연구 논문

유방암의 면역 미세환경 내 MPO 발현의 연관성: 생물정보학 및 단일 세포 분석을 통한 통찰

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DOI:

10.3791/71189

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2026년 8월 14일

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1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 5College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 논문은 유방암에서 myeloperoxidase (MPO) 발현과 면역/골수성 특성 간의 연관성을 탐구하기 위한 재현 가능한 생물정보학 및 단일 세포 분석 워크플로우를 제시합니다. 분석이 공개 데이터셋과 in silico 방법을 기반으로 하므로, 결과는 탐색적이며 가설 생성 단계로 해석됩니다.

초록

유방암은 여전히 암 관련 사망의 주요 원인이며, 탐색적 계산 워크플로우는 추가 연구를 위한 면역 관련 마커의 우선순위를 정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 연구에서는 The Cancer Genome Atlas 유방 침습성 암(TCGA-BRCA) 벌크 전사체 데이터와 공개 단일 세포 데이터셋 GSE161529를 사용하여 myeloperoxidase (MPO) 발현과 임상 결과, 면역 침윤, 메틸화, 상위 조절자 주석, 단일 세포 발현 패턴, 가상 녹다운 민감도 결과, 약물-유전자 상호작용 검색, 그리고 흡수, 분포, 대사, 배설 및 독성(ADMET) 주석 간의 연관성을 조사하였습니다. MPO 발현은 인접 비종양 조직보다 유방암 조직에서 더 낮게 나타났습니다. MPO 발현이 높을수록 무진행 생존 기간이 더 길었으나, 전체 생존율 및 질병 특이적 생존율과의 연관성은 통계적으로 유의하지 않았습니다. 수신자 조작 특성(ROC) 분석은 분석된 공개 데이터셋 내에서 종양-정상 분리가 가능함을 시사했으나, 이를 임상 진단적 검증으로 해석해서는 안 됩니다. 면역 디콘볼루션 및 농축 분석 결과, MPO 발현은 면역 미세환경의 종양 내재적 조절을 확립하기보다는 주로 면역 및 골수성 관련 전사 특성과 궤를 같이하는 것으로 나타났습니다. 단일 세포 해상도에서 MPO 신호는 희소했으며, k-최근접 이웃(KNN) 기반의 주변 확장 전에는 단 85개의 MPO 양성 세포만이 검출되었습니다. 검출 가능한 MPO 신호와 MPO 관련 점수는 희소 발현, 세포 유형 주석의 불확실성, 드롭아웃, 더블렛 또는 주변 RNA의 영향을 받았을 수 있으므로 주의 깊게 해석되었습니다. In silico 가상 녹다운은 후보 면역 및 염증 관련 전사 변화를 시사했으나, 이러한 결과는 탐색적인 것으로 간주되며 검증이 필요합니다. 약물-유전자 상호작용 데이터베이스(DGIdb) 기반의 약물-유전자 검색 및 ADMET 주석은 예비 화학적 주석으로만 사용되었으며, 치료적 근거로 해석되지 않았습니다. 종합적으로, 본 연구는 유방암에서 MPO 관련 면역/골수 특성에 대한 가설을 생성하기 위한 재현 가능한 in silico 워크플로우를 제공하며, 이는 외부 코호트 검증과 실험적 확인이 필요합니다.

서론

유방암은 매우 이질적인 면역 관련 악성 종양입니다1. 질병의 진행, 재발 및 전이 위험, 그리고 치료 반응은 종양 면역 미세환경(TIME)의 구성 및 기능적 상태와 밀접하게 연관되어 있습니다2. 포괄적인 치료 전략의 지속적인 최적화에도 불구하고 일부 환자들은 여전히 병세가 진행되거나 재발하는 경험을 하며, 이는 TIME 상태를 특징짓고 위험 계층화를 지원하는 분자 생체지표를 식별하고 그 기저 메커니즘을 규명해야 할 긴급한 필요성을 강조합니다.

Myeloperoxidase (MPO)는 주로 뉴트로필(neutrophils)에서 발현되며, 단핵구(monocytes) 및 대식세포(macrophages)에서도 적은 수준으로 발현되는 헴(heme) 함유 과산화효소입니다. MPO는 차아염소산(hypochlorous acid) 및 기타 반응성 산화제를 생성함으로써 항균 방어에 기여하지만, 산화적 조직 손상과 만성 염증을 촉진할 수도 있습니다. 암에서 MPO의 생물학적 중요성은 상황에 따라 다른 것으로 보입니다3. 한편으로, MPO로 매개되는 산화적 스트레스는 DNA 손상, 지질 및 단백질 산화, 염증성 신호 전달, 종양 미세환경의 재구성을 통해 암 발생 및 종양 진행에 관여하는 것으로 알려져 있습니다4,5,6. 다른 한편으로는, 특정 종양 상황에서 MPO 양성 선천 면역 세포 또는 골수성 세포의 침윤이 양호한 예후 또는 항종양 면역 활성과 연관이 있는 것으로 나타났습니다7,8,9. 이러한 상충하는 듯한 발견들은 MPO의 임상적 및 생물학적 중요성이 종양 유형, 질병 단계, MPO의 세포 기원 및 종양 미세환경의 면역 구성에 따라 달라질 수 있음을 시사합니다. 하지만 유방암에서, 특히 단일 세포 수준에서의 MPO 발현 패턴과 예후적 연관성은 아직 완전히 규명되지 않은 상태입니다.

종양 면역 미세환경(TIME)은 이질적인 골수성, 림프성, 기질성 및 상피성 구획을 포함하고 있습니다10. MPO는 전형적으로 호중구 및 기타 골수계 세포와 관련이 있으며, 따라서 벌크 종양 프로파일의 MPO 관련 신호는 종양 세포 자체의 활성보다는 면역 세포 구성과 관련이 있을 수 있습니다10. 유방암에서 벌크 및 단일 세포 데이터셋 전반에 걸친 MPO 신호의 분포, 면역 침윤 추정치와의 연관성, 그리고 하위 계산 분석의 재현성 한계는 여전히 충분히 규명되지 않은 상태입니다. 따라서 본 연구에서는 MPO를 TIME의 입증된 인과적 조절 인자나 검증된 치료 표적이 아니라, 탐색적 워크플로우 개발을 위한 면역 관련 마커로 취급합니다. 단일 코호트 차별 발현 분석이나 단일 플랫폼 면역 침윤 추정치와 비교하여, 벌크 전사체 분석, 면역 디컨볼루션, 메틸화 주석, 단일 세포 매핑 및 계산적 섭동을 결합한 통합 워크플로우는 유전자 관련 면역 맥락에 대해 더 넓은 탐색적 관점을 제공할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 특히 실험 데이터셋을 아직 사용할 수 없는 경우, 후보 마커의 우선순위를 정하고 검증 가능한 가설을 생성하는 데 유용합니다. 그러나 이러한 계산적 통합만으로는 세포 기원, 인과 관계, 약리학적 활성 또는 임상적 유용성을 결정할 수 없습니다. 대규모 공개 암 코호트와 단일 세포 전사체 기술의 발전으로, 생정보학적 접근 방식을 통해 집단 및 단일 세포 수준 모두에서 유전자 발현, 임상 결과, 면역 세포 구성 및 전사 상태 간의 연관성을 탐색할 수 있습니다11. 단일 세포 유전자 조절 네트워크 기반의 계산적 섭동 방법은 유전자 관련 전사 민감도에 관한 가설 생성 정보를 추가로 제공할 수 있습니다12,13. 따라서 본 연구는 유방암에서 MPO의 발현 패턴, 생존 연관성, 면역/골수성 맥락, 메틸화 프로파일, 단일 세포 분포 및 탐색적 계산적 섭동 프로파일을 특성화하는 것을 목표로 하였습니다. 전체 워크플로우는 그림 1에 나타나 있습니다.

프로토콜

TCGA 데이터베이스로부터의 데이터 수집

TCGA 유방 침윤성 암(TCGA-BRCA) 코호트의 RNA 시퀀싱 데이터와 임상 정보는 genomic data commons 포털에서 가져왔습니다14. STAR 워크플로 RNA-seq 데이터는 million당 전사체 수(TPM) 형식으로 일치하는 임상 주석과 함께 추출되었습니다. 해당 임상 정보가 없는 RNA-seq 샘플은 제외되었습니다. 발현 기반 분석을 위해 TPM 값은 log2(TPM + 1)로 변환되었습니다. MPO 발현량은 유전자 심볼 MPO 및 Ensembl 유전자 ID ENSG00000005381.8을 사용하여 추출되었습니다. MPO-high 및 MPO-low 그룹화가 필요한 분석의 경우, TCGA-BRCA 종양 샘플만 포함시켰으며, 인접 정상 샘플은 그룹 지정에서 제외하였습니다. 종양 샘플은 TCGA-BRCA 종양 샘플 간의 log2(TPM + 1) 변환 MPO 발현 값의 중앙값을 기준으로 나누었습니다. MPO 발현량이 중앙값보다 크거나 같은 샘플은 MPO-high 그룹으로, 중앙값보다 낮은 샘플은 MPO-low 그룹으로 지정하였습니다. 달리 명시되지 않는 한, 이러한 중앙값 기반 그룹화 전략이 생존 분석, 차등 발현 분석, 농축 분석, 메틸화 그룹화 및 면역 세포 농축 비교에 사용되었습니다. 성별, 연령, 인종, 병리학적 T 단계, 조직학적 등급, PAM50 하위 유형, 병리학적 단계, 종양 상태를 포함한 임상 병리학적 특성과 전체 생존율(OS), 무진행 간격(PFI), 질환 특이적 생존율(DSS)을 포함한 생존 종점은 R version 4.2.1을 사용하여 분석되었습니다.

공공 면역조직화학 이미지 검색

정성적인 단백질 수준의 참조 자료로 인접한 정상 유방 조직과 유방암 조직의 대표적인 MPO 면역조직화학(IHC) 이미지를 사용하였다. 이 이미지들은 정량적 형태측정학적 분석이나 통계 분석에는 포함되지 않았다. 상자로 표시된 영역은 더 높은 배율로 보여주는 부위를 나타낸다. 스케일 바는 20× 이미지에서 100 µm, 40× 이미지에서 50 µm를 나타낸다.

발현 상관관계 분석

유방암에서 MPO 발현과 공동 변동하는 유전자를 조사하기 위해 TCGA-BRCA 데이터세트를 사용하였다. MPO와 단백질 코딩 유전자 간의 전장 유전체 피어슨 상관계수를 계산하였으며, 시각화를 위해 양의 상관관계가 높은 상위 30개 유전자와 음의 상관관계가 높은 상위 30개 유전자를 선정하였다. 다수의 유전자를 테스트한 상관 분석의 경우, Benjamini-Hochberg 허위 발견율(FDR) 방법을 사용하여 공칭 p-값을 보정하였다. MPO 관련 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크는 상호작용 유전자/단백질 검색 도구(STRING) 데이터베이스를 사용하여 구축하였으며, 상호작용 점수가 0.40보다 큰 단백질 쌍만을 시각화에 포함하였다15.

기능적 농축 분석

|log2FC| > 1 및 Benjamini-Hochberg 보정 p-value < 0.05의 임계값을 사용하여 MPO-high 및 MPO-low TCGA-BRCA 종양 그룹을 비교함으로써 차별 발현 유전자(DEGs)를 식별하였습니다. DEGs의 기능적 풍부도 분석은 R 패키지 clusterProfiler 버전 4.4.4를 사용하여 수행되었으며, 여기에는 유전자 온톨로지(GO)의 생물학적 과정, 세포 성분, 분자 기능 및 Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG) 경로 분석이 포함되었습니다16,17,18,19,20. 보정 p-value가 < 0.05인 경우 풍부해진 GO 및 KEGG 용어가 유의미한 것으로 간주되었습니다.

MPO-고발현군과 MPO-저발현군 간의 차등 발현 통계에 기반한 사전 순위 지정 유전자 목록을 사용하여 유전자 세트 풍성도 분석(GSEA)을 수행하였습니다. MSigDB v2022.1.Hs에 해당하며 3,050개의 유전자 세트를 포함하고 있는 MSigDB C2 Canonical Pathways 컬렉션 c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt를 사용하였습니다21,22. 풍성해진 용어들은 Benjamini–Hochberg 보정 p-value < 0.05, FDR q-value < 0.25, 그리고 |정규화된 풍성도 점수(normalized enrichment score)| > 1 기준에 따라 유의미한 것으로 간주하였습니다. 해당되는 경우, 시각화를 위해 GOplot 패키지를 사용하여 유의미하게 풍성해진 용어들의 Z-score를 산출하였습니다.

종양 내 면역 세포 농축 분석

TCGA-BRCA 코호트의 면역 및 기질 성분은 R 패키지 estimate 버전 1.0.13에 구현된 ESTIMATE 알고리즘을 사용하여 평가되었습니다. Log2(TPM + 1)로 변환된 발현 데이터를 입력값으로 사용하였으며, 각 종양 샘플에 대해 면역 점수(immune score), 기질 점수(stromal score) 및 ESTIMATE 점수를 산출하였습니다. TIMER/TIMER2.0을 사용하여 TCGA-BRCA 코호트 내 MPO 발현과 B 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 대식세포, 호중구 및 수지상 세포를 포함한 주요 면역 세포 집단의 추정 침윤 수준 사이의 연관성을 평가하였습니다23,24,25. TIMER 기반 결과는 해당 온라인 리소스에서 도출된 면역 침윤 추정치로 해석되었습니다. 24가지 면역 세포 유형에 대한 면역 세포 풍부도 분석을 위해 R 패키지 GSVA 버전 1.46.0을 사용하여 단일 샘플 유전자 집합 풍부도 분석(ssGSEA)을 수행하였습니다26. 22가지 면역 세포 유형의 CIBERSORT 기반 디콘볼루션(deconvolution)에 사용된 LM22 면역 세포 시그니처 행렬은 Supplementary Table 1에 제공되어 있습니다. MPO 발현과 면역 세포 풍부도 점수 간의 상관관계는 Spearman 서열 상관 분석을 통해 평가되었습니다. 중앙값을 기준으로 정의된 MPO-high 및 MPO-low 종양 그룹 간의 면역 세포 풍부도 점수 차이는 Wilcoxon 순위 합 검정을 사용하여 비교하였습니다. 여러 면역 세포 유형이 포함된 분석의 경우, p-값은 Benjamini–Hochberg 허위 발견율(false discovery rate) 방법을 사용하여 보정되었습니다.

MPO 유전자의 DNA 메틸화

MethSurv를 사용하여 MPO 로커스 내의 DNA 메틸화 패턴을 평가하였습니다. TCGA-BRCA에 대한 CpG 메틸화 베타 값과 생존 연관성은 MethSurv 플랫폼에서 얻었습니다. 선택된 MPO 관련 CpG 부위를 시각화하였으며, MethSurv에서 제공하는 생존 분석 결과물을 사용하여 생존 결과와의 연관성을 평가하였습니다27. 여러 CpG 부위가 포함된 분석의 경우, Benjamini-Hochberg 위양성 발견율(false discovery rate) 방법을 사용하여 테스트된 MPO 관련 CpG 부위 전반에 대해 p-값을 보정하였습니다. 이러한 메틸화 분석은 탐색적 후성유전학적 주석으로 해석되었습니다.

호중구 관련 유전자의 PPI 네트워크 구축 및 상관관계 분석

MPO와 호중구 관련 생물학적 기전 사이의 연관성을 조사하기 위해 체계적인 네트워크 분석을 수행하였습니다. 기존 문헌을 통해 호중구 활성화 및 관련 염증 과정의 확립된 매개체로 구성된 유전자 세트를 큐레이션하였습니다. 전체 호중구 관련 유전자 목록은 부록 표 2에 제공되어 있습니다. 유전자 기호를 공식 유전자 기호로 통일하고 중복 항목을 제거하였으며, 가용한 유전자를 TCGA-BRCA 발현 행렬과 교차시킨 후 STRING/PPI 분석, 허브 유전자 우선순위 지정 및 MPO-허브 유전자 상관관계 분석을 진행하였습니다. 이러한 유전자들 간의 PPI 네트워크는 중간 신뢰도 상호작용 점수 임계값(>0.40)을 적용하여 STRING 데이터베이스(버전 11.5)를 통해 구축하였습니다. 이 네트워크 내의 허브 유전자는 노드당 직접적인 상호작용 수를 정량화하는 연결 중심성(degree centrality)을 기반으로 알고리즘적으로 우선순위가 지정되었습니다. 연결 점수가 가장 높은 상위 20개 유전자를 선정하여 후속 상관관계 분석에 사용하였습니다.

이어서, TCGA-BRCA 전사체 데이터셋에서 이러한 허브 유전자들과 MPO의 발현 프로파일을 추출하였습니다. MPO와 각 허브 유전자 사이의 연관성은 Spearman 서열 상관분석을 사용하여 통계적으로 평가하였습니다. 허브 유전자들 자체 간의 상관관계 패턴을 규명하기 위해, 모든 종양 샘플에 대해 쌍별 Spearman 상관행렬을 계산하였습니다. 이러한 상관분석은 MPO-허브 유전자 상관관계의 롤리팝 플롯(lollipop plot)과 허브 유전자 간 상관관계 패턴을 나타내는 코드 다이어그램(chord diagram)/히트맵(heatmap)을 포함한 후속 시각화의 정량적 근거가 되었습니다.

MPO를 표적으로 하는 상위 전사 인자 및 miRNA 예측

MPO의 표적 TF를 예측하기 위해 KnockTF 데이터베이스(https://bio.liclab.net/KnockTF/index.php)28,29, ChIP 데이터베이스(http://chip-atlas.org/)30,31, 그리고 GTRD 데이터베이스32,33(https://gtrd.biouml.org/#!)가 사용되었다. 또한, MPO를 표적으로 하는 잠재적인 miRNA 결합 부위를 예측하기 위해 TargetScan 데이터베이스(https://www.targetscan.org/vert_80/)가 활용되었다. 벤 다이어그램은 MicroBioinformatics 웹사이트(https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)34를 사용하여 생성되었다.

MPO의 단일 세포 분석

특정 데이터셋 GSE161529는 Gene Expression Omnibus (GEO)에서 얻었습니다. 데이터 전처리 과정에서 먼저 저품질 세포를 제외하기 위해 세포 수준의 필터링을 수행하였으며, 제외 기준은 미토콘드리아 유전자 발현 25% 초과, 총 고유 분자 식별자(UMI) 수 5000 미만, 또는 검출된 유전자 수 2500개 미만 중 어느 하나라도 해당되는 경우였습니다. 그 후, 주변 RNA 오염 및 기술적 배치 효과(batch effects)를 보정하였습니다35. 세포 간 유사성을 평가하기 위해 주성분 분석(PCA)을 통한 차원 축소를 수행하였으며, 이어서 세포 클러스터링 및 시각화를 위해 UMAP을 적용하였습니다. 그런 다음, 세포의 전형적인 마커 유전자에 따라 각 클러스터에 세포 유형을 주석 처리하였습니다11. 단일 세포 시그니처 스코어링에 사용된 MPO 관련 유전자 세트는 Supplementary File 1에 제공되어 있습니다. 스코어링 전, 유전자 심볼을 공식 유전자 심볼로 통일하고, 중복 항목을 제거하였으며, 사용 가능한 유전자를 GSE161529 발현 행렬과 교차 확인하였습니다. AUCell, Seurat AddModuleScore 및 ssGSEA를 사용하여 세포당 MPO 관련 점수를 계산하였습니다. 세 가지 방법으로 얻은 점수는 Z-score 정규화를 통해 비교 가능한 범위로 스케일을 조정하였으며, 이를 통합하여 후속 기술 분석을 위한 종합 MPO 관련 점수를 생성하였습니다. 세포-세포 상호작용 네트워크를 분석하여 MPO 관련 신호에 따라 층화된 상피 종양 세포와 다양한 파트너 세포 유형 간의 추론된 리간드-수용체 통신 패턴을 비교하였습니다. 이러한 결과는 MPO 발현 세포가 세포 간 통신을 직접 매개한다는 증거라기보다는 기술적인 통신 패턴으로 해석되었습니다.

scTenifoldKnk를 이용한 MPO의 단일 세포 가상 녹다운 및 경로 농축 분석

Seurat와 scTenifoldKnk를 통합하여 MPO의 단일 세포 가상 녹다운(virtual knockdown)을 수행하였다. 표준 품질 관리(세포당 200–6,000개의 유전자, 미토콘드리아 분율 < 10%)를 거친 후, 데이터를 로그 정규화하고 차원 축소 및 클러스터링을 위해 2,000개의 고변이 유전자를 선정하였다. MPO 관련 컨텍스트를 강화하기 위해, 골수성/중성구 유전자 모듈의 상위 50% 점수를 얻은 세포들을 유지하였다. 이 세포들 중 PCA 공간에서 k = 40의 최근접 이웃(nearest neighbors)을 사용하여 MPO 양성 시드로부터 확장함으로써 MPO 인접 서브셋(MPO-neighborhood subset)을 정의하였다. 확장된 서브셋을 순수한 MPO 양성 집단으로 간주하지 않았으며, 이 KNN 확장 단계로부터 세포 유형 비율에 대한 결론을 도출하지 않았다. 해당 서브셋을 대상으로 scTenifoldKnk를 통한 가상 녹다운 분석을 수행하였으며, 고변이 유전자와 MPO(≥25개 세포에서 발현)의 합집합을 유전자 세트로 사용하였다. 유의미하게 섭동된 유전자를 식별하였다(FDR < 0.05, BH 보정). 도출된 유전자들은 GO Biological Processes 및 KEGG 경로의 기능적 풍부도 분석을 추가로 수행하였다(q < 0.05).

탐색적 약물-유전자 검색 및 ADMET 주석 달기

DGIdb를 통해 MPO와 관련된 약물-유전자 또는 화학물질-유전자 상호작용 기록을 예비적으로 조회하였다. 데이터베이스 기반의 상호작용 목록에는 서로 다른 유형의 증거로 뒷받침되는 항목들이 포함될 수 있으며, 이것이 반드시 임상적으로 적용 가능한 치료제와 직접적으로 일치하는 것은 아니므로, 검색된 화합물들은 우선순위가 높은 치료 후보 물질이라기보다 탐색적 주석으로 처리하였다. 이후 SwissADME와 ADMETlab을 사용하여 예측된 물리화학적, 약동학적 및 독성학적 특성을 요약하였다. 이러한 in silico 주석은 화합물 수준의 해석을 위한 예비적 맥락을 제공하고, 치료적 관련성을 고려하기 전에 추가적인 약리학적, 독성학적 및 임상적 큐레이션이 필요함을 강조하는 데 사용되었다36.

결과

유방암에서의 MPO 발현 패턴 및 탐색적 생존 연관성

암 데이터 세트 전반의 MPO 발현 패턴을 기술하기 위해, TCGA 범암(pan-cancer) 데이터 세트의 MPO RNA-seq 데이터를 분석한 결과, 방광 요로상피암(BLCA), 유방 침윤성 암(BRCA), 교모세포종(GBM), 두경부 편평세포암(HNSC), 신장 염색성 세포암(KICH), 간세포암(LIHC), 폐 선암(LUAD), 폐 편평세포암(LUSC), 췌장 선암(PAAD), 전립선 선암(PRAD) 및 갑상선암(THCA)의 종양 조직에서 MPO 발현이 더 낮게 관찰되었으며, 결장 선암(COAD), 신장 유두세포암(KIRP) 및 기타 조직에서는 MPO 발현이 더 높게 관찰되었습니다(Figure 2A). 이어서 각 암종에서 MPO 발현과 임상 결과 사이의 연관성을 평가했습니다. TCGA-BRCA 코호트에서 비쌍체 및 쌍체 비교 모두 종양 조직의 MPO 발현이 정상/인접 조직보다 낮음을 보여주었습니다(Figure 2B,C). 종양 MPO 발현의 중앙값을 기준으로 TCGA-BRCA 종양 샘플을 층화한 후 Kaplan-Meier 분석을 수행한 결과, MPO 발현이 더 높은 환자의 무진행 기간이 더 길었습니다(Hazard Ratio (HR) = 0.67, p = 0.028) (Figure 2D). 전체 생존율(OS) (p = 0.296; Supplementary Figure 1A) 및 질환 특이적 생존율(DSS) (p = 0.18; Supplementary Figure 1B)은 통계적으로 유의하지 않았습니다. 종양 대 정상 ROC 곡선은 이 데이터 세트에서 조직 그룹 간의 구분을 시사했으나(Figure 2E), 이 분석을 임상 진단 검증으로 해석해서는 안 됩니다. 이러한 탐색적 판별은 정상 샘플의 출처, 배치 효과, 종양 순도 및 조직 구성의 차이에 의해 영향을 받을 수 있습니다. MPO 발현은 병리적 T 단계(Figure 2F) 및 PAM50 서브타입 분포(Figure 2G)와도 연관이 있었습니다. 정성적인 단백질 수준의 참고 자료로 인접 정상 유방 조직과 유방암 조직의 대표적인 MPO 면역조직화학(IHC) 이미지를 포함했습니다(Figure 2H). 상자로 표시된 영역은 고배율로 보여주는 영역을 나타냅니다. 20× 개요 이미지에는 100 µm 스케일 바가 포함되어 있으며, 40× 고배율 이미지에는 50 µm 스케일 바가 포함되어 있습니다.

TCGA-BRCA 코호트 내 MPO의 상관관계 및 농축 분석

피어슨 상관 분석을 통해 MPO와 양의 상관관계를 갖는 상위 30개 유전자를 확인하였으며, 이들은 MPO 발현 구배에 따라 협응적으로 상향 조절되는 양상을 보였습니다(그림 3A). 반면, 음의 상관관계를 갖는 상위 30개 유전자는 이와 반대되는 발현 패턴을 나타냈습니다(그림 3B). 경로 수준에서 MPO 발현은 염증 반응 시그니처(r = 0.41; 그림 3C), EMT 마커(r = 0.264; 그림 3D), 그리고 활성 산소(ROS) 관련 유전자 세트 점수(r = 0.415; 그림 3E)를 포함한 여러 종양 관련 시그니처 점수와 유의미한 양의 상관관계를 보였습니다. 이는 TCGA-BRCA 코호트에서 MPO 발현이 염증/산화 및 중간엽 유사 전사 상태와 궤를 같이함을 시사합니다.

MPO 관련 유전자의 비지도 클러스터링을 통해 종양을 병리적 T 단계 및 PAM50 내재적 아형을 포함한 임상 주석과 일치하는 발현 패턴으로 추가 세분화하였습니다(그림 3F). MPO 관련 유전자 간의 가능한 연결성을 탐색하기 위해 STRING을 사용하여 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 구축하였으며, 이를 통해 여러 MPO 상관 유전자들 사이의 상호 연결된 모듈을 확인하였습니다(그림 3G). PPI 네트워크에서 ESR1, FOXA1, XBP1, GATA3 및 KRT18은 이 상관관계 유래 모듈 내에서 높은 네트워크 연결성을 보였습니다. 이러한 결과는 MPO 발현과 함께 변하는 유전자들을 식별한 것이며, MPO 관련 병인이나 방향성을 확립한 것은 아닙니다. MPO 고발현 그룹과 저발현 그룹 간의 차별 발현 분석을 통해 전사체 차이를 확인하였으며, 이를 화산 플롯(volcano plot)에 요약하였습니다(그림 3H). 총 1,159개의 상향 조절 유전자와 854개의 하향 조절 유전자가 식별되었으며, 이는 후속 농축 분석을 위한 입력 데이터로 제공되었습니다.

다음으로 R의 clusterProfiler 패키지를 사용하여 MPO-high 그룹과 MPO-low 그룹 간의 차별 발현 유전자(DEG)의 기능적 연관성을 조사하였습니다. 유전자 온톨로지(GO) 풍부도 분석 결과, 이러한 DEG는 주로 면역 반응 관련 세포 표면 수용체 신호 전달 및 림프구 매개 면역을 포함한 면역 관련 생물학적 과정에 관여하는 것으로 나타났으며, T-세포 수용체 복합체와 같은 세포 구성 성분 및 수용체 활성화 효능과 관련된 분자 기능에서도 풍부도가 관찰되었습니다(그림 4A). 이와 일관되게 KEGG 경로 분석에서는 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용, 케모카인 신호 전달, T-세포 수용체 신호 전달, 자연 살해 세포 매개 세포 독성, Th1/Th2 및 Th17 분화, NF-κB 신호 전달, 일차 면역 결핍, 그리고 IgA 생성을 위한 장내 면역 네트워크를 포함하여 면역 및 염증 관련 경로가 강조되었습니다(그림 4B).

발현 방향성을 기능적 용어와 더욱 통합하기 위해, DEG |log2FC| 값을 기반으로 용어 수준의 Z-score를 계산하는 GO 플롯을 사용하였으며, 이를 통해 체액성 면역 반응, 백혈구/림프구 매개 면역, 면역 반응 활성화 및 신호 전달과 같은 면역 강화 전사 프로그램이 다시 한번 강조되었습니다(그림 4C). 순위가 매겨진 유전자 목록을 기반으로 한 유전자 세트 풍부성 분석(GSEA) 또한 적응 면역 체계, 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용 및 호중구 탈과립화를 포함한 면역 체계 경로의 풍부성을 보여주었습니다(그림 4D–G). MPO는 골수성/호중구 관련 유전자이므로, 이러한 풍부성은 MPO 자체가 면역 미세환경을 재구성한다는 증거라기보다, MPO-high 샘플이 더 강한 면역/골수성 전사 신호를 나타낸다는 증거로 해석됩니다.

유방암에서 MPO 발현과 면역 세포 침윤 사이의 상관관계

TCGA-BRCA 코호트에서 MPO 발현과 종양 미세환경 특성 간의 관계를 평가하였습니다. ESTIMATE 알고리즘을 적용한 결과, MPO 발현은 ESTIMATE 점수 (R = 0.347, p < 0.001), 면역 점수 (R = 0.361, p < 0.001) 및 기질 점수 (R = 0.232, p < 0.001)와 유의미한 양의 상관관계를 보였습니다 (Figure 5A). 샘플별 이러한 점수들의 분포는 Figure 5B에 나타내었습니다. TIMER/TIMER2.0 리소스를 이용한 분석 결과, TCGA-BRCA 코호트에서 MPO 발현은 B 세포, CD8+ T 세포, 호중구, CD4+ T 세포, 대식세포 및 수지상세포를 포함한 주요 면역세포 집단의 추정 침윤 수준과 관련이 있는 것으로 나타났습니다 (Figure 5C). 이러한 연관성 패턴은 24가지 면역세포 유형에 대한 ssGSEA 기반 면역세포 풍부도 점수를 사용하여 추가로 평가되었습니다. Benjamini–Hochberg 허위 발견율 보정 후, MPO 발현은 T 세포, B 세포, 세포독성 세포, 수지상세포 서브셋, 대식세포, T 헬퍼 서브셋, 조절 T 세포, CD8+ T 세포, NK 세포, 비만 세포 및 호중구를 포함한 여러 면역세포 풍부도 점수와 양의 상관관계를 보였습니다 (Figure 5D). 이러한 결과는 MPO가 직접적으로 면역세포 침윤을 조절한다는 증거라기보다는 면역 구성 간의 연관성으로 해석됩니다. TCGA-BRCA 코호트 전반의 샘플 수준 면역세포 풍부도 패턴을 시각화하기 위해 히트맵을 생성하였습니다 (Figure 5E). 이어 중앙값으로 정의된 MPO 고발현군과 저발현군 종양 그룹 간의 ssGSEA 추정 면역세포 풍부도 점수를 비교하였습니다. 활성화된 수지상세포 (aDC), B 세포, CD8+ T 세포, 세포독성 세포, 호중구, T 세포, Tregs, Th1 세포, Th2 세포, Th17 세포, γδ T 세포, 여포성 헬퍼 T 세포 (TFH) 고변동 유전자 (HVG) 세포, 작동 기억 T 세포, 중앙 기억 T 세포 및 T 헬퍼 세포를 포함한 여러 면역세포 풍부도 점수가 두 그룹 간에 차이를 보였습니다 (Figure 5F,G). 또한, LM22 시그니처 매트릭스를 이용한 CIBERSORT 기반 디콘볼루션을 수행하여 22가지 면역세포 유형의 상대적 분율을 추정하였으며, 그 결과로 얻은 면역세포 구성 패턴을 Figure 5H에 나타내었습니다.

TCGA-BRCA 코호트의 MPO DNA 메틸화 분석

동일한 종양 MPO 발현 중앙값 컷오프를 사용하여 TCGA-BRCA 샘플을 MPO-high 그룹과 MPO-low 그룹으로 나누었으며, 각 그룹에 대한 DNA 메틸화 패턴을 시각화하였습니다(그림 6A). MethSurv 분석 결과, cg22331200, cg14619064 및 cg11151395를 포함하여 MPO 유전자좌 내의 선택된 CpG 사이트들이 생존율과의 연관성을 보였습니다(그림 6B–G). 이러한 메틸화 관련 결과는 탐색적 후성유전학적 주석으로 해석되었으며, 예후 또는 기전적 결론을 내리기 전 독립적인 검증이 필요합니다.

유방암에서 MPO 발현과 호중구 관련 유전자 네트워크 간의 연관성

MPO 발현과 호중구 관련 유전자 사이의 연관성을 조사하기 위해 TCGA-BRCA 코호트를 이용하였다. 호중구 관련 유전자에 대해 STRING 기반의 PPI 네트워크를 구축하였으며, 네트워크 토폴로지에 따라 허브 유전자의 우선순위를 정하였다(그림 7A). 이후 상위 20개 허브 유전자를 대상으로 MPO 발현과의 상관관계를 평가하였다. 롤리팝 플롯에 나타난 바와 같이, MPO는 여러 호중구 관련 매개체와 주로 양의 상관관계를 보였으며, 특히 CCL5, CCL2, TLR2와 같은 케모카인/선천 면역 신호 전달 성분뿐만 아니라 TLR4, CXCR4, TNF, MMP9에서도 더 강한 연관성이 관찰되었다(그림 7B).

이러한 허브 유전자들 사이의 공동 조절 패턴을 추가로 특성화하기 위해, 코드 다이어그램(chord diagram)과 상관관계 히트맵(correlation heatmap)을 사용하여 쌍별 관계를 시각화하였으며, 그 결과 허브 모듈 전반에 걸쳐 광범위한 양의 유전자 간 상관관계가 나타났습니다. 이는 조정된 염증/중성구 관련 전사 프로그램과 일치하는 결과입니다 (그림 7C,D). 종합적으로, 이러한 결과는 유방암에서 MPO 발현이 높을수록 중성구 관련 유전자 네트워크의 조정된 발현이 동반됨을 시사합니다.

MPO에 대한 후보 전사 인자 주석

MPO와 잠재적으로 연관된 후보 전사 인자를 탐색하기 위해 KnockTF, ChIP-Atlas 및 GTRD를 포함한 공개 전사 인자 리소스를 조회하고 교차 분석하였습니다. 후보 전사 인자들은 네트워크 기반 우선순위 지정 및 상관관계 분석을 통해 추가로 요약되었습니다. 도식화된 요약 내용은 다음에서 확인할 수 있습니다. 부록 그림 2, 전체 표 결과는 다음에서 제공됩니다. 보충 파일 2이들 데이터베이스는 서로 다른 실험적 맥락의 증거들을 통합하고 있으므로, 데이터베이스 중첩 및 네트워크 차수는 후보 주석 달기와 우선순위 선정에만 사용되었습니다. 이러한 결과가 유방암에서 MPO의 직접적인 전사 조절에 대한 기능적 증거로 해석되지는 않았습니다. 따라서 MYC를 포함한 후보 인자들은 검증된 상위 조절자가 아니라 보조적인 탐색적 주석으로 제시되었습니다.

MPO 신호에 따라 층화된 단일 세포 클러스터링 및 기술적 세포 간 통신 분석

세포 유형을 주석 처리하기 위해, 우선 각 계통의 표준 마커를 기반으로 클러스터별 발현 분석을 수행하였습니다. 클러스터 전반에 걸친 이러한 핵심 유전자들의 평균 발현 수준과 발현 세포의 백분율이 표시되어 있으며, 이는 후속 주석 처리를 뒷받침합니다(Figure 8A). 이에 따라 주석 처리된 세포 클러스터들이 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP) 플롯으로 시각화되었으며, 각 집단은 plasmacytoid dendritic cells, endothelial cells, myoepithelial cells, cycling epithelial cells, plasma cells, cytotoxic T cells, epithelial tumor cells, B cells, activated CD4 T cells, monocytes–macrophages, fibroblasts 및 conventional T cells를 포함하여 식별된 유형에 따라 색상으로 구분되었습니다(Figure 8B). 히트맵은 세포 클러스터(C1-C8) 전반에 걸친 선택된 유전자들의 발현 수준을 보여줍니다. 각 행은 유전자를 나타내며, 각 열은 세포 클러스터를 나타냅니다. 색상 그라데이션은 발현 수준을 나타내며, 빨간색은 높은 발현을, 파란색은 낮은 발현을 의미합니다. 왼쪽의 덴드로그램은 유사한 발현 패턴을 가진 유전자들을 클러스터링합니다(Figure 8C). MPO 관련 점수는 Supplementary File 1에 제공된 MPO 관련 유전자 세트를 사용하여 세포별로 계산되었습니다. AUCell, Seurat AddModuleScore 및 단일 샘플 유전자 세트 풍부성 분석(ssGSEA)이 세포별 점수 계산에 사용되었습니다. 세 가지 방법으로 얻은 점수는 Z-score 정규화를 거쳐 비교 가능한 범위로 조정되었으며, 이를 통합하여 후속 기술 분석을 위한 복합 MPO 관련 점수를 산출하였습니다(Figure 8D).

본 세포-세포 상호작용 분석에서는 상호작용 네트워크, 신호 패턴 히트맵, 유출 신호 버블 플롯 및 유입 신호 버블 플롯을 포함하여, MPO 관련 신호에 따라 층화된 세포 그룹 간의 추론된 리간드-수용체 통신 패턴을 비교하였습니다(그림 8E–H). 단일 세포 수준에서 MPO 신호가 희소했고, 주석이 달린 세포 유형 전반에 걸친 겉보기 분포가 드롭아웃, 주변 RNA, 더블릿 및 주석의 불확실성에 의해 영향을 받았을 수 있으므로, 이러한 통신 플롯은 기술적인 워크플로 결과물로 해석해야 합니다. 이는 MPO를 발현하는 세포가 세포 간 통신을 매개하거나 제어한다는 것을 입증하는 것이 아닙니다. 검출 가능한 MPO 신호는 주석이 달린 상피 종양 세포와 단구-대식세포를 포함한 제한된 수의 세포에서 관찰되었습니다(그림 8I). MPO가 전형적으로 호중구/골수성 계통과 관련되어 있다는 점을 고려할 때, 이러한 패턴은 독립적인 단일 세포 데이터 세트나 직교 실험 방법을 통해 검증이 필요합니다.

희소성에 기반한 탐색적 scTenifoldKnk 민감도 분석 MPO 양성 세포

여러 개의 10x Genomics 샘플을 통합한 후, 정규화 및 HVG 선택, PCA 기반 차원 축소, k-최근접 이웃 그래프 구축 및 Louvain 클러스터링을 수행하였다. 클러스터 전반의 전형적인 마커 유전자 발현 패턴을 DotPlot으로 요약하여 이후의 세포 유형 주석 작업을 뒷받침하였다(그림 9A). UMAP 시각화를 통해 통합 데이터셋 내의 주석 처리된 단일 세포 집단들을 확인하였다(그림 9B). 전형적인 계통 마커(예: 상피 세포의 경우 EPCAM 및 KRT8/KRT18, 면역 세포의 경우 PTPRC, B 세포의 경우 MS4A1, 골수성 세포의 경우 LST1/S100A8/S100A9, 내피 세포의 경우 PECAM1, 섬유아세포/평활근 계통의 경우 COL1A1)가 클러스터 특이적 발현 패턴을 보여 세포 유형 주석을 뒷받침하였다(그림 9C). 샘플별로 층화된 누적 막대 그래프를 통해 각 샘플이 여러 클러스터를 포함하고 있으며, 배치 간의 전체적인 변동이 제한적임을 확인하였다(그림 9D).

단일 세포 데이터셋에서 MPO 발현은 상대적으로 드물게 나타났으며, 초기에는 85개의 MPO 양성 세포만이 검출되었습니다(그림 9E). 이러한 제한된 세포 수를 고려하여, KNN 기반의 이웃 확장(neighborhood expansion)은 탐색적 민감도 분석을 위한 국소 MPO 이웃 서브셋을 정의하는 용도로만 사용되었습니다. 확장된 서브셋에는 MPO 발현이 낮거나 검출되지 않는 인접 세포가 포함될 수 있으므로, 이를 순수한 MPO 양성 집단으로 해석해서는 안 됩니다. 이 MPO 이웃 서브셋 내에서 scTenifoldKnk를 사용하여 MPO의 가상 넉다운(virtual knockdown)을 계산적 민감도 분석으로 수행하였습니다. 그 결과로 도출된 화산 플롯(volcano plot), 매니폴드 변위 분석(manifold displacement analysis), 매니폴드 정렬 시각화(manifold alignment visualization), GO/KEGG 농축 결과 및 상위 변위 유전자(그림 9F-N)는 항원 제시, 골수구/림프구 활성화, 사이토카인 생성 및 파고솜 관련 경로와 관련된 후보 전사 프로그램들을 강조하였습니다. 이러한 결과는 MPO가 유방암에서 이러한 경로들을 기전적으로 조절한다는 직접적인 증거라기보다, 탐색적인 전사 민감도 출력 결과로 해석되어야 합니다. 이러한 관찰 결과를 입증하기 위해서는 독립적인 단일 세포 데이터셋과 면역조직화학염색, 유세포 분석, qPCR 또는 기능 분석과 같은 직교 실험적 검증이 필요할 것입니다.

탐색적 약물-유전자 상호작용 검색 및 ADMET 주석 생성

MPO 중심 분석의 탐색적 확장으로서, DGIdb로부터 약물-유전자 상호작용 정보를 검색하였다. 이에 대한 그래픽 요약은 다음에서 확인할 수 있다. 부록 그림 3, 화합물 수준의 결과는 다음에서 제공됩니다. 부록 표 3DGIdb 쿼리 결과, 임상적 타당성이 제한적이거나 독성 프로파일이 불리한 화합물을 포함하여 MPO와 관련된 이질적인 화학 물질 항목들이 도출되었습니다. 따라서 본 분석을 바탕으로 이러한 데이터베이스 유래 화합물들은 유방암의 치료 후보 물질로 고려되지 않았습니다. 예측된 물리화학적, 약동학적 및 독성학적 특성에 대한 예비 주석을 제공하기 위해 ADMET 관련 정보를 요약하였습니다. 데이터베이스 기반의 화합물 검색 및 ADMET 주석 부여는 임상적으로 선별된 약물 우선순위 지정과 동일하지 않습니다. 따라서 이러한 결과는 스크리닝 수준의 화학적 주석 역할만 하며, 어떤 화합물이든 치료 연구 대상으로 고려되기 전에 세심한 약리학적, 독성학적 및 임상적 필터링이 필요함을 시사합니다. 본 연구의 주요 결과는 MPO 발현과 면역/골수구 관련 전사 특성 사이의 연관성에 초점을 맞추고 있습니다.

데이터 가용성>:

TCGA-BRCA 전사체 및 임상 데이터는 Genomic Data Commons 포털(https://portal.gdc.cancer.gov; 2025년 8월 26일 다운로드; 데이터 릴리스/버전 202208)에서 확보하였다. 단일 세포 데이터 세트 GSE161529는 Gene Expression Omnibus(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161529)에서 확보하였다. 본 연구에서 새롭게 생성된 시퀀싱 데이터는 없다. 분석 스크립트는 https://github.com/tengfeitcm/MPO에서 공개적으로 이용 가능하다.

멀티오믹스 분석, 세포 간 통신, MPO 발현, 임상 데이터 통합의 순서도.
그림 1: 데이터 수집 및 분석 과정의 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유방암 연구; MPO 발현 막대 그래프, 생존 곡선, ROC, 조직학 이미지 분석.
그림 2: 유방암에서의 MPO 발현 패턴 및 탐색적 생존 연관성. (A) TCGA 데이터베이스를 사용하여 33가지의 서로 다른 암 유형과 그 인접 정상 조직에서 MPO 발현 수준을 분석하였다. (B) 유방암 및 정상 조직의 MPO mRNA 발현을 분석하기 위해 TCGA-BRCA 데이터셋에서 비쌍체 샘플을 선택하였다. (C) 유방암 및 정상 조직의 MPO mRNA 발현을 분석하기 위해 TCGA-BRCA 데이터셋에서 쌍체 샘플을 선택하였다. (D) TCGA-BRCA 코호트에서 종양 MPO 발현 중앙값 컷오프로 층화한 환자들의 PFI에 대한 Kaplan-Meier 분석. (E) 분석된 공공 전사체 데이터셋에서 MPO 발현에 기반한 종양-정상 판별 능력을 평가하는 탐색적 ROC 곡선. (F) 서로 다른 병리적 T 단계에 따른 MPO 발현. (G) PAM50 분자 아형에 따른 MPO 발현 및 아형 라벨 표시. (H) 인접 정상 유방 조직과 유방암 조직의 대표적인 MPO 면역조직화학(IHC) 이미지. 상자 표시된 영역은 고배율로 보여주는 영역을 나타낸다. 20× 전체 이미지에는 100 µm 스케일 바가 포함되어 있으며, 40× 고배율 이미지에는 50 µm 스케일 바가 포함되어 있다. 이 이미지들은 정성적인 단백질 수준의 참고 자료로 제시되었으며, 정량적 형태 측정 또는 통계 분석에는 사용되지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유전자 발현 분석 차트 및 네트워크 다이어그램, 히트맵, 산점도 및 볼케이노 플롯.
그림 3: 유방암에서 MPO 관련 상관관계 및 차등 발현 분석. (A) TCGA 데이터베이스의 Pearson 상관계수를 기반으로 mRNA 수준에서 MPO 발현과 양의 상관관계를 보이는 상위 30개 코딩 유전자. (B) Pearson 상관계수를 기반으로 mRNA 수준에서 MPO 발현과 음의 상관관계를 보이는 상위 30개 코딩 유전자. (C) MPO와 염증 반응에 의해 상향 조절된 유전자들 사이의 Spearman 상관관계를 보여주는 산점도. (D) MPO와 EMT 마커에 의해 상향 조절된 유전자들 사이의 Spearman 상관관계를 보여주는 산점도. (E) MPO와 ROS에 의해 상향 조절된 유전자들 사이의 Spearman 상관관계를 보여주는 산점도. (F) 임상적 유의성(T stage 및 PAM50)에 기반한 MPO 관련 유전자 클러스터의 히트맵. (G) STRING 데이터베이스를 사용하여 예측한 MPO 관련 단백질의 PPI 네트워크. (H) TCGA-BRCA 코호트에서 중앙값으로 정의된 MPO-high 및 MPO-low 종양 그룹 간의 차등 발현 유전자 볼케이노 플롯. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

경로 및 온톨로지 범주가 포함된 유전자 농축 분석 도표; 막대 그래프 및 선 그래프.
그림 4: 유방암에서 MPO의 농축 분석. (A) MPO 고발현 그룹과 MPO 저발현 그룹 간의 2,013개 차등 발현 유전자에 대한 Gene Ontology 농축 분석. (B) 2,013개 차등 발현 유전자에 대한 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 경로 농축 분석. (C) 농축된 용어와 차등 발현 방향 및 |log2FC| 값을 통합한 Gene Ontology 농축 시각화 결과. (D) MPO 관련 면역 관련 유전자 세트에 대한 대표적인 GSEA 농축 플롯; 패널에 유전자 세트 이름, 정규화된 농축 점수 및 FDR q-값이 표시됨. (E) 추가적인 MPO 관련 면역 관련 유전자 세트에 대한 대표적인 GSEA 농축 플롯; 패널에 유전자 세트 이름, 정규화된 농축 점수 및 FDR q-값이 표시됨. (F) 추가적인 MPO 관련 면역 관련 유전자 세트에 대한 대표적인 GSEA 농축 플롯; 패널에 유전자 세트 이름, 정규화된 농축 점수 및 FDR q-값이 표시됨. (G) 추가적인 MPO 관련 면역 관련 유전자 세트에 대한 대표적인 GSEA 농축 플롯; 패널에 유전자 세트 이름, 정규화된 농축 점수 및 FDR q-값이 표시됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유전자 발현 분석 차트, 면역 세포 침윤에서 MPO의 역할, 상관관계 및 데이터 시각화.
그림 5: 유방암에서 면역 세포 농축도와 MPO 발현 사이의 상관관계. (A) MPO 발현과 ESTIMATE 점수, 면역 점수 및 기질 점수 사이의 상관관계를 나타내는 산점도. (B) 중앙값으로 정의된 MPO-고발현 및 MPO-저발현 종양 그룹 간의 ESTIMATE 점수, 면역 점수 및 기질 점수의 차이를 보여주는 상자 그림. (C) MPO 발현과 주요 면역 세포 집단의 추정 침윤도 사이의 연관성을 보여주는 TIMER/TIMER2.0 기반 분석. (D) MPO 발현과 24가지 면역 세포 유형에 대한 ssGSEA 추정 농축 점수 사이의 Spearman 상관관계를 나타내는 롤리팝 플롯. 여러 면역 세포 상관관계에서 얻은 P-값은 Benjamini–Hochberg 허위 발견율 방법으로 보정되었다. (E) TCGA-BRCA 코호트 전반의 샘플 수준 면역 세포 농축 패턴을 보여주는 히트맵. (F) 중앙값으로 정의된 MPO-고발현 및 MPO-저발현 종양 그룹 간의 ssGSEA 추정 면역 세포 농축 점수 차이의 첫 번째 세트를 보여주는 상자 그림; 그룹 비교는 Benjamini–Hochberg 보정을 적용한 Wilcoxon 순위 합 검정으로 수행되었다. (G) 중앙값으로 정의된 MPO-고발현 및 MPO-저발현 종양 그룹 간의 ssGSEA 추정 면역 세포 농축 점수 차이의 두 번째 세트를 보여주는 상자 그림; 그룹 비교는 Benjamini–Hochberg 보정을 적용한 Wilcoxon 순위 합 검정으로 수행되었다. (H) 중앙값으로 정의된 MPO-저발현 및 MPO-고발현 종양 그룹에서 LM22 시그니처 매트릭스를 기반으로 22가지 면역 세포 유형에 대해 CIBERSORT로 추정한 면역 세포 분율을 나타내는 누적 막대 그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유전자 발현 연구를 위한 DNA 메틸화 패턴의 히트맵 및 생존 분석 그래프.
그림 6: 유방암에서 MPO 유전자의 DNA 메틸화 분석. (A) 중앙값으로 정의된 MPO 고발현 및 저발현 그룹의 MPO 메틸화 패턴을 보여주는 히트맵. (B) cg27456487 부위 메틸화의 예후적 유의성을 보여주는 Kaplan-Meier 생존 곡선. (C) cg02668773 부위 메틸화의 예후적 유의성을 보여주는 Kaplan-Meier 생존 곡선. (D) cg07110356 부위 메틸화의 예후적 유의성을 보여주는 Kaplan-Meier 생존 곡선. (E) cg11151395 부위 메틸화의 예후적 유의성을 보여주는 Kaplan-Meier 생존 곡선. (F) cg14619064 부위 메틸화의 예후적 유의성을 보여주는 Kaplan-Meier 생존 곡선. (G) cg22331200 부위 메틸화의 예후적 유의성을 보여주는 Kaplan-Meier 생존 곡선. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

유전자 발현 네트워크 분석; 다이어그램, 차트, 상관관계 결과; 단백질 상호작용 데이터.
그림 7: TCGA 데이터베이스를 이용한 mRNA 수준에서의 MPO 및 호중구 관련 유전자 상관관계 분석. (A) 핵심 단백질과 다른 단백질 간의 상호작용을 묘사한 단백질 상호작용 네트워크 시각화. (B) MPO와 상위 20개 호중구 관련 유전자의 상관관계 분석으로, 다양한 유전자에 대한 상관계수와 P-value 분포를 나타냄. (C) 상위 20개 호중구 관련 유전자 간 상관관계를 나타낸 코드 다이어그램으로, 유전자 연관성의 강도와 방향을 시각적으로 표현함. (D) 상위 20개 호중구 관련 유전자의 상관관계 히트맵으로, 색상 그라데이션과 통계적 표식으로 상관계수와 유의 수준을 표시함. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

세포 클러스터 및 발현 분석; 그래프, 히트맵 및 네트워크 다이어그램; RNA 시퀀싱 데이터.
그림 8: 유방암 단일 세포 데이터셋에서의 단일 세포 클러스터링 및 MPO 관련 세포-세포 통신 분석. (A) 세포 유형 주석을 위한 클러스터별 표준 마커 유전자의 DotPlot. (B) 주석이 지정된 세포 집단의 UMAP 시각화. (C) 세포 클러스터별 선택된 마커 유전자의 히트맵. (D) Supplementary File 1에 제공된 유전자 세트를 기반으로 AUCell, ssGSEA 및 Seurat AddModuleScore를 사용하여 계산한 주석 지정 세포 유형별 MPO 관련 점수를 요약한 DotPlot. (E) MPO 관련 신호에 따라 층화된 상피 종양 세포와 다른 세포 유형 간의 통신을 나타내는 세포-세포 상호작용 네트워크; 선의 너비는 상호작용 강도를 나타내며 노드의 크기는 전반적인 상호작용 활성을 반영함. (F) 세포 유형별 송신 및 수신 신호 패턴을 보여주는 히트맵. (G) MPO 관련 신호에 따라 층화된 상피 종양 세포에서 다른 세포 유형으로 향하는 송신 신호 경로의 버블 플롯. (H) 다른 세포 유형에서 MPO 관련 신호에 따라 층화된 상피 종양 세포로 향하는 수신 신호 경로의 버블 플롯. (I) 주석 지정 세포 유형별 MPO 발현 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

데이터 분석을 위한 UMAP 클러스터링 다이어그램, 유전자 발현 히트맵, 막대 그래프 및 볼케이노 플롯.
그림 9: 단일 세포 아틀라스 분석 및 MPO 민감도 결과의 탐색적 가상 넉다운. (A) 단일 세포 클러스터 전반의 표준 마커 유전자 발현을 보여주는 DotPlot; 점의 크기는 각 마커를 발현하는 세포의 비율을 나타내며, 색상의 강도는 평균 발현 수준을 나타냄. (B) 주석이 달린 단일 세포 집단의 UMAP 시각화로, 각 색상은 서로 다른 세포 유형 또는 클러스터를 나타냄. (C) 주요 마커 유전자 발현의 UMAP 시각화로, 골수성 세포를 포함한 세포 유형별 마커 유전자의 발현 분포를 보여줌. (D) 샘플별 세포 클러스터 비율의 누적 막대 그래프. (E) MPO 유전자 발현의 UMAP 시각화. (F) 단일 세포 시퀀싱 QC 지표를 보여주는 바이올린 플롯. (G) 주요 마커 유전자의 클러스터링 플롯. (H) 클러스터 수준에서의 표준 마커 유전자에 대한 DotPlot. (I) 가상 넉다운 민감도 분석에서 변화된 유전자의 볼케이노 플롯. (J) 변위 대 유의성의 산점도. (K) 매니폴드 정렬 화살표 플롯. (L) 가상 넉다운 결과 유전자의 GO BP 농축 분석. (M) 가상 넉다운 결과 유전자의 KEGG 경로 농축 분석. (N) MPO 제외 후 가장 높은 매니폴드 변위를 보이는 상위 20개 유전자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

부록 그림 1: TCGA-BRCA 코호트에서 MPO에 대한 추가 생존 분석. (A,B) 이 파일은 종양 MPO 발현의 중앙값 컷오프를 기준으로 층화한 (A) 전체 생존율 및 (B) 질환 특이적 생존율에 대한 부록 Kaplan-Meier 생존 분석 결과를 포함하고 있습니다. 이 분석들은 그림 2D에 대한 부록 결과 분석으로 제공되었으며, 본 코호트에서는 통계적으로 유의하지 않았습니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: MPO에 대한 탐색적 후보 전사 인자 주석. (A) 세 가지 공공 전사 인자 리소스에서 도출된 후보 전사 인자의 교집합을 보여주는 벤 다이어그램. (B) MYC 발현 비교 결과. (C) 행 및 열 레이블이 포함된 전사 인자 상관관계 히트맵. (D) MPO–MYC 상관관계 결과. (E) MYC 생존 분석 결과. (F) MYC ROC 결과. MYC 관련 결과는 보충 후보 전사 인자 주석으로만 제시되었으며, 기전적 상위 조절 인자 결론을 뒷받침하는 데 사용되지 않았습니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

부록 그림 3: MPO에 대한 탐색적 DGIdb 약물-유전자 검색 결과. 회색 노드는 MPO 유전자를 나타내고, 주황색 노드는 검색된 저분자 화합물 항목을 나타내며, 연결선은 데이터베이스에서 예측된 약물-유전자 관계를 나타냅니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 22종의 면역 세포 디컨볼루션 분석을 위한 CIBERSORT 기반 LM22 면역 세포 시그니처 매트릭스. 하위 분석 전, 유전자 기호를 통일하고 중복 항목을 제거하였으며, 사용 가능한 유전자를 해당 TCGA-BRCA 또는 GSE161529 발현 매트릭스와 교집합 처리하였다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 2: STRING/PPI 분석, 허브 유전자 우선순위 결정 및 MPO-허브 유전자 상관관계 분석에 사용된 호중구 관련 유전자 목록. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 3: MPO에 대한 탐색적 DGIdb 약물-유전자 검색 및 ADMET 주석 결과. 이 파일에는 DGIdb에서 검색된 MPO 관련 화학 물질-유전자 상호작용 기록과 화합물 수준의 예측된 물리화학적, 약동학적 및 독성 관련 주석이 포함되어 있습니다. 이러한 결과는 예비 화학 주석으로만 제공되며 치료 후보 목록으로 해석되어서는 안 됩니다. 이는 MPO 억제, 표적 결합, 리간드 특이성, 선택성, 안전성, 치료 효능 또는 임상 적합성을 입증하지 않습니다. 이 표의 값은 나열된 화합물에 대해 예측된 물리화학적 및 약물 유사성 파라미터를 나타냅니다. 분자량은 g/mol로 표시됩니다. 수소 결합 수용체 및 수소 결합 공여체 값은 각각 예측된 수소 결합 수용체와 공여체의 수를 나타냅니다. Moriguchi 옥탄올-물 분배 계수는 예측된 지질친화도를 나타냅니다. Lipinski 위반은 각 화합물이 충족하지 못한 Lipinski 5법칙 기준의 수를 나타냅니다. 생체이용률 점수는 예측된 경구 생체이용률 관련 점수를 나타내며, 위상 표면적은 예측된 위상 극성 표면적을 의미합니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: AUCell, Seurat AddModuleScore 및 ssGSEA를 이용한 단일 세포 시그니처 스코어링에 사용된 MPO 관련 유전자 목록. 여기를 클릭하여 파일을 다운로드하십시오.

보충 파일 2: MPO에 대한 탐색적 후보 전사 인자 및 miRNA 어노테이션 결과. 이 파일에는 KnockTF, ChIP-Atlas, GTRD 및 TargetScan을 포함한 공공 리소스를 기반으로 데이터베이스에서 도출된 후보 전사 인자 및 miRNA 어노테이션 결과가 포함되어 있습니다. 이러한 어노테이션은 탐색적 후보 우선순위 결정을 위해서만 제공되며, 유방암에서 MPO의 상위 조절에 대한 기능적 증거로 해석되지 않습니다.여기를 클릭하여 이 파일을 다운로드하십시오.

토론

본 연구는 유방암에서 MPO 발현과 면역/골수성 특성 간의 연관성을 조사하기 위한 탐색적 공개 데이터셋 및 in silico 워크플로우를 제시합니다. TCGA-BRCA 분석 결과, MPO 발현은 인접한 비종양 조직보다 종양 조직에서 더 낮았으며, MPO 발현이 높을수록 무진행 생존 기간이 더 긴 것과 연관이 있었습니다. 그러나 전체 생존율과 질환 특이적 생존율은 통계적으로 유의하지 않았습니다. 따라서 현재의 근거만으로는 MPO를 강력하거나 확립된 예후 바이오마커로 해석해서는 안 됩니다. 향후 연구에서는 확립된 임상 병리학적 변수를 조정한 다변량 Cox 회귀 모델, 독립적인 검증 코호트 및 서브타입별 층화 분석을 통해 MPO를 평가해야 합니다.

전통적인 단일 코호트 차등 발현 분석이나 단일 플랫폼 면역 침윤 추정과 비교하여, 이 MPO 중심 워크플로우는 벌크 전사체학, 면역 농축, 메틸화 주석, 단일 세포 매핑 및 가상 섭동을 통합하여 MPO 관련 면역/골수성 특징에 대한 더 넓은 탐색적 관점을 제공합니다. 그러나 이 워크플로우는 외부 코호트 검증, 공간 또는 단백질 수준의 검증, 실험적 섭동 분석을 대체하는 것이 아니라 이를 보완하는 역할을 합니다.

면역 침윤 및 농축 결과는 MPO에 의한 면역 리모델링이라기보다 MPO와 연관된 면역 컨텍스트로 해석되어야 합니다. MPO는 주로 호중구 및 기타 골수계 세포에서 발현됩니다37. 따라서 MPO 발현과 ESTIMATE 점수, 면역 점수, 면역 세포 농축 점수, 호중구 관련 유전자, 사이토카인 경로, 항원 제시 시그니처 또는 호중구 탈과립 경로 사이의 양의 상관관계는 생물학적으로 타당하며, 이는 주로 벌크 종양 샘플 내의 면역/골수계 세포 풍부도의 차이를 반영하는 것일 수 있습니다. 이러한 해석은 MPO 양성 호중구 침윤이 유방암에서 양호한 예후와 관련이 있으며, MPO가 수지상 세포 기능 및 T 세포 주도 조직 염증에 관여한다는 이전 연구 결과들과 일치합니다38,39. 벌크 RNA-seq 데이터로는 MPO가 종양 세포 고유의 활성을 갖는지, 아니면 관찰된 신호가 주로 침윤된 면역 세포를 반영하는지 판단할 수 없습니다. 세포 기원과 기능을 명확히 하기 위해서는 독립적인 단일 세포 데이터셋, 공간 프로파일링, 면역조직화학, 유세포 분석 또는 섭동 기반 실험 모델이 필요할 것입니다.

단일 세포 분석은 추가적인 기술적 정보를 제공하지만, MPO 검출 빈도가 낮아 한계가 있습니다. KNN 기반의 주변부 확장을 수행하기 전에는 단 85개의 MPO 양성 세포만이 처음에 검출되었습니다. KNN 확장을 통해 MPO 양성 세포의 국소 전사 주변부에 있는 세포들에 대한 민감도 분석이 가능해졌으나, 이 과정에서 MPO를 직접 발현하지 않는 세포들이 포함될 수 있습니다. 따라서 scTenifoldKnk 가상 넉다운 결과는 MPO 매개 경로 조절의 증거라기보다 탐색적인 계산 민감도 분석으로 해석해야 합니다40. 기전적 결론을 도출하기 위해서는 독립적인 유방암 단일 세포 데이터 세트 및 직교 실험 분석을 통한 검증이 필요할 것입니다.

전사 인자 분석 또한 신중하게 해석해야 합니다. KnockTF, GTRD 및 ChIP-Atlas 예측의 중첩 결과에 차수 기반 우선순위 지정을 적용하여 후보 전사 인자를 지목할 수는 있으나, 이것이 유방암에서 MPO의 기능적 전사 조절을 입증하는 것은 아닙니다. 따라서 MYC 및 기타 후보 인자들은 탐색적 주석으로만 유지되었습니다. 전사 인자의 활성은 맥락 의존성이 매우 높으며 종양의 하위 유형, 세포 구성, 분석 플랫폼 및 전처리 전략에 따라 달라질 수 있으므로, 특정 후보 인자에 상위 조절 역할을 부여하기 전에는 맥락 특이적 검증이 필요합니다. 이러한 검증에는 ChIP-qPCR 또는 ChIP-seq, 프로모터 리포터 분석, 그리고 전사 인자 섭동 후 MPO 발현량 측정이 포함되어야 합니다.

약물-유전자 검색 및 ADMET 주석 또한 주의 깊게 해석해야 합니다. DGIdb는 선택적 MPO 리간드가 아니거나 임상적 타당성이 제한적이며 독성 특성이 불리할 수 있는 화합물을 포함하여, 이질적인 화학물질-유전자 연관성을 반환할 수 있습니다36. ADMET 예측은 예비적인 화학적 주석을 제공하지만, 표적 결합, 효능, 선택성, 안전성 또는 치료 효능을 확립하지는 않습니다41. 따라서 현재의 화합물 수준 결과는 치료 가능성을 추론하는 데 사용해서는 안 됩니다. 의미 있는 중개 평가를 위해서는 약리학적으로 관련 있는 MPO 억제제 또는 프로브로 구성된 큐레이션 세트, 기성 MPO 표적 화합물과의 비교, 그리고 생화학적, 세포적, 약리학적 분석을 이용한 검증이 필요합니다. 약물 관련 결과를 해석할 때 암에서 MPO가 갖는 맥락 의존적이며 잠재적인 이중 역할 또한 고려해야 합니다. MPO는 산화 스트레스, 반응성 산화제 생성, DNA 손상, 만성 염증 및 종양 미세환경의 리모델링을 통해 종양 촉진 과정에 기여할 수 있습니다. 동시에, 대량 종양 데이터셋에서의 MPO 발현은 호중구나 다른 골수성 면역 세포의 침윤을 반영할 수 있으며, 이는 일부 맥락에서 면역 활성 미세환경 및 더 유리한 임상 결과와 연관될 수 있습니다39,42. 따라서 MPO의 생물학적 해석은 종양 유형, 세포 기원, 질병 단계 및 면역 세포 구성에 따라 달라집니다.

MPO 유전자좌 내의 DNA 메틸화 결과 또한 탐색적인 것으로 간주되었습니다. 선택된 CpG 사이트는 MethSurv 분석에서 생존 연관성을 보였으나, 예후 또는 기전적 결론을 도출하기 전에는 이러한 결과에 대한 독립적인 검증이 필요합니다. MPO의 후성유전학적 조절은 전사 인자 결합 및 염색질 수준의 조절과 상호작용할 수 있으나, 기능적 염색질 또는 섭동 데이터가 없는 상태에서 이러한 상호작용은 추측에 불과합니다43.

MPO 발현의 임상적 시사점은 신중하게 해석되어야 합니다. 본 결과는 MPO를 임상적으로 활용 가능한 바이오마커나 현재 유방암의 면역요법 결정을 안내할 수 있는 마커로 확립하는 것은 아닙니다. 그보다는 MPO가 종양 미세환경 내의 골수성/중성구 관련 면역 상황을 반영하는 것일 수 있습니다. 향후 연구에서는 종양 침윤 림프구, PD-L1 발현, 면역 관문 유전자 발현, 분자적 하위 유형 및 검증된 면역 시그니처를 포함하여 기존의 면역요법 관련 마커와 MPO 발현을 함께 평가할 수 있을 것입니다. MPO를 환자 층화나 면역요법 결정에 고려하기 위해서는 독립적인 코호트, 다변량 모델 및 치료 반응 데이터 세트를 포함한 분석이 선행되어야 합니다.

일관된 TCGA-BRCA 데이터 전처리, 종양 전용 중앙값 기반의 MPO-high/MPO-low 그룹화, 사전 정의된 통계적 임계값 및 다중 검정 보정, 면역 세포 농축 알고리즘 및 시그니처 세트, 단일 세포 품질 관리 및 주석 달기, KNN 기반의 MPO-이웃 확장, 그리고 가상 녹다운 및 DGIdb/ADMET 출력값의 탐색적 처리를 포함한 여러 워크플로우 단계가 재현성에 있어 매우 중요합니다. 이러한 파라미터의 변경은 하위 결과와 해석에 영향을 줄 수 있으므로, 신중하게 보고하고 재현해야 합니다. 문제 해결을 위해, 일관성 없는 출력값이 나타날 경우 샘플 출처, 발현 정규화, 그룹화 컷오프, 다중 검정 보정, 면역 세포 시그니처 세트, 단일 세포 QC 및 주석 달기, KNN-이웃 정의, 가상 녹다운 임계값, 농축 컷오프, 그리고 불균일한 DGIdb/ADMET 화합물 기록을 확인하여 해결해야 합니다.

본 연구의 몇 가지 제한 점을 인정해야 합니다. 첫째, 본 연구는 TCGA-BRCA 및 공개된 단일 세포 데이터를 사용한 공공 데이터베이스의 회고적 분석을 기반으로 했으므로, 코호트의 이질성, 샘플 소스의 차이, 배치 효과, 불완전한 임상 주석 및 종양 구성의 차이에 영향을 받았을 수 있습니다. 둘째, 본 결과는 주로 전사체 연관성과 in silico 분석에서 도출되었으며 직접적인 실험적 검증이 부족합니다. 따라서 MPO 발현, 면역/골수성 특성, 메틸화 주석, 전사 인자 후보 및 가상 넉다운 결과 사이에서 관찰된 연관성을 인과적 메커니즘으로 해석해서는 안 됩니다. 셋째, 단일 세포 데이터셋에서 MPO 검출 빈도가 낮았으며, KNN 기반 이웃 확장 전에는 단 85개의 MPO 양성 세포만이 검출되었습니다. 확장된 MPO 이웃 서브셋에는 MPO 발현이 낮거나 검출되지 않는 세포가 포함되었을 수 있으므로, 이를 순수한 MPO 양성 집단으로 간주해서는 안 됩니다. 넷째, MPO는 주로 호중구 및 기타 골수성 계열 세포와 관련이 있기 때문에, 벌크 RNA-seq 데이터의 MPO 관련 신호는 종양 세포 고유의 활성을 반영하기보다 면역 세포 풍부도, 종양 순도 및 세포 구성에 의해 혼동되었을 수 있습니다. 마지막으로, DGIdb 기반의 약물-유전자 검색 및 ADMET 주석은 탐색적인 화학적 주석일 뿐입니다. 이러한 결과가 MPO 억제, 표적 결합, 선택성, 안전성, 치료 효능 또는 임상적 적합성을 입증하는 것은 아닙니다. 이러한 발견의 생물학적 및 임상적 관련성을 확인하기 위해서는 독립적인 코호트, 공간적 또는 단백질 수준의 검증 및 기능적 실험을 이용한 향후 연구가 필요합니다.

요약하자면, 현재의 공공 데이터셋 분석 결과는 유방암에서 MPO 발현과 면역/골수성 전사 특징 사이의 연관성을 뒷받침하며, 분석된 코호트에서 MPO 발현이 높을수록 무진행 기간이 더 긴 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 탐색적 단계이며 가설을 생성하는 수준입니다. 본 연구는 MPO가 종양 면역 미세환경을 인과적으로 조절한다거나, MYC가 MPO를 기능적으로 조절한다거나, 또는 검색된 화합물들이 치료적 관련성이 있다는 점을 입증한 것은 아닙니다. 본 연구의 주요 기여는 재현 가능한 계산 워크플로우와 외부 코호트 검증 및 실험적 확인이 필요한 일련의 테스트 가능한 가설들을 제시한 것입니다.

공개 사항

저자들은 본 연구와 관련하여 이해관계의 충돌이 없음을 보고합니다. AI 기반 언어 편집 도구는 원고 수정 과정에서 영어 언어 다듬기 및 가독성 향상을 돕기 위해서만 사용되었습니다. 해당 도구는 연구 설계, 데이터 분석, 그림 생성, 결과 해석, 참고문헌 선택 또는 과학적 결론 도출에는 사용되지 않았습니다. 모든 분석, 결과, 해석, 참고문헌 및 최종 텍스트는 저자들에 의해 세밀하게 확인, 검토 및 승인되었으며, 저자들은 원고의 내용에 대해 모든 책임을 집니다.

감사의 글

저자들은 항공우주센터 병원 과학연구기금(YN202530)의 재정적 지원에 깊은 감사를 표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CellChatR 패키지/오픈 소스https://github.com/sqjin/CellChat세포 간 통신 분석
ChIP-Atlas공공 데이터베이스https://chip-atlas.org/TF 표적 스크리닝; 2021 업데이트 
clusterProfilerBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/GO/KEGG 풍부도 분석; v4.4.4
CytoscapeCytoscape 컨소시엄https://cytoscape.org/네트워크 시각화 및 토폴로지 분석
DGIdb워싱턴 대학교/공공 데이터베이스https://www.dgidb.org/약물-유전자 상호작용 검색
GDC/TCGA-BRCA국립암연구소https://portal.gdc.cancer.gov/벌크 전사체 및 임상 데이터 소스
Gene Expression Omnibus: GSE161529NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/단일 세포 데이터셋 소스
GSEA/MSigDBBroad 연구소https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb유전자 세트 풍부도 분석 및 유전자 세트 참조; 버전 3.0 
GSVABioconductorhttps://bioconductor.org/packages/GSVA/유전자 세트 변이/ssGSEA 관련 스코어링; 버전 1.46.0
GTRD공공 데이터베이스http://gtrd.biouml.org/TF 표적 스크리닝; 2021 
KnockTF공공 데이터베이스http://www.licpathway.net/KnockTF/index.htmlTF 섭동 리소스; 버전 2.0 
RR 통계 계산 재단https://www.r-project.org/통계 컴퓨팅 환경
scTenifoldKnkR 패키지/오픈 소스https://github.com/cailab-tamu/scTenifoldKnk가상 넉다운 분석
SeuratR 패키지/오픈 소스https://satijalab.org/seurat/단일 세포 전처리 및 클러스터링
STRINGELIXIR/공공 데이터베이스https://string-db.org/단백질-단백질 상호작용 분석; v11 
SwissADMESIB 스위스 생물정보학 연구소http://www.swissadme.ch/약물 유사성 평가; 2017 출시/웹 도구 
TIMER공공 웹 리소스https://timer.cistrome.org/면역 침윤 분석; TIMER2.0 
UCSC Xena 또는 연결된 TCGA 포털UCSChttps://xenabrowser.net/탐색적 데이터 액세스/검증 

참고문헌

  1. Onkar SS, et al. The great immune escape: Understanding the divergent immune response in breast cancer subtypes. Cancer Discov. 2023;13(1):23-40.
  2. Quail DF, Park M, Welm AL, Ekiz HA. Breast cancer immunity: It is time for the next chapter. Cold Spring Harb Perspect Med. 2024;14(2):a041324.
  3. Valadez-Cosmes P, Raftopoulou S, Mihalic ZN, Marsche G, Kargl J. Myeloperoxidase: Growing importance in cancer pathogenesis and potential drug target. Pharmacol Ther. 2022;236:108052.
  4. Ohshima H, Tatemichi M, Sawa T. Chemical basis of inflammation-induced carcinogenesis. Arch Biochem Biophys. 2003;417(1):3-11.
  5. Davies MJ, Hawkins CL. The role of myeloperoxidase in biomolecule modification, chronic inflammation, and disease. Antioxid Redox Signal. 2020;32(13):957-981.
  6. Gomez-Mejiba SE, et al. Myeloperoxidase-induced genomic DNA-centered radicals. J Biol Chem. 2010;285(26):20062-20071.
  7. Eruslanov EB, et al. Tumor-associated neutrophils stimulate T cell responses in early-stage human lung cancer. J Clin Invest. 2014;124(12):5466-5480.
  8. Däster S, et al. Absence of myeloperoxidase and CD8 positive cells in colorectal cancer infiltrates identifies patients with severe prognosis. Oncoimmunology. 2015;4(12):e1050574.
  9. Droeser RA, et al. High myeloperoxidase positive cell infiltration in colorectal cancer is an independent favorable prognostic factor. PLoS One. 2013;8(5):e64814.
  10. Gerber-Ferder Y, et al. Breast cancer remotely imposes a myeloid bias on haematopoietic stem cells by reprogramming the bone marrow niche. Nat Cell Biol. 2023;25(12):1736-1745.
  11. Xu H, et al. Single-cell transcriptomics reveals CCL3+ classical monocyte subset linked to autoimmune pathogenesis. J Inflamm Res. 2025;18:16273-16291.
  12. Jiahao S, Cong W, Xin L, Xu C, Wenpeng X, et al. BCAT1 mediates the carcinogenic effects of environmental bisphenol exposure: mechanistic discoveries in osteosarcoma and pan-cancer analysis. Mol Divers. 2026. doi:10.1007/s11030-026-11566-7.
  13. Huo Z, Sun W, Lou C, Yang T. Integrated single-cell and spatial mapping coupled with machine learning unveils core stemness landscapes and regulatory drivers in triple-negative breast cancer. Discov Oncol. 2026;17(1):602.
  14. Das SC, et al. Comprehensive bioinformatics and machine learning analyses for breast cancer staging using TCGA dataset. Brief Bioinform. 2024;26(1):bbae628.
  15. Szklarczyk D, et al. STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D607-D613.
  16. Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284-287.
  17. Ashburner M, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 2000;25(1):25-29.
  18. Kanehisa M, Goto S. KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 2000;28(1):27-30.
  19. Chen GY, et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022;2022:7858925.
  20. Chen GY, et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:5233462.
  21. Liberzon A, et al. Molecular signatures database MSigDB 3.0. Bioinformatics. 2011;27(12):1739-1740.
  22. Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545-15550.
  23. Li B, et al. Comprehensive analyses of tumor immunity: implications for cancer immunotherapy. Genome Biol. 2016;17(1):174.
  24. Li T, et al. TIMER: A web server for comprehensive analysis of tumor-infiltrating immune cells. Cancer Res. 2017;77(21):e108-e110.
  25. Li T, et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 2020;48(W1):W509-W514.
  26. Hänzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 2013;14:7.
  27. Modhukur V, et al. MethSurv: a web tool to perform multivariable survival analysis using DNA methylation data. Epigenomics. 2018;10(3):277-288.
  28. Feng C, et al. KnockTF: a comprehensive human gene expression profile database with knockdown/knockout of transcription factors. Nucleic Acids Res. 2020;48(D1):D93-D100.
  29. Feng C, et al. KnockTF 2.0: a comprehensive gene expression profile database with knockdown/knockout of transcription co-factors in multiple species. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D183-D193.
  30. Oki S, et al. ChIP-Atlas: a data-mining suite powered by full integration of public ChIP-seq data. EMBO Rep. 2018;19(12):e46255.
  31. Zou Z, Ohta T, Miura F, Oki S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Res. 2022;50(W1):W175-W182.
  32. Kolmykov S, et al. GTRD: an integrated view of transcription regulation. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D104-D111.
  33. Yevshin I, Sharipov R, Kolmykov S, Kondrakhin Y, Kolpakov F. GTRD: a database on gene transcription regulation—2019 update. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D100-D105.
  34. Tang D, et al. SRplot: A free online platform for data visualization and graphing. PLoS One. 2023;18(11):e0294236.
  35. Wang Y, et al. Immunological profiling of rheumatoid factor-positive primary Sjögren's syndrome by single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 2026;17:1822615.
  36. Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 2017;7:42717.
  37. Lin W, Chen H, Chen X, Guo C. The roles of neutrophil-derived myeloperoxidase MPO in diseases: The new progress. Antioxidants. 2024;13(1):132.
  38. Odobasic D, et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 2013;121(20):4195-4204.
  39. Zeindler J, et al. Infiltration by myeloperoxidase-positive neutrophils is an independent prognostic factor in breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2019;177(3):581-589.
  40. Osorio D, et al. scTenifoldKnk: An efficient virtual knockout tool for gene function predictions via single-cell gene regulatory network perturbation. Patterns. 2022;3(3):100434.
  41. Li X, Tang L, Li Z, Qiu D, Yang Z, et al. Prediction of ADMET properties of anti-breast cancer compounds using three machine learning algorithms. Molecules. 2023;28(5):2326.
  42. Scandolara TB, et al. Anti-neutrophil antibodies anti-MPO-ANCAs are associated with poor prognosis in breast cancer patients. Immunobiology. 2020;225(6):152011.
  43. Gilbert J, Gore SD, Herman JG, Carducci MA. The clinical application of targeting cancer through histone acetylation and hypomethylation. Clin Cancer Res. 2004;10(14):4589-4596.

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