다능성 줄기세포를 원시 생식세포 유사 세포로 분화하는 프로토콜

요약

2D 단층 기반 방법과 저저막 추출물 오버레이를 사용하여 인간 유도 다능성 줄기세포로부터 원시 생식세포 유사 세포를 견고하게 생성하는 단계별 가이드라인.

초록

시험 관 내에서 인간 다능성 줄기세포 분화를 사용한 것은 초기 생체 내 발달 과정에서 발생하는 계통 특정 사건에 대한 이해를 크게 넓혔으며, 이 시기는 조사가 매우 어려운 시기입니다. 인간 배아에서 가장 먼저 지정된 배아 계통 중 하나는 원시 생식세포(PGC)의 유도로 표시되는 생식세포 계통입니다. PGC는 생애 후반기에 생애 생식체의 유일한 창조 개체군이며, 이들의 특성화는 생물체의 생식력을 향한 중요한 첫걸음입니다. 여기서는 인간 유도 다능성 줄기세포(hiPSCs)로부터 PGC 유사 세포(PGCLC)를 생성하는 견고한 프로토콜을 설명하며, hiPSC의 다능 상태와 세포 특성의 초기 평가부터 시작하여 효과적인 PGCLC 분화를 보장합니다. 이를 위해 PGCLC 분화에 사용되는 다양한 세포 밀도, 플레이트 코팅, hiPSC의 영향에 대해 논의합니다. 마지막으로, 면역형광과 유세포분석을 이용한 hPGCLCs의 특성화 및 정량화 워크플로우가 제공됩니다. 차별 프로토콜은 대부분의 실험실에서 쉽게 정하고 검사할 수 있으며 필요에 따라 조정할 수 있는 조건에 초점을 맞춥니다. 더불어 이 프로토콜은 빠르기 때문에 hiPSC가 PGCLC 분화에 적합한지 여부를 판단할 수 있습니다. 프로토콜은 다양한 hiPSC 군주와 배양 플랫폼에서 hPGCLC 결과의 일관성과 호환성을 촉진하여, 신뢰할 수 있는 특성 분석과 인간에서의 성공적인 시험 관 내 배우자 형성을 위한 후속 분화 단계의 추가 최적화를 지원하는 강력한 수확을 보장하는 것을 목표로 합니다.

서론

인간 생식계 발달은 배아 발달 초기에 시작되는 매우 조율된 과정으로, 궁극적으로 난자와 정자를 기원시키는 원시 생식세포(PGC)의 지정에서 시작됩니다¹. 생체 내에서 PGC 특정은 이식 직후 인접 세포 ^4,5의 유도 신호에 ^{반응하여 발생합니다}. PGC의 발달은 설치류에서 광범위하게 연구되었으며, 특히 BMP, WNT, TGFβ 6,7,8,9와 같은 신호 전달 경로의 관여를 유전학 연구에서 입증했습니다. 명세에 따라 PGC는 유전체 DNA 탈메틸화와 염색질 재형성을 특징으로 하는 후생유전학적 재프로그래밍을 거쳐, 이후 (성별별) 생식세포 동일성을 확립합니다 10,11,12,13,14.

포유류에서 PGC 명세는 신호 경로 간의 조정된 교차 반응에 의해 결정되며, 일부 측면은 POU5F1과 NANOG ^{9,15,16,17,18}과 같은 다능성 인자의 관여를 포함하여 인간, 비인간 영장류, 돼지, 쥐 사이에서 진화적으로 보존되어 있습니다 . 공통된 특징에도 불구하고, 종별 PGC 분화 메커니즘과 유전자 조절 네트워크의 차이가 동물 모델에서 인간으로의 직접적인 번역을 제한합니다^{9, 19, 20, 21}.

인간의 배우자 발생을 이해하려면 인간 물질을 이용한 연구가 필요하지만, 초기 인간 배아에 대한 접근이 제한적이어서 여전히 도전적이다. 유도 다능 줄기세포(HiPSCs)와 같은 인간 원시 생식세포 유사세포(hPGCLCs)를 시험관 내 분화할 수 있는 프로토콜의 지속적인 발전은 인간 생식샘 조직에 대한 의존도를 줄이고 업스케일링과 유전학 연구를 가능하게 했습니다^18,22. 대부분의 확립된 hPGCLC 분화 전략은 3차원(3D) 집합체 또는 배아체에 의존^합니다. 이러한 플랫폼을 활용한 여러 연구에서 hPGCLC가 초기 인간 PGC의 주요 후생유전학적 특징, 예를 들어 생식선 전사 프로그램^23,24와 유전체 전체 DNA 메틸화 재프로그래밍²⁵를 재현한다는 것이 밝혀졌습니다. 이 시험관 내 플랫폼들은 계통 결정과 후생유전학적 재설정 등 인간 PGC 생물학에 대해 상당히 발전된 지식을 가지고 있습니다. 그러나 집계 기반 hPGCLC 분화 프로토콜은 시간이 많이 소요되어 여전히 도전적이며, 견고한 후생유전학적 특성 분석, 추가 분화 분석, 또는 고처리량 실험 응용 분야에서의 hPGCLC의 총 수확량은 여전히 낮습니다.

최근에는 희석된 기저막 추출물(BMEx)과 낮은 수준의 BMP4를 결합해 hiPSC를 hPGCLCs로 분화하는 2D 단층 기반 피더 없는 방법이 조직 배양 플레이트에서 비교적 쉽게 확장할 수 있었고, 짧은 분화 창(5일)에서 높은 효율(~55%)을 달성했습니다²⁶. 유도 전에 중간 액티빈 A 프라이밍 단계가 필요하고 더 높은 BMP4 농도(40–50 ng/^mL)를 사용한 다른 2D 시스템과 ^{비교할 때}, 이 BMEx 방법은 유도 전 단계가 필요 없고 낮은 BMP4 농도(10 ng/mL)를 사용하면서도 비슷한 효율과 향상된 확장성을 유지했습니다.

여기서는 hiPSC 유지 초기 평가(다능성 및 세포 특성 포함)부터 시작하여 다양한 hiPSC 플레이트 코팅과 세포 밀도가 hPGCLC 분화에 미치는 영향을 테스트하는 단계별 가이드를 제공합니다. 또한 유세포분석 및 면역형광을 통한 후속 특성 분석도 기술합니다. 실험실 편차를 줄이기 위한 중요한 처리 지점과 문제 해결 지침을 제공하여 연구자들이 이 2D 형식으로 hPGCLC 분화를 일관되게 재현할 수 있도록 합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 라이덴 대학교 의료센터(LUMC), LUMC 바이오뱅크 및 생체재료(TCBio), LUMC 라이덴 hiPSC 센터(BB24.037 하)의 지침과 규정을 따릅니다. 이 프로토콜에서 사용되는 모든 재료 및 대조 수(XY) hiPSC 라인(M54 및 M199)은 재료표에 나열되어 있습니다. 모든 조직 배양 절차는 전용 생물안전 2단계 조직 배양실에서 수행되었으며, 이 실내에는 가습 정상산소 인큐베이터(37 °C, 5%_CO2), 다목적 벤치탑 원심분리기(스윙 버킷 로터), 그리고 입체현미경이 장착된 클래스 II 생물안전 캐비닛이 설치되어 있습니다.

주의: 모든 hiPSC 계통이 hPGCLCs^{26, 29}로 구분되는 것은 아닙니다. 그러나 다른 hiPSC를 PGCLC 분화에 사용하고 PGCLC가 관찰된다면, 여기서 설명한 방법(그림 1A)을 통해 hPGCLC 생성을 확대할 수 있습니다.

1. hiPSC 배양용 조직 배양 플레이트 코팅

이 프로토콜은 희석된 BMEx와 비트론넥틴을 함께 코팅하는 조직 배양 플레이트를 설명합니다.

1. 기저막 추출물(BMEx) 코팅
   1. 얼음에 올려 BMEx 한 조각을 해동하세요. 이 약은 Geltrex, Cultrex, 또는 Matrigel일 수 있습니다.
   2. 기저막 추출물을 차가운 DMEM/F12에 희석하여 최종 농도인 1%(v/v)로 희석한 후 부드럽게 재현탁합니다.
   3. 6웰 플레이트의 원하는 웰 수만큼 희석된 BMEx 1mL를 각 웰마다 코팅합니다.
   4. 코팅된 플레이트를 37°C에서 최소 30분간 배양하세요.
      참고: 코팅된 플레이트는 최대 1주일간 2–8 °C에서 보관할 수 있습니다. 코팅된 플레이트를 2–8 °C에서 보관할 때는 37 °C에서 최소 10분간 배양한 후 추가 사용.
2. 비트로넥틴 코팅
   1. 상온(RT)에서 비트론넥틴 알리코트 한 장을 10–15분간 해동합니다.
   2. 칼슘과 마그네슘 없이 DPBS에서 최종 농도인 5 μg/mL로 희석한 후 부드럽게 재현탁합니다.
   3. 6웰 플레이트의 원하는 웰 수에 각 웰당 희석된 비트론넥틴 1mL를 코팅합니다.
   4. 코팅된 6웰 플레이트를 RT에서 1시간 배양하세요.

2. hiPSC 유지 통과

1. 배양액 준비: 혈청 없는 세포 배양지 mTeSR Plus에 마이코플라즈마 오염 방지 용액(MycoZap (1:1000))을 보충합니다.
2. 배양 배지를 배출할 준비가 된 세포에서 흡인하세요.
3. 각 웰에 0.5mL 인간 PSC 선택 및 통과제(ReLeSR)를 첨가하고 1분 이내에 흡취합니다. 세포 위에 아주 얇은 층을 남겨두세요.
4. 세포를 37°C에서 6분간 배양하세요.
5. 6웰 플레이트 옆면을 몇 번 두드리세요.
6. 1mL 배양액으로 p1000 피펫으로 위아래로 피펫을 움직이며 세포를 조심스럽게 분리하고, 콜로니 조각의 크기를 정기적으로 확인하여 크기를 50–200 μm 사이로 유지하세요.
7. 미리 코팅된 6웰 플레이트를 가져와 코팅 용액을 제거하세요(1단계).
8. 각 웰에 2mL 배양지를 추가하세요.
9. 분리된 hiPSCs 콜로니 조각을 포함한 배양지를 원하는 비율로 새로운 우물로 옮깁니다.
   참고: hiPSC 집단 조각을 분리하는 이상적인 비율은 1:6-1:50으로, 4일에서 7일마다 배설할 수 있습니다.
10. 통과된 hiPSCs 콜로니 조각이 포함된 세포 배양 플레이트를 가습 노름산소 인큐베이터(37 °C, 5%_CO2)에 넣습니다.
11. hiPSC가 다시 통과될 준비가 될 때까지 2mL 배양지를 격일로 교체하세요.
    참고: 주말 동안 리프레시할 필요가 없도록 각 6-웰에 2mL 대신 4mL 배양지를 추가하세요.
    주의: 합류율이 너무 낮을 때는 hiPSC를 통과시키지 말고, 합류율이 너무 높으면 건강한 hiPSC 배양을 유지하고 자발적 분화를 피하기 위해 배양을 폐기해야 합니다.

3. hPGCLC 분화

1. hPGCLC 분화 전 준비 과정(0일차).
   1. hPGCLC 분화 시작 1시간 전에 hiPSCs 배양지를 갱신하세요.
   2. 코팅액을 준비하세요: 1% BMEx 용액을 차가운 DMEM/F12에 희석하여 v/v로 사용하세요.
   3. 12웰 플레이트의 원하는 웰 수만큼 0.5mL 코팅액을 코팅합니다.
   4. 분화를 시작하기 전에 코팅된 판을 최소 30분 이상 37°C에서 배양하세요.
   5. 도금 배지를 준비하세요: 2% (v/v) BMEx 용액을 냉 배양 배지에 넣고, 해동 후 회수 배양액(RevitaCell)(1:100)을 보충합니다.
      주의: hiPSCs의 준비 및 평판 시 배지를 얼음 위에 보관하세요.
2. hPGCLC 분화를 위한 hiPSCs 플레이트 작업(0일차).
   1. hiPSC가 포함된 6-웰에서 배양 배지를 제거하여 hPGCLC 분화에 사용한다. 50–80% 일치율의 고품질 hiPSC부터 시작하며, 자발적 분화 징후가 없습니다.
   2. 웰당 1mL 트립신 용액(TrypLE)을 추가하세요.
   3. hiPSC를 37°C에서 5분간 배양합니다.
   4. p1000 피펫으로 hiPSCs 콜로니를 2–3번 조심스럽게 재현탁하여 단일 세포 현탁을 만듭니다.
   5. 역현미경으로 단일 세포 현탁액이 있는지 확인해 보세요. 만약 그렇지 않다면, p1000 피펫으로 hiPSCs 콜로니를 1–2번 더 재현탁합니다.
   6. hiPSC 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮깁니다.
   7. 15 mL 튜브에 4 mL DMEM-F12 배지를 추가합니다.
   8. hiPSC 셀 현탁액을 200 x g 에서 5분간 원심분리합니다.
   9. 상원액을 흡인하고 hiPSC 세포를 0.5–1.0 mL 도금 배지에 조심스럽게 재현탁합니다.
   10. 세포 계수기나 혈구계를 사용해 hiPSC 수를 세고, hPGCLC 분화에 필요한 hiPSC 수를 계산합니다.
       참고: 출발점으로는 40–80K 셀/cm² 의 도금 밀도를 사용할 수 있습니다. 그러나 각 세포주와 각 통과 횟수에 대해 최적의 수율을 달성하기 위해 플레이트 밀도 최적화가 권장됩니다. 여기서 hiPSC는 10K에서 100K cells/cm²의 도금 밀도로 도금되었습니다.
   11. 적절한 양의 도판 배지(12웰 플레이트의 웰당 1mL)에 필요한 수의 hiPSC를 신중히 재현탁하고, p1000 피펫을 사용해 균질한 세포 현탁액을 얻도록 하십시오.
   12. 인큐베이터에서 코팅된 12웰 플레이트를 가져와 코팅 용액을 제거합니다.
   13. 12웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 세포 현탁액을 추가합니다.
   14. 플레이트를 조심스럽게 흔들어 셀이 웰 내에 고르게 분포되도록 하세요.
   15. 12웰 플레이트를 가습 상태의 노르맥스 인큐베이터(37 °C, 5%_CO2)에 16–24시간 동안 보관합니다.
3. hPGCLC 차별화 (1일차–2일차)
   1. RB27 기저 배지를 준비하세요: B-27(1:100), 1X 아미노산 대체물(글루타맥스), 1X MEM 비필수 아미노산, 그리고 마이코플라즈마 오염 방지 용액(1:1000)으로 고급 RPMI160.
   2. 분별 배지를 준비합니다: 2% (v/v) BMEx 용액을 차가운 RB27 기저 배지에 넣고, 최종 농도인 10 ng/mL에 BMP4를 첨가합니다. 기저막 추출물은 내내 발광 생성을 유도하고 PGCLC 특정을 생 체 내에서 유발하는 데 필요합니다.
      주의: 분화 배지는 얼음 위에 보관하거나 4 °C에 보관하세요. 분화 배지는 분화 프로토콜의 1일차와 2일차에 준비할 수 있습니다.
   3. 1일째(hiPSC 플레이트 후 16–24시간 이내)에는 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내 플레이트 배지를 제거합니다.
   4. 웰마다 0.5 mL RB27 기저 매개체를 추가하여 세척하세요.
   5. RB27 기저 배지를 흡입하고 각 웰당 1mL의 분화 배지를 추가합니다.
   6. 세포가 포함된 플레이트를 가습 정상산소 인큐베이터(37 °C, 5%_CO2)에 다시 넣습니다.
   7. 분화 2일째에는 각 웰당 1mL의 분화 배지를 사용해 세포를 새로 채웁니다.
4. hPGCLC 분화 (3일차–5일차)
   1. 교환 배지를 준비: RB27 기저 배지를 BMP4(10 ng/mL), LIF(10 ng/mL), SCF(50 ng/mL), EGF(50 ng/mL)를 보충합니다. 스위치 배지는 생 체 내에서 hPGC 규격에서 생존 및 증식으로의 전환을 반영합니다. BMEx는 루메노제네시스가 더 이상 필요하지 않기 때문에 생략됩니다.
   2. 3일차와 4일차에는 각 웰을 1mL 스위치 배지로 새롭게 합니다.
   3. 분화 5일째에는 면역형광 또는 유동세포검사를 통해 hPGCLCs를 특성화할 수 있습니다.

4. 면역형광 및 유세포검사를 통한 hPGCLCs 특성 규명

1. 면역형광을 이용한 특성 분석.
   1. 투과화 용액을 준비하세요: PBS에 희석된 0.3% Triton X-100.
   2. 세척액 준비: 0.05% 트위언 20인치 PBS (PBST)
   3. 차단액을 준비하세요: PBST 내 1% 소 혈청 알부민(BSA).
   4. hPGCLC 분별에 사용되는 웰에서 스위치 매체를 제거하세요.
   5. 세포를 1mL 단위 DPBS(-/-)로 세척하세요.
   6. 세포를 1mL per well, 4% 파라포름알데히드(PFA)를 PBS에 15분간 RT 상태로 고정합니다.
   7. 세포를 PBS로 5분간 3번 세척하며, 웰당 1mL를 사용하세요.
      참고: 이 시점에서 플레이트는 면역형광을 시작하기 전에 4 °C에서 보관할 수 있습니다.
   8. 투과화 용액으로 세포를 15분간 RT에서 15분간 투과시키며, 웰당 1mL를 사용한다.
   9. 세척액으로 세포를 3번 5분간 세척하며, 웰당 1mL를 사용하세요.
   10. 차단액으로 세포를 RT에서 1시간 동안 차단하며, 웰당 1mL를 사용하세요.
   11. 1차 항체 용액을 준비하세요: 차단용액으로 관심 있는 1차 항체를 희석합니다.
       참고: 여기서는 PGC 마커에 대해 다음 두 가지 항체 조합을 사용했습니다: 염소 항-SOX17 항-항-TFAP2C, 염소 항-SOX17 항-POU5F1 (재료표).
   12. 차단액을 제거하고, 웰당 0.4mL의 1차 항체 용액을 추가한 후 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
       참고: 비특이적 항체 결합을 평가하기 위해 음성 대조군을 포함하는 것이 중요합니다. 이를 위해 1차 항체는 제외하고 차단액 중 하룻밤 동안 잘 보관한 후, 2차 항체 용액으로 그 웰을 염색하세요.
   13. 다음 날, 1차 항체 용액을 제거하고 PBST로 세포를 3회 5분간 세척합니다.
   14. 2차 항체 용액을 준비하세요: 관심 있는 2차 항체(재료표)와 DAPI(1:500)를 블로킹 용액에 희석합니다.
       참고: 2차 항체 용액은 빛에 민감하므로 어두운 곳에 보관해야 합니다.
   15. PBST를 제거하고 우물당 0.4mL의 2차 항체 용액을 어둠 속에서 1시간 동안 RT에 추가하세요.
   16. 세포를 PBS로 5분간 3번 세척하며, 웰당 1mL를 사용하세요.
   17. 세포 영상(20배 대물렌즈)을 하세요.
       참고: 면역형광 이미지는 Airyscan 현미경의 20배 대물렌즈를 사용해 획득했으며, 밝야 이미지는 EVOS 현미경의 4배 및 10배 대물렌즈를 사용해 촬영되었습니다.
2. 유세포분석에 의한 특성 분석
   1. FACS 버퍼 준비: DPBS (-/-) 내 0.5% BSA
   2. hPGCLC가 있는 우물에서 스위치 매체를 제거하세요.
   3. 세포를 1 mL DPBS(-/-)로 세척합니다.
   4. 웰당 0.5mL의 예열된 Accutase를 추가하고 37°C에서 15분간 배큐합니다. 해리 시에는 hPGCLC가 해리에 매우 민감하기 때문에 아큐타제가 트립신 용액보다 선호됩니다.
   5. p1000으로 셀을 2–3번 조심스럽게 재현탁하여 단일 셀 현탁액을 만드세요.
   6. 역현미경으로 단일 세포 현탁액이 있는지 확인해 보세요. 만약 그렇지 않다면, p1000 피펫으로 셀을 1–2번 더 재현탁하세요.
   7. 세포 현탁액을 40 μm 체를 통해 15 mL 튜브로 걸러냅니다.
   8. 40 μm 체를 5 mL FACS 버퍼로 세척하세요.
   9. 셀 현탁액을 300 x g 에서 5분간 원심분리합니다.
   10. 상정액을 제거하세요.
   11. 세포 펠릿을 1.5mL 튜브 내 0.3 mL FACS 버퍼 내에 재현탁합니다.
       참고: 세포 계수기나 혈구계를 사용하여 세포 수를 세는 것은 선택 사항입니다. 셀을 세면 12웰 플레이트의 웰당 약 100만 개의 셀이 있을 것으로 예상됩니다.
   12. 유세포분석(염색되지 않은 단일 염색 대조군)을 위한 적절한 대조 샘플을 준비하세요. 이를 위해 세포 현탁액 15–30 μL을 1.5 mL 튜브에 옮기고 FACS 완충액을 100 μL로 채웁니다.
       참고: 본 연구에서는 EPCAM-PEcy7(1:200), ITGA6-BV421(1:200), 7AAD(1:200)의 단일 염색 3가지를 준비하였습니다. 접합 항체와 7AAD가 포함된 용액은 빛에 민감하여 어두운 곳에 보관해야 합니다.
   13. 관심 있는 결합 항체를 세포 현탁액에 직접 첨가하여 적절한 희석을 달성합니다. 여기서는 PGC 마커에 대한 다음 접합 항체를 함께 사용했습니다: EPCAM-PEcy7 (1:200)와 ITGA6-BV421 (1:200) (재료표).
   14. 결합된 항체와 함께 어둠 속에서 얼음 위에 30분간 배양하세요.
   15. 샘플, 염색되지 않은 대조군, 단일 항체 대조군에 1mL FACS 완충제를 추가하고, 300 x g 에서 5분간 원심분리합니다.
   16. 상정액을 제거하세요.
   17. 샘플은 1 mM EDTA가 포함된 FACS 완충제 0.5 mL에, 대조 샘플은 0.2 mL에 재현탁합니다. 이로 인해 세포가 뭉치는 것을 방지합니다.
   18. 샘플과 대조군을 세포 체가 있는 5mL FACS 튜브에 넣은 후 체를 통과시킵니다.
   19. 유세포계에서 측정하기 몇 분 전에 각 샘플에 7AAD를 직접 첨가하세요.
   20. 플로우 사이토미터를 사용해 샘플을 측정하세요. 이 연구에서는 형광 기반 세포 분석기를 사용해 샘플을 측정했고, 데이터는 FACSDiva 소프트웨어(v9.0)와 FlowJo 소프트웨어(v10.10.0)를 사용해 데이터를 분석했습니다.
   21. 대조군 샘플(염색되지 않은 및 단일 항체 대조군)을 사용하여 게이팅 전략을 설정하고 필요 시 보상을 수행하세요.
   22. 샘플을 기계에 넣기 전에 소용돌이로 변환하세요.
   23. 먼저 면적을 기준으로 [전방 산란 영역(FSC-A)과 측면 산란 영역(SSC-A)]을 기준으로 게이트를 설정하여 모든 사건에서 세포 군수를 추출합니다.
   24. 이 세포 집단에서 크기[FSC-너비(FSC-W)와 FSC-높이(FSC-H)] 및 과립도[SSC-W 및 SSC-H]에 따라 단일 세포를 추출합니다.
   25. 7AAD 음성 세포에 대한 게이트를 설정하여 죽은 세포는 추가 분석에서 제외합니다.
   26. 샘플을 사용해 게이트가 제대로 설정되었는지 확인하고 필요하면 조정하세요.
   27. 이 생세포 집단에서 관심 있는 표지를 분석하세요. 여기서 EPCAM과 ITGA6 양성 게이트 세포는 hPGCLCs와 일치하였다.

결과

hiPSCs의 질과 안정 상태는 추가 분별에 중요합니다
hiPSC는 분별 실험과 분석 전에 최소 3번의 다양한 코팅 통로 동안 6웰 플레이트에 유지되었습니다. hiPSC는 세포 집락이 70–80%의 수합 지점에 도달했을 때 전달되었으며(그림 1B), 이는 hPGCLC 분화를 시작하는 최적의 hiPSC 합류점이기도 하다. 건강한 hiPSC 배양은 밝은 시야 이미지에서 볼 수 있는 어두운 영역이나 분화된 영역 없이 균일한 군집 형태를 보였다(그림 1B). 그러나 세포 집락이 최적의 수합 지점을 유지하지 못하거나 분화 징후를 보일 경우 hiPSCs의 질이 영향을 받았습니다(그림 1B). 낮은 합류 지점에서는 hiPSC가 계속 증식했고, 합류점이 통과 또는 분화 실험에 적합해질 때까지 집단 형성에 더 많은 시간이 필요했다. 높은 합류율에서는 hiPSC들이 서로 겹쳐 성장했고, 분화된 영역이 나타났습니다. hiPSCs의 다능성 상태는 SOX2 또는 POU5F1의 발현으로 확인되었으며, 이 두 전사인자는^hiPSCs에서 다능성과 자기갱신을 유지하는 데 필수적이며, 가장 중요한 점은 SOX2가 hPGCLCs³¹에 의해 발현되지 않는다는 점이다. phalloidin 염색을 사용하여 세포골격 조직과 집단 형태를 평가하여 hiPSCs의 질을 나타냈다. 세포 형태의 차이는 SOX2 또는 POU5F1의 환원과 관련이 있음을 유의하세요(그림 1B).

hiPSC 유지 기질이 hPGCLC 분화에 미치는 영향
hiPSC를 서로 다른 코팅 기판에서 유지하는 것이 hPGCLCs로의 분화에 영향을 미치는지 평가하기 위해, hiPSCs는 다양한 기판(Geltrex, Matrigel, Cultrex, vitronectin)에서 배양되었습니다(그림 2). 모든 기질에서 hiPSC는 견고하고 균일한 핵 SOX2 또는 POU5F1 수치를 보였으며, 이는 다능성 상태를 나타낸다. 겔트렉스, 마트리겔, 컬트렉스에서 유지된 hiPSC 군락은 비트로넥틴의 둥근 군락과 비교해 형태가 유사했으며, 뚜렷한 군체 경계와 불규칙한 전체 군체 형태를 보였다(그림 2). 70–80% 합류율에 도달한 hiPSC는 40K 세포/^cm² 밀도로 플레이트되어 Geltrex²⁶에서 hPGCLCs로 분화되었습니다. 5일째 밝은 시야 이미지에서는 모든 조건에서 특징적인 hPGCLC 집락이 나타났다(그림 3). 더불어 모든 조건에서 삼중 양성 SOX17/TFAP2C/PDPN 또는 이중 양성 SOX17/POUF51 hPGCLC가 확인되었습니다(그림 3). 이는 분화 프로토콜이 다양한 조건에서 배양된 hiPSC와 함께 사용할 수 있음을 시사했습니다.

초기 hiPSC 세포 밀도가 hPGCLC 분화에 미치는 영향
최적의 hPGCLC 분화를 위해 최적의 시딩 밀도를 확인하는 것이 중요한데, 이는 다양한 hiPSC가 증식률이 다르기 때문입니다. 또한, hiPSC가 지속적으로 통과됨에 따라 hPGCLC 분화 효율이 떨어질 경우, hiPSC 시딩 셀 밀도를 조절하는 것이 권장됩니다. 시딩 세포 밀도가 hPGCLC 분화 효율에 미치는 영향을 평가하기 위해, hiPSC는 10K에서 100K cells/cm² 사이의 다양한 밀도로 시딩되었습니다(그림 4A). 5일째에는 인간 PGC 표지자에 대해 EPCAM과 인테그린 α6(ITGA6)라는 두 가지 다른 접합 항체를 이용한 플로우 사이토메트리로 hPGCLCs의 비율을 평가하였습니다³². 유동 세포분석 분석은 40K 세포/^{cm 2} 에서 시딩된 M199 hiPSC에 대해 표준적인 순차적 게이팅 전략을 따랐습니다(그림 4B). 간단히 말해, 전체 세포 집단(모든 사건)을 이물질(입자 면적)을 배제하기 위해 게이트를 설정했고, 그 후 크기(FSC)와 과립도(SSC)를 기준으로 단일 세포를 선정했으며, 마지막으로 7AAD 염색을 기준으로 죽은 세포를 제외했습니다. 그 후, EPCAM-cy7과 ITGA6-BV421을 발현하는 세포를 정량하는 게이트를 염색된 샘플과 비염색 샘플을 사용해 설정하였다(그림 4B).

서로 다른 시딩 세포 밀도와 다양한 기질에서 배양된 hiPSC를 사용한 hPGCLC 분화 효율을 비교한 결과, 밀도에 따라 변하는 경향이 나타났다(그림 4C). 20–40K 세포/cm^²의 시딩 밀도에서 M54와 M199 hiPSC는 Geltrex와 Cultrex에서 유지된 hiPSC에서 달성된 EPCAM+/ITGA6+ 이중 양성 hPGCLC의 비율이 가장 높았다. 흥미롭게도, 밀도가 높을수록 분화 효율이 낮아졌습니다. pPGC 마커인 SOX17/TFAP2C/PDPN 또는 SOX17/POUF51을 사용한 면역형광 검사 결과는 유세포검사 결과를 검증했습니다(그림 4D). 이 결과들은 최적의 분화 효율을 얻기 위해 특정 hiPSCs에 맞춰 시딩 밀도를 조정하는 것이 중요함을 시사합니다. 면역형광과 유세포분석법을 결합하면 hPGCLC 분화 분석법의 견고성을 향상시킵니다.

그림 1: hPGCLC 구분 워크플로우와 hiPSC의 품질. (A) 본 연구에서 사용된 워크플로우의 도식. hiPSCs는 배양 배지 내에서 유지되었으며, 분화 당일(0일, D0)에 60–80% 일치율에 도달했습니다. D0에서는 hiPSCs를 단일 세포로 해리하여 원하는 시딩 밀도(도금 배양 내)로 플레이트링했습니다. 다음 날, 세포들은 분화 배양물(D1–D3)으로 처리한 뒤, 이어서 스위치 배지(D3–D5)를 투여했습니다. D5에서는 hPGCLC가 면역형광 또는 유세포분석에 사용되었습니다. (B) 밝은필드 이미지(상단 행 - 4배 배율); SOX2, 팔로이딘 염색, DAPI 염색(중간 행)에 대한 면역형광; POU5F1, 팔로이딘 염색, DAPI 염색(하단 행)에서는 hiPSC가 서로 다른 수합도를 보였다. 스케일 바 = 50 μm. 그림 1A의 그림은 저자들이 Adobe Illustrator의 기본 드로잉 도구를 사용해 제작했으며; 유료 소프트웨어나 도구는 사용하지 않았습니다. 따라서 저작권 라이선스는 필요하지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: hiPSC 배양 중 다양한 코팅 기판의 영향. 밝은 필드 이미지(상단 줄); SOX2, 팔로이딘 염색, DAPI 염색(중간 행)에 대한 면역형광; POU5F1, 팔로이딘 염색, DAPI 염색(하단 줄)에서는 다양한 코팅 기판에서 배양된 hiPSC를 보여줍니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

그림 3: hiPSC 배양 중 다양한 코팅 기질이 hPGCLC의 분화에 미치는 영향. 밝은 영역 이미지(상단 행 10배 확대); SOX17, TFAP2C, PDPN, DAPI 염색에 대한 면역형광(중간 행); 그리고 5일차에 다양한 코팅 기판에서 배양된 hiPSCs에서 시작하여 hPGCLCs의 분화를 POU5F1, SOX17, DAPI-염색(하단 행)(겔트렉스 사용)을 수행했습니다. 노란 점선은 hPGCLC가 있는 영역을 강조합니다. 스케일 바 = 25μm(상단 줄), 50 μm(중간 및 하단 줄). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: hiPSC 시딩 밀도가 hPGCLCs 분화에 미치는 영향. (A) hPGCLC의 분화 1일차(D1)와 D3 시각을 다른 hiPSC 시딩 밀도(40K cells/cm², 60K cells/cm2, 80K cells/cm²)를 사용한 밝은필드 이미지. 스케일 바 = 250 μm. 4배 배율. (B) EPCAM+/ITGA6+ hPGCLCs의 비율을 정량화하기 위한 게이팅 전략을 보여주는 대표적인 유세포측 플롯. 이를 위해 M199 hiPSCs(겔트렉스 위에서)를 40K 세포/cm^²의 시딩 밀도로 사용했습니다. (C) 다양한 코팅에서 배양하고 서로 다른 밀도로 씨앗을 심은 hiPSCs(M199 및 M54)를 사용했을 때 D5에서 EPCAM+/ITGA6+ hiPGCLCs의 비율을 나타내는 막대 그래프. (D) SOX17, TFAP2C, PDPN, DAPI 염색에 대한 면역형광 검사(왼쪽 패널); 그리고 hPGCLC의 분화 중 D5에서 SOX17, POU5F1, DAPI 염색(오른쪽 패널)을 40K 및 80K 세포/cm2에서 시딩한 hiPSCs(M199 및 M54, Geltrex 시)를 사용한다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

토론

시험관 내 배우자 발생은 통제된 배양 조건과 환자 특이적 기반 하에서 인간 생식세포 발달, 생식 독성, 불임을 조사하는 강력한 실험 플랫폼입니다. hPGCLC와 hiPSC를 구분하는 여러 프로토콜^{이 보고되었}으나, 연구실 간 표준화되고 확장 가능하며 재현 가능한 접근법의 제한으로 인해 진전이 저해되고 있습니다. 최근 연구들은 bMP4 기반 마이크로패턴 분화²⁷, 3.5일 이내에 hPGCLC 생성이 가능한 빠른 2D 단층 플랫폼²⁸, 착상 전 발달 및 파라크린 니치^{신호 전달을} 모델링하는 3D 배양 시스템 등 hPGCLC 유도를 위한 단순화되고 효율적인 접근법을 기술했습니다. 이 프로토콜들이 hPGCLC 차별화를 효율적으로 지원했음에도 불구하고, 여전히 고처리량 플랫폼으로서의 역할은 부족합니다. hPGCLC 기반 연구가 특히 생식 독성학 선별에 광범위하게 적용되려면, 프로토콜이 견고하고 기술적으로 접근성이 좋으며 후속 정량 분석과 호환되어야 합니다. 여기서는 hPGCLC의 BMEx 차별화 프로토콜에 대한 단계별 분석을 제시하며, 재현성과 성능을 결정하는 중요한 기술적 매개변수를 강조합니다.

성공적인 분화의 주요 결정 요인은 hiPSCs의 초기 다능성 상태입니다. 통로 번호, 세포 건강, 계통 특이적 특성, 분화 전 배양 조건 등이 hPGCLC 분화 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 초기에는 hiPSC 유지 단계에서 코팅 기질, 시딩 세포 밀도, 배양판 형식에 주의를 기울일 수 있으며, 이들은 함께 hPGCLC 분화 초기 콜로니 구조와 신호 전달 환경을 정의합니다. 본 연구는 다양한 코팅과 다양한 씨앗 밀도에 대해 배양한 hiPSCs가 hPGCLCs의 분화에 미치는 영향을 보여줍니다(겔트렉스). 여기서 테스트한 두 hiPSC 계통은 20,000–40,000 세포^/cm² 시딩 밀도에서 최대 분화 효율을 보였습니다. 이는 새로운 세포주를 도입하거나 장기간 전달 후 도입하거나 실험 레이아웃이나 배양 플레이트 형식을 변경할 때 최적의 씨앗 밀도를 결정할 필요성을 강조합니다. 표면적-부피 비율이나 성장 속도학의 사소한 변화조차도 높은 분화 효율을 유지하기 위해 최적화가 필요할 수 있습니다. 따라서 사용자는 먼저 hPGCLC 분화에 최적의 조건을 결정하기 위해 소규모 파일럿 실험을 수행할 것을 권장합니다.

견고함에도 불구하고, 이 방법은 인정해야 할 한계점이 있습니다. 여러 코팅과 밀도에 적합하지만, 분화 효율성은 후생유전학적 상태 및 통과 이력 등 hiPSC의 내재적 특성에 민감하며, 이는 완전히 조절되지 않습니다. 여러 검사된 hiPSCs는 hPGCLCs^로 분리되지 못하는 것으로 보였다. 무엇보다도, 완전히 정의된 제품인 비트론넥틴과 달리, BMEx는 배치별로 변동이 있는 동물유래 제품으로, 이는 재현성에 영향을 줄 수 있습니다. 이전에 Matrigel, Cultrex, Geltrex의 서로 다른 배치를 시험하여 일관^{된 결과를 얻}었지만, 이는 여전히 우려 사항이며, 향후 재현성과 전이 가능성을 보장하기 위해 BMEx에 대한 완전히 정의된 대안을 고려해야 합니다. 여기서는 두 개의 남성(XY) hiPSC 라인이 사용되었으나, 이 프로토콜은 여성(XX)과 남성(XY) 라인²⁶ 모두에서 테스트되었습니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 hPGCLCs를 생성했으며, 이는 hPGC와 전사적으로 유사하고 추가 발달 능력을 가진 것으로 입증되었으나(^26,34), 이후 생식세포 단계로의 추가 성숙은 여기서 다루지 않았다. 스크리닝 스타일 응용 분야에서 확장성이 입증되었지만, 자동화 기반 적응과 더 넓은 hiPSC 라인 패널에 걸친 실험실 간 검증이 번역 효용성을 더욱 강화할 것입니다.

기존의 hPGCLC 차별화 전략과 비교할 때, 이 프로토콜은 여러 가지 장점을 제공합니다. 고도로 특수화되거나 매트릭스 제한 방식과 달리, 일반적으로 사용되는 hiPSC 유지 기질과 배양 플레이트 형식을 수용하여 기술적 장벽을 낮춥니다. 밀도 최적화와 초기 단계 품질 관리에 대한 강조는 시험 관 내 배우자 형성 분야에서 지속적인 도전인 재현성을 더욱 향상시킵니다.

여기서 설명한 방법론적 틀은 생식 독성학, 불임 모델링, 발생생물학에 특히 관련성이 높습니다. 확장 가능한 형식과의 호환성은 중고처리량 화합물 스크리닝을 가능하게 하며, 재현성은 연구 간 비교와 협력 컨소시엄 노력을 지원합니다. 더 넓게는, hPGCLC 유도 프로토콜의 실험실 간 체계적 표준화와 기능 평가^{기준 18,35}를 비교하는 것이 시험관 내 배우자 형성을 예측 가능한 인간 관련 플랫폼으로 발전시키는 데 필수적일 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
7AAD 생존성 염색 용액	BioLegend	420403	희석 1:200
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
Advanced RPMI 1640 배지	Gibco	12633012
Alexa Flour 488 당나귀 항-마우스 IgG	Invitrogen	A21202	희석 1:500
Alexa Flour 594 당나귀 항-토끼 IgG	Invitrogen	A21207	희석 1:500
Alexa Flour 647 당나귀 항-염소 IgG	Invitrogen	A21447	희석 1:500
Alexa Fluor Phalloidin 594	Invitrogen	A12381	희석 1:400
Alexa Fluor Phalloidin 647	Invitrogen	A30107	희석 1:400
항체 항-CD49f (ITGA6), 브릴리언트 바이올렛 421	Biolegend	313624	희석 1:200
항체 항-CD326 (EPCAM1), PE/Cyanine7	Biolegend	324222	희석 1:200
항체 항-SOX2, 토끼 폴리클로널	Merck	ab5603	희석 1:200
항체 항-SOX17, 염소 폴리클로널	R&D Systems	AF1924	희석 1:500
항체 항-OCT3/4 (POU5F1), 마우스 단클로널	Santa Cruz Biotechnology	SC-5279	희석 1:200
항체 항-Podoplanin (PDPN), 마우스 단클로널	Abcam	ab256561	희석 1:200
항체 항-AP-2γ (TFAP2C), 토끼 폴리클로널	Cell Signaling Technology	2320S	희석 1:300
B-27 보충제, 혈청 프리	Gibco	17504044	희석 1:100
BD FACSCanto	BD Biosciences		유동 세포 분석기용 장비
BD FACSDiva 소프트웨어 버전 9.0	BD Biosciences		소프트웨어
우청 알부민(BSA), 분획 V	Roche	10735086001	PBST에 용해
CELLSTAR 12 웰 세포 배양 플레이트	Greiner	665180
CELLSTAR 15 mL 튜브	Greiner	188271
CELLSTAR 6 웰 세포 배양 플레이트	Greiner	657160
Corning 40 µm 세포 여과기	Corning	431750
Cultrex 줄기 세포 검증, 감소된 성장 인자 기저막 매트릭스	R&D systems	3434-101-02	차가운 DMEM-F12에 희석
DAPI (4′,6-다이아미디노-2-페닐인돌)	Invitrogen	D3571	희석 1:500
DMEM:F12, GlutaMAX 보충제	Gibco	31331028
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음	Gibco	14190144
EVOS M5000	Invitrogen		이미지 처리용 장비
EVOS M5000 소프트웨어 버전 1.3.660.548	Invitrogen		소프트웨어
Falcon 5 mL 라운드 바텀 폴리스티렌 테스트 튜브, 세포 여과기 스냅 캡 포함	Corning	352235
FlowJo 소프트웨어 버전 10.10.0	BD Biosciences		소프트웨어
Geltrex 감소된 성장 인자 기저막 매트릭스, LDEV-Free, 줄기 세포 검증	Gibco	A1413302	차가운 DMEM-F12에 희석
GlutaMAX 보충제	Gibco	35050061	희석 1:100
FlowJo 소프트웨어 버전 10.10.0	BD Biosciences		소프트웨어
Geltrex 감소된 성장 인자 기저막 매트릭스, LDEV-Free, 줄기 세포 검증	Gibco	A1413302	차가운 DMEM-F12에 희석
GlutaMAX 보충제	Gibco	35050061	희석 1:100
hiPSCs M54	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0054iCTRL03	MTA와 함께 요청 시 분배 가능
hiPSCs M199	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0199iCTRL01	MTA와 함께 요청 시 분배 가능
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Matrigel h