화학저항성 세포에 대한 후생유전체 전체 CRISPR-Cas9 기반 녹아웃 스크리닝

요약

여기서는 용량 증가 방식을 이용한 항암저항성 세포 생성 프로토콜을 제시하고, 이어서 후생유전학적 조절자를 표적으로 하는 집중된 sgRNA 라이브러리를 이용한 CRISPR/Cas9 기반 스크리닝을 통해 획득된 화학저항성 조절자를 규명합니다. 프로토콜은 또한 항암저항성 세포 모델에 맞춘 여러 최적화 포인트를 제공하여 내성 메커니즘을 연구하는 연구자들에게 견고한 틀을 제공합니다.

초록

항암 치료 내성은 암 치료에서 여전히 큰 도전 과제로 남아 있으며, 암세포가 적응적 특성을 획득하고, 신호 전달 경로를 재배선하며, 약물 유발 세포독성을 회피하기 위해 염색질 구조를 변화시키는 능력에 의해 촉진됩니다. 이러한 과정들은 크로마틴 조직과 전사 가소성을 조절하는 후생유전학적 메커니즘에 크게 의존하기 때문에, 후생유전적 조절 인자는 화학요법 내성의 핵심 기여자로 떠올랐습니다. 삼중음성 유방암(TNBC)에서 가장 널리 사용되는 화학요법제 중 하나인 파클리탁셀에 대한 내성을 조사하기 위해, 우리는 크로마틴 조절에 관여하는 유전자를 체계적으로 교란하도록 설계된 후생유전체 중심 녹아웃 라이브러리(EPIKOL)를 사용했습니다. 화학내성 세포주는 임상적으로 중요한 약물 적응을 재현하는 단계별 용량 증가 프로토콜을 통해 생성되었습니다. 그러나 이러한 내성 세포는 다중 약물 내성(MDR) 표현형을 보여 효율적인 바이러스 전달과 안정적인 세포 집단 선택에 큰 도전을 제기합니다. 본 연구에서는 EPIKOL CRISPR 스크리닝을 화학저항성 TNBC 모델에 성공적으로 적용할 수 있도록 고효율 렌티바이러스 전도 및 선택을 달성하기 위한 주요 방법론적 단계를 설명합니다. 기술된 프로토콜에 따라 화학저항성 TNBC 세포에 대한 후생유전체 전역 CRISPR 스크리닝이 실시되었고, 새로운 후생유전학적 화학저항성 조절인자가 확인되었습니다. 이 프로토콜은 CRISPR 기반 기능 상실 접근법을 사용하여 획득된 파클리탁셀 내성에 기여하는 후생유전학적 조절자를 규명하는 견고한 틀을 제공합니다.

서론

삼중음성 유방암(TNBC)은 유방암의 아형으로, 전체 유방암의 12–17%를 차지^합니다. 이 질환은 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR), 인간 표피 성장인자 수용체-2(HER2)의 발현 장애가 특징이며, 이는 표적 치료의 가능성을 심각하게 제한하고 기존 화학요법이 주요 치료 방식으로 남게 됩니다^. 탁산과 안트라사이클린은 TNBC 치료에 흔히 사용됩니다; 그러나 환자들은 보통 저항성을 발현합니다 ^2,3. 화학요법 내성 획득은 유전적, 대사적, 전사적, 후생유전학적 적응을 포함하는 복잡하고 다차원적인 과정입니다 ^2,4. 후생유전학적 변형은 세포 가소성의 중심 조절자로 등장하여, 암세포가 화학요법으로 인한 독성을 견딜 수 있도록 하는 동적 전사 재프로그래밍을 촉진합니다^.

탁솔(파클리탁셀)은 탁산계에 속하며, 미세소관 역학을 방해하여 세포 사멸을 일으키고 항유사분열 작용제로 기능한다⁶. TNBC 환자들은 처음에는 탁솔을 포함한 화학요법에 반응하지만, 내성이 보통 시간이 지남에 따라 발생한다². 획득성 탁솔 내성은 일반적으로 ATP 결합 카세트(ABC) 수송체, 특히 ABCB1(MDR1, P-당단백질)의 과발현과 관련이 있으며, 이 수송체는 탁솔의 약물 배출을 매개하여 세포내 약물 독성을 감소시킵니다⁷. 다양한 화학요법제가 이러한 ABC 수송체의 기질이기 때문에, 이들의 상향 조절은 다른 화학요법 약물의 사용을 제한하여 다중 약물 내성 표현형(MDR)을 초래합니다⁸. ABC 수송체 억제는 임상 환경에서 다제제 내성 극복 전략으로서 크게 성공하지 못한 것으로 입증되었으며, 이는 주로 ABC 발현과 다양한 내인성 및 외인성 기질의 운반에 필수적인 역할 때문입니다⁹. 1세대 ABCB1 억제제인 베라파밀은 임상적 이점이 제한적이거나 전혀 없었고 임상시험에서 유의미한 독성과 연관되어 있었지만(¹⁰), MDR 시험 관 내 모델 선택 효율성을 향상시키는 귀중한 실험 도구로 남아 있습니다.

MDR 표현형은 주로 스트레스 조건에서 나타나는 역동적이고 적응적인 과정입니다^. ABC 수송체 발현은 돌연변이 사건보다는 전사 및 후생유전학적 조절 메커니즘에 의해 주로 조절됩니다 ^5,11. ABC 수송체를 직접 표적으로 삼는 제한은 내성 세포에 특이적인 취약점임을 확인하기 위해 이러한 단백질의 상류 조절자를 규명할 필요성을 강조합니다. 따라서 후생유전학적 요인에 대한 체계적인 조사는 화학요법 내성의 새로운 조절자를 규명하고 이러한 취약점을 겨냥한 병용 요법을 개발하는 중요한 전략이 되었습니다.

CRISPR-Cas9 기반 기능적 녹아웃 스크리닝은 편향 없고 체계적인 전반 유전체 교란을 가능하게 하여 암에서 유전자 손실의 유전체 스케일에 대한 영향을 연구할 수 있습니다¹². 그러나 유전체 전체 CRISPR 라이브러리는 유전자당 단일 가이드 RNA(sgRNA) 표현이 제한적이어서 집중 라이브러리에 비해 민감도가 감소합니다^. 중요하게도, 견고한 스크리닝은 섭동의 품질뿐만 아니라 적절한 모델과 최적화된 실험 프로토콜에도 의존합니다. 이러한 맥락에서, 약물 내성과 같은 역동적이고 복잡한 과정을 연구하는 것은 맞춤형 프로토콜을 갖춘 집중된 라이브러리¹³의 도움이 될 수 있습니다. 이전 연구에서는 후생유전체에 초점을 맞춘 CRISPR-Cas9 녹아웃 라이브러리를 생성하여 염색질 조절자를 표적으로^{했습니다.} 다른 공개된 후생유전체 중심 CRISPR 라이브러리와 비교할 때, 후생유전학 녹아웃 라이브러리(EPIKOL)는 779개의 유전자를 포함하고 있으며, 여기에는 염색질 리더, 작곡자, 지우기 및 관련 단백질이 각각 10개의 sgRNA로 표적되어 유전자당 깊이가 증가하고 염색질 중심 기능 스크리닝의 견고성과 재현성을 향상시킵니다¹⁴. EPIKOL은 Cas9가 다른 벡터에서 발현되는 LentiGuide 시스템과 Cas9을 포함하는 LentiCRISPR 시스템 모두에서 제공되며, 세포주에 따라 유연성을 제공합니다. 충분한 라이브러리 커버리지(sgRNA당 평균 세포 수(예: 500×–1000×)를 달성하는 것은 유전체 전체 라이브러리에 비해 EPIKOL이 더 쉬워 느리게 성장하는 화학저항성 세포주 연구에 유리합니다.

CRISPR 스크리닝은 화학저항성 기전을 조사하는 강력한 접근법을 제공하지만, 표준 통합 스크리닝 워크플로우는 활성 약물 유출이 있는 화학저항성 세포에 최적화되어 있지 않습니다. 렌티바이러스 CRISPR 시스템에서 흔히 사용되는 선택적 항생제인 푸로마이신은 ABC 수송체, 주로 ABCB1에 의해 내성 세포에서 배출될 수 있어 형질전환 세포의 성공적인 선택을 방해합니다^15,16. 이러한 한계는 세포 집단의 이질성을 초래하고, 배경 잡음을 증가시키며, 궁극적으로 데이터 품질을 저하시킬 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 베라파밀로 ABC 매개 약물 배출을 일시적으로 억제하여 sgRNA 감염 세포의 효율적인 농축을 가능하게 하여 푸로마이신 선택 단계를 최적화했습니다. 이 전략을 사용하여 우리는 TNBC¹⁷에서 ABCB1 발현과 탁솔 내성을 조절하는 물질로 브로모도메인과 PHD 핑거 포함 1(BRPF1)을 확인하였습니다. BRPF1 억제는 유전적 또는 약리학적으로 내성 세포에서 탁솔 민감성을 회복시켜, 이 최적화된 프로토콜이^{화학저항성} 내 실행 가능한 표적을 식별하는 데 유용함을 입증했습니다.

여기서는 항암내성 모델에서의 음성 선택 CRISPR 스크리닝의 핵심 단계를 개괄하며, 특히 대부분의 항암내성 또는 CRISPR 선별 프로토콜에서 종종 간과되는 기술적 도전에 초점을 맞춥니다. 프로토콜은 먼저 화학저항성 세포 생성을 위한 단계별 용량 증가 방법을 시연하고, 이후 ABC 수송체 매개 약물 배출을 극복하기 위해 바이러스 전달 및 선택 조건을 최적화합니다. 이러한 최적화는 CRISPR 스크리닝 중 sgRNA 양성 세포의 효율적인 농축을 보장하고, 비형질 세포를 효과적으로 제거하여 화학저항성 TNBC 세포에서 전도 및 선택에 대한 견고하고 효율적인 전략을 제공합니다. 마지막으로, 프로토콜은 차세대 시퀀싱과 생물정보학 분석을 통해 CRISPR 스크리닝 성공률을 식별하는 기본을 강조합니다.  이 프로토콜은 EPIKOL 스크리닝 플랫폼을 효과적으로 구현하여 내성 17,18,19를 극복할 잠재적 치료 표적을 식별할 수 있게 합니다.

프로토콜

이 연구에 사용된 모든 시약과 장비는 재료표에 제공되어 있습니다.

1. 탁솔 내성 삼중음성 유방암 세포주 생성

1. 세포의 약물 민감도를 결정하기 위해, 96웰 검은색 투명 바닥판에서 Ham's F12 영양 혼합물에 5% 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신, 5 μg/mL 인슐린, 10 mM HEPES, 1 μL/mL 하이드로코르티손을 보충하여 96 웰 투명 바닥판에서 SUM159PT 부착 세포 밀도를 2× 10^{3 세포로} 조절하고, 세포를 37°C, 5%_CO-2 배양 인큐베이터에서 16시간 배양합니다.
2. 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해된 탁솔 스톡을 준비합니다. 세포 처리를 위해 0.3 nM에서 10 μM까지 다양한 배양액에서 탁솔을 연속 희석하여 제조하고(예: 0.3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 300 nM, 300 nM, 1μM), DMSO를 단독으로 임시 대조군으로 사용한다.
3. 200 μL 증가량의 탁솔(1.2단계에서 준비됨)을 3회로 처리하고, 5%_CO2로 37°C에서 세포 배양 인큐베이터에 72시간 동안 보관합니다.
4. 약물 치료 72시간 후, 발광 기반 아데노신 삼인산(ATP) 정량 세포 생존 가능성 분석법으로 세포 생존력을 측정합니다. 마이크로플레이트 리더기를 사용해 발광을 측정하고 값을 DMSO 제어에 맞게 정규화하세요. 적절한 통계 소프트웨어에서 4가지 매개변수 로지스틱 선량-반응 모델을 사용하여 비선형 회귀로 10% 억제 농도(IC10)와 IC50 값을 계산합니다.
5. 항암저항성 세포를 생성하기 위해서는 6웰 플레이트에 웰당 10×^{5개의 SUM159PT} 세포를 시드합니다. 5%_CO2와 함께 37°C에서 하룻밤 배양하세요.
6. 다음 날, IC10 또는 IC50 수치의 탁솔을 2mL 배양 배지 내 72시간 동안 시작 농도로 처리합니다.
7. 세포가 현재 약물 농도를 견딜 수 있다면, 두 개의 웰로 나누세요. 신선한 배지에 백업 조절 우물을 하나 유지하고, 두 번째 우물의 배지를 이전 탁솔 농도의 두 배 함유한 배지로 교체하세요.
   참고: 비정상적인 세포 돌출, 광범위한 둥글고 분리, 증식의 현저한 감소 등 스트레스로 인한 형태학적 변화로 인해 회복이 필요한 세포는 약물 없는 배지에 보관하고 세포가 건강하고 융합될 때까지 기다리십시오. 그 다음 1.7단계부터 시작하는 단계를 반복하세요.
8. 내성 세포를 생성할 때, DMSO 함유 배지를 대조군으로 사용하는 부모 세포를 통과시킵니다. DMSO의 양을 해당 탁솔 처리에 포함된 DMSO의 양에 맞게 조정하세요.
9. 1.2–1.4단계에 따라 3–4주마다 세포 생존력을 측정하고, 이 과정을 반복하여 적용된 약물에 따라 p< IC50 값 간 유의미한 차이(약 종류에 따라 0.05배 또는 10–50배)가 나타날 때까지 진행합니다. 용량 증량 절차는 일반적으로 약물에 따라 6개월에서 9개월 정도 소요됩니다.
10. 안정된 내성 세포를 얻은 후, 내성 표현형을 보존하기 위해 배양하면서 약물의 유지 용량(마지막 적용 용량)으로 유지합니다.
    참고: 용량 증폭 방법을 이용한 항암저항성 세포 생성은 시간이 많이 소요되며, 그 기간은 세포주, 내인성 성장 속도, 사용된 특정 화학요법제 등 여러 요인에 따라 달라집니다. 일반적으로 임상적으로 관련된 저항 수준에 따라 6개월에서 9개월이 소요됩니다. 내성 수준의 유의미한 차이를 판단하는 또 다른 방법은 내성 세포는 생존하지만 부모 세포는 생존하지 않는 최소 약물 농도를 평가하는 것입니다.
11. 내성 세포의 특성 분석: RNA 시퀀싱, 웨스턴 블로팅, 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR), 약물 처리(예: 콜로니 형성 분석)와 함께 세포 생존성 검사를 수행하여 내성 세포 표현형을 특성화합니다. 여러 번 검사한 후 내성 표현형을 재평가하여 IC50 표현형이 시간이 지남에 따라 안정적임을 입증하세요.

2. 렌티바이러스 생성

1. 0일차: 100mm^당 100mm× 6개의 세포를 4 100mm당 6개로 씨앗 채HEK293T우고, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하여 다음 날 90% 수합을 달성했습니다.
2. 1일차: 각 바이러스별로 폴리에틸레니민(PEI)과 DNA 혼합물을 혈청 무첨가 DMEM(-/-)에 각각 각각 준비합니다. 표 1 과 표 2 를 사용하여 원하는 바이러스 수량에 따라 PEI와 DNA의 부피와 농도를 조정하세요.
   참고: PEI는 총 DNA μg의 4배에 사용되며(예: 100mm 플레이트에서는 30 μL PEI를 사용해 총 7.5 μg DNA를 얻습니다). 이 프로토콜에서는 100mm 접시에서 바이러스 생산을 따르며, 5–10개의 100mm 접시에서 얻은 바이러스는 여러 번 스크리닝을 수행할 수 있게 합니다. 검증 실험이나 소규모 감염의 경우, 6웰 플레이트 단일 웰이나 60mm 접시면 충분합니다. 선형 폴리에틸레니민 염산염은 독성 형질전환제이므로, 형질전환 시 세포 융합률이 90%인지 반드시 확인하세요.
   1. 충분히 섞은 후, PEI 튜브에 DNA 혼합물을 넣습니다. 잘 섞고 PEI-DNA 복합체를 상온에서 30분간 보관하세요.
   2. 그 다음 600 μL PEI-DNA 복합체를 HEK293T에 드롭 단위로 추가합니다. 5%_CO2를 함유한 37°C에서 바이러스 인큐베이터에 16시간 동안 플레이트를 넣습니다.
3. 2일차: 감염된 세포 배지를 교체하여 PEI와 바이러스 함유 배지를 흡인하고, 100mm 조직 배양 접시당 완전 DMEM 8mL를 추가합니다. 세포를 배양하여 바이러스 생성을 가능하게 하세요.
4. 3일차: 8mL의 상원액을 적절한 크기의 원심분리관에 부드럽게 제거하여 4°C에서 보관하여 첫 바이러스 채취를 수행합니다. 바이러스 생성용 여러 판이 있다면 상원액을 합치세요. 그 다음 각 접시에 신선하고 완전 DMEM 8mL를 넣고 배지판을 바이러스 인큐베이터로 돌려놓습니다.
5. 4일차: 수집 단계를 반복하고 3일차부터 상원액과 결합합니다.
   1. 50% (w/v) 폴리에틸렌글리콜(PEG)-8000 용액을 인산염 완충식염수(PBS)에 조제하여 5× PEG 스톡 용액을 얻습니다. 오토클레이브를 녹이고 멸균하는 용도로.
   2. 300 x g 에서 5분간 원심분리하여 잔류 세포를 펠릿으로 제거한 후 여과로 진행합니다.
   3. 0.45 μm 필터(주사기 또는 50 mL 진공 필터)를 4 mL PEG 용액이 담긴 튜브에 16 mL의 바이러스 상정액을 여과하여 최종 1× PEG 농도를 얻고 남은 이물질과 세포를 제거합니다.
   4. 튜브를 막고 반전으로 믹싱하세요. 이 과정을 모든 바이러스 제제에 반복하세요. 어두운 곳에서 4°C에서 하룻밤 보관하며, 선택적으로 부드러운 저어주기를 선택하세요.
   5. 다음 날에는 눈에 띄는 강전물이 나타날 것입니다. 튜브를 1400 x g 에서 4 °C에서 20분간 원심분리합니다.
      참고: PEG 침전된 바이러스 펠릿은 원심분리 5일 전까지 4°C에서 보관할 수 있습니다; 하지만 바이러스 역가는 잠복 기간이 길어질수록 감소할 수 있습니다.
   6. 원심분리 후에는 상청액을 조심스럽게 버리고, 펠릿을 방해하지 않도록 튜브 내에 약 100 μL의 소량을 남겨둡니다.
   7. 튜브를 300 x g 에서 5분간 원심분리하여 튜브 측면에서 가능한 한 많은 액체를 모으세요. 그 후 남은 상정액을 조심스럽게 버리세요.
   8. 바이러스를 100배 농축하려면 바이러스 상원액의 초기 부피의 1/100에 PBS를 첨가한 후 피펫팅으로 펠릿을 재현탁합니다(예: 16mL 바이러스 상청액으로 시작할 경우 120–140 μL의 PBS를 펠릿에 첨가하여 최종 부피 160 μL에 도달하며, 이는 펠릿 부피를 고려합니다). 격한 피펫 사용을 피하세요; 바이러스를 알리콥터로 투여하세요.
      참고: PEG 농도 후 예상 역가는 LentiGuide 시스템의 경우 >1 ×^{10 8} 감염 입자/mL(ip/mL), LentiCRISPR 시스템의 경우 > 1 × 10 7입니다. 한 자릿수 낮은 역가는 허용될 수 있으나, 표적 세포주의 감염성 및 필요한 바이러스 양과 비교해 검증해야 합니다.
   9. 바이러스 농도가 필요하지 않다면 동결-해동 주기를 최소화하기 위해 바이러스를 분리해 보관하세요. 농축 또는 비농축 바이러스는 -80 °C에 보관하세요. 표백제와 쓰레기 접시.
      참고: 렌티바이러스 생성 및 처리에 대한 더 자세한 설명을 원하시면 정립된 프로토콜²⁰을 참고하시기 바랍니다. 렌티바이러스 생성 과정에서 흔히 발생하는 문제에 대해서는 보충 표 1을 참조하십시오.

	6웰 플레이트 1개의 웰	60 mm 판	100 mm 판	150 mm 판
PEI(기본 1 mg/mL) 용량	6 μL	9 μL	30 μL	60 μL
DMEM (-/-) 볼륨	54 μL	100 μL	270 μL	540 μL

표 1: PEI 혼합물에 따라 다른 플레이트에 필요한 PEI 및 DMEM 부피.

	6웰 플레이트 1개의 웰	60 mm 판	100 mm 판	150 mm 판
VSV-G	75 ng	150 ng	375 ng	750 ng
개그-폴	675 ng	1350 ng	3375 ng	6750 ng
타겟 벡터	750 ng	1500 ng	3750 ng	7500 ng
DMEM (-/-) 최종 볼륨을 다음과 같이 조정하세요	60 μL	100 μL	300 μL	600 μL

표 2: DNA 혼합물의 다양한 플레이트에 필요한 플라스미드 및 DMEM 부피.

3. MDR 세포에 최적화된 푸로마이신 선택 확립

참고: ABCB1 과발현을 보이는 항암내성 세포에서는 ABCB1 매개 푸로마이신의 활성 배출로 인해 푸로마이신 선택이 실패하여 sgRNA 감염 세포의 효과적인 선택이 방해됩니다. 이 한계를 극복하기 위해 베라파밀은 푸로마이신과 함께 투여되어 ABCB1 매개 유출을 일시적으로 억제하여 세포 내 축적을 가능하게 하고 감염되지 않은 세포를 효율적으로 제거합니다.

1. 세포 생존력에 영향을 주지 않으면서도 ABCB1 매개 약물 배출을 차단하는 베라파밀 농도를 결정합니다. 이를 위해 내성을 얻은 항암제(이 경우 탁솔)와 함께 베라파밀 용량을 증가시키는 것을 사용하세요.
   1. 씨앗 SUM159PT 탁솔 내성 및 부모 세포를 3회로 3중 2×^{3개의 웰} 크기로 96웰 검은색 투명 바닥판으로 형성합니다. 세포를 37°C에서 5%_CO2로 하룻밤 배양합니다.
   2. 베라파밀을 연속적으로 희석한 세포(0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 μM)로 처리하되, 모든 조건에서 탁솔 농도(예: 유지 용량)를 일정하게 유지합니다.
   3. 치료 72시간 후, 발광 기반 ATP 정량 세포 생존 검사로 세포 생존력을 평가합니다. 베라파밀 농도는 자체적으로 생존력을 감소시키지 않으며(≥처리되지 않은 대조군 대비 90%–95% 생존율) 내성 세포에서 민감도를 회복시키는 농도를 결정합니다.
2. 베라파밀과 함께 사용할 푸로마이신 농도를 찾기 위해, 탁솔 내성 세포를 96웰 플레이트에 시드 SUM159PT 2× 10^{3 셀씩}포착합니다. 5%_CO2로 37°C에서 16시간 배양합니다.
   1. 이전에 결정된 베라파밀 농도를 포함한 배지에서 퓨로마이신(0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 μg/mL)을 연속 희석하여 제거하고 그에 맞게 세포를 처리합니다.
   2. 72시간 후에는 발광 기반 ATP 정량 세포 생존 분석법으로 세포 생존력을 측정하고, 베라파밀 존재 시 모든 세포를 제거하는 최소 농도(≤5% 생존율)를 결정합니다. 이 농도는 CRISPR 선별 시 선별에 사용됩니다.
      참고: 이러한 약물 농도 최적화 단계는 세포주와 상황에 따라 다릅니다. 내재적 약물 민감도, ABC 수송체 발현 수준, 성장률과 같은 요인들이 유효 농도에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 각 새로운 세포주 및 저항성 모델마다 이 최적화를 수행하세요. (참고로, 본 연구에서 사용되는 탁솔 내성 세포에는 5 μg/mL 푸로마이신과 20 μM 베라파밀이 함께 사용된다¹⁷). 푸로마이신 + 베라파밀 선택 문제 해결은 보충 표 1을 참조하세요.

4. 바이러스 조절 및 감염 다중성(MOI) 계산

1. 1일차: 6웰 플레이트의 각 웰에 2× 10⁵개의 탁솔 내성 세포를 완전한 햄스 F12 영양 혼합물로 SUM159PT씨앗.
2. 0일차: 프로타민 황산염(PS)이 포함된 햄의 F12 영양소 혼합물에서 바이러스를 8 μg/mL로 4회 연속 희석합니다. (농축 바이러스의 경우, 1 μL에서 시작하여 희석 10-1 >> ^{10-1 10-2} > ^10-3으로 희석합니다. 농축되지 않은 바이러스의 경우, 부피를 조절하세요(예: 100 μL > 10 μL > 1 μL > 0.1 μL ).
   1. 네 개의 웰 각각에 1mL의 바이러스 함유 배지를 투여합니다. 한 곳은 푸로마이신 선택 통제군으로, 다른 한 곳은 미처리 대조군으로 남겨두세요.
3. 1일차: 감염 후 16시간 후 바이러스 배지를 2mL의 신선한 배지로 교체합니다.
4. 2일차: 각 웰의 세포 내용물을 100mm 세포 배양 접시에 옮기고, 3.2단계에서 정한 농도에 퓨로마이신 + 베라파밀을 포함한 햄스 F12 영양소 혼합물. 선택되지 않은 셀이 과잉 합류할 경우, 정의된 분율(예: 1/2)을 시딩하며, 최종 계산 시 이를 고려합니다.
   참고: 필요 시 신선한 푸로마이신 + 베라파밀을 배지를 3-4일 동안 보조하여 대조판의 모든 세포가 죽을 때까지 유지하세요.
5. 4일차부터 5일차까지: 대조판 내 세포가 죽으면 계수에 충분한 세포가 있는 판을 결정합니다. 세포를 트립신화하고, 셀 수 있으며, 총 세포 수를 결정합니다.
6. 생존 세포를 세고 나서, 다음과 같이 전도 효율과 감염 다중성(MOI)을 계산하세요( 보조 표 2 를 템플릿으로 사용).
   1. 아래 공식을 사용하여 전도율(감염 세포의 비율)을 계산합니다.
      
      
      _{N 선택}: 감염된 웰에서 푸로마이신 선택 후 총 세포 수
      N_대조: 전도되지 않고 선택되지 않은 대조 우물에 있는 세포의 총 수입니다
      p: 전도율(감염된 세포의 비율).
      참고: 처리되지 않은 대조군 세포의 일부만 시딩되었다면, N_대조군을 계산할 때 이를 고려하세요
   2. MOI를 계산하세요. 렌티바이러스 전도에서는 감염 사건이 포아송 분포를 따릅니다. 따라서 적어도 하나의 바이러스에 감염된 세포의 비율은 다음과 같이 정의됩니다:
      p =1- e ^-MOI
      따라서 MOI는 다음과 같이 계산합니다:
      MOI = - ln(1-p)
   3. 감염 세포 수를 기준으로 렌티바이러스 역가(감염성 입자/밀리리터, IP/mL)를 계산합니다:
      역가(IP/mL) = (_시작 MOI x N) / 바이러스 부피
      N_{시작 시간}: 감염을 위해 씨앗 채운 세포 수
      바이러스 부피: 웰당 첨가된 바이러스 부피(mL)
      참고: 각 감염에 대해 렌티바이러스 역가를 별도로 계산하고, 바이러스 양과 역가 값을 비례하는 웰들의 평균을 취하여 최종 역가를 결정하세요. 포화 상태나 비례 스케일링에서 벗어난 웰은 역가 계산에서 제외해야 합니다.

5. Cas9 발현 안정 세포주의 생성 및/또는 검증

참고: LentiGuide_EPIKOL 사용 시 이 단계는 필수입니다. 검증된 Cas9 안정 라인이 이미 있거나 LentiCRISPR_v2_EPIKOL 사용 중이라면 바로 섹션 6으로 이동하세요.

1. 2절에 설명된 LentiCas9_blast 벡터를 사용하여 Cas9 렌티바이러스를 생산합니다.
2. 다음 날 세포를 감염시키고, MOI는 10입니다. 4절의 의도된 MOI에 따라 바이러스 양을 계산하고, 계산된 바이러스 부피를 사용해 8 μg/mL 프로타민 황산염(PS)이 포함된 배양지를 담은 배양지를 가진 배지의 세포에 직접 투여합니다.
3. 감염 후 16시간 후 바이러스 배지를 신선한 배지로 교체하세요
4. 다음 날, 이전에 결정된 블라스트사이드딘 농도가 포함된 배양지를 세포에 투여하여 블라스트사이드 선택을 적용합니다(최종 농도는 3절에서 설명한 세포 생존 분석으로 세포주별로 결정됨). 감염되지 않은 세포가 제거될 때까지(보통 6–7일)
   참고: Cas9 발현 세포가 선별 전에 장기간 배양될 경우, Cas9 음성 세포를 제거하기 위해 방반산 제거 과정을 반복합니다.
5. Cas9 검증(권장): 필수 유전자(sgRNA 서열은 EPIKOL 라이브러리 내에 있음; 보충표 3 참조)나 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 리포터 시스템을 사용하여 녹아웃 효율과 반응학을 평가하는 대조 sgRNA를 사용하여 Cas9 활성을 검증합니다. 상세한 검증 방법은 이전 연구에서 확인할 수 있습니다¹⁹.

6. 후생유전체 전역 CRISPR 녹아웃 렌티바이러스 라이브러리 감염 및 선별

참고: 정확한 유전자형-표현형 매핑을 보장하기 위해, 통합 CRISPR 스크리닝은 낮은 MOI 감염과 충분한 라이브러리 커버리지(일반적으로 500×–1000)가 필요하며, 이는 실험적 엄격성과 세포주 행동에 따라 다릅니다. 라이브러리 설계 및 실험 설정을 포함한 통합 유전체 CRISPR 스크리닝 워크플로우의 일반 원칙은 이전에 발표된 프로토콜^21,22를 참조하십시오. EPIKOL의 경우, 전체 검사 범위 내에서 >500배 보장을 강력히 권장하는데, 이 임계값 이하로 떨어지면 확률적 sgRNA 손실 위험이 증가하며, 특히 약물 치료 단계의 스크리닝에서 더욱 그렇습니다. 다음 계산은 저MOI 감염을 저도서관 복잡성을 저해하지 않으면서 EPIKOL 전이요법을 수행하기 위해 필요한 시작 세포 수, 전이 효율, 바이러스 부피를 결정하기 위해 필요합니다.

1. 1일차: 100mm 또는 150mm 배양 배양 접시에 계산된 총 세포 수를 적절한 플레이트당 개수에 씨앗 뿌립니다.
   1. 원하는 라이브러리 커버리지에 도달하기 위해 성공적으로 감염된 세포 수를 계산합니다( 보조 표 2 를 템플릿으로 사용):
      _{N 감염} = (sgRNA 수) × (표적 커버리지)
   2. 낮은 MOI(0.3–0.4) 감염 시 감염되지 않은 세포 비율을 보상하기 위해 복제당 시작 세포 수를 계산합니다:
      N_시작 = _{N 감염/}p
      여기서 p는 포아송 분포를 기반으로 결정된 전도율(감염된 세포의 비율)입니다(4.6단계 참조).
      참고: 이 조정은 낮은 MOI 감염 시 원하는 라이브러리 커버리지에 도달할 수 있도록 충분한 수의 단일 sgRNA 감염 세포가 풀에 존재하도록 보장합니다.
2. 0일차 - 변환
   1. 복제당 필요한 바이러스 양을 계산하세요
      필요한 바이러스 양 = (최대 ×_시작 점 N) / (바이러스 역가(이전에 산정된 ip/mL))
      참고: 목표 MOI 범위 0.3–0.4에서의 전도 효율은 대략 다음과 같습니다
      선택 전 26%–33%의 푸로마이신 내성 세포.
   2. 8 μg/mL 프로타민 황산염(PS)이 포함된 전체 배양 배지에서 계산된 바이러스 부피로 세포를 감염시킵니다. 감염 중 바이러스-세포 접촉을 늘리기 위해 배지 부피를 줄이세요(예: 100mm 플레이트의 경우 10 mL 대신 8 mL)
   3. 각 생물학적 복제체마다 독립적인 감염 혼합물을 준비하세요.
      참고: 최소 두 개의 생물학적 복제가 권장됩니다; 세 명이 선호됩니다. 생물학적 복제체는 각각 개량, 선별, 유지(배지 변경 및 통과 포함)되어야 하며, 시퀀싱 이전에 어떤 단계에서도 풀어서는 안 됩니다.
3. 1일차 - 16시간 후 바이러스 배지를 신선한 배지로 교체하고 37°C에서 5%_CO2와 함께 배양합니다
4. 2일차 - 형상 세포 선별: 베라파밀(3.2단계에서 결정된 농도) 존재 하에 푸로마이신 선택을 적용하여 SUM159PT 탁솔 내성 세포의 sgRNA 감염 세포를 농축합니다. 감염되지 않은 대조판의 모든 세포가 제거될 때까지 선택을 계속합니다(보통 ~3일).
5. 5일차 - T₀ 참조 샘플링: 푸로마이신 + 베라파밀 선택이 완료된 후, 세포를 트립신화하고 각 생물학적 복제체에서 전달 과정에서 결정된 커버리지 수준에 해당하는 초기 시간 0 (T₀) 세포 펠릿을 수집합니다. 초기 라이브러리 배포의 기준점이 될 것이므로, 세포 손실이 발생하기 전에 셀 펠릿을 선택이 완료되자마자 즉시 수집하세요. 항상 통신 범위를 유지할 수 있도록 충분한 셀 번호를 시딩하세요.
   참고: 푸로마이신 + 베라파밀 선택 후에는 세포주의 두 배 생성 시간과 달성한 전도 효율에 따라 생존한 형질전이 세포 수가 달라집니다. 생존한 개체군은 일반적으로 선별이 완료되면 초기 씨앗 밀도로 회복되며, 성장이 빠른 세포주에서는 이를 초과할 수 있습니다. 생존한 셀 번호가 허락한다면, 여러 개의 T₀ 펠릿을 채취하고 백업 샘플을 -80 °C에서 냉동하세요. 또한, EPIKOL 감염 세포는 액체 질소에서 냉동 보존하면서 덮개를 유지할 수 있습니다. 이러한 예기치 않은 스크리닝 실패 시나 향후 대체 실험 접근법(예: 추가 약물 치료 시험)을 위해 해동할 수 있습니다. 감염되지 않은 제어 플레이트를 사용하여 전도 효율을 점검하여 의도한 전도 효율이 달성되었는지 확인하라(4절 참조). 관찰된 전도 효율이 예상보다 높으면, 실험을 재개하여 전도가 낮은 MOI에서 수행되도록 하여 세포당 여러 sgRNA 통합을 방지합니다.
6. 스크린 실행: Cas9 매개 게놈 편집이 완료된 후, 5절에서 정한 기간 동안 세포를 처리 그룹으로 나눕니다.
   참고: 이 과정은 일반적으로 전개 후 7일에서 9일이 걸리며, 최대 노크아웃 효율은 대략 전도후 7일차²³일에 도달합니다. 후생유전학적 표적의 경우, 9일간의 창은 약물 선택 시작 전 염색질 수준에서 변화를 허용합니다.
   1. 세포를 실험군으로 나누면서 복용량을 유지합니다: 하나는 DMSO를 투여하는 기준선 상태인 대조군이고, 다른 하나는 탁솔을 투여받는 상태인 치료군입니다.
   2. 개체군 14–16배 동안 배양 유지. 인구 두 배 수준(PDL)은 다음과 같이 계산됩니다:
      PDL = PDL_s + 3.322 (로그 C_f – 로그 C_i)
      PDL_s = 시작 인구 두 배 수준
      C_i = 초기 셀 번호 시드
      C_f = 성장기 말의 총 세포 수
   3. 각 통과마다 생존력과 성장 속도론을 모니터링하고, 적절한 세포 수를 유지하여 병목 현상을 피하세요. 과도한 세포 사사가 발생하면 치료 강도를 조정하세요.
      참고: 각 통과마다 주간 또는 특정 PDL에서 백업 세포 펠릿을 수집하는 것을 목표로 하세요. 이 백업 샘플들은 시퀀싱의 대체 시점이나 유전체 DNA 추출 과정의 최적화 샘플로 활용될 수 있습니다. 예상치 못한 세포 손실을 막기 위해 주기적으로 냉동 보존 세포를 보관하세요.
7. _{최종 샘플}링: 원하는 PDL에 도달하면 각 복제와 조건별로 각 펠릿별 라이브러리 커버리지를 유지하여 최종 시간점 펠릿(T_최종)을 수집합니다. -80 °C에서 gDNA 추출을 할 때까지 펠릿을 보관하세요.
   참고: 배양 시간이 조건별로 다르더라도 비교 가능한 PDL에서 스크리닝을 종료하는 것을 목표로 하세요.

7. 유전체 DNA 추출

1. 검증된 방법(예: MN NucleoSpin 조직 키트)을 사용하여 유전체 DNA(gDNA)를 추출하며, 큰 집합 세포 펠릿에서 용해 효율을 높이기 위한 소폭 프로토콜 조정을 합니다.
   1. 큰 펠릿 크기 때문에 세포 프로토콜보다는 조직 프로토콜을 따르세요. 필요하다면 시약 용량을 늘리고 셀 펠릿당 여러 개의 스핀 컬럼(컬럼당 5개 × 10개^6셀을 초과하지 않음)을 사용하는 것을 고려해 효율적인 용해를 보장할 수 있습니다.
      참고: 용해 전에 최소한의 PBS(~50 μL)로 펠릿을 재현탁하면 용해 효율을 높일 수 있습니다. 펠릿의 불완전한 용해는 스핀 컬럼을 막아 DNA 수율이 감소할 수 있습니다.
   2. 고수율 및 고농도 용출 권장사항을 따르세요. 특히 세포 펠릿을 여러 컬럼으로 나누는 경우, 권장 부피의 약 2/3 용량의 용출 버퍼 용량을 줄여 컬럼당 gDNA를 용출합니다.
2. gDNA의 질과 양을 측정하세요(예: 나노드롭).

8. 유전체 DNA에서 추출한 EPIKOL 시퀀싱 라이브러리 준비

1. 전용 PCR 캐비닛을 사용하여 모든 라이브러리 PCR 단계를 수행하여 gDNA PCR 중 플라스미드 오염을 방지하세요. 플라스미드 주형은 유전체 DNA보다 증폭이 더 효율적이며, sgRNA 분포를 왜곡할 수 있습니다.
   1. 작업 공간, 마이크로피펫, 랙을 각각 10% 표백제와 70% 에탄올로 청소하세요.
   2. 사용 전에 모든 시약(특히 프라이머)을 일회용 용량으로 분할 배치하여 교차 오염과 동결-해동 사이클 위험을 줄이세요.
   3. 시약은 -20 °C에 보관하고 PCR 설치 시 얼음에 보관하세요.
2. 적절한 라이브러리 복잡도를 유지하기 위해 sgRNA당 200×–500× 커버리지를 목표로 하여 시작 gDNA 입력량을 최적화합니다. 예시: EPIKOL 라이브러리에서는 gDNA가 1000× 커버리지에서 수집된 세포 펠릿에서 추출하는 것이 선호되며, 최종 250× 커버리지는 gDNA 증폭에 사용됩니다.
   1. 원하는 커버리지를 위해 필요한 gDNA 입력량을 다음과 같이 계산합니다.
      gDNA 양 = (sgRNA 수) × 범위 × (66pg DNA/핵)
      예시: 8000 gRNA ×(250× 커버리지) × (6.6 pg DNA/핵) = 13.2 μg gDNA/샘플을 증폭해야 합니다.
   2. 표 3, 표 4, 표 5, 표 6의 외부 및 내부 PCR 반응 조건을 사용하여 반응당 gDNA 양을 점차 증가시키고(예: 1 μg, 3 μg, 6 μg) 검사 PCR을 수행하여 튜브당 최적의 gDNA 양을 결정합니다.
      참고: gDNA 입력 부족이나 과도한 PCR 순환은 증폭 편향을 유발하고 sgRNA 커버리지를 왜곡할 수 있습니다.
   3. 내부 PCR 산물을 분석하기 위해 2% 아가로스 겔을 돌리세요. 약 350 bp 지점에서 밝은 띠가 관찰되도록 하세요.
   4. 튜브당 최적의 gDNA 양을 바탕으로, 원하는 라이브러리 커버리지를 달성하면서 개별 반응당 과도한 gDNA 양을 피하기 위해 샘플당 필요한 총 PCR 반응 수를 산출합니다.
      참고: 총 gDNA 13.2 μg가 필요하고 반응당 3.3 μg가 최적의 증폭을 위해 가능하다면, 100 μL 반응 부피에 3.3 μg의 gDNA를 사용한 4개의 병렬 PCR 반응을 준비하십시오. 이 환경에서는 과도한 주형 입력으로 인한 PCR 억제를 피하기 위해 gDNA 부피가 반응 부피의 10%를 초과해서는 안 됩니다.
3. gDNA 템플릿에서 sgRNA 카세트를 증폭하기 (First/외부 PCR)
   1. 보충표 2에 나열된 프라이머를 사용하여 안정적으로 통합된 렌티바이러스 sgRNA 카세트를 포함하는 유전체 영역을 증폭합니다. 표 4의 PCR 반응 조건을 사용하여 8.2단계에서 결정된 gDNA 양(표 3 참조)으로 PCR 반응을 수행합니다. 템플릿 DNA가 없는 PCR 대조관을 준비하여 오염 가능성을 확인하고, 튜브는 항상 얼음 위에 보관하세요.
   2. 마지막으로 DNA 중합효소를 추가하고, 탭핑이나 피펫팅으로 잘 섞은 뒤, PCR 튜브를 잠시 회전시켜 열순환기에 넣으세요. 비특이적 증폭을 방지하기 위해 핫스타트를 수행하세요.
   3. 외부 PCR이 완료되면 모든 PCR 반응을 하나의 마이크로 원심분리관에 모으세요. 외부 PCR 후 PCR 정화나 겔 시각화는 필요하지 않습니다. 두 번째(내부) PCR에서 풀린 PCR 산물을 템플릿으로 직접 사용하세요. PCR 제품은 -20°C에 보관하세요.

시약	반응당 부피
dNTP (각각 10 mM)	2 μL
퓨전 중합효소	1 μL
6피트 GC 버퍼	20 μL
전방향 프라이머 (10 μM)	5 μL
역프라이머 (10 μM)	5 μL
gDNA	X μL
뉴클레아제 없는 물	최대 100 μL (67–X μL)
총	100 μL

표 3: 첫 번째/외부 PCR에 필요한 시약.

사이클 번호	변성	어닐링	확장
1	95 °C, 3분
2–19	95 °C, 25초	65 °C, 20초	72 °C 15초
20			72 °C 3분

표 4: 첫 번째/외부 PCR의 PCR 조건.

4. 인덱스 바코드 작성(2차/내부 PCR) 및 겔 추출 수행
   1. 두 번째(내부) PCR 중에는 역인덱스 프라이머를 사용해 샘플에 바코드를 부착합니다; 따라서 각 샘플마다 다른 인덱스 프라이머를 사용하세요.
      참고: pLentiCrispr v2 백본을 사용해 생성된 라이브러리의 경우, CT 염기로 끝나는 역인덱스 프라이머를 사용하며, lenticrisprv2_rev(인덱스 X)로 라벨링됩니다( 보충표 2 참조).
   2. pLentiGuide 백본으로 생성된 라이브러리의 경우, GT 베이스로 끝나는 인덱스를 사용하고 보충표 2에서 rev_index_X로 라벨링됩니다.
   3. 9개의 계단 프라이머(기본 100 μM)에서 각각 2 μL를 혼합하고, 무균 마이크로 원심분리관에 162 μL 무핵효소 물을 첨가하여 전방 계단 프라이머 혼합물을 준비합니다. 프라이머 혼합물의 최종 농도는 10 μM입니다.
   4. 풀링된 외부 PCR 산물을 입력 값으로 사용하여 표 5 와 표 6의 지침을 사용하여 샘플당 두 차례의 병렬 100 μL 내부 PCR 반응을 수행합니다. 외부 PCR의 'No template DNA' 컨트롤(단계7.3)을 입력으로 PCR 제어 반응을 준비하여 잠재적 오염을 모니터링합니다.
   5. 마지막으로 DNA 중합효소를 추가하고, 탭핑이나 피펫으로 잘 섞은 뒤, PCR 튜브를 잠시 회전시키고 열순환기에 넣으세요. 비특이적 증폭을 방지하기 위해 핫스타트를 수행하세요.
   6. 2% 아가로스 겔에서 내부 PCR 반응을 결합하여 표적 증폭세포를 분리합니다.
      참고: 템플릿 없는 PCR 컨트롤에서는 밴드가 감지되지 않습니다. LentiCrispr_V2는 337 bp, LentiGuide 라이브러리는 357 bp 정도의 뚜렷한 밴드를 관찰해야 합니다. 약 500 bp의 상부 비특이적 밴드도 존재할 수 있으니 하위 가공에서 제외해야 합니다.
   7. 밴드를 시각화하기 위해 내부 PCR 산물 12 μL(PCR 산물 10 μL + 로딩 염료 2 μL)을 적재하고, 나머지 PCR 산물은 겔 추출용으로 지정된 병합 또는 인접 웰에 적재합니다. DNA 회복을 극대화하기 위해 아가로스 두께를 최소화하세요. 겔 절제 시 자외선에 의한 DNA 손상을 최소화하기 위해 시각화 시 젤 추출 레인을 과도하게 노출하지 마세요.
   8. 제조사의 지침을 따라 특정 젤 추출 키트(예: NucleoSpin Gel 및 PCR 정화 키트)를 사용하여 아가로스 겔에서 PCR 제품을 정제하세요. 분광광도계를 사용해 DNA 농도를 측정하세요. PCR 제품은 -20°C에 보관하세요.
      참고: 적절한 시퀀싱을 위해서는 젤 추출 후 최소 농도가 >20 ng/μL이어야 합니다. 세 번의 병행 내부 PCR 반응에도 필요한 수율을 달성하지 못하면 새로운 gDNA를 분리하고 과정을 반복합니다.

시약	반응당 부피
dNTP (각각 10 mM)	2 μL
퓨전 중합효소	1 μL
6피트 GC 버퍼	20 μL
포워드 스태거 믹스 프라이머 (10 μM)	5 μL
역인덱스 프라이머 (10 μM)	5 μL
외부 PCR	5 μL
뉴클레아제 없는 물	62 μL
총	100 μL

표 5: 두 번째/내부 PCR에 필요한 시약.

사이클 번호	변성	어닐링	확장
1	95 °C, 3분
2–25	95 °C, 25초	65 °C, 20초	72 °C 15초
26			72 °C 3분

표 6: 두 번째/내부 PCR의 PCR 조건.

9. 시퀀싱

1. 화면 시작 부분에 정의된 라이브러리 커버리지를 바탕으로 매핑된 읽기 수를 결정합니다. 매핑 효율이 60%–70%라고 가정하면, 읽기 손실을 보상하기 위해 더 많은 총 읽기 수를 요청합니다. EPIKOL 라이브러리의 1000× 커버리지를 위해서는 ~800만 건의 매핑 리드가 필요하며, 이는 총 1,000만에서 1,200만 건의 리드에 해당합니다.
2. 시퀀싱 전에 Tapestation이나 Bioanalyzer를 사용하여 라이브러리 크기와 무결성을 확인하기 위해 시퀀싱 라이브러리의 품질 관리를 수행하세요.
3. 서로 다른 샘플의 라이브러리를 포킹하여 인덱스 프라이머로 고유하게 바코드화하여 시퀀싱 전에 시퀀싱합니다.
4. 시퀀싱 시설과 읽기 구조(R1/R2 방향)와 디멀티플렉싱 요구사항을 확인하세요. 2× 150 bp 쌍 시퀀싱은 Illumina HiSeq, Novaseq 또는 동등한 Illumina 호환 시퀀싱 플랫폼에서 권장됩니다. 시퀀싱 다양성을 개선하기 위해 최소 5% 이상의 PhiX 스파이크인 요청을 고려해 보세요.

10. EPIKOL 시퀀싱 분석 개요

1. MAGeCK 분석 파이프라인을 사용하여 쌍말 FASTQ^{파일을 분석}하세요. 각 생물학적 복제를 개별 입력 파일로 정리하세요.
2. MAGeCK와 호환되는 EPIKOL의 sgRNA 입력 파일을 참고 라이브러리( 보조 표 4에 제공됨)를 사용하고, 카운트 함수를 적용하여 개별 FASTQ 파일에서 sgRNA 리드를 정량하여 각 복제와 조건에 대한 원시 카운트 파일을 생성합니다.
   1. 정규화된 sgRNA count 그래프를 시각화하여 각 샘플의 품질과 분포를 점검하기 위해 백만 번당 읽기(RPM) 정규화를 사용해 각 카운트 파일을 정규화^하세요.
3. 기본 설정과 함께 중앙값 정규화를 사용해 두 번째 -count 함수를 수행해 카운트를 하나의 파일로 병합하세요.
4. - test 함수를 실행하여 병합된 원시 계수 파일을 사용해 유전자 수준의 변화를 식별하세요. 스크리닝 성능을 평가하기_{위해 최종 샘플} T 샘플과 T₀ 샘플을 비교하고, 비표적 대조군과 필수 유전자 표적 sgRNA의 분포를 확인하라.
   참고: 각 스크리닝 그룹에서 양성 대조군 유전자 소모를 평가하는 것이 스크린 성능을 평가하는 데 매우 중요합니다. 약물 노출이 세포 반응에 확률적 차이를 일으킬 수 있기 때문에, 약물 처리 스크리닝 군에서는 복제체 간 생물학적 변동성이 관찰될 것으로 예상됩니다. 이러한 변동성은 화학요법 저항성 스크린에 내재된 것이며, 반드시 화면 품질이 좋지 않다는 의미는 아닙니다. 따라서 히트콜 시 최소 세 개의 생물학적 반복을 함께 분석해야 하며, 히트는 10개 중 6개 이상의 유효 sgRNA를 가진 유전자로 결정해야 합니다.
5. 약물로 인한 sgRNA 풍부도와 유전자 수준 효과의 변화를 규명하기 위해, DMSO 그룹을 대조군으로 사용하여 T_최종 탁솔 처리 샘플과 T_최종 DMSO를 비교하였다.
6. FDR(FDR) 기준 F

결과

TNBC에서 화학저항성의 후생유전학적 조절 인자를 연구하기 위해, SUM159PT 세포주를 이용한 전체 프로토콜은 그림 1에 나와 있습니다. 먼저, SUM159PT 세포 내 탁솔의 IC₁₀ 및 IC₅₀ 값을 택솔 농도를 점차 처리하여 측정했습니다(그림 2A). 탁솔 내성 SUM159PT 세포를 생성하기 위해 단계별 용량 증가 방법을 사용하였습니다. 몇 달 후, IC50 값의 변화는 탁솔 노출 없이 병렬 유혈 투여된 대조군과 비교했을 때 이 프로토콜을 사용한 내성 표현형이 성공적으로 확립되었음을 보여줍니다(그림 2B).

그림 1: 탁솔 내성 SUM159PT 세포에서 EPIKOL 스크리닝의 도식. 생성된 탁솔 내성 SUM159PT 세포에서 EPIKOL 스크리닝의 전반적인 워크플로우. 이 도형은 BioRender.com 이 도형의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

내성 세포가 확립된 후, 표현형 및 분자 변화를 특성화하기 위한 여러 실험이 수행되었습니다. 탁솔 처리 하에서 내성 세포의 증식 능력을 부모 세포와 비교하여 콜로니 형성 분석법으로 평가하였다. 그림 2C,D에서 볼 수 있듯이, 내성 세포는 탁솔 처리 하에서 증식 능력을 유지하는 반면, 부모 세포는 생존하지 못합니다. 이 분석은 내성 세포 특성 분석에서 중요한 단계 중 하나로, 약물 치료 하에서 부모 세포와 내성 세포 간 증식 능력을 평가할 수 있음을 보여줍니다.

내성 세포 특성 분석의 일환으로, 항암 저항성과 관련된 전사체 변화를 분석하기 위해 부모 및 내성 세포에 대해 RNA 시퀀싱이 수행되었습니다(그림 2E). 내성 세포에서 가장 상향 조절된 유전자 중 하나는 ABCB1이었으며, 그 뒤를 따라 ABCB4와 ABCA5 등 몇 가지 다른 ABC 수송체가 등장했습니다. ABCB1 발현의 상향 조절은 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR)으로 검증되었으며, 이는 qPCR을 통해 후보 유전자 발현 변화를 검증할 수 있음을 보여줍니다(그림 2F).

그림 2: 내성 세포의 생성 및 그 특성 분석. (A) 용량 증가법을 이용한 탁솔 내성 SUM159PT세포 생성 도식. (B) 부모 세포와 생성된 내성 세포의 IC50 값 차이를 보여주는 용량 반응 곡선. 부모 IC50 = 6 nM, 탁솔 내성 IC50 = 355.4 nM. (C) 탁솔 존재 하에서의 군락 형성 분석. (D) 집단 영역의 정량화 (C.) Tukey의 사후 검정을 이용한 분산 양측분석(ANOVA)은 Prism 8(GraphPad 소프트웨어)을 사용해 적용되었습니다. 유의수준은 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001로 설정되었습니다. (E) Taxol-Res 세포에서 부모 세포와 비교하여 차등 발현 유전자를 보여주는 Volcano 플롯, LFC>2 및 p<0.001 컷오프. (F) 부모 세포 및 탁솔-레즈 세포에서 ABCB1 mRNA 발현의 qPCR 검증. 쌍측 학생 t-검정으로 결정된 P 값과 대조군; **P < 0.01. 패널 A는 BioRender.com 로 제작되었습니다. 패널 E는 예디에-바이람 등(Yedier-Bayram) 등의 허가를 받아 수정^{되었습니다.} 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

탁솔 저항성 세포에서 ABCB1 및 기타 ABC 수송체의 과발현을 보여주고 ABCB1의 광범위한 기질 스펙트럼을 고려한 후, MDR 표현형의 존재가 평가되었습니다. 이를 위해 탁솔 내성 세포는 ABCB1 수송체의 기질로 알려진 여러 약물로 처리되었으며, 이들은 서로 다른 작용 기전을 가지고 있으며, 이들의 약물 민감도를 평가했습니다(그림 3A,B). 관찰된 ABC 수송체 발현 프로필 과 일치하여, 탁솔 내성 세포는 독소루비신과 빈크리스틴에 대한 내성을 보였으며, 이는 MDR 프로필의 존재를 확인하고 다약물 내성 표현형을 기능적으로 평가할 수 있음을 보여주었습니다.

MDR 표현형은 CRISPR 기반 스크리닝 방법인 EPIKOL에서 도전 과제인데, 라이브러리가 형질전환 세포를 풍부하게 만들기 위해 푸로마이신 선택이 필요하기 때문입니다. 푸로마이신은 ABCB1 매개 약물 배출에 의해 세포 밖으로 배출될 수 있기 때문에, 내성 세포에서는 푸로마이신 선택이 효율적이지 않을 수 있습니다(그림 3C). 따라서 비형질 세포는 선택을 견뎌내어 스크리닝 결과를 교란시킬 수 있습니다.

이 한계를 해결하기 위해 EPIKOL 스크리닝 전에 MDR 프로필을 가진 항암저항성 세포의 선택 과정을 최적화하였습니다. 1세대 ABCB1 억제제인 베라파밀은 ABC 수송체 매개 약물 배출을 차단하여 화학요법제 또는 푸로마이신의 세포 내 축적을 가능하게 했습니다(그림 3D). 베라파밀 단독으로는 세포 생존력에 영향을 미치지 않았으나, 화학요법 약물과 병용할 경우 약물 민감성을 회복시켰습니다(그림 3E, F). 마찬가지로, 비독성 베라파밀 용량과 결합된 푸로마이신 살상 곡선은 ABCB1 억제가 푸로마이신 감수성을 회복시킨다는 것을 보여주었습니다(그림 3G,H). 이로 인해 선택을 살아남는 세포가 성공적으로 형질전환된 세포가 아니라, ABCB1 유도 약물 유출로 인해 선택을 피하는 세포가 되도록 보장합니다. 항암저항성 세포에서 효과적인 선택 워크플로우를 확립하는 것은 신뢰할 수 있는 EPIKOL 스크리닝 결과를 위해 매우 중요합니다.

그림 3: 다약물 내성 표현형과 베라파밀이 내성 세포에 미치는 영향. 부모세포와 생성된 내성 세포의 IC50 값을 나타내는 용량 반응 곡선, (A) 독소루비신, (B) 빈크리스틴, (C) 푸로마이신 사용. (D) 베라파밀 사용 여부와 없는 탁솔 내성 SUM159PT 세포 선별을 보여주는 도식. 이 인형은 BioRender.com 로 만들어졌습니다. (E) 탁솔-레스 세포를 이용한 세포 생존성 분석으로 최적의 베라파밀 농도를 결정하는 방법. (F) 베라파밀은 탁솔 내성 세포를 탁솔에 재감작합니다. (G) 베라파밀은 부모 세포의 푸로마이신 반응을 변화시키지 않습니다. (H) 베라파밀은 탁솔-레스 세포에서 푸로마이신 감수성을 회복시킵니다. 패널 A, B, F는 예디에르-바이람 외 ¹⁷명의 허가를 받아 재사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

TNBC에서 화학내성의 새로운 조절 인자를 찾기 위해, 그림 4A에 나타난 것처럼 탁솔 내성 SUM159PT 세포를 대상으로 EPIKOL 스크리닝이 수행되었습니다. 내성 세포는 부모 세포보다 성장 속도가 느리기 때^문에, Taxol 및 DMSO 처리 그룹 모두에서 개체군 두 배 수준을 스크리닝 전반에 걸쳐 모니터링하여 16 개체군 두 배에 도달하는 데 걸리는 시간을 결정했습니다(그림 4B). 따라서 DMSO 처리군에 대한 EPIKOL 선별검사는 약 35일째에 완료되었고, 탁솔 처리군은 추가로 15일간 배양하여 동일한 인구 두 배 수준에 도달하였습니다.

시퀀싱 이후, MAGeCK 분석 파이프라인을 사용하여 sgRNA가 동일한 유전자를 표적으로 하는 효과를 결합하여²⁴번 노크아웃 시 유전자 수준 변화를 밝혀냈습니다. EPIKOL 라이브러리에는 필수 유전자를 표적으로 하는 sgRNA가 양성 대조군으로 포함되어 있으며, 첫 품질 관리 단계는 이 sgRNA가 예상대로 고갈되었는지 평가하는 것이었습니다. 워터폴 플롯은 서로 다른 비교에서 필수 유전자의 Log2 폴드 변화를 보여줍니다(그림 4C–E). DMSO 또는 탁솔 처리 조건의 최종 시점 샘플을 초기 시점과 비교 했을 때, 거의 모든 필수 유전자가 녹아웃 시 고갈되어 효과적인 스크리닝 성능을 나타냅니다(그림 4C,D). 그러나 두 종말 샘플(DMSO 처리와 탁솔 처리)을 비교했을 때는 이 고갈이 명확히 관찰되지 않는데, 이는 두 조건 모두에서 필수 유전자가 세포 생존에 필요하기 때문입니다(그림 4E).

화면 결과를 시각화하는 또 다른 방법은 화산 플롯으로, Log2 접힘 변화와 통계적 유의성(p값 또는 FDR 값)을 함께 보여줍니다. 탁솔 내성 세포에서 수행된 EPIKOL 스크리닝에서 여러 양성 대조군 유전자가 유의미하게 고갈된 것으로 확인되어, 양성 대조군 유전자를 표적으로 하는 sgRNA의 고갈이 성공적인 스크리닝의 전형적인 품질 관리를 보여주는 점에서 스크리닝의 신뢰성을 더욱 뒷받침합니다(그림 4F). 필수 유전자 대조 외에도, EPIKOL 라이브러리에는 여러 ABC 수송체 유전자를 표적으로 하는 맥락특이적 양성 대조 sgRNA가 포함되어 있습니다. 예상대로, 다양한 그룹에서 ABCB1 sgRNA의 정규화 수치는 탁솔 처리군에서 ABCB1 표적 sgRNA의 유의미한 감소를 강조했습니다(그림 4G). 전반적으로, 이는 sgRNA 수준 변화를 해석하여 약물 반응과 관련된 후보 유전자를 식별하는 방법을 보여줍니다.

그림 4: EPIKOL 스크리닝 결과 탁솔 내성 세포와 예시 그래프가 나옵니다. (A) EPIKOL 스크린 프로토콜 도식. (b) 탁솔-레스 세포의 인구 배가율(PDL). (C–E) EPIKOL 스크리닝 결과(필수 유전자를 강조), DMSO 처리군과 패널 C의 초기 시점, 탁솔 처리군과 D패널 초기 시점, 덱솔 처리군과 DMSO 처리군 비교, E형 패널의 DMSO 처리군과 비교한 결과. (F) Volcano plot, Log2Fold 표시. Taxol 처리 샘플 유전자 변화와 초기 시점. p<0.05를 가진 유전자는 색소와 표지가 이루어졌습니다. 이 수치는 이전 출판물¹⁷에서 수정되었습니다. (G) EPIKOL에서 제공하는 10개의 서로 다른 ABCB1 sgRNA 그래프의 백만 rpm당 읽음. 패널 A는 BioRender.com 로 제작되었습니다. 패널 E는 예디에르-바이람 등(¹⁷)의 허가를 받아 재사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 표 1: 문제 해결 표.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 표 2: 바이러스 역가 및 MOI 계산.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 3: EPIKOL 라이브러리의 sgRNA 목록.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 4: EPIKOL 시퀀싱 라이브러리 준비에 사용되는 프라이머. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

CRISPR-Cas9 기반 풀드 스크리닝 접근법은 다양한 세포 환경에서 잘 확립되어 있습니다. 그러나 항암저항성 세포에서의 스크리닝은 뚜렷한 도전 과제를 제시하며 추가적인 최적화가 필요합니다. 화학저항성 세포는 화학저항성 종양의 취약성을 연구하는 데 유용한 모델이므로, 화학저항성의 유전적 또는 후생유전학적 조절자를 신뢰성 있게 규명하기 위한 선별 전략의 한계를 해결하는 것이 중요합니다.

화학저항성 세포주 생성 자체가 번거로울 수 있으며, 사용되는 화학요법제에 크게 의존합니다. 세포는 특정 약물에 쉽게 적응할 수 있지만, 다른 약물에는 매우 민감할 수 있습니다²⁵. 따라서 내성 세포주 생성 프로토콜 전에 세포주별 IC50 값을 결정하는 것이 중요합니다. 세포가 여러 차례 IC50 수준의 약물 노출을 견디지 못하는 경우, 낮은 약물 농도(예: IC10-20)로 시작할 수 있습니다(프로토콜 섹션 1 ^참조). 저항성 획득은 확률적 사건이므로, 여러 웰/플레이트를 동시에 처리하여 내성 세포 획득 가능성을 높일 수 있습니다. 투여 증대 절차 중 전사 및 표현형 변화를 순진한 상태와 비교하기 위해 얻은 약물 내성 세포군을 포괄적으로 특성화하는 것이 매우 중요합니다. RNA-seq와 같은 전역 프로파일링 기법을 사용하여 부모 계통에 비해 차별화된 유전자를 식별할 수 있습니다. 기능적으로, 획득성 약물 내성은 세포 생존 및 증식 검사로 검증되어야 하며, 내성 세포가 부모 세포에 세포독성이 있는 약물 치료 조건에서 생존을 유지함을 입증해야 합니다. 또한, 증식 능력과 성장률의 잠재적 변화를 부모 세포주와 비교하여 측정하여 각각의 PDL을 계산해야 합니다. 획득된 탁솔 내성은 적어도 부분적으로 ABC 매개 약물 배출에 의해 매개되는 것으로 알려져 있으므로, 주요 ABC 수송체(예: ABCB1)의 발현은 qPCR과 웨스턴 블롯팅을 통해 mRNA와 단백질 수준에서 평가되어야 하며, 전사체 데이터로 보완할 수 있습니다. ABC 수송체 발현 프로필을 바탕으로 MDR 표현형 존재를 고려하고, 다른 화학요법제에 대한 내성을 평가해야 합니다. 이전 연구에서 우리는 탁솔 내성 세포주를 특성화하고 ABCB1이 가장 상향 조절되는 유전자 중 하나임을 확인했으며, ABCB1 매개 다약물 내성이 푸로마이^{신 선택 실패}를 일으킬 수 있다고 추론했습니다. 따라서 저항성 세포 생성 후에는 ABC 수송체와 MDR 표현형의 발현을 어떤 형질전환 절차 전에 반드시 평가해야 합니다.

용량 증폭 방법은 고용량 약물 노출 프로토콜에 비해 각 단계에서 세포를 냉동 보존할 수 있어 유연성을 제공하고 배양 손실을 방지할 수 있어 장점이 있습니다. 더불어, 점진적인 용량 증가는 시간이 지남에 따라 내성 표현형을 획득하여 적응 진화를 가능하게 합니다; 급성 고용량 치료는 기존에 내성이 있는 하위 집단을 선택하는 것과 대조적입니다. 단계적 진행 덕분에 연구자들은 선택을 중단하고 결과 표현형의 특성을 평가할 원하는 저항 수준을 의도적으로 선택할 수 있습니다. 또한, 용량 증가의 중간 단계를 활용해 후천 저항성 기전을 시간 경로적으로 연구할 수 있습니다. 근본적인 생물학적 질문에 따르면, 저항 수준이 낮은 초기 적응 기전이나 더 강한 저항성 세포에서 안정적이고 완전히 확립된 저항 표현형을 연구하기 위해 다양한 저항 수준을 얻을 수 있습니다. 더불어, 임상적으로 관련된 내성 임계값은 약물, 세포주, 그리고 내재 증식률에 따라 크게 다르며; 따라서 용량 증가 시간표도 이에 따라 달라질 수 있습니다(저희 경우 탁솔 내성 세포 생성에 약 6개월이 소요되었습니다). 이러한 논리에 따라, 이전 연구에서 SUM159PT 세포의 두 가지 저항성을 확인하고 이들의 뚜렷하고 공통된 특징을 비교했습니다¹⁷. 따라서 연구자들이 임상 및 생물학적 관련성에 따라 관심 약물의 IC50 표적 범위를 정의할 것을 권장합니다.

약물 압력 철회가 세포의 후생유전체와 전사체를 재배선할 수 있어 화학요법 내성 상실로 이어질 수 있다는 것은 잘 알려져 있다²⁵. 따라서 저항성 표현형의 안정성을 수개월에 걸쳐 평가할 것을 권장합니다. 약물 중단 시 세포가 민감한 상태로 되돌아가는 경향이 있다면, 내성 세포를 유지용량(일반적으로 내성 생성 시 최종 약물 농도에 해당)에서 배양하여 내성 표현형을 보존할 수 있습니다. 시험관 내 화학저항성 세포주 모델은 실용적이고 재현 가능하며 획득된 화학저항성 연구에 널리 사용되지만, 환자 종양에서 관찰되는 표현형 이질성을 완전히 재현하지 못하고 종양 미세환경, 면역 상호작용, 공간적 이질성이 부족할 수 있습니다 ^3,4,25. 더불어, 저항성 생성 중 장기간 전달은 환자 샘플에서 관찰된 것과 다른 유전적·후생유전학적 변이를 초래할 수 있어, 확인된 히트의 번역적 관련성을 제한할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜을 통해 확인된 후보 유전자와 기전은 공배양 모델, 환자 유래 오가노이드, 또는 생체 내 연구와 같은 임상적으로 더 중요한 실험 시스템에서 추가로 검증되어야 합니다. EPIKOL은 이러한 모델에서 보완 스크리닝을 수행할 때 집중 특성을 제공하여 최대 셀 수가 본질적으로 제한되어 있습니다.

항암내성 세포는 부모 세포보다 성장 속도가 느리기 때문에, 라이브러리 커버리지를 유지하기 위해 대규모 세포 집단이 필요한 유전체 전체 스크리닝에 실질적인 도전이 될 수 있습니다. EPIKOL과 같은 집중 라이브러리는 적은 시작 물질로 스크리닝을 수행할 수 있으면서도 유전자당 sgRNA 깊이를 증가시켜 정의된 표적 공간 내에서 감도와 재현성을 향상시킵니다. 하지만 설계상 EPIKOL은 후생유전학적 저항성 기전만을 포착하며, 화학요법 내성에 비후생유전적 기여자는 포함하지 않습니다. 따라서 도서관 선택은 이전 실험과 특정 생물학적 질문에 따라 결정되어야 합니다. 이 라이브러리 이용자는 집중된 라이브러리의 한계를 인지하고, 라이브러리의 범위 내에서 결과를 해석해야 합니다.

항암저항성 모델의 CRISPR 스크리닝에서 주요 장애물은 ABC 수송체 상향 조절에 의해 발생하는 MDR 표현형의 출현입니다. ^9,10. 서로 다른 ABC 수송체가 서로 다른 기질의 유출을 매개합니다. 약물 내성 세포주가 생성되면, 내성이 다른 화학요법제에도 확장되는지 평가하는 것이 중요합니다. 푸로마이신 내성은 주로 ABCB1 과발현에 의해 발생하며, 이는 대부분의 라이브러리가 형질전환 세포 농축을 위한 푸로마이신 선택 카세트를 보유하기 때문에 통합 CRISPR 스크리닝 접근법의 선택 과정에 영향을 미칩니다. 여기서는 1세대 ABCB1 억제제인 베라파밀을 이용해 세포 내 푸로마이신 축적을 촉진하고, ABCB1 매개 약물 유출로 인해 선별을 피할 수 있는 전달되지 않은 내성 세포를 선택적으로 제거하였습니다. 베라파밀은 ABCB1에 가역적으로 결합하기 때문에, 베라파밀을 제거하면 몇 시간 내에 ABCB1 기능이 회복됩니다. 따라서 베라파밀은 이후 약물 치료 단계에서 내성 세포에 대한 추가적인 취약성을 부여하지 않습니다. 하지만 베라파밀의 몇 가지 한계도 인정해야 합니다. 베라파밀은 칼슘 채널 및 기타 운반체를 억제하기 때문에 ABCB1 억제 범위를 넘어 세포 생리학에 영향을 미칠 수 있습니다¹⁰. 또한, 효과적인 베라파밀 농도는 세포주와 MDR 모델에 따라 ABCB1 발현 수준과 다른 운반체의 활성에 따라 달라집니다. 따라서 각 세포주별로 베라파밀 농도를 최적화해야 하며, 표적외 효과가 우려된다면 ABCB1에 더 특이적인 새로운 세대의 ABCB1 억제제를 고려할 수 있습니다. 또 다른 중요한 단계로, 바이러스 역가분석은 감염성과 선택성이 종종 다르기 때문에 부모 세포가 아닌 내성 세포 자체에 대해 시행해야 합니다.

또 다른 중요한 고려사항은 적절한 스크리닝 기간을 결정하는 것입니다. 화학저항성 세포는 종종 부모 세포보다 성장 속도가 느리기 때문입니다²⁶. 이 차이를 설명하기 위해 우리는 인구 증가 수준 계산(프로토콜 6절)을 사용하여 대조군과 처리군이 원하는 PDL 임계치에 도달했을 때를 평가했습니다. 따라서 스크리닝은 다른 날짜에 종료되어 인구 증가가 비슷하게 이루어지고 치료군 내 sgRNA 효과를 더 안전하게 해석할 수 있습니다.

라이브러리 준비 PCR은 후속 히트(Hit Site) 식별의 정확성에 매우 중요합니다. 낮은 gDNA 입력과 증가된 PCR 사이클로 인한 바이어스는 특정 sgRNA 서열의 증폭을 초래하여 위양성 풍부화 또는 고갈을 초래할 수 있습니다. 이를 완화하기 위해 가능한 한 많은 gDNA를 사용하고, 이 프로토콜에서 제공하는 PCR 사이클 수를 준수하며, 시퀀싱 전에 병렬 반응을 수행하여 풀링하는 것을 권장합니다. 가능한 경우, 라이브러리 범위는 권장 임계값(>300× 커버리지 이하로 떨어져야 하며, 이는 저 sgRNA의 확률적 손실이 아닌 고갈된 sgRNA의 신뢰성 있는 검출을 보장해야 합니다.

시퀀싱 후 MAGeCK 분석 프레임워크를 사용하여 여러 하위 품질 관리 분석과 데이터^{해석 단계를 수행}했습니다. 첫째, 주성분 분석(PCA)을 사용하여 생물학적 복제체의 분포와 재현성을 평가하였다(데이터는 표시되지 않았으며, MAGeCK 출력). PCA에서 복제 군집화는 각 팔 내에서 예상되며; 그러나 약물 치료 팔에서 더 높은 변동성이 화학요법 내성 스크리닝에서 흔히 나타나는 특징으로, 약물이 확률적 변화를 유도할 수 있습니다. 양성 및 음성 대조군이 각 팔에서 예상대로 동작하더라도, 이러한 변동성은 진정 양성 히트의 식별을 방해하지 않습니다. 다음으로, 초기 및 최종 시점에서 sgRNA 수에 대한 백만 당 읽기(RPM) 정규화를 적용하여 필수 유전자를 표적으로 하는 sgRNA가 예상대로 고갈되었는지 평가하였다¹⁴. 이후 중앙값 정규화를 사용해 sgRNA 수준 효과를 집계하여 유전자 수준 고갈을 식별할 수 있게 했습니다²⁴. 유전자 수준별 고갈 점수는 가장 고갈된 유전자부터 풍부한 유전자까지 순위를 매기는 워터폴 플롯을 통해 시각화되었습니다. 장기간 약물 노출로 인한 복제수 변화와 다배체는 비효율적이거나 과도한 Cas9^절단으로 인해 스크리닝 결과를 혼란시킬 수 있습니다. EPIKOL은 일반적으로 탁솔 주도 증폭에 영향을 받지 않는 염색질 조절자를 표적으로 하지만, 스크리닝 전에 내성 세포의 배수체 상태와 복제수 변화를 평가할 것을 권장합니다. 복사 번호 변화가 의심될 경우, CRISPRcleanR이나 CERES와 같은 계산 보정 도구를 MAGeCK 분석 중에 적용할 수 있습니다.

대조군과 치료군 두 실험군이 참여하는 스크리닝에서는 스크리닝 성능과 생물학적 의존성을 올바르게 해석하기 위해 서로 다른 비교가 필요합니다¹⁷. 초기부터 최종 비교까지는 필수 유전자와 비표적 대조군의 예상 행동을 포함한 스크리닝 성능 평가에 적합합니다. 대조군의 종말점(DMSO)을 초기 시점과 비교하면 약물 압력이 없는 상태에서 내성 세포의 성장과 적합도에 필요한 유전자를 식별할 수 있습니다. 반면, 약물 처리(탁솔)와 대조군(DMSO) 두 종말 샘플을 비교하면 약물에 대한 내성에 필요한 특정 유전자가 일반적인 적합도보다는 밝혀졌습니다. 두 종말 샘플의 직접 비교는 필수 유전자 대조군의 분포가 왜곡되는데, 이는 두 그룹 모두 생존에 필수적이기 때문입니다. 또 다른 시각화 방법은 Volcano 플롯으로, log2 중복 변화와 유의점을 함께 표시하여 크게 고갈된 유전자를 식별할 수 있게 합니다. 후보 유전자가 확인되면, 정규화된 sgRNA 수와 시각화 플롯을 통해 후속 검증 분석에서 가장 우수한 sgRNA를 결정하는 데 유용합니다. EPIKOL 스크리닝에서는 10개 sgRNA 중 최소 6개가 일치하는 행동을 보여준 후보 유전자를 우선시할 것을 권장하는데, 이는 유전자 수준 효과에 대한 신뢰도를 높여줍니다.

여기서는 ABCB1을 상향 조절하고 MDR 표현형을 보이는 탁솔 내성 세포주에 대해 EPIKOL 스크리닝을 수행하는 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 푸로마이신 또는 기타 선택 항생제에 교차 내성을 보이는 모든 항암내성 모델에 널리 적용 가능하며, 이를 통해 해당 세포에서 CRISPR 스크리닝을 가능하게 합니다. 모든 프로토콜 단계에서 가장 흔히 발생하는 기술적 문제에 대한 실질적인 지침은 보충표 1에 제공되어 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100 mm 플레이트	Corning	353003	세포 배양
45 µm 필터	Sigma-Aldrich	SLHVM33RS	세포 배양
6 웰 플레이트	Corning	3506	세포 배양
96웰 블랙 클리어 바닥 플레이트	Sigma-Aldrich	CLS356259	CellTiter-Glo 발광 세포 생존도 분석
블라스티시딘	Thermo Fisher	A1113903	선택을 위해
CellTiter-Glo 발광 세포 생존도 분석	CellTiter-Glo, Promega	G7570	CellTiter-Glo 발광 세포 생존도 분석
DMEM	Gibco		세포 배양
DMSO	PanReac AppliChem	A3672,0050	세포 배양
FBS	Gibco	16140071	세포 배양
Ham’s F12 영양 혼합물	Gibco	11765054	세포 배양
HEK293T 세포			Robert Weinberg(미국 보스턴 MIT)의 친절한 선물.
HEPES	Thermo Fisher	15630080	세포 배양
하이드로코르티손	Sigma-Aldrich	H4001-1G	세포 배양
인슐린	Sigma-Aldrich	I9278-5ML	세포 배양
LentiCas9-blast	Addgene	#52962	Cas9-안정 세포주 생성을 위해
LentiGuide-Puro	Addgene	#52963	gRNA 클로닝의 백본
MN NucleoSpin 조직 키트	Macherey-Nagel	740952.5	게놈 DNA 추출
PBS	Gibco	10010023	세포 배양
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15140122	세포 배양
pLentiCRISPR v2	Addgene	#52961	gRNA 클로닝의 백본
폴리에틸렌글리콜(PEG)-8000	Sigma-Aldrich	P2139-500G	렌티바이러스 농축
폴리에틸렌이민, 선형(PEI)	Sigma-Aldrich	765090-1G	렌티바이러스 생산
프로타민 설페이트(PS)	Sigma-Aldrich	P4380-25G	렌티바이러스 감염
psPAX2	Addgene	# 12260	렌티바이러스 생산
푸로마이신	Thermo Fisher	A1113803	선택을 위해
SUM159PT 부착 세포			Robert Weinberg(미국 보스턴 MIT)의 친절한 선물.
탁솔	팍리탁셀, 시그마	PHR1803-200MG	RES 세포 생성 및 유지
트립신-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054	세포 배양
베라파밀	Selleck Chemicals	S4202	선택을 위해
VSV-G	Addgene	# 8454	렌티바이러스 생산