제브라피쉬에서 안전한 용량(≤200 µg/mL)의 Mollugin은 꼬리 재생의 개선과 관련이 있었으며, 이는 세포 사멸 관련 유전자 발현, 염증 마커, 항산화 효소 활성 및 대식세포 관련 마커의 변화를 동반했습니다. 이러한 결과는 Mollugin이 제브라피쉬 꼬리 재생 과정 중 국소 손상 반응을 조절할 수 있음을 시사합니다.
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연구 논문
* These authors contributed equally
제브라피쉬에서 안전한 용량(≤200 µg/mL)의 Mollugin은 꼬리 재생의 개선과 관련이 있었으며, 이는 세포 사멸 관련 유전자 발현, 염증 마커, 항산화 효소 활성 및 대식세포 관련 마커의 변화를 동반했습니다. 이러한 결과는 Mollugin이 제브라피쉬 꼬리 재생 과정 중 국소 손상 반응을 조절할 수 있음을 시사합니다.
Mollugin은 항염증 및 항산화 활성이 보고된 천연 나프토퀴논 화합물이지만, 조직 재생에서 이의 역할은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 본 연구에서는 제브라피시 꼬리 절단 모델을 사용하여 wound repair 및 관련 면역 및 산화환원 반응에 미치는 Mollugin의 영향을 조사하였습니다. 제브라피시 배아에 꼬리 손상 후 22 µg/mL, 66 µg/mL, 200 µg/mL 농도의 Mollugin을 처리하였습니다. Mollugin 처리는 농도 의존적으로 꼬리 면적 회복의 개선과 관련이 있었으며, 이는 apoptosis 관련 유전자의 발현 감소 및 IL-1β, IL-6, TNF-α, TLR4, NF-κB1을 포함한 전염증 매개체의 억제와 동반되었습니다. 동시에, Mollugin은 superoxide dismutase와 catalase의 항산화 효소 활성을 회복시켰습니다. Tg(mpeg1:GFP) 제브라피시의 형광 이미징 결과, Mollugin은 대식세포 축적에 대해 시간 의존적인 영향을 보였으며, 24 h에서는 뚜렷한 감소가 없었으나 66 및 200 µg/mL 처리군은 손상 모델 그룹과 비교하여 48 h에서 대식세포 양성 면적이 감소하였습니다. qRT-PCR 분석 결과, M1 관련 마커인 iNOS의 발현은 감소하고 M2 관련 마커인 arginase-1의 발현은 증가한 것으로 나타났습니다. 종합적으로, 이러한 결과는 Mollugin이 염증, 산화 스트레스, apoptosis 관련 및 대식세포 관련 마커의 변화와 연관되어 제브라피시 꼬리 재생을 지원할 수 있음을 시사합니다. 기저의 세포 및 분자 메커니즘을 규명하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
조직 재생은 생물이 손상을 복구하는 중요한 생리적 과정으로, 세포 증식과 분화, 그리고 미세환경 항상성 유지의 복잡한 조절 과정을 포함합니다1. 척추동물 모델 중에서 제브라피쉬는 탁월한 재생 능력 덕분에 상처 치유 메커니즘 연구를 위한 핵심 시스템으로 부상했습니다. 특히, 제브라피쉬의 꼬리 지느러미 재생은 염증 조절, 산화 반응 균형, 아포토시스 제어 등 여러 생물학적 사건의 시공간적 협응을 포함합니다2,3. 최근 몇 년 동안 천연물의 약리학적 활성은 재생 의학 연구의 중심점이 되었습니다. 특히 나프토퀴논 화합물은 다양한 생물학적 효과로 인해 널리 연구되어 왔습니다4. Mollugin은 Rubiaceae 식물에서 유래한 나프토퀴논 화합물로, 이전 연구에서 항염증, 항산화 및 세포 주기 조절 활성을 보였습니다5,6. 하지만 조직 재생에서 이 화합물의 작용 기전은 여전히 불분명하며, 염증성 미세환경 및 면역 세포 분극화를 조절하는 잠재적 역할에 대한 체계적인 조사가 필요합니다.
손상 후 염증 반응이 빠르게 활성화되어 조직 수복에 직접적인 영향을 미칩니다. 적절한 수준의 염증 신호 전달은 괴사 조직을 제거하고 재생 프로그램을 시작하는 데 필수적이지만, 과도한 염증 연쇄 반응은 산화 스트레스를 악화시켜 조직 섬유화로 이어질 수 있습니다7. IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함한 사이토카인은 손상 후 현저히 증가하며, TLR4/NF-κB 신호 전달의 활성화가 동반되어 염증 반응과 조직 재형성을 증폭시킵니다8,9. 세포 간 접착 분자-1(ICAM-1)과 CC 케모카인 리간드 2(CCL-2) 또한 손상 후 수치가 상승하며, 이는 손상된 조직으로의 호중구 및 대식세포 모집 증가와 관련이 있습니다10. 특히, 산화 불균형은 조직 손상을 더욱 악화시키며, superoxide dismutase (SOD) 및 catalase (CAT) 활성의 감소는 항산화 능력의 저하를 나타냅니다2,11.
대식세포는 염증성 미세환경의 핵심 조절자 역할을 하며, 이들의 기능적 분극화는 재생 과정에 상당한 영향을 미칩니다12. M1 대식세포는 유도성 산화질소 합성효소(iNOS) 발현 및 염증 활성과 관련이 있는 반면, M2 대식세포는 arginase-1 (Arg-1)을 발현하며 조직 수복과 연관됩니다13,14. 대식세포 분극화는 국소 사이토카인, 산화적 스트레스 및 세포사멸 관련 신호에 의해 영향을 받습니다. 이러한 맥락에서 Bcl-2(B-cell lymphoma-2) 가족 단백질과 caspase-3로 구성된 세포사멸 조절 네트워크는 손상 부위의 세포 생존에 영향을 미칠 뿐만 아니라, "find-me" 신호의 방출을 통해 면역 세포의 화학성 유인 행동을 간접적으로 조절합니다15. 따라서 염증 반응, 산화적 스트레스 및 대식세포 분극화를 동시에 조절하는 중재 전략을 탐색하는 것은 조직 재생을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다.
천연 화합물은 이러한 생물학적 과정을 조절하는 데 있어 독특한 장점을 보여주었습니다. 최근 연구들에 따르면, 나프토퀴논(naphthoquinone) 물질은 공액 구조 덕분에 자유 라디칼을 제거할 가능성이 있으며, 그 벤조퀴논(benzoquinone) 코어는 전자 전달 메커니즘을 통해 산화환원 민감성 신호 전달 경로에 영향을 미칠 수 있음이 확인되었습니다16,17. 몰루긴(Mollugin)은 DSS 유도 대장염에서 염증 반응을 완화하며, 대장 조직 내 전염증성 사이토카인 생성을 감소시키고 TLR4 발현을 낮추는 것으로 보고되었습니다18. 또한 몰루긴은 대식세포에서 TAK1-NF-κB/MAPK 신호 전달을 억제하고 Keap1-Nrf2 경로를 활성화하는 것으로 나타났으나6, 체내(in vivo) 상처 모델에서 대식세포 분극 및 세포사멸-항세포사멸 네트워크에 미치는 영향은 아직 밝혀지지 않았습니다. 더욱이, 몰루긴의 용량 의존적 생물학적 효과와 재생 과정 중의 조절 역할은 여전히 체계적인 규명이 필요한 상태입니다.
본 연구에서는 제브라피쉬 꼬리 지느러미 재생 모델에서 Mollugin의 효과를 조사하였습니다. 구체적으로, Mollugin 처리 후 꼬리 재성장, 세포 사멸 관련 유전자 발현, 염증성 신호 전달, 항산화 효소 활성 및 대식세포 관련 반응을 분석하였습니다. 연구 결과, Mollugin 처리가 제브라피쉬 모델에서 꼬리 재생 개선 및 다양한 손상 반응 마커의 변화와 연관이 있음을 확인하였습니다.
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모든 동물 실험 절차는 국립연구위원회(National Research Council)의 실험 동물 관리 및 사용 지침을 준수하였으며, 푸저우 제1종합병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호 202408002).
제브라피쉬 번식
모든 실험은 표준 실험실 조건에서 유지된 제브라피쉬 (Danio rerio)를 사용하여 수행되었습니다. 독성 분석 및 꼬리 절단 재생 분석에는 야생형 AB 제브라피쉬가 사용되었습니다. 대식세포 이미징에는 Tg(mpeg1:GFP) 제브라피쉬가 특이적으로 사용되었습니다. Tg(mpeg1:GFP)는 대식세포에서 발현되는 mpeg1 프로모터의 제어 하에 GFP 발현으로 대식세포 계열 세포를 표지하는 대식세포 리포터 라인입니다. 모든 제브라피쉬 라인은 14시간 명기/10시간 암기의 광주기 하에 28.5 °C에서 유지되었습니다. 형태적으로 정상인 배아만 실험에 사용되었습니다. 모든 실험에서 배아는 NaCl, KCl, Ca(NO₃)₂·4H₂O, MgSO₄·7H₂O 및 pH 7.2로 조절된 HEPES를 포함한 시약급 화학 물질을 사용하여 조제한 Danieau’s 버퍼에서 배양되었습니다.
약물 준비 및 안전성 결정
Mollugin (40 mg)을 1 mL DMSO에 녹여 40 mg/mL 스톡 용액을 제조하였다. 이 스톡 용액을 먼저 Danieau’s buffer로 1:10 희석하여 4 mg/mL로 만든 후, 처리 농도인 22, 66, 200 µg/mL로 추가 희석하였다. 최대 안전 농도를 결정하기 위해, 수정 후 48시간(hpf) 된 AB strain 배아의 난막을 제거하고 0.003% 차아염소산나트륨으로 소독한 뒤 6-well 플레이트에 분주하였다 (그룹당 n=20, 3개 웰 반복). 배아를 E3 배지 내의 Mollugin (22 µg/mL, 66 µg/mL, 200 µg/mL, 240 µg/mL, 280 µg/mL, 320 µg/mL 또는 360 µg/mL)과 함께 28.5 °C에서 48시간 동안 배양하였다. 실체현미경 하에서 생존율을 모니터링하였으며, 배아 생존율이 90% 이상인 최고 농도를 후속 실험을 위한 안전 상한선으로 설정하였다.
꼬리 절단 및 재생 모델 구축
재생 연구를 위해, 배아 배지에 준비한 0.03% tricaine으로 48 hpf 야생형 AB 배아를 마취시킨 후 실체현미경 하에서 측면으로 배치하였다. 꼬리 절단 전, 배아를 Danieau’s buffer에 유지하였다. 실체현미경의 안내에 따라 표준화된 횡단 꼬리 절단을 수행하였다. 절단선은 척삭 끝의 바로 뒤쪽에 위치시켰으며, 척삭의 후단을 해부학적 지표로 사용하였다. 표본 간의 일관된 손상 수준을 보장하기 위해, 해당 지표보다 원위에 있는 꼬리 지느러미 접힘(tail fin fold)을 미세 메스로 제거하였다. 절단 직후(0 h), 실체 형광 현미경으로 이미지를 획득하였다. 절단 후, 재생 분석을 위해 배아를 해당 E3 기반 처리 배지로 옮겼다. Mollugin 작업 용액은 Mollugin 스톡 용액을 E3 배지에 희석하여 최종 농도가 22, 66, 200 µg/mL이 되도록 준비하였다. 재생 기간 동안 몰루진(Mollugin)을 배스 노출(bath exposure) 방식으로 투여하였다. 용매 노출 조건을 맞추기 위해, 비손상 대조군과 손상 모델군은 200 µg/mL Mollugin 군의 최종 DMSO 농도와 동일한 0.5% DMSO 함유 E3 배지에서 유지하였다. 배아를 6-well 플레이트에 담아 28.5 °C에서 2일 동안 유지하였으며, 매일 해당 E3 기반 처리 배지를 교체해 주었다. 꼬리 재생 및 대식세포 분포를 평가하기 위해 절단 후 24 및 48 h에 백색광 및 형광 설정 모두에서 이미지를 촬영하여 재생 과정을 기록하였다. 이미지 측정은 ImageJ를 사용하여 수행하였다.
재생 정량화를 위해, 회복된 꼬리 영역을 µm2 단위의 절대 면적으로 측정하였으며, 배아 크기나 원래의 꼬리 크기로 표준화하지 않았습니다. 변동성을 최소화하기 위해, 모든 배아는 척삭 끝 바로 뒤쪽의 동일한 해부학적 지점에서 절단되었으며, 그룹 간 측정 영역을 정의하는 데 동일한 지점이 사용되었습니다. 관심 영역은 꼬리 외형을 바탕으로 ImageJ에서 수동으로 구획하였으며, 분석은 처리 그룹을 알지 못하는 연구자에 의해 수행되었습니다. 대식세포 양성 영역 정량화를 위해, Tg(mpeg1:GFP) 배아의 GFP 형광 이미지를 ImageJ에서 분석하였습니다. 꼬리 손상/재생 영역은 꼬리 면적 측정에 적용된 것과 동일한 해부학적 지점을 사용하여 관심 영역으로 수동 정의하였습니다. 이미지는 8비트 그레이스케일로 변환되었으며, 동일한 실험 내 모든 이미지에 대해 동일한 배경 보정 설정을 사용하여 배경 형광을 제거하였습니다. 이후 GFP 양성 대식세포 관련 신호를 식별하기 위해 각 실험 내의 모든 이미지에 고정된 형광 임계값을 일괄적으로 적용하였습니다. 대식세포 양성 영역은 정의된 ROI 내에서 임계값 양성 GFP 영역으로 계산되었습니다. 측정은 형광 강도나 수동 세포 계수가 아닌 형광 양성 면적을 기준으로 하였습니다. 모든 이미지 분석은 처리 그룹을 알지 못하는 연구자에 의해 수행되었습니다.
RNA 추출 및 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)
재생 분석 완료 후, 각 실험 조건의 배아를 수집하고 RNA 분석을 위해 함께 모았습니다(그룹당 최소 20개의 배아). 각 조건에 대해, 하나의 생물학적 반복구는 동일한 실험 그룹에서 유래한 최소 20개의 배아가 포함된 풀링된 샘플로 구성되었습니다. 각 조건에 대해 3개의 독립적인 풀링된 생물학적 반복구를 준비하여 통계 분석에 사용하였습니다. 페놀/구아니딘 기반의 RNA 추출 시약을 이용해 기계적 균질화를 거친 후 총 RNA를 분리하였습니다. RNA의 품질과 농도는 A260/A280 비율을 측정하여 분광광도계로 평가하였습니다. 상용 역전사 키트를 사용하여 cDNA를 합성하였습니다. PCR 증폭은 SYBR Green 시약을 사용하여 수행하였습니다. qRT-PCR 사이클 조건은 다음과 같았습니다: 95 °C에서 30초간 초기 변성시킨 후, 95 °C에서 5초간 변성 및 60 °C에서 30초간 어닐링/신장을 40회 반복하였습니다. 세포 사멸 관련 유전자(caspase-3 및 Bcl-2), 염증 관련 유전자(TNF-α, IL-1β, IL-6, NF-κB1, TLR4, CCL2, ICAM1), 그리고 대식세포 표현형 관련 유전자(iNOS 및 arginase-1)의 발현 수준을 측정하였습니다. β-Actin을 참조 유전자로 사용하였습니다. 유전자 발현의 배수 변화(fold change)는 2−ΔΔCt법을 사용하여 결정하였습니다. 프라이머 정보는 표 1에 나열되어 있습니다.
SOD 및 CAT 활성 분석
꼬리 손상 후 항산화 상태를 평가하기 위해 SOD 및 CAT 수치를 측정하였다. 절단 후 48시간에 각 그룹의 제브라피시를 수집하여 차가운 PBS에서 균질화하였다. 원심분리 후, 상층액 추출물을 상용 활성 분석 키트를 사용하여 SOD 및 CAT 측정에 이용하였다. SOD 활성은 제조사의 지침에 따라 WST-1 기반 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 샘플을 표준물질과 함께 96-웰 분석 플레이트에 분주하고, 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 효소 활성은 표준 곡선을 통해 산출하였다. 모든 분석은 3회 반복 수행되었다.
통계 분석
데이터는 최소 3회 이상의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± SEM으로 표시하였다. 독성 분석의 경우, 각 독립 실험은 1개의 배아 배치로 구성되었으며, 그룹당 20개의 배아를 사용하고 웰을 3회 반복 측정하였다. Tg(mpeg1:GFP) 제브라피쉬의 재생 및 대식세포 이미징의 경우, 개별 배아를 측정 단위로 사용하였으며 그룹당 10개의 배아를 분석하였다. qRT-PCR 분석의 경우, 하나의 생물학적 반복구는 동일한 실험 그룹의 배아 최소 20개가 포함된 풀링된 샘플로 구성되었으며, 조건당 3개의 독립적인 풀링된 생물학적 반복구를 분석하였다. SOD 및 CAT 활성 분석의 경우, 조건당 5개의 독립적인 풀링된 생물학적 반복구를 분석하였다. 그룹 간 차이는 Tukey의 사후 검정을 동반한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)으로 분석하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism을 사용하여 수행하였다. p < 0.05인 경우를 통계적으로 유의미한 차이로 간주하였다.
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독성 및 안전 용량 결정
Mollugin의 효과를 조사하기 위해 먼저 독성 시험을 수행하였습니다. 결과에 따르면 제브라피시 배아의 사망률은 200 µg/mL 농도까지는 낮게 유지되었으나, 200 µg/mL 초과 농도에서는 사망률이 증가하는 것이 관찰되었습니다(표 2). 이에 따라 최고 안전 용량은 200 µg/mL로 결정하였으며, 저용량 및 중용량은 각각 22 및 66 µg/mL로 설정하였습니다.
꼬리 절단 모델 및 초기 꼬리 영역 회복 평가
이어서, 48 hpf 야생형 AB 제브라피시에서 꼬리 절단 모델을 구축하였으며, 현미경 관찰을 통해 모델 구축이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였다(그림 1). 이후, 모델 군에 안전 용량의 Mollugin을 투여하였다. 절단 후 24시간째에 200 µg/mL Mollugin을 처리한 ...
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본 연구에서는 Mollugin이 제브라피시의 꼬리 재생에 미치는 영향을 조사하였습니다. 테스트한 용량 범위 내에서, Mollugin 처리는 손상 후 꼬리 면적의 회복 개선과 더불어 세포사멸 관련 유전자 발현, 염증 마커, 항산화 효소 활성 및 대식세포 관련 마커의 변화와 연관이 있었습니다.
재생 연구의 주요 모델인 제브라피쉬는 여러 신호 전달 경로의 협력 작용을 통해 꼬리 재생이 일어납니다19. 손상 후, Bcl-2 발현은 감소한 반면 caspase-3 수준은 증가하여 세포 사멸이 촉진되었음을 나타냈습니다. 이러한 과도한 세포 사멸 활성화는 재생 세포 풀을 고갈시킬 뿐만 아니라 2차 염증 반응을 악화시켜 추가적인 조직 손상을 유발합니다20,21. Mollugin 처리 시 세포 사멸 마커의 균형이 회복되었으며, 이는 Mollugin이 ...
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저자들은 상충하는 이해관계가 없음을 선언합니다.
본 연구는 중국 푸젠성 보건위원회(지원 번호 2022QNA085)의 후원을 받아 수행되었습니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 6-웰 조직 배양 플레이트 | Corning | 3516 | |
| 카탈라아제 (CAT) 분석 키트 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| 클로로포름 | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| CMax Plus 마이크로플레이트 리더 | Molecular Devices | iD3s | |
| Danieau’s 완충액 – Ca(NO3)2·4H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Danieau’s 완충액 내 최종 농도: 0.6 mM. |
| Danieau’s 완충액 – HEPES | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Danieau’s 완충액 내 최종 농도: 5 mM; pH 7.2로 조정. |
| Danieau’s 완충액 – KCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Danieau’s 완충액 내 최종 농도: 0.7 mM. |
| Danieau’s 완충액 – MgSO4·7H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Danieau’s 완충액 내 최종 농도: 0.4 mM. |
| Danieau’s 완충액 – NaCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Danieau’s 완충액 내 최종 농도: 58 mM. |
| 디메틸 설폭사이드 (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E3 배아 배지 | 실험실 조제 (표준 레시피) | N/A | 표준 레시피. |
| 유전자 특이적 qPCR 프라이머 (tnfα, il1β, il6, nfkb1, tlr4, ccl2, icam1, inos, arginase-1, caspase-3, bcl2, β-actin) | Sangon Biotech | N/A | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | N/A | 버전 8.0. |
| ImageJ 소프트웨어 | National Institutes of Health (NIH) | N/A | 버전 1.52n. |
| 몰루긴 (Mollugin (≥98%, HPLC)) | Sigma-Aldrich | SMB00431 | Rubia cordifolia 유래 활성 화합물, DMSO에 40 mg/mL로 용해한 후 E3 배지에서 22, 66 및 200 µg/mL로 희석함. |
| 전동 조직 균질기 | IKA, T10 basic ULTRA-TURRAX (또는 동등 제품) | N/A | |
| NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | Novoprotein | abs60077 | |
| 인산 완충 식염수 (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| 실시간 PCR 시스템 (Archimed X4) | Sansure Biotech Inc. | Archimed X4 | |
| 냉장 마이크로 원심분리기 | SCILOGEX | CF1524R | |
| RNA-free 팁 | Sangon Biotech | F603222-0010 | |
| RNAiso Plus | Takara Bio Inc. | 9109 | 페놀/구아니딘 기반 RNA 추출 시약. |
| RNase-free 마이크로 원심분리 튜브, 1.5 mL | Axygen / Eppendorf | N/A | |
| SMZ800N 형광 실체 현미경 | Nikon | SMZ800N | Tg(mpeg1:GFP) 치어를 촬영하고 대식세포 응집을 정량화하는 데 사용된 형광 실체 현미경. |
| 차아염소산 나트륨 용액 | McLean, USA | N/A | 0.003% 작동 용액. |
| SYBR Green qPCR Mix (2× SYBR qPCR Mix) | Novoprotein | E096 | |
| SZX16 실체 현미경 | Olympus | SZX16 | 치어의 형태학적 관찰, 독성 평가 및 꼬리 지느러미 절단에 사용됨. |
| 총 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (T-SOD) 분석 키트 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-3 | |
| 형질전환 제브라피쉬 Tg (mpeg1:GFP) | Anburui, Fujian, China (또는 자체 콜로니) | N/A | 대식세포 리포터 라인. |
| 트리카인 메탄설포네이트 (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | 0.03% 작동 용액. |
| UltraPure DNase/RNase-Free 증류수 | Invitrogen | 10977023 | |
| 야생형 제브라피쉬, CZ98 계통 (Danio rerio) | Anburui, Fujian, China | N/A | 성체 번식 집단으로부터 수정란 및 치어를 얻음. |
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