핀 근학을 이용한 대동맥 내재성 강직성 평가: 순환 환경의 영향 조사를 위한 번역적 틀

요약

여기서는 핀근촬영을 통해 대동맥 내성 벽 강성(탄성 계수)을 평가하는 프로토콜과 순환 환경이 대동맥 내재 벽 강성을 조절하는 잠재적 역할을 검토하는 접근법을 제시합니다.

초록

대동맥 경직은 심혈관 질환 및 인지 저하, 신장 기능 장애, 시력 저하, 포도당 인슐린 기능 저하 등 만성 질환의 독립적인 위험 인자입니다. 생체 내에서 대동맥 강직성은 동맥 파형이나 종방향 동맥 구간을 각각 시각화하는 토노미터 기반 또는 초음파 기반 기법으로 일반적으로 평가됩니다. 그러나 생체 내 측정은 동맥압과 자율신경계 입력 등 여러 요인에 의해 영향을 받아 대동맥 강성이 어떻게 변하는지, 왜 변하는지에 대한 기전적 통찰을 제한합니다. 대동맥 조직을 직접 획득할 수 있는 전임상 마우스 모델은 생 체 내 대동맥 강성과 대동맥의 내재적 기계적 특성을 혼란 생리학적 변수 없이 평가할 수 있는 독특한 실험적 틀을 제공합니다. 이 모델들은 또한 순환 환경(즉, 혈류 내 순환 생리활성 분자의 집합)과 대동맥 강성을 전임상 중개 스펙트럼에서 조절하는 역할을 직접 조사할 수 있게 합니다. 순환 환경의 변화는 원발성 노화, 암 및 암 치료와 관련된 조기 노화 등 다양한 상태에서 대동맥 경화의 주요 기전적 근거로 부상했으며, 이는 전임상 및 임상 연구뿐만 아니라 중재 효과 매개에도 작용하고 있습니다. 이 글은 (1) 전임상 생체 모델에서 내재성 대동맥 강성(탄성 계수), (2) 전임상 및 임상 생체 시료를 사용하여 순환 환경(및 그 구성 요소)이 대동맥 강성에 기여하는 기여도를 평가하는 단계별 가이드를 제공합니다.

서론

대동맥 경직은 심혈관 질환 및 기타 만성 질환의 독립적인 위험 인자입니다 ^1,2. 생체 내 대동맥 강직성 평가는 대동맥 강성을 조절하는 통합적 생리학적 과정(예: 혈압 및 자율신경 입력)을 고려할 때, 기전적 해결이 부족할 수 있습니다². 따라서 핀 근촬영술을 이용해 대동맥 내재 강성(즉, 대동맥 벽 강성/탄성 계수)을 체외에서 평가하는 것은 교란 생리학적 변수와 무관하게 대동맥 강성을 직접 평가할 수 있는 기회를 제공합니다^. 더불어, 체외 실험 접근법을 사용하면 대동맥 벽 강성을 매개할 수 있는 분자 메커니즘을 탐구할 수 있습니다. 압력근촬영, 이축 평면 검사, 순환/맥박성 근도기 시스템과 같은 생리학적 시스템 모델링(예: 뇌내 압력 및 맥박성 혈역학)에 의존하는 다른 동맥 강성 평가 방법과 달리, 핀 근촬영은 생체 내 모델링이 필요 없는 고도로 통제된 환경에서 대동맥벽 강성을 등척력으로 직접 평가할 수 있게 합니다.

혈류 내 생리활성 분자의 집합체(순환 환경)는 대동맥과 직접 자주 접촉하며, 대동맥 경직 환경(예: 암 생존자나 암 생존자 모델과 같은 시간적/원발성 노화 및 조기 노화)에서 흔히 변화합니다^3,4. 우리는 전임상 생체(생미)와 임상(인간) 생물시료(혈장 및 혈청)를 모두 사용하여 순환 환경^{이 4차} 대동맥과 조기 노화³ 모두에서 대동맥 경직에 직접적으로 기여한다는 것을 확인했습니다. 더 나아가, 우리는 순환 환경 내에서 대동맥 경직에 미치는 영향을 매개하는 데 있어 특정 성분들이 얼마나 직접적으로 기여하는지 결정하는 실험적 틀을 구축하였다 ^3,5,6. 여기서는 핀근모학을 이용해 대동맥 내재성 강성과 순환 환경(및 그 구성 요소)의 대동맥 강화에 대한 기여를 평가하는 단계별 실험 접근법을 개괄하고 설명하며, 대표적인 결과(그림 및 인용문과 함께)를 제공합니다.

프로토콜

이 연구 전반에 걸쳐 수컷 야생형 C57BL/6J 젊은 성체(4개월)를 사용하였다. 실험용 쥐를 이용한 사육 및 절차는 콜로라도 대학교 안슈츠 의과대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 승인되었습니다.

1. 냉생리식염수 용액(CPSS) 제제

1. Ca²⁺ 링거의 스톡 용액을 diH₂O 1L에 준비하여 4 °C에서 보관합니다(표 1).
2. 13.9g의 MOPS를 100mL diH_2O에 첨가하여 MOPS 완충 용액을 준비하고 4 °C에서 보관합니다.
3. 100mL diH₂O에 0.186 g의 EDTA를 첨가하여 EDTA 스톡 용액을 준비하고, pH를 8.0으로 설정한 후 실온에서 보관합니다.
4. 위에 준비된 CPSS를 포함한 재고 용액과 아래에 나열된 화학물질을 준비합니다(표 2). 총 부피를 2L로 만들고, diH₂O, pH를 7.4, 34 °C에서 CPSS를 ≤ 0.45 μm 필터로 필터링합니다. 50mL 원뿔형 튜브에 분포하여 -20 °C에 보관하세요.

2. 마우스 대동맥 박리 (그림 1, 그림 2, 그림 3)

1. 이소플루란(2.5%)을 흡입해 마취시키고, 쥐를 등을 대고 누운 자세로 눕히세요(그림 1A-C).
2. 쥐가 마취 수술 평면 아래에 들어가면 심장 천자를 시행하여 혈액을 채취하고, 양측 흉부 절개술을 통한 2차 안락사법을 완성합니다(그림 1B–C).
3. 다음으로, 대동맥궁에서 복부 대동맥으로 대동맥을 조심스럽게 제거하세요(그림 1D–F).
4. 대동맥을 CPSS에 넣고 Fine Science Tools Vannas 스프링 가위(2.5mm)를 사용해 결합 및 혈관 주변 지방 조직을 모두 제거합니다(그림 2A–E).
5. 흉부 부위 대동맥궁 바로 아래에 1mm 폭의 대동맥 구간 세 개를 조심스럽게 절단합니다(그림 3).
6. 두 개의 1mm 대동맥 구간을 CPSS로 채운 1.5mL 튜브에 넣고 -80°C에서 스트레스-변형 핀 근조기 실험을 할 때까지 보관합니다. 아래에 설명된 후 조직학적 측정을 위해 세^번째 마디를 적절히 보관하세요.

3. 스트레스-변형 핀 근조도 실험

참고: 핀 근촬영 시스템은 대동맥 경직성의 시험관 내 검사를 수행하는 데 사용됩니다(그림 4 및 그림 5).

1. 먼저, 약 6mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한 챔버를 37°C로 예열하고, 1mm 크기의 동결된 대동맥 구간을 해동합니다.
   참고: 적절히 산소가 공급되고 pH가 조절된 대체 생리적 염액도 앞서 설명한 대로 사용할 수 있습니다⁷.
2. 37°C가 측정되면 제조사의 교정 프로토콜을 따르세요.
   1. 교정 브리지를 근촬영기에 놓아 T-밸런스 바가 핀 근촬영 챔버의 힘 변환기에 연결된 핀에 닿지 않도록 하세요.
   2. 힘 변환기 핀이 어떤 힘도 받지 않도록 하세요. 상대 힘이 안정되면 T-브리지에 2g의 추를 올려 T-밸런스 바가 힘 변환기 핀에 ~2g의 힘을 가하게 합니다.
   3. 힘 측정값이 9.71–9.91 mN 이내에 있는지 확인하세요. 그렇다면 보정은 완료된 것입니다.
3. 기준선 마이크로미터 측정값을 측정하고 값을 기록합니다(즉, 초기 측정값).
   1. 해부 망원경 아래에서 두 평행 핀이 거의 닿는 기준선 마이크로미터 거리를 측정합니다(그림 4).
      주의: 두 핀이 접촉하지 않도록 주의하세요. 이는 근도 챔버 내 힘 변환기를 손상시키거나 손상시킬 수 있습니다.
4. 해리 현미경 아래에서 1mm 대동맥 마디를 두 핀 위에 놓고 마이크로 캘리퍼스를 사용해 마디의 너비를 기록합니다(그림 6A). 그 다음 챔버 유닛을 핀 근촬영 시스템 인터페이스에 연결하세요.
   참고: 대동맥을 두 핀에 고정할 때 대동맥 구간에 장력을 가하기 위해 핀 폭을 늘려 대동맥 구간이 빠지지 않도록 하세요.
5. 대동맥에 장력이 가해지고 챔버가 핀 근촬영 시스템에 연결되어 장착된 상태라면, 위 3.3단계에서 결정한 "초기 위치"로 미세 포지셔너를 되돌려 놓으십시오.
6. 대동맥 완전 전신장.
   1. 초기 마이크로 포지셔너 위치에서 두 핀 간 거리를 1mm씩 늘려 대동맥을 늘리세요(그림 6B).
   2. 다음으로, 핀을 초기 미세 포지셔너 측정값으로 되돌려 대동맥을 이완시킵니다. 이 스트레칭-이완 시퀀스를 세 번 수행하세요(그림 6A).
      참고: 마지막 스트레칭-릴랙 시퀀스 후에는 마이크로 포지셔너가 초기 측정값으로 돌아와야 합니다.
7. 핀 근촬영 시스템 인터페이스에서는 사용 중인 각 챔버에 대해 제로 힘 측정이 가능합니다(그림 7).
8. 스트레스-변형 실험 시작.
   1. 마이크로 포지셔너를 조정하여 힘 측정값을 약 1 mN으로 증가시킵니다(그림 7).
   2. ~1 mN 힘의 평형(3–5초) 후, 새로운 마이크로 포지셔너 판독값을 ~1 mN 힘으로 기록하고 첫 번째 힘 값을 기록합니다.
   3. 마이크로 포지셔너를 50 μm(즉, 5 클릭/해시) 늘리고 대동맥 구간을 3분간 늘리세요. 3분 후, 기록적인 힘.
   4. 마이크로 포지셔너를 3분마다 50 μm씩 계속 증가시키며 '항복 지점'에 도달할 때까지 힘을 기록합니다.
      참고: 항해점(yield point)은 대동맥에 돌이킬 수 없는 구조적 손상(예: 대동맥의 찢어짐이나 파손, 상당한 힘 감소)이 발생하기 전에 발생하는 가장 큰 힘입니다.
   5. 초기 수율 지점 이후 대동맥을 추가로 50μm 늘려 수율점을 확인합니다. 힘 값이 항복 지점보다 낮거나 약간 높게 유지되도록 하세요. 만약 수율 지점이 확인되지 않으면, 3분 증가를 반복하여 수율 지점에 도달할 때까지 계속합니다.
   6. 항복 지점이 확인되면 실험이 완료됩니다. 지금 바로 분석을 시작하세요.

4. 콜라겐과 엘라스틴 영역의 탄성 계수를 결정하기 위한 응력-변형 핀 근촬영 실험 분석

1. 근도기에서 얻은 힘 측정값을 사용하여 다음 식을 사용하여 응력-변형 곡선을 생성합니다:
   변형률 (λ)=∆d/[d(i)]
   여기서 D 는 지름이고 d_I 는 초기 직경이며;
   응력 (t)=λL/[2(HD)]
   여기서 L은 1차원 하중, H는 내부 매체 두께, D는 용기 길이입니다. 응력-변형률 곡선이 생성되면, 앞서 설명한 대로 고힘 영역과 저힘 영역을 계산합니다 ^8,9(그림 8).
2. 고힘 영역(콜라겐 영역)을 계산하세요 (그림 8B).
   1. 응력-변형률의 탄성 계수를 응력-변형률의 선형 회귀 적합이 응력-변형률의 마지막 네 점에 적합한 기울기로 구합니다. 응력-변형률 그래프에서 고력 측정값을 얻으려면 아래 단계를 따르세요.
      1. 그래프에서 데이터 포인트를 우클릭하여 ' 데이터 선택 > 추가 > 시리즈 이름: 탄성 모듈러스를 입력하세요.
      2. 시리즈 X 값: 변형 값에서 4개의 데이터 포인트를 선택하세요. 이 세 지점이 힘이 '항율 지점'에 가까워질 때 나타나야 합니다. 네 번째 지점으로 항율 지점을 반드시 포함하세요.
      3. 시리즈 Y 값: 응력 값 중 4개의 데이터 포인트를 선택하세요. 이 세 지점이 힘이 '항율 지점'에 가까워질 때 나타나야 합니다. 네 번째 지점으로 항율 지점을 반드시 포함하세요.
      4. 확인 버튼을 클릭하고 차트에 추세선을 추가하고 선형 > 방정식을 표시>> 차트에 R제곱 값을 표시합니다.
   2. 이 방정식의 기울기는 고힘 탄성 계수입니다. 탄성 계수가 정확하려면 R-제곱 값이 ≥ 0.99가 되도록 하세요.
3. 저힘 영역(엘라스틴 영역) 계산 (그림 8C)
   1. 7차 다항식 방정식(r² > 0.99)을 데이터에 적합시키고, 방정식의 근을 계산하여 응력-변형 곡선의 엘라스틴 우세 영역(곡률이 ~0인 저힘 영역)의 경계를 결정합니다. 첫 번째 근은 매우 낮은 힘 영역과 엘라스틴 영역의 경계이며, 두 번째 근은 엘라스틴 영역과 콜라겐 섬유 결합 시작 사이의 경계입니다.
   2. 그 다음 두 근 ^8,9 사이의 응력-변형률 데이터에 적합한 선형 방정식의 기울기로 저힘 영역의 탄성 계수를 구한다. 이를 얻으려면:
      1. 보충표 1에 나온 것처럼 열을 포함하는 스프레드시트를 만드세요.
      2. 이 문서를 "txt" 문서로 변환한 후 R 코드 소프트웨어인 "Modulus of Elasticity" R 스크립트로 열어보세요.
      3. 데이터를 사용하려면 정규 기울기를 확인하세요 - R 출력의 3^차 도함수 그래프는 "M" 모양이어야 합니다.
      4. 결과 탭에서 기울기 열(Slope column) 아래의 수치값은 탄성 계수(modulus of elasticity)입니다. 탄성 계수가 정확하려면 R-제곱 값이 0.99 이상이어야 합니다.
      5. 이 값을 스프레드시트에서 얻으려면, R 코드 결과 탭에서 얻은 1차와 2차 미분 사이의 변형률 값(및 그에 해당하는 응력 값)을 선택하세요.
      6. 4.2단계에서 설명한 단계를 따라 방정식과 스프레드시트 그래프의 R² 값을 얻으세요.

5. 대동맥 직경과 벽 두께 평가

1. 마지막 1mm 대동맥 구간을 최적 절단 온도(OCT) 화합물이 채워진 크라이오몰드에 넣습니다. 링을 루멘이 평평하고 금형 바닥 중앙에 맞추고, 하루날축이 절단면에 수직으로 정렬되도록 하여 횡단면을 얻습니다.
2. 액체 질소에 냉각된 2-메틸부탄 용기를 준비한 후, 차가운 2-메틸부탄에 크라이오몰드를 담가 OCT가 불투명한 흰색으로 변할 때까지 담가둡니다.
3. 크라이오몰드는 절편 절단 전까지 -80°C에서 보관하세요. 적절한 OCT 절단 온도(≈-20 °C)로 냉동 온도를 설정한 후 동결 블록을 시료 홀더에 장착합니다.
4. 마운트에 고정된 후에는 조직이 나타날 때까지 두께를 7 μm로 유지하며 블록을 조심스럽게 다듬습니다.
5. 슬라이드에 마우스 ID를 붙이고 대동맥 조직을 7 μm 두께로 4–5개의 횡단부로 절단합니다.
6. 절단된 조직을 슬라이드로 옮기려면, 절단된 모든 부위를 냉동조절기(칼 단계라고도 함)에 올려놓고, 라벨이 붙은 슬라이드를 그 위에 직접 올려놓습니다.
7. 이식이 완료되면 자연 건조 슬라이드를 사용하세요.
8. 밝은 필드 현미경에서 10배 확대로 단면을 촬영하는 것. 이미지를 JPG/TIFF 형식으로 저장하고 사진 하단에 축척 바를 두세요.
9. 분석을 위해 ImageJ를 열고 파일 > 열기 에서 대동맥 이미지를 선택하세요.
10. 대동맥 이미지가 올라오면 Control + + 아이콘을 사용해 스케일 바를 확대한 후 라인 도구를 사용해 스케일 바 길이를 측정하세요. 결과를 채우려면 Control + M 키를 누르세요. 길이로 계산된 측정값은 스케일 바의 측정값입니다.
11. 소프트웨어를 보정하려면 '분석 > 설정 척도'로 가세요. 픽셀 단위의 거리 를 위해 8단계에서 ImageJ가 계산한 선의 길이를 입력하세요. 알려진 거리 에는 실제 스케일 바 길이를 입력하고, 단위 아래에 측정 단위(μm, mm, cm 등)를 입력하세요.
12. 전 역 박스를 체크하여 이후 모든 이미지를 자동으로 보정하세요. 다른 이미지의 스케일 바가 다른지, 아니면 ImageJ가 닫혀 있는지 주목하세요; 그렇다면 재보정이 필요합니다.
13. 벽 두께는 직 선 도구를 사용해 광미 가장자리에서 외부 음재 가장자리까지 수직선을 그립니다. Control + M 버튼을 눌러 결과 탭에서 길이를 자동으로 채워 넣으세요.
14. 5.13단계를 반복하여 대동맥 둘레를 따라 6개의 고르게 간격을 두고 측정을 수행하고 각 값을 기록합니다.
15. 마우스 대동맥당 평균 두께를 계산하기 위해 동일한 마우스의 4–5개 샘플에서 얻은 모든 두께를 평균화합니다.
16. 루미날 직경을 측정하려면 폴리곤 툴을 선택하고 내부 루미날 테두리를 시계 방향으로 따라 그립니다. Control + M 버튼을 눌러 주변 거리(μm)를 기록하세요.
17. 반시계 방향으로 따라 다른 지점부터 반복하세요. 두 둘레 값이 서로 가까운지 확인하고 그 대동맥 고리에 맞게 평균을 내세요.
18. 같은 마우스의 4–5개 대동맥 샘플에 대해 5.16단계를 반복하여 모든 둘레 값을 평균화합니다.
19. 직경을 계산하기 위해 다음과 같은 식을 사용하세요: 직경(μm) = 둘레/3.14.

6. 순환 환경 매개 대동맥 탄성 계수

참고: 순환 인자나 특정 화합물이 내재성 대동맥 강직성을 변화시키는지 확인하기 위해, 개입 미생물 마우스의 흉부 대동맥 고리를 정의된 표준 배양 조건(37 °C, 5%_CO2, 20% O₂, 가습) 하에서 체외 배양할 수 있습니다(그림 9).

1. 흉부 대동맥을 박리하고 각 조건마다 1mm 고리 두 조각을 절단하세요. 혈관 주위 지방 조직을 모두 제거하세요.
2. 96웰 플레이트에서 대동맥 고리를 표준 배지(DMEM + 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 구성)에 인큐베이팅합니다.
3. 배지에 실험적 처리를 추가하세요. 혈장 또는 세럼(처리되지 않은 혈장/혈청도 사용 가능)의 경우, 전체 배지 부피의 10%를 사용하세요. 전임상 및 임상(인간) 혈장 또는 혈청 ^3,4,6을 사용하세요 (그림 9).
4. 연구 그룹 간에 다르게 나타나는 순환 인자의 인과적 역할을 확립하기 위해, 혈장/혈청 노출을 반복하면서 동시에 그룹 간 농도 차이를 보정(즉, 관심 인자의 농도를 정규화함)하고, 평균 그룹 차이를 나타내는 농도에서 관심 인자의 직접적인 효과를 규명합니다. 또는 순환 환경의 영향을 매개하는 것으로 여겨지는 인자의 신호 전달을 차단하는 것.
   참고: 후자의 두 접근법은 각각 트리메틸아민-N-옥사이드(TMAO)⁵와 고급 당화 종산물 수용체 차단으로 이전에 수행된 바^{있습니다.}
5. 과도한 슈퍼옥사이드 관련 산화 스트레스 또는 미토콘드리아의 역할을 밝히기 위해-
   이 모델 시스템에서 특정 초산화물 관련 산화 스트레스를 사용하여 대동맥 고리를 인큐베이팅할 때 다음 농도를 사용합니다: TEMPOL: 1 μM ^5,10 및 MitoQ: 1 μM⁶.
6. 48–72시간 잠복 후 대동맥 고리를 핀 근도기에 넣고 위에 설명한 단계를 따르세요.

결과

연령 관련 대동맥 경화

내재 기계적 강성의 경우, 각 신장 간격에 대응하는 힘이 기록되어 계산에 사용됩니다. 앞서 논의한 계산에서는 응력-변형률 곡선을 생성하고, 위에서 설명한 대로 1) 콜라겐 영역 및/또는 2) 엘라스틴 영역의 탄성 계수를 계산할^{것입니다. 이는} Gioscia-Ryan 등이 처음 보여준 9번입니다. 응력-변형률 곡선에서 콜라겐 우세 영역의 탄성 계수는 응력-변형률^곡선 8,9,11,12,13의 마지막 4점에 적합한 선형 방정식의 기울기로 결정된다.

토론

핀 근촬영기를 이용해 대동맥 내재성 강직성 평가를 체 외 검사할 수 있어, 혈압과 자율신경계 입력과 같은 생 리 학적 변수와 무관하게 대동맥 내성 강성을 평가할 수 있는 기회를 제공합니다^. 더불어, 이러한 체외 실험 접근법은 대동맥 내재성 강성의 차이를 기저로 할 수 있는 분자 메커니즘을 스크리닝할 기회를 제공합니다. 여기서는 핀 근촬영법을 이용한 대동맥 내재성 강성을 평가하는 단계별 가이드를 제공하고, 이 접근법으로 이전에 발표한 연구의 대표적인 결과를 제시했습니다. 더 나아가, 전임상 및 임상 생물 시료를 사용하여 순환 환경이 대동맥 내재 강성 조절에 미치는 역할을 어떻게 조사할 수 있는지, 그리고 대동맥 내재성 강성의 차이를 부여하는 데 있어 순환 내 특정 인자의 인과적 역할을 어떻게 확립할 수 있는지에 대한 상세한 지침을 제공했습니다.

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-메틸부탄	Fisher Scientific	AA19387AP
BSA	Fisher Bioreagents	BP1600
염화 칼슘 이수화물	Sigma-Aldrich	C7902
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
D-(+)-글루코스 (덱스트로스)	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Fisher Scientific	MT10017CV
EDTA (A.C.S.)	Fisher Chemical	E478
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
황산 마그네슘 7수화물	Sigma-Aldrich	M2773
MitoQ	Cayman Chemical	845959-50-4
일나트륨 인산염	Sigma-Aldrich	S5011
MOPS (Na 염)	Sigma-Aldrich	M9024
멀티 핀 미오그래피 시스템	Danish Myo Technology (DMT)	620M
NaCl	Fisher Chemical	S271
페니실린-스트렙토마이신	Fisher Scientific	15-140-148
RAGE 항체	R&D System	AF1145
나트륨 피루브산염	Sigma-Aldrich	P2256
TEMPOL	Sigma-Aldrich	2226-96-2
Tissue-tek OCT 화합물	Sakura	4583
트리메틸아민 N-산화물 (TMAO)	Sigma Aldrich	317594

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