험동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며, 산둥성 병원 실험동물위원회(윤리 승인 번호 2022–007, 2022년 1월 24일 승인)로부터 승인을 받았습니다.

주의: 동물의 혈액, 대변 샘플, 조직은 잠재적으로 생물학적 위험 물질로 취급해야 합니다. 살아있는 동물, 생물학적 샘플, 샤프, 유기 용매, 화학 분석 시약을 포함한 모든 절차는 기관의 생명안전, 동물 관리 및 화학 안전 규정에 따라 수행되어야 합니다. 동물 사체, 조직, 혈액 오염 물질, 대변 샘플은 지정된 생물학적 위험 폐기물 용기에 수거되어 기관 동물 시설 또는 생물안전 사무소를 통해 처리해야 합니다. 바늘, 가비지 바늘, 모세관 및 기타 날카로운 도구는 사용 후 즉시 승인된 용기에 버려야 합니다. 메탄올, 아세토니트릴, 개미산 함유 용액을 포함한 유기 용매 폐기물은 라벨이 붙은 화학 폐기물 용기에 수집되어 기관 유해 화학폐기물 프로그램을 통해 폐기되어야 합니다. 생화학적 및 산화 스트레스 분석에서 나온 폐기물은 제조업체의 안전 데이터 시트와 기관 화학 안전 규정에 따라 수집 및 폐기되어야 합니다.

실험 동물

6주 된 수컷 C57BL/6J 마우스(그룹당 n = 4마리)는 22± 2°C, 50–60% 상대습도에서 12시간 동안 밝고 어두운 주기를 가진 특정 무병원체(SPF) 조건 하에서 유지되었습니다. 동물들은 자유롭게 먹이와 물을 사용할 수 있었으며, 한 우리당 최대 다섯 마리의 쥐를 수용할 수 있었습니다. 대조군 쥐들은 탄수화물 70%, 단백질 20%, 지방(kcal) 10%로 구성된 표준 차우 식단을 먹였다. MASLD 마우스 모델을 확립하기 위해, 쥐들은 8주간 20% 탄수화물, 20% 단백질, 60% 지방(kcal)을 포함한 고지방 식단을 먹였다. 모든 식단은 4°C에 보관되어 주 2회 보충되었습니다. 쥐는 무작위 수치 생성기를 사용해 실험군에 무작위로 배정되었고, 표본 크기(n=4개)는 유사한 고지방 식이 유도 마우스 모델과 예비 실험을 바탕으로 결정되었습니다. 모든 치료는 생체 변동을 최소화하기 위해 매일 같은 시간에 시행되었습니다.

미세조류 오일은 산둥 농업과학원에서 약 99%의 순도로 추출 및 정제되었습니다. 미세조류 오일은 빛으로부터 보호된 채 −30 °C에서 보관되었습니다. 투여 전에 오일은 유화제로 준비되어 균질성을 보장하기 위해 충분히 혼합되었습니다. 구체적으로, DHA가 풍부한 미세조류 오일은 0.5% 카복시메틸셀룰로오스 나트륨에 유화되었으며, 이 나트륨에는 0.5% Tween-80이 포함되어 있었다. 미세조류 오일과 유화 유체 유체는 1:9(v/v) 비율로 혼합되어 가베지 직전 2분간 소용돌이 작용하여 균일한 현탁을 얻었습니다. 미세조류 오일 처리군의 쥐들은 무균 먹이 바늘을 사용해 하루 1회 경구 먹이를 통해 10 μL/g 체중 용량의 용량으로 제제를 받았습니다. 가비지 용량은 체중에 따라 매일 조절하여 용량 일정을 유지했습니다. 대조군 쥐들은 동일한 조건에서 동등한 양의 멸균 생리식염수를 투여했습니다. 사용한 식염수는 0.9% 염화나트륨 주입이었습니다.

프로바이오틱스 치료는 Lactobacillus plantarum (DY-1), Lactobacillus acidophilus (KDB-03), Lactobacillus casei (KDB-LC), Bacillus coagulans (GIM 1.645)를 포함한 복합 제형으로 구성되었습니다. 네 가지 균주는 1:1:1:1의 동일한 생존 가능한 세포 비율로 혼합되었다. 각 균주는 최종 제형에 2.5 × 10⁷ CFU/mL를 기여하여 총 박테리아 농도는 1 × 10⁸ CFU/mL였습니다. 프로바이오틱스 혼합물은 산둥 농업과학원에서 합성되었으며 상업적으로는 판매되지 않습니다. 프로바이오틱스 치료는 Lactobacillus plantarum DY-1, Lactobacillus acidophilus KDB-03, Lactobacillus casei KDB-LC, Bacillus coagulans GIM 1.645를 포함한 복합 프로바이오틱 발효 육수로 구성되었습니다. 제형의 박테리아 농도는 1 × 10⁸ CFU/mL였습니다. 프로바이오틱 발효 육수는 사용 전 4°C에서 보관되었습니다. 프로바이오틱스 처리군 쥐들은 실험 기간 동안 체중 0.01 mL/g 용량의 경구 개비지로 하루 한 번 프로바이오틱스 제형을 투여받았습니다.

개별 균주는 적절한 조건에서 배양되어 중간 로그 성장 단계(OD₆₀₀ ≈ 0.6)에 수확한 후 지정된 비율로 결합되었습니다. 박테리아 배양물을 원심분리하여 상청액을 제거하고, 알갱이를 멸균 인산염 완충 생리식염수(PBS)에 재현탁시켰습니다. 신선하게 준비된 박테리아 현탁액은 투여 전에 얼음 위에 보관하여 생존력을 유지했습니다. 투여 전 최종 박테리아 농도는 1 × 10⁸ CFU/mL로 조정되었습니다. 프로바이오틱스 그룹의 쥐들은 실험 기간 동안 하루 1회 0.01 mL/g 체중 용량의 경구 제형을 투여받았습니다. 프로바이오틱스 투여 전에는 항생제 전처리가 적용되지 않았습니다. 실험적 편향을 줄이기 위해 해당 경우 블라인드 연구자가 결과 평가를 수행하였습니다. MASLD는 혈액 생화학적 분석을 통해 확인되었습니다.

혈액 분석

실험 기간이 끝날 무렵, 쥐들은 포도당 측정과 말기 혈액 채취 전에 12시간 동안 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 단식했습니다. 마우스는 마취 증기화기를 사용해 이소플루란으로 깊은 마취를 취해 발달 반사 상실이 확인되었습니다. 말기 혈액 샘플은 후궁출혈을 통해 채취되었습니다. 혈액 채취 후 쥐들은 심마취 상태에서 경추 탈구로 안락사되었으며, 호흡과 심장 박동이 멈추어 사망이 확인되었습니다. 혈액은 상온에서 응고된 후 3,000 × g 에서 10분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청 샘플은 추출하여 −80 °C에서 보관되어 분석이 완료되었습니다. 혈청 포도당, 총 콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-c), 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-c), 아스파르트산 아미노트랜스퍼라제(AST), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)를 제조사의 지침에 따라 자동 생화학 분석기를 통해 측정하였습니다. 이 매개변수들은 표준 시약 키트를 분석기 시스템에 통합한 효소 색도 측정법을 사용하여 정량화하였습니다. 모든 생화학적 매개변수는 혈청 부피에 맞게 정규화되어 제조사가 지정한 단위로 표현되었습니다.

산화 스트레스 검사

산화 스트레스 바이오마커는 말론디알데히드, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 카탈라제 키트를 사용하여 측정하였다. 검사는 제조사의 지침에 따라 수행되었습니다. 간략히 간 조직은 얼음 냉각 완충제에서 균질화되고 원심분리하여 분석을 위한 상청액을 얻었습니다. 말론디알데히드(MDA) 농도는 티오바르비투르산 반응성 물질(TBARS) 분석법을 사용하여 측정되었으며; 초산화물 디무타제(SOD) 활성은 초산화물 매개 반응을 억제하는 능력으로 측정되었으며; 카탈라아제(CAT) 활성은 과산화수소의 분해 속도를 모니터링하여 정량화되었습니다. 측정은 마이크로플레이트 리더기를 사용해 수행되었고, 값은 표준 곡선이나 키트에 제공된 공식을 사용해 계산되었습니다. 산화 스트레스 마커는 간 조직 무게로 정규화되어 제조사 사양에 따라 표현되었습니다.

16S rRNA 시퀀싱 및 마이크로바이옴 분석

실험 기간 말에 개별 쥐로부터 멸균 조건에서 직접 대변 샘플을 채취하여 즉시 액체 질소에 냉동한 후 −80 °C에서 DNA 추출 시까지 보관했습니다. 미생물 DNA는 제조사 프로토콜에 따라 상업용 키트를 사용해 추출되었습니다. 박테리아 16S rRNA 유전자의 V3–V4 영역은 341F/806R 프라이머를 사용하여 증폭하였다. PCR 증폭은 주형 DNA, 2개의 PCR 마스터 믹스, 각 프라이머 0.2 μM을 포함한 25 μL 반응 시스템에서 수행되었다. 증폭 프로그램은 95°C에서 3분간 초기 변성, 95°C에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 45초간 25주기, 그리고 최종적으로 72°C에서 10분간 연장하는 방식으로 이루어졌다. Amplicon 라이브러리는 상업용 시퀀싱 서비스 제공업체가 2× 250 bp 페어리드 엔드 전략을 사용하여 Illumina MiSeq 플랫폼에서 구축 및 시퀀싱했습니다. 라이브러리 품질은 시퀀싱 전에 평가되었고, 통합 라이브러리는 제조사가 권장하는 클러스터 밀도에 맞춰 로드되었습니다. 모호한 기준, 길이 부족, 평균 품질 점수가 Q20 미만인 저품질 리드는 하위 분석 전에 제거되었습니다.

원시 시퀀싱 리드는 QIIME 2 버전 2019.4²⁰을 사용하여 처리되었습니다. 간단히 말해, 쌍 엔드 리드는 DADA2를 사용해 기본 매개변수를 사용하여 탈다중화, 품질 필터링, 노이즈 제거, 병합, 키메라 필터링을 거쳤습니다. 비단일원 증폭 서열 변이(ASV)는 후속 분석을 위해 유지되었습니다. 분류학적 할당은 QIIME2²¹에 구현된 Greengenes 데이터베이스 버전 13_8을 사용하여 수행되었습니다. 특히 Greengenes 데이터베이스를 사용할 때 16S rRNA 유전자 서열 분석의 고유한 해상도 한계를 고려할 때, 분류학적 주석은 오직 속 단위에서만 해석되었습니다. 종 수준의 분류는 신뢰할 만하지 않다고 여겨져 하위 분석, 통계 비교, 생물학적 해석에 사용되지 않았습니다. 모든 미생물 특징은 시각화 및 분석 전에 속 수준으로 축소되었습니다.

알파 다양성 지표(Chao1, 관찰 종, Shannon, Simpson, Faith's PD, Pielou 균등도)가 사용되었습니다. 그룹 간 알파 다양성의 통계적 비교는 적절한 비모수 검정(예: Kruskal–Wallis 검정)을 사용하여 수행되었습니다. Jaccard 거리와 Bray-Curtis 불일치가 베타 다양성 지표로 사용되었습니다. 주요 좌표 분석(PCoA) 플롯, 비미터 다차원 스케일링(NMDS), 선형 판별 분석 효과 크기(LEfSe)를 사용하여 마이크로바이옴 군집의 변화를 보여주었으며, LDA 점수 임계값은 2.0이었습니다. 베타 다양성의 통계적 유의성을 평가하기 위해 전열적 다변량 분산 분석(PERMANOVA)을 사용하였습니다. 데이터 시각화와 통계 분석은 GenesCloud 플랫폼(https://www.genescloud.cn)을 사용하여 수행되었습니다.

미생물 기능 프로필은 샷건 메타게놈 또는 전사체 시퀀싱으로 직접 측정하는 대신 16S rRNA 시퀀싱 데이터를 통해 추론되었습니다. 정규화된 경로 또는 기능기 풍부도 표를 바탕으로, 예측된 기능 단위는 KEGG, MetaCyc, COG 등 일반적으로 사용되는 데이터베이스에 매핑되었습니다. KEGG 경로 풍부도는 계층적 기능 범주별로 요약되었으며, 하위 비교를 위해 2단계 경로 분류가 사용되었습니다. 각 경로 범주의 평균 풍부도는 R 소프트웨어를 사용해 계산되었습니다.

간 샘플의 비표적 대사체 분석

간 조직은 사망 확인 직후 신속히 절제되어 즉시 액체 질소에 냉동되어 분석하기 전 −80 °C에 보관되었습니다. 약 50mg의 냉동 간 조직을 얼음처럼 차가운 메탄올 물(4:1, v/v)에 균질화하고 내부 표준체를 보충했습니다. 조직 대용 용매 비율은 1:10(w/v)이었습니다. 샘플은 1분간 소용돌이 처리, 10분간 얼음 초음파 검사, 그리고 단백질 침전을 개선하기 위해 −20 °C에서 30분간 배양했습니다. 동질체는 완전히 혼합되어 얼음 위에서 초음파 검사를 받고, 12,000 × g 에서 4 °C에서 15분간 원심분리했습니다. 상청액은 신중히 수집되어 온화한 질소 흐름 하에서 증발시킨 후 50% 메탄올로 재구성되어 후속 분석을 수행했습니다.

품질 관리(QC) 샘플은 각 샘플에서 동일한 부피를 모아 생성되었으며, 분석 안정성과 재현성을 평가하기 위해 실행 기간 동안 간헐적으로 분석되었습니다. 비표적 대사체학 분석은 상업 서비스 제공자가 운영하는 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템과 고해상도 질량분석법을 결합하여 수행되었습니다. 대사산물은 0.1% 개미산이 함유된 물과 0.1% 개상의 아세토니트릴로 구성된 이진 용매 시스템을 사용하여 역상 C18 컬럼에서 분리되었습니다. 주입 용량은 2 μL였고, 컬럼 온도는 40 °C로 유지되었으며, 유량은 분당 0.30 mL로 설정되었습니다. 광범위한 대사물 분리를 위해 구배 용출 프로그램을 사용했습니다. 질량분석법은 70–1,000 m/z 범위에서 양 및 음의 전기분무 이온화 모드로 수행되어 광범위한 대사물 커버리지를 달성하였습니다. 이온 분무 전압은 양극 모드에서 3.5 kV, 음극 모드에서 −2.5 kV로 설정되었습니다. 모세혈관 온도는 320 °C로 유지되었으며, 데이터는 전면 스캔 MS 모드에서 대사물 주석을 위한 데이터 의존적 MS/MS 획득으로 수집되었습니다. 원시 데이터는 특징 검출, 정렬, 정규화를 위해 전용 대사체학 소프트웨어(MassLynx v4.1)를 사용해 처리되었습니다. 대사체 식별은 인간 대사체 데이터베이스(HMDB) 및 교토 유전자 및 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG)(v2023) 등 공개 데이터베이스와 비교하여 정확한 질량, 보존 시간, MS/MS 분열 패턴을 기반으로 수행되었습니다.

다변량 및 경로 분석

처리된 대사체학 데이터는 주성분 분석(PCA)과 부분 최소제곱 판별 분석(PLS-DA)을 포함한 다변량 통계 분석을 통해 실험군 간 대사 차이를 시각화하였습니다. 차등 대사산물은 예측 점수(VIP) 점수(>1.0)와 통계적 유의성(p < 0.05)의 변수 중요도를 결합하여 확인되었습니다. 확인된 대사산물은 KEGG 경로 풍부 분석을 통해 대사 경로와 더 자세히 매핑되어 DHA가 풍부한 미세조류 오일 보조와 관련된 생물학적 과정을 밝혀냈습니다.

통계 분석

데이터는 SEM 평균± 제시되었고, 분산 일방향분석(ANOVA)과 Tukey의 다중 비교 검정을 사용해 분석하였습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 정의되었습니다. 간 대사산물의 농축 분석은 R(버전 4.4.1)을 사용하여 수행되었습니다. 미생물 속과 간 대사산물 간의 쌍별 연관성을 Spearman 랭크 상관관계를 분석하였다. 유의미한 상관관계(거짓 발견률, FDR < 0.05)만이 |ρ| ≥ 0.6명이 통합 네트워크 분석에 포함되었습니다. 미생물군 및 대사체 데이터 처리는 위에서 설명한 대로 진행되었으며, GenesCloud 플랫폼과 품질 관리 절차를 포함했습니다.

결과

DHA가 풍부한 미세조류 오일은 HFD 유발 MASLD 마우스에서 지질 대사, 간 손상 및 간 산화 스트레스를 개선합니다

식이 보충제가 포도당 및 지질 항상성에 미치는 영향을 평가하기 위해, 생화학적 매개변수를 다섯 그룹에서 평가하였다: 일반 식사(RC), 고지방 식단(HFD), DHA 풍부한 미세조류 오일 보충, 프로바이오틱 보조, 그리고 DHA 풍부한 미세조류 오일 + 프로바이오틱스 보충 생쥐 복합군. 본 연구의 주요 목적이 DHA가 풍부한 미세조류 오일의 효과를 평가하는 것이었기 때문에, DHA 풍부한 미세조류 오일 처리 그룹이 주요 중재 그룹으로 간주되었고, 프로바이오틱스 및 복합 치료군은 프로바이오틱스 단독 및 잠재적 상호보호 효과를 평가하기 위한 비교 중재로 포함되었습니다. 그림 1A에 나타난 것처럼, HFD 급여는 마스락 증...

토론

최근 몇 년간 MASLD와 관련된 미생물군 변화를 조사하는 여러 연구가 이루어졌습니다. 그러나 대부분의 연구는 건강한 개인과 MASLD 환자를 비교하거나²⁴등급의 지방증을 비교하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 따라서 MASLD에서 간 섬유증과 관련된 특정 장내 미생물군 변화에 대한 자세한 증거는 제한적이며, 섬유화가 환자 결과 예측에 가장 중요한 요인임에도 불구하고 말이다. 본 연구에서는 DHA가 풍부한 미세조류 오일이 HFD 유도 MASLD 마우스에서 포도당 조절보다는 지질 대사를 주로 개선한다는 것을 보여준다. 이 효과는 간 손상과 산화 스트레스 감소, 락토바실러스 와 비피도박테리우m과 같은 유익 분류군의 선택적 풍부화, 그리고 클로스트리디움 과 루미노코쿠스를 포함한 HFD 관련 분류군의 개체수 감소를 동반했습니다. 또한 조직병리학적 분석도 이러한 결과를 뒷받...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2x PCR 마스터 믹스	타카라 바이오 주식회사, 일본	RR902A	16S rRNA PCR 증폭에 사용
아세토니트릴	독일 머크	100030	UHPLC 이동상에 사용되는 용매
마취 증기 발생기	RWD 생명과학	R580	쥐에게 이소플루란 마취를 전달하는 데 사용됨
자동 생화학 분석기	지안청 생물공학연구소, 난징, 중국	A110-1 및 A111-1	혈청 지표(혈당, TC, TG, LDL-C, HDL-C, AST, ALT) 및 간 지질 수치 측정
바실러스 응고균 (GIM 1.645)	중국 광둥성 미생물 배양 수집 센터	GIM 1.645	프로바이오틱스 제형의 성분 균주
카복시메틸셀룰로오스 나트륨 (CMC-Na)	시그마-올드리치, 미국	C4888	DHA가 풍부한 미세조류 오일 제제의 유화 성분으로 사용됨
카탈라아제(CAT) 분석 키트	난징건설유한회사	A007-1-1	간 조직에서 항산화 능력의 지표인 CAT 활성을 감지합니다
DADA2 소프트웨어 패키지	DADA2 개발팀	QIIME 2 v2019.4에 포함됨	시퀀싱 리드의 잡음 제거 및 키메라 필터링에 사용됨
DHA가 풍부한 미세조류 오일 (Schizochytrium sp.에서 유래)	-	-	도코사헥사엔산(DHA)이 풍부하며; Gavage가 10µ에서 매일 투여; L/g를 실험적 개입으로
실험용 동물 (수컷 C57BL/6J 마우스)	베이징 바이탈 리버 실험동물기술회사.	-	생후 6주 때, 그룹당 n = 4마리; HFD 피딩을 통한 MASLD 모델 구축에 사용됨
개미산	시그마-올드리치, 미국	F0507	대사체 분석을 위한 이동상 첨가제
그린지네스 데이터베이스	그린지네스	버전 13_8	미생물 분류학 분류에 사용됨
고지방 다이어트(HFD)	리서치 다이츠 주식회사, 미국	D12492	탄수화물 20%, 단백질 20%, 지방 60%(kcal); MASLD를 유도하기 위해 8주간 수유
고해상도 질량분석기	서모 피셔 사이언티픽, 미국	Q 익스액티브 오비트랩	양 및 음 이온 모드에서 대사물 검출에 사용됩니다
인간 대사체 데이터베이스(HMDB)	캐나다 앨버타 대학교	2024년 출시	공개 대사물 주석 데이터베이스
일루미나 MiSeq 플랫폼	일루미나, Inc., 미국	MiSeq 시스템	페어드 엔드 2 & 타임에 사용; 250 bp 시퀀싱
이소플루란	독일 머크	PHR2874	마우스의 흡입 마취에 사용됨
교토 유전자 및 유전체 백과사전 (KEGG)	일본 카네히사 연구소	버전 2023	경로 농축 및 대사물 주석에 사용되는 데이터베이스
락토바실루스 아시도필루스 (KDB-03)	중국 산둥성 농업과학원	-	프로바이오틱스 제형의 성분 균주
락토바실루스 케이스이 (KDB-LC)	중국 산둥성 농업과학원	-	프로바이오틱스 제형의 성분 균주
락토바실루스 플랜타룸 (DY-1)	중국 산둥성 농업과학원	-	프로바이오틱스 제형의 성분 균주
액체 질소	에어 리퀴드	-	대변 및 간 샘플의 신속 냉동 및 보존에 사용됩니다
말론디알데히드(MDA) 분석 키트	난징건설유한회사	A003-1	간 조직에서 MDA(지질 과산화/산화 손상의 지표)를 검출합니다
매스링크스 소프트웨어	워터스 코퍼레이션, 미국	버전 4.1	대사체학 원시 데이터 처리, 특징 추출 및 정규화에 사용됩니다
메탄올	독일 머크	106035	대사물 추출에 사용되는 용매
마이크로바이옴 데이터 분석 플랫폼	제네스클라우드	V1	온라인 플랫폼: https://www.genescloud.cn/home; PCoA, NMDS, LEfSe 및 기타 미생물군 시각화 분석에 사용
오메가 토양 DNA 키트	오메가 바이오텍, 노크로스, 조지아, 미국)	그리고 nbsp; (M5635-02)	DNA 분리
OTU의 참조 서열	제네스클라우드		McDonald 등, 2012; 앰플리콘 서열 변이(ASV)의 분류학 할당에 사용됨
인산염 완충 식염수(PBS)	깁코, 서모피셔 사이언티픽, 미국	10010023	박테리아 펠릿 재현탁에 사용됩니다
프라이머 341F/806R	칭커 바이오테크놀로지 유한회사, 중국	-	16S rRNA V3&ndash 증폭에 사용; V4 영역. 341F: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′; 806R: 5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′
프로바이오틱스	-	-	명확히 언급되지 않은 특정 품종; 비교 중재로 사용됨 (주로 혈당 항상성 개선)
QIIME 2 소프트웨어	-	2019.4	마이크로바이옴 생물정보학 분석(ASV 처리, 알파/베타 다양성 계산)에 사용됨
R 소프트웨어	-	4.4.1	간 대사물 풍부화 분석 및 미생물-대사물 연관의 Spearman 상관분석 연구에 사용됩니다
냉장 원심분리기	에펜도르프, 독일	5810R	혈청 및 대사체학 샘플 원심분리에 사용됩니다
역상 C18 컬럼	워터스 코퍼레이션, 미국	186002350	대사산물의 크로마토그래피 분리에 사용됩니다
생리식염수	스자좡 제4 제약	2211112304	대조군에게는 매일 가비지로 투여 (미세조류 오일 처리 대비)
표준 차우 식단	케아오 시엘리 사료 주식회사, 중국	1016706714625204224	탄수화물 70%, 단백질 20%, 지방(kcal) 10%로 구성되어 있습니다; 제어 그룹(RC) 그룹으로 공급됨
멸균 급식 바늘	인스테크 연구소, 미국	FTP-20-38	구강 게비지 투여에 사용
슈퍼옥사이드 디뮤타제(SOD) 분석 키트	난징건설유한회사	A001-3	간 조직 내 SOD 활성(항산화 능력의 지표)을 감지합니다
트윈-80	시그마-올드리치, 미국	P4780	DHA가 풍부한 미세조류 오일 제제의 유화 성분으로 사용됨
초음파 균질기	사이엔츠 바이오테크놀로지, 중국	JY92-IIN	대사물 추출 중 간 조직 초음파 검사에 사용됩니다
비표적 간 대사체학	메타보-프로파일 바이오테크놀로지(상하이) 유한회사.	프로젝트 코드: P035Y23A13_SFMU_MJWang_SH
보텍스 믹서	서모 피셔 사이언티픽, 미국	LP 보텍스 믹서	샘플 균질화 및 유화에 사용