방법 논문

환자 유래 대장암 종양 오가노이드-면역 세포 공배양 평가를 위한 다중 모드 프레임워크

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DOI:

10.3791/71204

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2026년 9월 3일

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1Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Oncology and Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 자가 림프구와 함께 공동 배양하는 환자 유래 결장 종양 오가노이드를 구축하고, 이후 치료용 저분자 화합물 및 면역 관문 억제제를 처리하여 T 세포 반응성과 치료 효능을 평가하는 방법을 설명합니다.

초록

T 세포는 암 면역요법에서 핵심적인 역할을 하며, 종양과의 상호작용을 이해하는 것은 새로운 면역요법을 개발하는 데 필수적입니다. 본 프로토콜에서는 바이오뱅크로부터 대장암 환자 유래 오가노이드(PDO)를 확립하고 자가 PDO-T 세포 공배양 시스템을 구축하기 위한 단계별 워크플로우를 설명합니다. Annexin V NIR 및 cleaved caspase-3 염색을 이용하여, T 세포의 반응성과 세포독성 및 종양 오가노이드의 사멸을 평가하기 위한 표면 및 세포 내 염색 유세포 분석 프로토콜을 표준화하였습니다. 유세포 분석 기반의 분석 외에도, granzyme B와 perforin 분비를 정량화하기 위한 ELISpot 분석 및 Annexin V 기반의 세포사멸 검출을 통해 시간에 따른 T 세포 매개 종양 사멸을 모니터링하는 라이브 셀 이미징과 같은 기능적 분석을 위한 방법론적 접근 방식이 포함되어 있습니다. 또한, 이 워크플로우에서는 단일 요법 및 병용 치료 설정 모두에서 표적 억제제 및 면역 관문 억제제를 도입하는 것을 포함하여 공배양 조건을 설정하는 상세한 방법을 다룹니다. T 세포 반응성을 위한 CD137, T 세포 탈과립화를 위한 CD107a, 종양 세포사멸을 위한 caspase-3, 그리고 종양 증식을 위한 Ki67을 포함하여 주요 면역학적 및 종양 관련 마커를 선택하고 적용하는 가이드라인이 제공됩니다. 종합적으로, 본 논문은 대장암 오가노이드 확립, 자가 T 세포 배양 및 증식, 공배양 설정, 치료적 섭동, 그리고 유세포 분석, ELISpot, 공초점 현미경 및 라이브 셀 이미징을 이용한 하위 분석을 위한 포괄적이고 재현 가능한 프레임워크를 제공합니다.

서론

조기 진단과 다각적 치료법의 발전에도 불구하고, 대장암(CRC)은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인 중 하나로 남아 있습니다1. 환자의 예후를 개선하는 데 있어 주요 과제는 인간 대장암에서 관찰되는 복잡한 구조, 종양 내 이질성, 종양-면역 상호작용 및 치료 반응을 정확하게 재현하는 전임상 모델이 부족하다는 점입니다2,3,4,5,6. 유전자 변형 마우스 모델(GEMM)과 환자 유래 이식 모델(PDX)을 포함한 기존 모델들은 대장암 연구를 크게 발전시켰으나 뚜렷한 한계를 가지고 있습니다. GEMM은 인간 종양의 다양성을 포착하지 못하는 경우가 많으며, 인간의 생리학적 특성과 상당히 다른 마우스 미세환경에서 개발됩니다. 마찬가지로 PDX 모델은 종양 이질성의 일부 측면을 보존하지만, 비용이 많이 들고 시간이 오래 걸리며, 면역결핍 마우스에 의존해야 하고, 종 간의 차이로 인해 인간 특이적 면역 반응을 연구하는 능력이 제한적입니다7,8. 또한, 소동물 사용에 대한 규제가 강화됨에 따라 인간에게 더 적합하고 윤리적으로 지속 가능한 대안의 필요성이 강조되고 있습니다.

최근 몇 년 동안 환자 유래 오가노이드(patient-derived organoids, PDOs)는 중개 암 연구를 위한 혁신적인 플랫폼으로 부상했습니다. 신선한 수술 또는 생검 표본에서 생성된 CRC 오가노이드는 클론 다양성과 치료 반응성 세포 상태를 포함하여 원발성 종양의 조직학적, 유전적 및 표현형 특성을 유지합니다. 이러한 특성 덕분에 PDO는 질병 모델링, 기능 유전학, 바이오마커 발굴 및 맞춤 의학을 위한 가치 있는 도구가 되었습니다7,8,9,10,11. 중요한 점은, 오가노이드 시스템에 인간 면역 성분을 통합함으로써 그 유용성이 더욱 확대되었다는 것입니다. CRC 오가노이드를 말초혈액 단핵구(PBMCs) 또는 엔지니어링된 면역 서브셋과 공동 배양하면 생리학적으로 관련성 있는 시스템에서 종양-면역 상호작용, 면역 회피 메커니즘, 항원 제시 및 면역 요법 반응을 조사할 수 있습니다12. 이러한 모델은 체크포인트 억제제, CAR-T/TCR 치료제 및 이중 특이성 항체의 평가를 지원하는 동시에 예측 바이오마커와 내성 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다.

면역요법 외에도, CRC 오가노이드는 약물 스크리닝 및 정밀 종양학 응용 분야에서 점점 더 중요해지고 있습니다. 환자 유래 배양물을 통해 화학요법 및 표적 치료제의 반응을 테스트하여 개별 치료 반응을 예측할 수 있으며, 여러 연구에서 오가노이드 반응과 임상 결과 사이의 상관관계가 입증되었습니다. 따라서 이러한 시스템은 기존의 동물 기반 접근 방식에 대한 확장 가능하며 환자 중심적인 대안을 제공합니다10,13,14,15,16,17,18.

본 논문에서는 중개 및 전임상 연구를 위해 환자 유래 CRC 오가노이드를 구축하고 이를 면역 공배양 시스템과 통합하는 다루기 쉽고 확장 가능한 프로토콜을 제시합니다. 종양 조직을 효소적으로 분해하여 종양의 이질성과 계통 분화를 보존하는 최적화된 성장 조건 하에 3차원 세포외 기질 내에 배양합니다. 구축된 오가노이드는 확장, 동결 보존, 유전적 조작이 가능하며 분자적 특성 분석, 약물 섭동 연구, 면역 프로파일링을 포함한 하위 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 또한, PBMC와의 공배양을 통해 면역 매개 세포독성, 체크포인트 차단제 민감도 및 종양 특이적 면역 활성화를 평가할 수 있습니다.

또한 조직 처리, 오가노이드 품질 평가, 유세포 분석, 면역형광 이미징 및 ELISpot 기반 면역 모니터링 프로토콜에 대해 상세히 설명합니다. 종합적으로, 이러한 오가노이드 기반 시스템은 CRC 생물학, 치료 내성, 종양 이질성 및 면역 요법 반응을 연구하기 위한 윤리적으로 지속 가능하고 임상적으로 유의미한 플랫폼을 제공합니다. 오가노이드 공학 및 미세환경 통합의 지속적인 발전은 이러한 모델들을 향후 CRC 연구 및 정밀 종양학의 초석으로 자리 잡게 하고 있습니다.

프로토콜

모든 환자는 IRB 승인을 받은 Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center 바이오뱅크 프로토콜(Einstein IRB# 2021-13730)에 따라 고지된 동의를 제공하였습니다. 임상 조정 및 규제 지원은 암 임상시험 센터(CCTO)에서 제공하였습니다. 종양 조직은 표준 치료 수술 절제 및 병리 검토 후 수집되었으며, 이후 포르말린 고정, 환자 유래 오가노이드 생성 또는 20% FBS와 10% DMSO가 포함된 DMEM 내에서 냉동 보존을 위해 처리되었습니다. 모든 시약 준비물은 표 1.

1. 생검 또는 절제 조직을 이용한 종양 오가노이드 배양 확립 (4 h)

  1. 갓 얻은 종양 조직을 멸균 페트리 접시에 넣고 오가노이드 세척 완충액으로 얼음 위에서 5분씩 5회 세척한다. 멸균 면도날이나 미세 바늘을 사용하여 조직을 약 1–2 mm3의 작은 정육면체 형태로 절단한다.
    참고: 건조를 방지하기 위해 절단 과정 중 조직이 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 촉촉하게 유지되도록 한다.
  2. 절단된 조직 조각을 15 mL Falcon 튜브로 옮기고 Dulbecco's 인산염 완충 식염수(DPBS)로 1회 세척한 후, 상온(RT)에서 200 x g로 5분간 원심 분리한다. 상층액을 조심스럽게 제거한 다음, 조직 조각을 멸균 6-well 플레이트 또는 35-mm 페트리 접시로 옮긴다.
  3. 멸균되고 오토클레이브 처리된 앵글 가위를 사용하여 조직을 더 미세한 조각으로 다진다. 1X Gentle Collagenase/Hyaluronidase 1 mL를 DPBS 9 mL에 희석한다. 여기에 Y-27632(ROCK 억제제) 10 µL와 Primocin 20 µL를 첨가한다.
  4. 조직 조각이 들어 있는 15 mL 튜브에 미리 데워둔 해리 용액을 넣는다. P1000 팁을 다시 코팅한 후, 조직 조각을 흔들어 섞기 위해 피펫팅을 반복한다.
  5. 15 mL 튜브를 37 °C rocking 워터 배스에서 30분 동안 배양하며, 10분마다 뒤집어준다. 조직 조각이 가라앉도록 둔 후, 소화 용액의 대부분을 새 튜브로 옮기고 상온에서 500 x g로 5분간 원심 분리한다.
  6. 원래의 15 mL 튜브에 DMEM 1 mL를 넣고 코팅된 P1000 팁으로 강하게 피펫팅하여 조직 조각을 기계적으로 해리시키고 추가적인 crypt를 방출시킨다.
  7. 현미경으로 관찰하여 조직이 단일 세포나 작은 클러스터로 분해되고 있는지 진행 상황을 확인한다. 조직 조각이 포함된 DMEM 10–20 µL를 페트리 접시에 옮겨 현미경으로 crypt 존재 여부를 검사한다.
    참고: 배양 시간은 샘플 유형에 따라 다르다. 생검(biopsy)의 경우 배양 시간은 15–30분이며, 외과적 절제(surgical resection)의 경우  45–60분이다.
  8. crypt가 검출되면(또는 생검의 경우 30분, 절제의 경우 60분 후), 얼음처럼 차가운 기초 배지를 동일한 부피로 넣어 소화를 중단시키고 상온에서 500 x g로 5분간 원심 분리한다.
  9. 펠렛을 DPBS로 세척하여 재현탁한 후 다시 원심 분리한다. 선택적으로, 현탁액을 원추형 튜브로 옮겨 상온에서 300 x g로 5분간 원심 분리하여 세포를 펠렛화한다.
    참고:  CRC의 경우, 일반적으로 RBC 용해가 필요하지 않다.
  10. 펠렛이 붉게 보이면, 상온에서 5 mL RBC 용해 완충액 으로 15분간 배양하여 적혈구를 용해시킨다. 용해 후 즉시 튜브를 PBS로 채우고 다시 원심 분리한다.
  11. 펠렛을  DPBS로 1회 세척한다. 상온에서 300 x g로 5분간 원심 분리한 후 상층액을 제거한다. 소량의 배지에 펠렛을 재현탁한다. trypan blue 염색법을 이용한  hemocytometer 나  자동 세포 계수기를 사용하여 생존 세포 수를 측정한다.
  12. 세포를  얼음처럼 차가운 Matrigel(기저막 매트릭스) 에 재현탁한다(선택 사항: 배지 10 µL당 약 1.5–3 x 104 세포 농도). 냉각된 wide-bore 팁을 사용하여 세포 현탁액을  기저막 매트릭스와 혼합한다(일부 실험실에서는 기저막 매트릭스와 완전 오가노이드 배지를 1:1 비율로 사용한다).
    참고: 조기 중합을 방지하기 위해 기저막 매트릭스와 모든 혼합물을 얼음처럼 차갑게 유지한다.
  13. 미리 데워둔 멸균  24-well 배양 플레이트의 각 웰에 세포-기저막 매트릭스 혼합물 ~50 µL를 돔 형태로 분주한다. 플레이트를 37 °C에서 10–12분 동안 배양하여 기저막 매트릭스가 돔 모양으로 응고되도록 한다(플레이트를 뒤집어서 배치한다).
  14. 기저막 매트릭스가 응고되면 플레이트를 바로 세운다. Rock 억제제(1:1000)와 Primocin(1:500)이 포함된 PDO 배지 500 µL/well을 조심스럽게 첨가한다.
    참고: 오염을 방지하기 위해 냉동 오가노이드 바이오뱅크가 구축될 때까지 모든 배양 배지에 Primocin을 사용한다.
  15. 오가노이드 배지를  주 2회 신선한 완전 오가노이드 배지로 교체한다. 현미경으로 오가노이드 성장을 정기적으로 관찰한다.

2. 혈액으로부터 인간 PBMC 분리 (2 h)

  1. 멸균된 15 mL Falcon 튜브에 Histopaque 5 mL를 분주하여 실온(RT)에서 평형화한 후, 동일한 부피의 신선한 인혈(최대 5 mL)을 그 위에 조심스럽게 층을 이루어 넣는다. 계면이 흐트러지지 않도록 튜브 벽면을 따라 혈액을 Ficoll 위로 천천히 층을 쌓으며, 튜브당 총 부피를 10 mL 이하로 유지한다.
    참고: 최적의 분리를 위해 원심분리 전 Ficoll 층과 혈액 층이 서로 섞이지 않게 유지하십시오.
  2. 여러 개의 튜브를 사용하는 경우, 원심분리기에서 적절히 균형을 맞추십시오. 혼합하거나 흔들지 마십시오. 혈액-Ficoll 계면이 유지되어야 합니다.
  3. ~에서 원심분리하십시오. 1500배 g 실온에서 15분 동안 유지하십시오. 사용하십시오. 기울기(gradient)가 흐트러지는 것을 방지하기 위해 브레이크 설정을 0으로 맞춥니다. 원심분리 후, a) 하단의 적혈구(RBC) 층, b) 중간의 PBMC 백혈구층(buffy coat), c) 상단의 혈장 층으로 뚜렷하게 구분됩니다. 백혈구층이 보일 때까지 혈장을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.
    참고: PBMC 층이 흐트러지지 않도록 튜브를 조심스럽게 다루십시오.
  4. 새 멸균 피펫을 사용하여 다음을 조심스럽게 흡입하십시오. 버피코트 층 PBMC가 포함되어 있으며, 세포를 새로운 멸균 상태의 15 mL Falcon 튜브. Ficoll과 혈소판을 제거하기 위해, 1000 xg에서 원심분리하여 10 mL PBSA(PBS + 0.1% BSA)로 세포를 2회 세척합니다. g 상온에서 7분 동안 처리하며, 각 세척 단계 후 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
  5. 잔류 혈소판을 제거하기 위해, PBSA로 한 번 세척한 후 다음 조건에서 원심분리합니다. 200배 g 실온에서 7분 동안 유지합니다. 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 펠렛이 붉게 보이면, 5 mL의 RBC 용혈 버퍼(RBC lysis buffer)에서 다음과 같이 배양하여 적혈구 용혈을 수행합니다. 37 °C 5분 동안 반응시킨 후, PBSA로 세척하고 200 x g에서 원심분리합니다. g 실온에서 7분 동안.
  6. PBMC 펠릿을 2 mL의 DPBS 또는 배양액에 재현탁하고, 헤모사이토미터나 자동 세포 계수기를 사용하여 트라이판 블루로 생존 세포 수를 측정합니다. 즉시 사용하지 않을 경우, PBMC를 5–10 x 106 90% FBS 및 10% DMSO 내의 cells/mL. –에서 서서히 동결한다.80 °C 하룻밤 동안 보관한 후, 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮깁니다.
  7. PBMC 확장 (7~12일):
    1. 500 x g에서 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. g 실온(RT)에서 5분 동안 유지한다. 5 x 10 농도로 재현탁한다.5 T 세포 증식 배지가 담긴 웰당 cells/well의 세포를 넣고 CD3/CD28 칵테일로 활성화한다.
    2. 500 IU/mL의 IL-2로 세포를 자극하고 3일 동안 배양합니다. 3일째에 세포를 혼합하여 수를 측정한 후, IL-2가 첨가된 T 세포 확장 배지를 추가하여 배양 규모를 확장합니다.
    3. 완전 T 세포 확장 배지(complete T Cell Expansion Medium)에서 세포 농도를 1~2.5 x 10^5 cells/mL로 조정하여 2일간 배양하고, 확장 과정 동안 2~3일마다 생존율을 모니터링하십시오.
      참고: 2~3일마다 신선하고 따뜻한 완전 배지로 교체하십시오(교체 주기를 넘기지 마십시오). >3일). PBMCs는 향후 사용을 위해 T세포 동결 배지에 동결 보존할 수 있습니다.

3. 오가노이드 공동 배양 (4일):

  1. 준비 및 품질 관리:
    1. 공배양 전 오가노이드가 건강하고 오염이 없으며 표현형 특성이 규명되었는지 확인한다. 동의한 기증자 또는 상업적 공급원으로부터 PBMC를 얻고, 사용 전 생존율과 기본 표현형을 확인한다.
    2. PBMC를 신선한 상태, 휴지 상태 또는 사전 활성화 상태로 사용할지 여부와 자가 또는 동종 여부를 결정한다. 공배양 전 오가노이드의 생존율, 크기의 균일성 및 마커 발현을 평가한다.
    3. PBMC 생존율과 기본 면역 조성(CD3, CD4, CD8, NK 마커, 단핵구)을 검증하고, 기증자 메타데이터를 기록한다.
  2. PBMC 공배양을 위한 오가노이드 분리:
    1. 배양액을 제거하고 각 웰에 미리 데워둔 세포 회복 솔루션을 첨가하여 세포외 기질을 용해하고 오가노이드를 방출시킨다. 넓은 구경의 피펫 팁으로 오가노이드를 부드럽게 재현탁하고, 기질이 용해되어 오가노이드가 방출될 때까지 잠시 인큐베이션한다.
    2. 현탁액을 수집 튜브로 옮기고 필요한 경우 0.5M EDTA를 첨가하며, 밸런스 버퍼로 부피를 조절한다. 원심분리하여 오가노이드를 펠릿화하고 상층액을 제거한 뒤, 보충제(HEPES 및 Glutamax)와 항생제가 포함된 기본 배지로 세척하고 다시 원심분리하여 재펠릿화한다.
    3. 오가노이드를 완전 배양액에 재현탁하고 조직 배양 처리된 플레이트에 분주한 후, 추가 공정을 진행하기 전 약 24시간 동안 회복시킨다.
  3. 병행 PBMC 회복:
    1. 표준 절차에 따라 냉동 보관된 PBMC를 빠르게 해동하고, 삼투압 쇼크를 최소화하기 위해 즉시 미리 데워둔 T 세포 확장 배지로 희석한다.
      참고: 해동 과정에서 일부 세포 손실은 일반적이며, 배지를 미리 데우면 회복률이 향상된다.
    2. 해동된 PBMC를 400 x g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 동결 배지를 제거한다. 세포 응집을 줄이고 단일 세포 현탁액의 품질을 높이기 위해 benzonase가 포함된 T 세포 확장 배지에서 잠시 인큐베이션한다.
    3. 신선한 확장 배지로 PBMC를 세척 및 재펠릿화한 후, 생존과 회복을 돕기 위해 사이토카인(예: IL-2)이 보충된 T 세포 배양액에 재현탁한다. 공배양 전 하룻밤 동안의 휴지 기간을 위해 PBMC를 멀티-웰 플레이트에 분주한다.
  4. 공배양 전 준비 (공배양 1일 전):
    1. 항원 제시 경로를 강화하기 위해 공배양 전 오가노이드를 면역 자극 사이토카인(예: IFN-γ)으로 선택적으로 처리한다.
    2. 최소 24시간 전에 웰을 공자극 항체(예: anti-CD28)로 코팅하여 공배양 플레이트를 준비하고 4 °C에 보관한다. 사용 전 결합되지 않은 항체를 제거하고 DPBS로 웰을 두 번 세척한다.
  5. 단일 세포로의 오가노이드 해리 (공배양 실험 당일):
    1. 사전 자극된 오가노이드를 수집하여 펠릿화하고 상층액을 제거한 후, 전체 세포군을 회복하기 위해 부착 세포와 함께 효소 해리 시약(예: TrypLE)에 재현탁한다.
    2. 부드럽게 섞으며 인큐베이션하고, 과도한 소화를 방지하면서 대부분의 오가노이드가 단일 세포나 작은 클러스터로 해리될 때까지 현미경으로 모니터링한다.
    3. 버퍼로 해리 시약을 중화하고 세포를 펠릿화한 뒤, 상층액을 제거하고 계수 및 혼합을 위해 T 세포 배양액에 재현탁한다.
  6. 세포 계수 및 공배양 준비:
    1. 세포 현탁액을 부드럽게 섞고, 혈구계수기 또는 생존율 염색약이 포함된 자동 계수기를 사용하여 생존 세포 수를 결정한다. T 세포 배지에서 원하는 밀도로 종양-PBMC 비율을 조절한다.
    2. PBMC를 펠릿화하고 신선한 배지에 재현탁하여 생존 세포 수를 결정하여 준비한다. PBMC를 세척하고 사이토카인(예: IL-2) 및 필요에 따라 선택적 면역 조절 항체(예: anti-PD-1)가 보충된 T 세포 배지에 재현탁한다.
  7. 공배양 수행:
    1. 해리된 종양 세포와 PBMC를 원하는 작동 세포:표적 세포 비율로 혼합한다. 세포를 넣기 전 anti-CD28이 코팅된 웰을 세척하되, 웰이 마르지 않도록 주의한다.
    2. 필요한 분석 부피로 오가노이드-PBMC 혼합물을 분주하고 표준 배양 조건에서 인큐베이션한다. 실험 중 필요에 따라 배양액을 교체하거나 분할 배양한다.
  8. 실험 설계 및 대조군 (치료 전략용):
    1. 공배양 시스템을 사용하여 약물(예: 체크포인트 억제제 또는 소분자 화합물)이 종양 오가노이드에 대한 PBMC 반응을 어떻게 조절하는지 평가한다.
    2. 생물학적 반복(여러 오가노이드 라인 및 PBMC 기증자)과 기술적 반복(조건당 최소 3개의 웰)을 포함한다.
    3. 대조군을 포함한다: 오가노이드 단독, PBMC 단독(매개체 또는 활성화), 오가노이드 + PBMC(매개체), 오가노이드 + 약물, PBMC + 약물 조건.
  9. 전형적인 공배양 시점 프레임워크:
    1. 개시 후 24, 48, 72시간에 공배양물을 분석하여 면역 활성화, 증식, 사이토카인 분비, 세포 사멸 및 종양 세포 사멸을 평가한다.
    2. 24시간에 조기 활성화 마커와 사이토카인 분비를 평가하고, 48~72시간에 유세포 분석, 이미징 또는 생존율 분석을 통해 세포 독성, 증식 및 활성/소진 마커를 평가한다.
      참고: 만성 활성화, 면역 소진 또는 장기 약물 반응을 평가하기 위해 후기 시점(예: 5~7일)을 포함할 수 있다.
  10. 오가노이드의 면역형광 염색:
    1. 슬라이드를 PBS로 5분 동안 세척하고, 실온(RT)에서 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액으로 20분 동안 고정한다. 고정 후 슬라이드를 PBS로 5분씩 두 번 세척한다.
      참고: 염색 전 과정 동안 오가노이드가 건조해지지 않도록 유지한다. 필요한 경우 슬라이드를 실온의 PBS에 최대 3시간까지 보관할 수 있으나, PBS 내에서 하룻밤 동안 보관하는 것은 피한다.
    2. 오가노이드 구조를 유지하면서 세포 내 및 핵 염색이 가능하도록 실온에서 0.1~0.5% Triton X-100이 포함된 PBS로 15~20분 동안 투과화한다.
      참고: 과도한 투과화는 오가노이드 구조를 파괴할 수 있으므로 피한다. 적절한 투과화는 형태를 유지하면서 균일한 세포질 및 핵 염색을 보장한다.
    3. 슬라이드를 1x IF 버퍼로 두 번 세척하고, 비특이적 염색을 줄이기 위해 실온에서 1~10% BSA(또는 종 일치 혈청)가 포함된 IF 버퍼로 60~120분 동안 블로킹한다.
      참고: BSA는 일반적인 블로킹에 적합하지만, 비특이적 결합을 줄이고 신호 특이성을 높이기 위해 특정 마커 염색에는 종 일치 혈청을 권장한다.
    4. 슬라이드를 세 번(각 5분) 세척하고, 습윤 챔버 내 4 °C에서 1% 혈청 블로킹 버퍼에 1차 항체(10~50 µg/mL)를 넣어 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
      참고: 증발을 방지하기 위해 슬라이드를 파라필름으로 덮고, 배경 염색을 최소화하면서 특이적 염색이 되도록 적정(titration)을 통해 1차 항체 농도를 최적화한다.
    5. 슬라이드를 1x IF로 3회(각 5분) 세척한다.
      참고: 세척 과정은 개별 항체 염색에 맞게 최적화해야 한다. 두 개 이상의 1차 항체를 동시에 사용하는 경우 세척 과정을 표준화해야 한다.
    6. 형광 표지 2차 항체(1% 혈청 블로킹 버퍼 내 1:200~1:500)를 처리한 오가노이드 슬라이드를 습윤 챔버 내 4 °C에서 하룻밤 또는 실온의 암소에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
      참고: 2차 항체를 첨가한 후의 모든 후속 단계는 형광 물질의 광퇴색을 방지하기 위해 암소에서 수행한다.
    7. 슬라이드를 1x IF 버퍼(2회 5분)로 세척한 후 PBS(5분)로 세척한다. 5% 혈청 블로킹 버퍼에 포함된 DAPI(1 µg/mL) 및 AlexaFluor-594 표지 항체(20 µg/mL)와 함께 실온 암소에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, PBS로 세척(3회 5분)한다.
    8. 슬라이드에 마운팅 용액을 첨가하고 커버슬립을 덮되 공기 방울이 생기지 않도록 한다. DAPI가 포함된 마운팅 용액을 사용하는 경우 DAPI 염색 단계는 생략한다. 슬라이드 스캐닝 용도인 경우 하드 마운팅 용액을 사용한다.
    9. 슬라이드를 실온에서 한 시간 동안 건조시킨 후 –20 °C에 보관하고, 공초점 현미경 또는 슬라이드 스캐너를 사용하여 이미징한다.

4. 오가노이드를 위한 유세포 분석 및 세포 내 염색 프로토콜

  1. 오가노이드 배양액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 1x PBS로 오가노이드를 한 번 부드럽게 세척하여 잔류 배양액과 혈청 단백질을 제거합니다. 차가운 PBS 또는 회복 용액을 사용하여 세포외 기질로부터 오가노이드를 분리하고, 전단 응력을 최소화하면서 부드럽게 피펫팅하여 기질을 파쇄합니다.
  2. 오가노이드 현탁액을 원심 분리 튜브로 옮겨 4 °C에서 300 x g 로 5분간 원심 분리하여 펠렛을 형성하고 상층액을 버립니다. 효소적 해리를 위해 0.05% TrypLE 용액 250–500 µL에 오가노이드 펠렛을 재현탁합니다. 세포-세포 간 결합이 효율적으로 소화되도록 37 °C에서 배양합니다.
    참고: 5분마다 튜브를 탭핑하거나 피펫팅하여 현탁액을 부드럽게 섞어주고, 과소화가 일어나지 않도록 단일 세포 현탁액이 될 때까지 현미경으로 관찰합니다.
  3. 세포 현탁액을 40 µm 세포 스트레이너에 통과시켜 덩어리를 제거합니다. 세포를 4 °C에서 300 x g로 5분간 원심 분리하고 Ca2+ / Mg2+ buffer가 없는 1x PBS에 재현탁합니다.
  4. 세포 수를 측정하고 염색 완충액에서 약 1 x 106 cells/mL가 되도록 조정합니다. 비특이적 결합을 줄이고 생존/사멸 세포를 식별하기 위해 Fc block (1:200) 및 생존 염색 시약(예: Live/Dead Blue, 1:1000–1:3000)과 함께 배양합니다.
  5. 세포를 암실 상태의 상온(RT)에서 30분 동안 배양한 후, 1x PBS로 한 번, 염색 완충액으로 한 번 세척합니다.
  6. 염색 완충액 내에서 각 항체를 최적화된 희석 배율로 혼합하고, 마스터 믹스를 위해 적정된 µL/test 값을 사용하여 총 부피를 계산함으로써 표면 항체 칵테일을 준비합니다.
    참고: 패널에 여러 개의 폴리머 기반 형광 발색단(예: Brilliant Violet, Brilliant Ultraviolet 또는 Brilliant Blue 염료)이 포함된 경우, 형광 발색단 간의 상호작용을 줄이고 신호 해상도를 높이기 위해 항체 칵테일에 Brilliant Stain Buffer (BSB)를 포함하십시오. 제조사의 지침(통상적으로 최종 농도 1x)에 따라 BSB를 추가하고 부드럽게 섞은 후, 모든 샘플을 위한 마스터 믹스(약 10% 추가 부피)를 준비합니다. 빛을 차단하고 사용 전까지 얼음 위에 보관합니다.
  7. 항체 칵테일을 추가하고 암실 상태의 상온에서 30–50분 동안 배양합니다. 염색 완충액과 PBS (Ca2⁺/Mg2⁺ 제외)로 세척한 다음 500 x g로 5분간 원심 분리합니다. 농축액을 희석제로 희석하여 작동 고정/투과화 용액을 준비합니다. 예를 들어, 농축액 1분량 : 희석제 3분량 비율로 혼합하여 1x 또는 지정된 작동 농도로 만듭니다.
  8. 고정/투과화 용액을 추가하여 세포를 완전히 재현탁하고(100만 세포당 약 100–200 µL), 빛을 차단한 상태에서 상온 또는 2–8 °C에서 15–20분 동안 배양합니다. 고정 시간이 지난 후, 1x Permeabilization Buffer로 세포를 세척합니다. 상층액을 버립니다. 과잉 고정제를 제거하기 위해 세척 과정을 최소 한 번(때로는 두 번) 반복합니다.
  9. 형광 표지 항체를 1x permeabilization buffer 내에서 최적 농도로 희석하여 세포 내 염색 칵테일을 준비합니다. 필요에 따라 사이토카인, 전사 인자 또는 인산화 단백질을 타겟팅하는 항체를 포함하여 투과화된 세포에 세포 내 항체 칵테일을 추가합니다.
  10. 세포를 암실 상태의 상온에서 2시간 동안 배양합니다.
    참고: 필요한 경우, 배양 시간을 제조사가 권장하는 최소 시간으로 단축하거나, 염색 품질에 영향을 주지 않도록 4 °C 암실에서 하룻밤 동안 배양할 수 있습니다.
  11. 세포를 1x permeabilization buffer로 두 번, 염색 완충액으로 한 번 세척한 후, 펠렛을 250–300 µL의 염색 완충액에 재현탁합니다.
  12. 현탁액을 40 µm 스트레이너에 통과시켜 단일 세포 현탁액을 얻고, 분석 전까지 빛을 차단한 상태로 얼음 위나 4 °C에 보관합니다. 염색된 샘플의 장기 보관을 피하고, 염색 후 가능한 한 빨리 사이토미터로 샘플을 획득하십시오.
  13. 형광체와 일치하는 적절한 레이저와 필터가 장착된 유세포 분석기를 사용합니다. 단일 염색 샘플 및 FMO(fluorescence-minus-one) 컨트롤을 포함한 보정 컨트롤을 설정합니다.
  14. 강력한 통계 분석을 위해 샘플당 최소 50,000–100,000개의 이벤트를 획득합니다. FlowJo, FCS Express 또는 이에 상응하는 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 살아있는 단일 세포를 게이팅합니다. 표면 및 세포 내 마커 발현을 분석합니다.
    참고: 각 항체-형광체 접합물을 연속 희석하여 적정함으로써, 최대 신호와 최소 배경값을 제공하며 세포군 분리가 뚜렷한 최적 농도를 확인하십시오.

5. 유세포 분석법을 이용한 Annexin V 기반 세포사멸 분석:

  1. 필수 대조군 및 시약:
    1. 비염색 대조군: 세포 자가형광의 기준선을 설정하여 실제 양성 신호와 배경 신호를 구별할 수 있게 합니다.
    2. 단일 염색 대조군: 적절한 보정(전통적 사이토메트리) 또는 스펙트럼 언믹싱(스펙트럼 사이토메트리)을 위해 패널 내 모든 형광색소에 대해 필요합니다. 이는 채널 간 정확한 신호 분리를 보장합니다.
    3. 형광색소 하나 제외(FMO) 대조군: 약하거나 전이 단계에 있는 세포군(population)의 게이트를 정의하는 데 필수적입니다. 이는 약양성 이벤트의 과대평가를 방지하는 데 도움이 됩니다.
    4. 세포 사멸 양성 대조군: 의도적으로 세포 사멸을 유도한 샘플(예: staurosporine 처리 세포)을 통해 분석법이 세포 사멸 이벤트를 신뢰성 있게 검출하는지 검증합니다.
    5. 이소형(Isotype) 대조군: Annexin V 결합은 항체 매개 방식이 아니라 인지질 특이적 결합이므로 Annexin V 자체에는 유용하지 않습니다. 다만, 필요한 경우 추가적인 표면 마커 항체에 대해 포함할 수 있습니다.
      참고: Annexin V 결합은 칼슘 의존적이므로 칼슘 이온이 포함된 Annexin V 결합 버퍼를 사용하십시오. 상용 제품 또는 검증된 동등 버퍼를 사용하십시오.
    6. 막 비투과성 생존 염료(예: PI, 7-AAD, DAPI 또는 고정 가능 사세포 염료)를 사용하여 초기 세포 사멸 세포와 후기 세포 사멸/괴사 세포를 구분합니다. 유세포 분석기의 레이저 및 고정 조건과 호환되는 염료를 선택하십시오.
  2. 염색 절차:
    1. 플레이트를 500 x g에서 5분간 원심분리하여 공배양된 세포를 수확합니다. 배양액과 부유 파편을 제거하기 위해 상층액을 조심스럽게 흡입하여 버립니다. 배경 염색을 줄이고 방해 단백질을 제거하기 위해 차가운 염색 버퍼(예: 1–2% FBS 함유 PBS)로 세포를 두 번 세척합니다.
    2. 계보(lineage) 또는 하위 집합 마커(예: PBMC의 경우 CD8, 종양 세포의 Lgr5와 같은 암 줄기세포 마커)가 필요한 경우, 빛이 차단된 상태에서 완만한 쉐이커를 사용하여 실온에서 30–45분 동안 항체 칵테일과 함께 세포를 배양합니다. 이 단계의 표면 염색은 항원의 무결성을 보존하고 구획별 분석을 가능하게 합니다.
    3. 세포를 두 번 세척합니다. 먼저 차가운 염색 버퍼로 결합되지 않은 항체를 제거하고, 이어서 Annexin V 결합 버퍼(예: BioLegend Cat. No. 422201)를 사용하여 칼슘 가용성을 확보합니다. 결합 버퍼 내의 세포 농도를 약 1 x 106 cells/mL로 조정합니다.
    4. 샘플당 100 µL의 세포 현탁액에 형광색소가 접합된 Annexin V 시약 5 µL를 첨가합니다. 선택한 형광색소는 패널 내 다른 염료와 스펙트럼적으로 호환되어야 합니다.
    5. PI, 7-AAD 또는 DAPI와 같은 생존 염료로 대조 염색을 수행합니다. PI 및 DAPI의 최적 희석 배수는 기기 및 레이저 강도에 따라 일반적으로 1:1000에서 1:60,000 범위이며, 실험적으로 결정해야 합니다. 후속 고정 과정이 필요한 경우 고정 가능 생존 염료가 선호됩니다.
    6. 피펫팅으로 세포를 부드럽게 재현탁하고 암소 실온에서 20–40분 동안 배양합니다. 과도한 배양은 비특이적 결합이나 위양성을 증가시킬 수 있으므로 최적 배양 시간은 실험적으로 결정해야 합니다.
    7. 각 웰에 200 µL의 Annexin V 결합 버퍼를 첨가합니다(샘플 농도가 매우 높은 경우 최소 100 µL). 이는 유세포 분석을 위한 충분한 부피를 제공하고 분석 중 버퍼 조건을 유지해 줍니다. 전압 설정이 음성과 양성 세포군을 명확히 구분하도록 최적화되었는지 확인한 후, 교정된 유세포 분석기에서 즉시 샘플을 분석합니다.
  3. 권장 게이팅 전략:
    1. 전방 산란광(FSC) 대 측방 산란광(SSC) 플롯을 사용하여 작은 파편과 큰 응집체를 제거하고 온전한 세포만 유지합니다. FSC-A 대 FSC-H(또는 FSC-W) 게이팅을 적용하여 이중체(doublet)와 응집체를 제거함으로써 단일 세포만 분석되도록 합니다.
    2. 생존 염료를 바탕으로 적절한 경우 강양성 사세포를 제외합니다. 또는 분석 사분면에 해당 염료를 포함시킵니다. 표면 마커를 사용하여 PBMC(예: CD45+)를 종양 세포(예: EpCAM+ 또는 기타 종양 특이적 마커)와 구분합니다. 이를 통해 세포 사멸의 구획별 정량이 가능해집니다.
    3. 각 게이트 내 구획에서 Annexin V 대 생존 염료를 플롯하여 다음 네 가지 세포군을 생성합니다: a) Annexin V− / Dye− = 생존 세포; b) Annexin V+ / Dye− = 초기 세포 사멸 세포; c) Annexin V+ / Dye+ = 후기 세포 사멸 또는 괴사 세포; d) Annexin V− / Dye+ = 일차 괴사 세포 또는 아티팩트(주의 깊게 해석해야 함).
    4. PBMC를 다시 하위 집합(예: CD4 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포, 단핵구)으로 세분화하여 특정 면역 세포군의 세포 사멸 프로필을 조사합니다.

6. 오가노이드 공동 배양 내 T-세포 모니터링을 위한 ELISPOT 분석 (3일):

  1. 0일차에, 미리 코팅된 PVDF-membrane 96-well plate를 세척하고 활성화합니다. 분석하고자 하는 항체/사이토카인 검출용 ELISpot 프로토콜 키트에 따라 4 °C에서 24시간 동안 보관하십시오.
  2. 1일차에,
    1. 섹션 3.5에 기술된 대로 오가노이드를 단일 세포 현탁액으로 만듭니다. RT에서 500 x g로 5분 동안 원심분리한 후, CTL 배지(CTL ELISpot 키트에 제공됨)에 재현탁합니다. 냉동 보존된 PBMC를 해동하거나 신선하게 분리된 PBMC를 사용합니다. PBMC를 RT에서 500 x g로 5분 동안 원심분리합니다.
    2. PBMC를 키트 배지에 재현탁합니다. 오가노이드 단일 세포와 PBMC를 5:1 비율로 부드럽게 혼합하여 공동 배양을 수행합니다. 미리 활성화된 96-well assay plate의 각 웰에 공동 배양 혼합물을 200 µL/well씩 첨가합니다. 플레이트를 매우 조심스럽게 톡톡 칩니다. 37 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 4시간 후, 인큐베이터에서 assay plate를 조심스럽게 꺼냅니다. 적절한 양성 및 음성 대조군을 포함하여 지정된 웰에 처리물을 첨가합니다.
      참고: 최적의 사이토카인 스팟 형성 및 스캐닝 결과를 위해 오가노이드:PBMC 비율을 최적화해야 합니다.
  3. 2일차에,
    1. 24시간 배양 후, 제조사의 염색 프로토콜을 따릅니다. 특정 마커를 분비하는 세포 수를 검출하고 비교하기 위해 단색 및 이중색 대조군을 고려하십시오. 배양 시간은 색상에 따라 다르며, 스팟 형성을 정기적으로 모니터링해야 합니다. 제조사의 지침에 따라 플레이트를 스캔합니다. 분비된 면역 스팟을 플롯하고 비교합니다.
      참고: 실험 설계 및 관심 마커에 따라, 플레이팅된 세포와 스팟 사이의 관계는 단색 또는 이중색에서의 사이토카인/항체 발현을 나타냅니다.

7. Annexin V NIR 및 생세포 이미징을 이용한 실시간 세포 사멸 검출 (3일):

자동화된 살아있는 세포 이미징과 결합된 Annexin V NIR은 약물 반응 및 세포 독성 분석을 위해 세포 사멸(apoptotic cell death)을 실시간으로 고처리량 모니터링할 수 있게 합니다.

  1. 0일 차에 오가노이드를 단일 세포 현탁액으로 만듭니다. GFP 세포 추적자로 세포를 염색합니다. 염색된 단일 세포를 웰당 100 µL의 완전 배지에 분주합니다. 세포가 부착되어 클러스터를 형성하도록 둡니다.
    참고: 96-웰 U-바닥, 초저부착 플레이트를 사용하십시오. 일반적인 시작 밀도(경험적으로 조정): 웰당 5,000개 세포, 웰당 10,000개 세포. 처리하지 않은 음성 대조군, 용매 대조군 및 모든 실험 처리군을 위한 웰을 포함하십시오(3반복 이상).
  2. 1일 차에 동결 보존된 PBMC를 해동하거나 갓 분리한 PBMC를 사용합니다. PBMC를 RT에서 500 x g로 5분 동안 원심 분리합니다. IL-2가 보충된 증식 배지에 PBMC를 재현탁하고 인큐베이터에서 배양합니다.
  3. 2일 차에 노란색 세포 추적자 염료로 PBMC를 염색합니다. 염색 후 PBMC를 RPMI에 재현탁합니다. 플레이트에서 오가노이드 배지를 매우 조심스럽게 제거합니다. 오가노이드 단일 세포와 PBMC를 1:5 비율로 부드럽게 혼합하여 공동 배양을 수행합니다. 공동 배양 혼합물의 각 웰에 PBMC가 포함된 RPMI 배지 200 µL를 추가합니다. 플레이트를 매우 조심스럽게 탭하고 인큐베이터에 넣습니다.
    참고: 웰 바닥에 있는 오가노이드 단일 세포가 흐트러지지 않도록 주의하십시오.
  4. 37 °C에서 2–4시간 동안 배양합니다. 4시간 후, 플레이트를 인큐베이터에서 조심스럽게 꺼냅니다.
  5. 적절한 양성 및 음성 대조군을 포함하여 약물 처리 웰을 준비합니다. 동결 건조된 Annexin V NIR 시약을 100 µL의 완전 배지 또는 PBS에 재구성하고 부드럽게 섞습니다. 최종 작동 농도의 두 배(예: 최종 희석 배수가 1:200인 경우 1:100)로 Annexin V NIR을 포함하는 2배 농도 처리 배지를 준비하고, 배지에 ≥1 mM Ca2⁺가 포함되어 있는지 확인합니다.
  6. Annexin V NIR 1:200 희석액을 웰에 추가합니다. 이후 48–72시간 동안 라이브 세포 이미징 인큐베이터에 플레이트를 보관합니다.
    참고: 충분한 세포 간 상호작용과 측정 가능한 세포 사멸 반응을 보장하기 위해 오가노이드:PBMC 비율을 최적화해야 합니다.
  7. 라이브 세포 이미징 및 분석
    1. 4x 또는 10x 대물렌즈를 사용하고 Annexin V NIR을 위한 NIR 채널에서 이미지를 획득합니다(멀티플렉싱 하는 경우 추가 채널 사용). 처리 기간에 따라 24–72시간 동안 4–6시간마다 플레이트를 스캔합니다.
    2. IncuCyte CX3와 같은 라이브 세포 이미징 소프트웨어를 사용합니다. 기본적인 정량 분석을 위해서는 전체 면적 또는 객체 수를 사용하여 NIR 채널을 분석하고, 단일 세포 역학 분석을 위해서는 Cell-by-Cell 또는 Object 분석 모듈을 사용합니다. 멀티플렉싱(예: Cell tracer yellow 및 GFP)을 사용하는 경우, 스펙트럼 언믹싱(spectral unmixing) 참고 사항을 확인하십시오.

결과

먼저, 표준화된 워크플로우(그림 1)를 사용하여 여러 환자의 검체로부터 종양 오가노이드를 생성하였습니다. 이러한 PDO는 일반적으로 2주간의 확립 기간이 필요하며, 이후 추가 연구를 위해 확장 및 계대 배양이 가능합니다. 확립 시간과 오가노이드 생성 효율은 조직마다 다르다는 점에 유의해야 합니다. 예를 들어, 일부 조직은 오가노이드 생성에 추가 시간이 필요하며, 일부 오가노이드는 계대 배양에 적합한 합류도(confluency)에 도달하기까지 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다. 이에 따라 오가노이드 배지 보충제를 조정할 수 있습니다.

다음으로, 본 문서에 기술된 프로토콜(그림 2)을 사용하여 오가노이드-T 세포 공배양 시스템을 구축하였습니다. 환자의 말초혈액에서 PBMC를 설명된 대로 분리한 후 증식시켰습니다. 이 범위를 벗어난 비율은 다른 결과를 초래할 수 있으므로 종양 세포 대 림프구의 비율을 최적화해야 합니다. 비율이 너무 낮으면 오가노이드와 T 세포 간의 상호작용 정도가 제한될 수 있습니다.

공배양 시스템의 기능을 평가하기 위해, 증식 및 세포 사멸의 바이오마커인 Ki67과 cleaved caspase-3를 각각 비교하고자 오가노이드와 공배양물에 대해 병렬 면역형광 이미징을 수행하였습니다 (Figure 3). 공배양물의 생존율과 기능성은 Annexin V 및 DAPI 염색을 통해 입증되었습니다. T 세포와 오가노이드를 구별하기 위해, 먼저 설명된 방법대로 면역 세포와 오가노이드를 염색한 후 유세포 분석기로 분석하였습니다 (Figure 4A). 처리 후, 공배양물을 Annexin V와 DAPI로 염색하고 유세포 분석기를 사용하여 측정하였습니다. Cell Trace 마커를 통해 T 세포 (Figure 4B)와 오가노이드 (Figure 4C)의 세포 사멸을 개별적으로 측정할 수 있습니다.

면역 바이오마커인 CD107a 및 CD137 또한 유세포 분석법을 통해 평가되었습니다(그림 5A). 두 마커는 일반적으로 T 세포 활성화 또는 탈과립을 나타냅니다. 본 연구에서는 공동 배양 후 CD107a 및 CD137 발현을 통해 T 세포 반응성을 평가할 수 있습니다.그림 5 B,C). 이후 라이브 셀 이미징 시스템을 사용하여 처리 과정 중 PDO-T 세포 공동 배양의 세포사멸을 모니터링하였다. 정성적인 (그림 6A) 및 정량적 (그림 6B분석 결과는 다양한 조건에서 33시간 동안 진행된 오가노이드 세포 사멸(apoptosis)을 보여줍니다. 종양 오가노이드와 PBMC 사이의 상호작용을 지속적으로 모니터링하기 위해 IncuCyte CX3 플랫폼이 사용되었습니다. 스캐닝 시간은 처리 후 원하는 시점으로 설정할 수 있습니다.

약물 A와 anti-PD-1을 단독 또는 병용하여 24시간 동안 처리한 오가노이드 공동 배양 시스템에서 Granzyme B 및 Perforin 사이토카인의 분비량을 정량화하기 위해 Immunospot 분석을 수행하였습니다. CRC PDO 공동 배양을 위해 ELISpot double color를 사용하였습니다(그림 7). 오가노이드와 림프구의 비율에 따라 사이토카인 프로파일이 다르게 나타날 수 있다는 점에 유의해야 합니다.

종양 조직 준비: 기계적, 화학적 소화; 환자 유래 오가노이드; 현미경 결과.
그림 1. CRC 종양 오가노이드의 구축. (A) 종양 오가노이드 구축의 도식적 절차. (B) 대표적으로 구축된 환자 유래 오가노이드. 정상 성장 중인 구축된 PDO 배양물의 (4X) 배율 이미지(위상차 현미경을 이용한 Echo Revolve로 획득). 스케일 바 = 200 µm. 이 그림은 Mohammadi M et al. 19에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

대장암 치료 과정 도식: 환자 PBMC 분리, T 세포 증식, 공동 배양 분석.
그림 2. 종양 오가노이드와 면역 세포 공동 배양 및 하위 분석의 도식적 절차. 면역 세포의 분리 및 증식과 병행하여 종양 오가노이드를 구축한다. 종양 오가노이드와 면역 세포의 단일 세포 현탁액을 정해진 비율로 공동 배양한다. 24 h 후에 공동 배양물에 처리를 수행한다. 하위 분석은 본 프로토콜에 설명된 대로 수행한다. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

오가노이드의 형광 현미경 사진; DAPI, Caspase-3, Ki67 염색; CRC PDO PBMCs 공동 배양.
그림 3. 24시간 후 오가노이드와 공동 배양의 비교. 40배 배율로 Ki67(증식) 및 cleaved caspase-3(세포 사멸) 마커를 평가하기 위해 공초점 현미경 관찰을 수행하였다. 오가노이드를 분주하고 자가 면역 세포와 공동 배양하였다. 또한 핵 시각화를 위해 DAPI로 염색하였다. 스케일 바 = 20 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유세포 분석 데이터 분석; 세포 생존율 그래프 포함. 세포 사멸 실험 도식.
그림 4. 세포 사멸 유세포 분석 어세이를 이용한 공배양 시스템 내 세포 사멸의 정량화. (A) 종양 세포를 CellTrace Far Red로, T 세포를 CellTrace Far Yellow로 라벨링한 유세포 분석 게이팅 전략. Annexin V vs DAPI 플롯은 48 h 후 T 세포와 오가노이드의 생존율을 나타낸다. (B) 다양한 처리 조건에 따른 T 세포 생존율의 정량화. (C) 다양한 처리 조건에 따른 종양 오가노이드 세포 사멸의 정량화. 실험은 3회 반복 수행되었다. 약물 A와 약물 B를 단독 표적 치료제로서, 그리고 anti-PD-1 (nivolumab)과의 병용 요법으로 평가하였다. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유세포 분석 다이어그램; CD8 T 세포 하위 집합, CRC PDO, PBMC 공배양; 활성화 연구.
그림 5. CRC 오가노이드-면역 세포 공배양에서의 면역 마커 평가. (A) T 세포 활성화 마커인 CD107a 및 CD137을 발현하는 CD8+ T 세포를 검출하기 위한 유세포 분석 게이팅 전략. (B) 서로 다른 처리군 간 공배양된 CD8+ T 세포의 CD107a 발현 수준 비교. (C) 서로 다른 처리군 간 공배양된 CD8+ T 세포의 CD137 발현 수준 비교. 약물 A와 약물 B를 단독 표적 치료제 및 anti-PD-1 (nivolumab) 병용 투여로 평가하였다. 실험은 3회 반복 수행되었다. 막대 그래프는 각 군의 마커 평균 백분율과 SD를 나타낸다 (p = 0.0023, one-way ANOVA 결과). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

오가노이드 공동 배양 실험; 현미경 이미지; 약물 분석 및 CRC-PDOs+PBMCs 시계열 그래프.
그림 6. CRC 오가노이드-면역 세포 공동 배양의 살아있는 세포 이미징 분석. (A) 0일 차에 IncuCyte CX3 시스템을 사용하여 캡처한 종양 오가노이드와 면역 세포의 대표적인 살아있는 세포 이미지(단시간 타임랩스 녹화). 종양 오가노이드는 말초혈액 단핵구(cell trace yellow 형광 염료로 염색된 PBMCs; 파란색)와 구별하기 위해 녹색 형광 염료로 라벨링되었다. (B) 서로 다른 처리 조건 하에서 공동 배양 중 종양 오가노이드 세포 사멸의 정량화. 세포 사멸은 33시간 동안의 연속적인 살아있는 세포 이미징 과정에서 Annexin V Near-Infrared (NIR) 분석법을 사용하여 모니터링되었다. 스케일 바 = 1 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

대장암 오가노이드 공동 배양 실험 결과; 도표는 약물 및 처리법의 분비 수준과 효과를 보여줌.
그림 7. CRC 오가노이드-면역 세포 공동 배양에서 사이토카인 정량 분석(granzyme B 및 Perforin)에 대한 대표적인 ELISpot 결과. (A) 24시간 공동 배양 후 작동 세포를 자극하고 처리하여 인간 Granzyme B(빨간색) 및 perforin(파란색) 분비를 분석한 대표적인 면역 분석 이미지 및 현색 결과. (B) 이중 색상(Perforin은 파란색, Granzyme B는 빨간색) 분비 결과. (C) 조건별 Perforin 분비량. (D) 조건별 Granzyme B 분비량. 분석은 이중으로 수행되었다. 스캐닝 및 계수는 CTL 분석기를 사용하여 수행되었으며, 데이터는 GraphPad Prism으로 작성되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

번호완충액/시약실험 절차의견
1CRC PDO 배지L-WRN을 해동하고, 지정된 시간 동안 배양하여 컨플루언시(confluency)에 도달하게 한 뒤 배지를 수집하며, 최대 12-14일 동안 매일 신선한 배지를 추가한다. 수집한 배지에 Advanced DMEM을 첨가하고 여과한 후, 여과 직후에 GLUTAMAX I, HEPES, [LEU15]-Gastrin I Human, B-27 (serum-free), N2, Penicillin-Streptomycin 및 N-Acetylcysteine을 보충한다.실험 시작일에 A83-01, SB202190, EGF, nicotinamide 및 PGE2의 두 번째 보충제 세트를 오가노이드 배양 배지에 추가한다. 해동 및 계대 배양 후 첫 일주일 동안은 Y-27632와 Primocin을 추가한다. - 에 보관한다.80 °C.
2오가노이드 세척 배지PBS에 Primocin 1:500, Gentamicin 1:200, 1% Penicillin/streptomycin 및 Amphotericin 1:100 비율로 첨가한다.
3T 세포 해동 배지RPMI-1640 배지에 1% 페니실린/스트렙토마이신과 10% FBS를 첨가하십시오.
4T 세포 성장 배지RPMI-1640에 10% 인체 혈청 알부민과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하십시오. 배지를 다음 조건에서 보관하십시오. 4 °C 1개월 이내로
5T 세포 증식 배지T 세포 성장 배지에 500 IU/mL IL-2와 CD3/CD28 칵테일을 첨가하십시오.즉석에서 준비하십시오
6동결 보존 배지FBS 내 10% DMSO 제조
7코팅 완충액Advanced DMEM/F12에 1% BSA와 15 mM HEPES를 첨가한다.버퍼를 다음 조건에서 보관하십시오. 4 °C 최대 3개월까지
8FACS 버퍼PBS에 1% FBS를 첨가하십시오. 보관 온도 4 °C
9IF 완충액PBS에 0.2% Triton X-100과 0.05% Tween-20을 첨가한다.보관 온도 4 °C
10블로킹 버퍼IF 버퍼에 1% 소혈청알부민(BSA)을 첨가하십시오.보관 온도 4 °C

표 1: 시약 준비. 본 프로토콜에서는 대장암 환자 유래 오가노이드 배양, PBMC 분리 및 증식, 오가노이드-면역 세포 공동 배양, 유세포 분석, 면역형광법, ELISpot 및 살아있는 세포 이미징 분석에 사용되는 버퍼, 배지, 염색 용액 및 보충제의 조성과 준비 방법을 설명합니다.

토론

본 프로토콜에서는 바이오뱅크 저장소로부터 PDO 및 확장된 T 세포를 생성하기 위한 다루기 쉽고 재현 가능한 방법을 설명하였습니다. 다양한 돌연변이를 가진 환자 샘플을 위한 PDO CRC 공배양 설정과 치료 요법에 대해서도 상세히 설명하였습니다. 얻어진 결과는 공배양 모델에 대한 치료 효과를 입증하였습니다.

여기서 설명하는 오가노이드 공동 배양 시스템은 인비트로(in vitro)에서 복잡한 생물학적 상호작용을 모델링하기 위한 강력하고 유연한 플랫폼을 제공합니다. PBMC를 환자 유래 매칭 오가노이드와 통합함으로써, 본 프로토콜은 기존의 2-D 세포 배양보다 오가노이드 신호 전달 역동성과 기능적 이질성을 더 잘 재현합니다. 재현성이 낮거나 생존력이 제한적이었던 이전 접근 방식과 달리, 본 방법은 배양 조건을 최적화하여 원하는 시점까지 오가노이드의 무결성과 T 세포 활성을 모두 유지합니다20,21. 본 프로토콜의 핵심 강점은 유연성에 있습니다. 이는 장, 간, 폐 모델을 포함한 다양한 오가노이드 유형에 적용할 수 있으며, 다양한 면역 세포와의 공동 배양을 지원합니다13,14,20,21,22,23. 이러한 적응성 덕분에 연구자들은 숙주-병원체 상호작용 분석부터 환자 맞춤형 맥락에서의 치료 반응 평가에 이르기까지, 구체적인 생물학적 질문에 맞게 방법을 조정할 수 있습니다13,20,24,25. 또한, 이 워크플로우는 전사체학, 대사체학 및 이미징을 포함한 다운스트림 분석과 호환되므로, 기전 및 중개 연구에 대한 유용성을 확장합니다26,27.

이 프로토콜들은 암 면역학, 중개 종양학 및 정밀 의료의 다양한 분야에서 매우 유용하게 적용될 수 있습니다13,20,21. 오가노이드-면역 공배양 플랫폼은 환자 특이적 종양-면역 상호작용 연구, 면역요법 및 표적 치료제 평가, 그리고 반응 또는 내성 바이오마커 식별을 위한 생리학적으로 적절하고 확장 가능한 시스템을 제공합니다13,14,20,21. 유세포 분석, ELISpot 및 살아있는 세포 이미징과 같은 기능적 분석법을 통합함으로써, 이러한 방법들은 면역 활성화, 세포 독성 및 종양 거동에 대한 종합적인 분석을 가능하게 합니다13,14,20,21. 3차원 환자 유래 오가노이드를 사용하면 종양의 이질성과 미세환경적 특징이 보존되어 중개 연구의 관련성이 더욱 향상되며, 이는 본 프로토콜들을 전임상 약물 테스트 및 차세대 면역요법 개발을 위한 가치 있는 도구로 만들어 줍니다13,14,20.

이러한 장점에도 불구하고 오가노이드 모델에는 여전히 한계가 있습니다. 오가노이드 구축 효율은 종양 유형, 샘플 품질 및 이전 치료 이력에 따라 다르며, 특히 사전 치료를 많이 받은 종양에서 더욱 그러합니다20,21. 또한, 오가노이드는 섬유아세포, 혈관 및 기질 신호 전달과 같은 핵심 종양 미세환경 구성 요소가 결여된 경우가 많습니다14,20,21. 공동 배양 시스템은 종양-면역 상호작용의 모델링을 개선하지만, 체외(in vitro)에서 면역 세포의 생존력과 기능을 유지하는 것은 여전히 어려운 과제입니다13,14,20,21. 실험실마다 다른 배양 조건과 세포외 기질의 가변성 또한 표준화와 재현성을 제한합니다14,20,21.

오가노이드 연구의 향후 발전은 종양 미세환경을 더 잘 모방하고 개인 맞춤형 면역요법 테스트를 개선하기 위해 섬유아세포, 혈관내피세포, 미생물군 및 자가 면역세포를 통합하는 데 중점을 둘 것입니다.28최신 오가노이드-온-칩 시스템과 CRISPR/Cas9 기반 엔지니어링은 질병 모델링, 기능 연구 및 치료제 스크리닝을 더욱 향상시킬 것입니다. 바이오뱅킹 이니셔티브를 통한 표준화는 확장성, 재현성 및 임상 적용 가능성을 개선할 것으로 기대됩니다. 전반적으로, 본 프로토콜은 오가노이드-면역 상호작용 연구를 위한 재현 가능하고 생리학적으로 유의미한 플랫폼을 제공하며, 중개 연구 및 정밀 종양학 연구를 지원합니다.

공개 사항

C.K.는 다음과 같은 공개 사항을 보고하며, 이는 모두 본 원고와 무관합니다: Loki Therapeutics (연구비 지원), Teiko (컨설턴트), Seattle Genetics (컨설턴트), Insights Driven Research (컨설턴트), BMS (컨설턴트), Guardant Health (컨설턴트), OMNI Oncology (컨설턴트), Exelixis (컨설턴트), Nuvectis Pharma (컨설턴트, 약물), Real CME (사례비). C.K.와 N.T.는 2025년 1월 17일에 제출된 미국 임시 출원 63/746,435의 공동 발명자이며, 이는 본 원고와 무관합니다. 나머지 저자들은 보고할 공개 사항이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center CCSG (P30CA013330)의 지원을 받았습니다. 기술적 도움을 준 Hillary Guzik, Rotem Alon, Jinghang Zhang, Swathi Swaminathan 및 Jacky Chuen에게 감사를 표합니다. 유세포 분석 연구는 Albert Einstein College of Medicine Flow Cytometry Core Facility의 National Institutes of Health (1S10OD026833-01) 지원을 받은 Cytek Aurora 분석기를 사용하여 수행되었습니다. 공초점 이미징은 Albert Einstein College of Medicine Analytical Imaging Facility의 NIH (1S10OD034397-01) 지원을 받은 Leica STELLARIS 8 현미경을 사용하여 진행되었습니다. E.N., W.E., C.K.는 NIH 보조금 T32CA200561, R01CA248536, R42CA287679 및 K12CA279871의 지원을 받았습니다. 지원 기관은 원고 작성에 관여하지 않았습니다.

또한 MM, NS 및 NT에 대해 줄기세포 및 재생의학 연구를 위한 Ruth L. and David S. Gottesman Institute의 지원에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
화학 물질, 시약 및 항체
비타민 A 제외 B27 보충제 GIBCO C12587-010
B27 보충제 GIBCO 17504-044 
N-아세틸시스테인 Sigma-Aldrich A9165-5G 
니코틴아마이드 Sigma-Aldrich N0636 
인간 재조합 EGF Peprotech AF-100-15 
N2Gibco17502001
A83-01 Tocris2939
SB202190 Cayman Chemicals 10010399
프로스타글란딘 E2 Cayman Chemicals 14010-1 
Y-27632 Sigma-Aldrich Y-0503 
콜라게나제 type II Sigma-Aldrich C6885 
히알루로니다제 IV형 Sigma-Aldrich H3506 
Advanced DMEM-F12 GIBCO 12634-028 
페니실린/스트렙토마이신 GIBCO 15070063
울트라글루타민 타입 I Lonza BE17-605E 
HEPES GIBCO 15630-056 
TrypLE Express GIBCO 12604-013 
세포 배양 회복용 동결 보존 배지 GIBCO 12648-010 
RPMI 1640 GIBCO 11875093
인간 혈청, 인간 남성 AB형 혈장 유래 Sigma-Aldrich H3667 
벤조나제(Benzonase) Merck 70746-3 
인간 재조합 인터페론 감마 Peprotech 300-02 
디스파제(Dispase) II형 Sigma-Aldrich D4693 
세포 회복 용액 Corning 354253
Invivogen PrimocinInvivogen ANTPM1NC9141851
재조합 인간 IL-2 (E. coli 발현, carrier-free)Biolegend791906
재조합 인간 IL-7 (E. coli 발현, 캐리어 프리)Biolegend569706
재조합 인간 IL-15 (캐리어 프리)Biolegend570306
PE/Cyanine5 항-인간 CD107a (LAMP-1)Biolegend328656
Brilliant Violet 711™ 항인간 CD137 (4-1BB)Biolegend309832
Pacific Blue™ 항인간 CD8a 항체Biolegend300928
anti-human CD3-APC/Cy7Biolegend317342
anti-human CD4 PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4Biolegend980810
Alexa Fluor® 647 anti-human/mouse Granzyme B (647 항인간/마우스 그랜자임 B)Biolegend515406
anti-human CD56-PE/Cy7Biolegend985912
PE/Dazzle™ 594 항인간 IFN-γ 항체Biolegend506530
PE anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1)Biolegend393608
정제된 항-인간 CD28 항체Biolegend302901
Brilliant Violet 510™ 항인간 CD45 항체Biolegend304036
마우스 항-인간 CD326 (EpCAM) (PE/Cy7-접합)Biolegend324222
anti-Ki67Abcamab15580
NucView® 생세포용 488 Caspase-3 분석 키트Biotium30029
PI 포함 FITC Annexin V 세포사멸 검출 키트Biolegend640914
PE/Cyanine7 Annexin VBiolegend640950
Incucyte® Annexin V 근적외선 염료봉제근4768
생존/사멸(LIVE/DEAD)™ 고정 가능한 Blue Dead Cell 염색 키트, UV 여기용InvitrogenL23105
Cell Trace Far YellowThermo FischerC34567
Cell Trace Far RedThermo FischerC34564
그린 CMFDAMedChem ExpressHY-126561 
Human TruStain FcX™ (Fc 수용체 차단 용액)Biolegend422302
Brilliant 염색 완충액BD Biosciences563794
BD Pharmingen™ 염색 완충액 (BSA)BD Biosciences554657
보정 비드Biolegends424602
Corning® Dulbecco’인산 완충 식염수, 칼슘 및 마그네슘 제외 1XCorning20-031-CM
Corning® Dulbecco’인산완충식염수, 칼슘 및 마그네슘 포함 1XCorning20-030-CV
항인간 PD1 항체 (nivolumab)Merus/SelleckchemA2002
디메틸 설폭사이드Fisher ScientificBP231-100 
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Genesee25-500
EDTA 완충액Invitrogen15575020
태아송아지혈청VWR97068-075
인산완충식염수제네시(Genesee)25-507
파라포름알데히드 (PFA)Thermo Scientific Chemicals0473779L
고정/투과화 용액 키트BD554714
인간 가스트린 IMilliporeG9145-.1MG
GLUTAMAX IFisher Scientific35050061
CD3/CD28 칵테일 STEMCELL Technologies 10971
Immunocult 증식 배지STEMCELL Technologies 10981
DAPI 포함 ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36962
Triton X-100Thermo Scientific Chemicals215680025
트립판 블루 용액, 0.4%Gibco15250061
Tween-20TCI AmericaT0543500G
장비
유세포 분석기/유세포 분석 코어 시설Cytek (Wuxi) Biosciences모델 번호 N7-0021
유세포 분석기/Singh LabInvitrogenATTUNE NXT (모델 번호 4486517)
공초점 현미경LeicaSTELLARIS 8
생세포 분석 시스템SartoriusIncucyte CX3

참고문헌

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