트리아졸 및 옥사디아졸 기반 아세트아마이드 유도체를 합성하여 우레아아제와 α-글루코시다아제 억제제로 평가하였다. 화합물 8c가 가장 강한 우레아제 억제를 보였고, 9e는 α-글루코시다제에 대해 아카르보스보다 더 좋은 성능을 보였습니다. BSA 결합 및 인-실리코 연구는 이들의 약물 유사 특성을 지지하며, 두 화합물을 유망한 선적 후보로 확인했습니다.
연구 논문
새로운 트리아졸 및 옥사디아졸 기반 아세트아마이드를 우레아제 및 α-글루코시다제 억제제로 합성, 생물학적 평가 및 실리코 연구로 활용하고 있습니다
이 논문에서
요약
초록
이 연구는 위장 질환과 제2형 당뇨병에 각각 관여하는 우레아제와 α-글루코시다아제의 이중 표적 억제제로서 새로운 1,2,4-트리아졸 및 1,3,4-옥사디아졸 기반 아세트아마이드 유도체의 치료 가능성을 조사하였습니다. 다단계 유기 합성, 시험관 내 생물학적 평가, 분자 도킹, 실리코 ADME 예측, 밀도 기능 이론(DFT) 분석을 결합한 통합 접근법을 사용하여 유리한 약동학적 특성을 가진 강력한 리드 화합물을 식별하였습니다. 벤조산에서 출발하여, 치환 아세트아마이드 모이에티를 포함하는 1,2,4-트리아졸 유도체(8a–c)와 1,3,4-옥사디아졸 유도체(9d–f)를 성공적으로 합성하였습니다. 모든 화합물은 두 표적 효소 모두에 대해 억제 활성을 보였습니다. 화합물 8c는 가장 강력한 우레아아제(IC₅₀ = 6.14 ± 1.06 μM)였으며, 화합물 9e는 가장 강력한 α-글루코시다아제 억제제(IC₅₀ = 27.29 ± 0.41 μM)를 보였으며, 참조 억제제 아카르보스(IC₅₀ = 38.25 ± 0.12 μM)를 능가했습니다. 계산 분석은 실험 결과를 뒷받침하였으며, ADME 예측은 약물 유사 특성을 긍정적으로 보였고, 분자 결합에서는 강한 결합 상호작용이 나타났으며, 화합물 8a는 α-글루코시다아제에 가장 높은 친화력(−7.165 kcal/mol)을, 화합물 9e는 우레아제에 가장 강한 결합(−7.30 kcal/mol)을 보였다. DFT 계산은 생물학적 활성과 전자적 특성을 추가로 상관관계 있게 하여, 가장 활성적인 화합물인 8c(0.14831 a.u.)와 9e(0.14302 a.u.)에서 상대적으로 작은 HOMO–LUMO 에너지 갭을 드러냈습니다. 이 결과들은 8c와 9e 화합물을 우레아제와 α-글루코시다아제 차세대 억제제 개발을 위한 유망한 선두로 확인했습니다.
서론
헤테로사이클 모이에트는 기존 약물에서 이미 보고된 바 있으며, 헤테로사이클은 대사 및 감염병 치료에 사용되는 중요한 효소 억제제 클래스입니다.1. 헤테로사이클 중에서 1'3'4-옥사디아졸은 신약 개발에서 가장 많이 연구된 비계 중 하나이며, 항바이러스, 항균, 항암, 저혈압, 신경보호제, 항경련제, 항결핵제로 보고되었습니다2, 3,4,5. 마찬가지로, 1'2'4-트리아졸 유도체는 항경련제, 항박균, 항바이러스제, 항결핵제, 항당뇨제, 항염증제, 항증식제, 항산화제, 항말라리아제, 그리고 우라아제(ureases) 억제 활성을 보였습니다. 6,7. 아세트아마이드 함유 화합물은 강한 약리학적 특성을 지니며, 이종 화학과 항당뇨제에서 합성 중간체로 사용되어 왔습니다. 항응고제와 화학감작제로 인해 신약 개발에 매력적인 리드 구조가 됩니다 8,9.
α-글루코시다제와 우레아제의 다중 표적 억제제 개발을 위한 상당한 노력이 집중되어 왔습니다. α-글루코시다제 억제는 탄수화물 소화와 포도당 흡수를 지연시켜 제2형 당뇨병 환자의 식후 혈당 수치를 낮춥니다. 현재 사용되는 아카르보스와 같은 억제제는 효과적이지만 위장 부작용과 연관되어 있어 구조적으로 다양한 억제제의 필요성을 만듭니다10,11. 우레아제는 요소를 암모니아와 이산화탄소로 분해합니다. 이 반응은 궤양을 일으키고 숙주를 위암에 더 취약하게 만드는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 박테리아가 위에서 생존할 수 있게 하므로, 우레아아제는 항궤양 약물 개발에서 중요한 표적입니다. 치료 목표는 두 효소 모두에 대한 새로운 억제제 개발입니다 9,12.
그러나 1'2'4-트리아졸과 1'3'4-옥사디아졸 스캐폴드에 대한 연구 결과가 있음에도 불구하고, 1'2'4-트리아졸과 1'3'4-옥사디아졸의 아세트아마이드 유도체가 쌍α-글루코시다아제 및 우레아제 억제제로서 티오에터 모이에티를 포함하는 경우와 관련된 연구는 매우 적게 보고되었습니다. 이들의 단백질 결합 행동과 계산적 특성 분석도 이 맥락에서 제한적인 관심을 받았습니다. 본서, 우리는 트리아졸 또는 옥사디아졸과 치환된 아세트아마이드 조각을 동일한 분자 프레임워크에 결합하면 만족스러운 효소 억제 프로파일과 허용 가능한 물리화학적 특성을 얻을 수 있다고 제안했습니다.
이 가설을 검증하기 위해 1,2,4-트리아졸 기반 아세트아마이드 유도체(8a–c)와 1,3,4-옥사디아졸 기반 아세트아마이드 유도체(9d–f)를 합성하여 α-글루코시다아제와 우레아제에 대한 억제 활성을 평가하였다. 가장 활성적인 화합물(8a, 8c, 9e)과 소 혈청 알부민(BSA)의 결합 상호작용은 형광 분광법, 결합 상수 결정, 열역학 분석을 통해 조사되었습니다. 또한, 분자 도킹, ADME 예측, 밀도 함수 이론(DFT) 계산을 수행하여 결합 방식, 약동학적 특성, 전자 특성을 조사하였습니다.
프로토콜
모든 시약은 분석등급이었으며 추가 정제 없이 사용되었다. 반응 진행 상황은 n-헥산/에틸 아세테이트(7:3–6:4, v/v)를 사용한 실리카겔 위의 얇은 층 크로마토그래피(TLC)로 모니터링되었으며, 자외선으로 인해 반점이 시각화되었습니다. 특별한 언급이 없는 한, 모든 반응은 주변 대기 하에서 수행되었다. 합성된 화합물들은 푸리에 변환 적외선(FTIR), 1H NMR, 13C NMR 분광법으로 특성화되었습니다. 1H와 13C NMR 스펙트럼은 각각 600 MHz와 150 MHz의 CDCl₃에 기록되었으며, 잔류 용매 신호에 비해 화학적 이동은 ppm 단위로 보고되었습니다. 합성 경로는 그림 1에 나타난다. 모든 합성 화합물에 대한 완전한 물리화학적 특성화 데이터는 보충 문서 1에 제공되어 있습니다.
에틸벤조산염 합성 (1)
벤조산(50g, 0.41mol)을 500mL 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 절대 에탄올(150mL)을 첨가했다. 농축 황산(6 mL)은 연속 자기 교반 하에서 촉매로 드롭 단계로 첨가되었습니다. 반응 혼합물은 수냉식 응축기를 사용해 78°C에서 4–6시간 동안 역류로 가열되었습니다. 반응 진행 상황은 TLC에서 모니터링되었습니다. 완성 후 혼합물을 실온까지 냉각한 후 포화 탄산나트륨으로 중화하여 pH가 7–8에 도달할 때까지 사용했습니다. 반응 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 유기층을 수집한 후 증류수로 세척한 후 무수 황산나트륨 위에 건조되었습니다. 여과 후에는 추가 정제 없이 다음 단계에서 에틸벤조에이트(1)를 직접 사용했습니다(그림 1).
벤조하이드라자드 합성 (2)
에틸벤조산염(1; 0.41몰)을 절대 에탄올(100 mL)에 용해시키고, 하이드라진 하이드레이트(80%, 25 mL, 초과 함량)를 연속 교반 하에 첨가했습니다. 반응 혼합물은 78°C에서 역류하에서 4–5시간 동안 대기에서 수냉식 응축기를 사용해 가열되었습니다. 반응 진행 상황은 TLC에서 모니터링되었습니다. 완성 후, 벤조히드라자이드(2)의 흰색 결정질 침전물을 여과하여 차가운 에탄올로 세척한 후 상온에서 일정한 무게로 건조한 후 후속 합성 단계에 사용되었습니다(그림 1).
5-페닐-1,3,4-옥사디아졸-2-티올 합성 (3)
벤조히드라자드(2; 10g, 0.073 mol)와 수산화칼륨(4.12 g, 0.073 mol)은 에탄올(30 mL)이 들어 있는 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 혼합물은 수냉식 응축기를 사용해 78°C에서 10분간 역류로 가열되었습니다. 그 후 이황화탄소(CS₂; 5 mL, 0.083 mol)를 첨가하고 역류가 추가로 3–4시간 지속되었다. 반응 진행 상황은 TLC에서 모니터링되었습니다. 완성 후 반응 혼합물을 증류수로 옮겨 연속 교반하여 가열했습니다. 희석된 염산을 점차 첨가하여 pH가 5에 도달하면, 화합물 (3)(그림 1)이 침전되었습니다. 침전수는 여과로 수집되고, 차가운 증류수로 철저히 세척한 뒤 일정한 무게로 건조된 후 무게를 측정하여 수율을 결정했습니다. 이 화합물은 FTIR, 1H NMR, 13C NMR 분광법으로 특성화되었습니다.
4,5-디페닐-4H-1,2,4-트리아졸-3-티올 합성 (4)
벤조히드라자드(2; 5g, 0.037 mol)와 페닐이소티오시아네이트(4 mL, 0.037 mol)는 수냉식 응축기가 장착된 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 반응 혼합물은 78°C에서 역류하여 티오세미카바지드 중간체가 완성될 때까지 가열되었으며, 이는 n-헥산/에틸 아세테이트(7:3, v/v)를 사용한 TLC에서 확인되었습니다. 수산화칼륨(2g, 0.036mol)을 에탄올(20mL)에 용해한 후 추가하였고, TLC로 확인된 바와 같이 화합물(4)이 형성될 때까지 역류가 계속되었습니다. 반응 혼합물을 증류수로 옮긴 후 연속 교반으로 가열한 후 희석 염산으로 pH 5로 산성화하여 화합물(4)을 침전시켰다(그림 1). 침전수는 여과를 통해 수집되고, 차가운 증류수로 완전히 세척된 후 일정한 무게로 건조된 후 FTIR, 1HNMR, 13C NMR 분광법으로 특성화되었습니다.
브로모아세트아마이드 중간체 합성 7(a–f)
각 치환된 아닐린 유도체 5(a–f)(1 equiv.)는 클로로포름에 용해되어 얼음 욕조에서 냉각되어 반응 온도를 0–5 °C로 유지했다. 브로모아세틸 브로마이드(6, ≥98%, 1 equiv.)를 점차 첨가하여 연속적으로 저어주었습니다. 반응 중에는 생성된 溴수소산을 중화하여 반응 pH를 9에서 10 사이로 유지하기 위해 필요에 따라 18% 탄산나트륨 용액을 첨가했습니다. 브로모아세틸 브로마이드 첨가가 완료된 후, 반응 혼합물을 실온까지 데워 TLC가 시작 물질의 완전한 소비를 확인할 때까지 저어주었다. 결과 생성된 브로모아세아마이드 중간체 7(a–f)은 여과를 통해 수집되어 차가운 증류수로 세척한 후 일정한 무게로 건조된 후 추가 정제 없이 다음 합성 단계에서 직접 사용되었습니다(그림 1).
트리아졸 기반 아세트아마이드 유도체 합성 8(a–c)
트리아졸 유도체(4; 0.5 g, 0.002 mol)는 50 mL 둥근 바닥 플라스크 안에서 N, N-디메틸포름아마이드(10 mL)에 용해되었다. 적절한 브로모아세트아마이드 중간체(7a, 7b, 또는 7c; 0.002 mol, 1 equiv.)를 연속 교반 후 수소나트륨(0.05g, 0.002 mol)을 첨가하여 S-알킬화를 촉진했습니다. 반응 혼합물은 상온에서 24–48시간 동안 저어주었으며, 반응 진행 상황은 TLC에서 모니터링되었습니다. 완성 후 반응 혼합물을 얼음처럼 차가운 물에 부어 침전을 유도했다. 침전물은 여과를 통해 수집되어 찬물로 완전히 세척된 후 건조된 후 FTIR, 1HNMR, 13CNMR 분광법으로 특성화되었습니다(그림 1).
옥사디아졸 기반 아세트아마이드 유도체 9(d–f) 합성
옥사디아졸 유도체(3; 0.5 g, 0.002 mol)는 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 N, N-디메틸포름아마이드(10 mL)에 용해되었다. 이에 대응하는 브로모아세트아마이드 중간체인 7d, 7e, 또는 7f(0.002 mol, 1 equiv.)가 첨가되었고, 이어서 S-알킬화를 촉진하기 위해 수소나트륨(0.05g, 0.002 mol)이 첨가되었습니다. 반응 혼합물은 실온에서 24–48시간 동안 저어주었고, 진행 상황은 TLC에서 모니터링되었습니다. 완성 후 혼합물을 얼음처럼 차가운 물에 부어 침전했습니다. 침전물은 여과를 통해 수집되어 찬물로 완전히 세척된 후 건조된 후 FTIR, 1HNMR, 13CNMR 분광법으로 특성화되었습니다(그림 1).
α-글루코시다제 억제 분석법
α-글루코시다아제 억제 활성은 시험 샘플 용액 50 μL와 인산 버퍼(pH 6.8)에서 조제된 100 μL α-글루코시다제 용액(0.35 U/mL)을 혼합하여 평가하였다. 반응 혼합물은 37°C에서 10분간 배양한 후, 1.5 mM p-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드 100 μL을 기질로 첨가했습니다. 37°C에서 20분간 추가 배양한 후, 1 mL의 탄산나트륨(Na₂CO₃)을 첨가하여 반응을 종료했습니다. 흡광도는 400 nm14에서 측정되었습니다. 양성 대조군으로 아카보스가 사용되었습니다. 시험 화합물이 없는 반응 혼합물이 음성 대조군으로, 효소가 없는 반응 혼합물이 빈 대조군으로 사용되었다.
모든 실험은 3회로 수행되었으며, 결과는 표준편차(SD)± 평균으로 표현됩니다. α-글루코시다제 활성 억제율은 다음 식(1)14를 사용하여 계산되었습니다:
(1)
여기서 As는 시험 샘플 용액의 흡광도, Ab는 시약 블랭크(α-글루코시다제 제외)의 흡광도, A0은 음의 대조군(샘플 제외)의 흡광도입니다. IC50 값은 3.125에서 100 μM 사이의 화합물 농도를 시험하여 결정되었습니다. 비선형 회귀 분석은 표준 그래프 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.
우레아제 억제 분석법
우레아아제 억제 활성은 수정된 베르텔로(Berthelot) 방법을 사용하여 확인되었습니다. 반응 혼합물은 시험 샘플 용액 300 μL, 잭빈 우레아제 용액 200 μL, 25 mM 요소 200 μL로 구성되었습니다. 혼합물은 37°C의 물욕에서 30분간 배큐되었다. 배양 후에는 10 g/L 페놀과 50 g/L 니트로프루사이드 나트륨을 포함한 색소현상 용액 500 μL를 추가하고, 이어서 5% (v/v) 차아염소산나트륨과 5 g/L 수산화나트륨을 포함한 두 번째 용액 500 μL를 추가했다. 반응 혼합물을 추가로 15–30분 배큐하여 색 현상을 허용했습니다.
용액의 흡광도는 시약 블랭크15에 대해 625nm 거리에서 측정되었다. 티오레아는 양성 대조군으로, 검사 화합물이 없는 반응 혼합물을 음성 대조군으로, 우레아제 효소가 없는 혼합물을 블랭크로 사용했습니다. 모든 실험은 삼중분수(n = 3)로 수행되었으며, 결과는 표준편차(S.D.)± 평균 값으로 표현되었습니다. 억제 비율은 다음 수학 공식(2)15를 사용하여 계산되었습니다:
(2)
여기서 A0은 대조군(억제제 포함)의 흡광도이고 As는 시험 샘플(억제제 포함)의 흡광도입니다. 표준 데이터 플롯 소프트웨어를 사용하여 IC50 값을 결정하기 위한 그래프 작성과 비선형 회귀 분석이 수행되었습니다.
BSA 결합 분석법
소 혈청 알부민(BSA)과 합성 화합물 간의 결합 상호작용은 형광 소광 분광법을 사용하여 조사하였다. 10 μM BSA 스톡 용액을 20 mM 인산 완충제(pH 7.4)에 준비하였다. 각 적정 실험마다 BSA 용액 1.0 mL를 석영 큐벳 안에 2.0 mL의 인산염 완충제와 혼합했습니다. 용액은 시험 화합물 5 μL 알리코트(메탄올 함량 1.5 mM)를 연속적으로 첨가하여 증정하였습니다. 295 nm에서 여기된 후 300–400 nm 파장 범위에서 형광 방출 스펙트럼이 기록되었으며, 최대 방출은 약 336 nm에서 관측되었습니다. 형광 측정은 표준 형광 획득 소프트웨어가 장착된 형광분광광도계를 사용하여 수행되었으며, 여기 및 방출 슬릿 폭은 각각 10nm와 2.5nm로 설정되어 있습니다. 결합의 열역학적 매개변수, 즉 깁스 자유 에너지(ΔG), 엔탈피(ΔH), 엔트로피(ΔS)를 결정하기 위해 적정 실험은 298, 308, 313 K에서 반복되었다.
형광 소환 메커니즘을 조사하기 위해 실험 데이터는 Stern–Volmer 방정식(방정식 3)16을 사용하여 분석되었습니다:
(3)
여기서 F0과 F는 각각 소광기가 없을 때와 있을 때의 BSA의 형광 강도를 나타냅니다; Kq는 이분자 소광률 상수이며; τ0은 소광기가 없는 BSA의 평균 수명입니다; KSV는 스턴-볼머 담냉 상수이며; [Q]는 소광기의 농도입니다. 결합 상수(Kb)와 결합 부위의 수(n)는 이후 식(4)16에 따라 이중 로그를 그래프로 그리며 결정되었습니다:
(4)
또한, 결합 상호작용을 지배하는 표준 깁스 자유 에너지 변화(ΔG°), 표준 엔탈피 변화(ΔH°), 표준 엔트로피 변화(ΔS°)는 방정식 (5) 및 (6)17에 표현된 반트 호프와 깁스-헬름홀츠 관계를 사용하여 계산되었다:
ΔG∘ = -RT ln Kb (5)
(6)
여기서 R 은 보편 기체 상수이고 T 는 절대 온도(켈빈)입니다.
분자 도킹
모든 분자 모델링 및 도킹 시뮬레이션은 슈뢰딩거 스위트(Maestro 인터페이스)를 사용하여 수행되었으며, 도킹은 Glide 모듈을 통해 수행되었습니다. α-글루코시다제(PDB ID: 5NN8)와 우레아제(PDB ID: 4H9M)의 결정 구조는 RCSB 단백질 데이터 뱅크에서 추출하였습니다. 단백질 구조는 단백질 준비 마법사를 사용하여 공동결정화된 리간드, 물 분자, 비필수 이형원자를 제거하고, 누락된 잔기와 루프를 추가하며, 올바른 결합 순서를 할당하고, 극성 수소 원자를 추가하여 준비했습니다. 양성자 및 전동양체 상태는 Epik 모듈을 사용하여 생리적 pH(7.0 ± 2.0)에서 할당되었습니다. 준비된 단백질 구조는 이후 OPLS의 힘장을 이용해 제한 에너지 최소화를 거쳐 입체 충돌을 완화했다.
화합물 3, 4, 8(a–c), 9(d–f)의 2차원 구조와 참조 억제제인 아카르보스(acarbose)와 티오레아(thiourea)는 LigPrep 모듈을 사용하여 준비하였습니다. 생리학적 pH에서 결합 차수, 입체화학, 이온화 상태를 최적화하였고, OPLS 힘장을 이용해 3차원 리간드 구조를 에너지 최소화했습니다.
수용체 그리드는 수용체 그리드 생성 도구를 사용하여 생성되었으며, 그리드 박스는 활성 부위를 정의하기 위해 공동결정화된 천연 리간드를 중심으로 배치되었습니다. 격자 박스 크기는 두 단백질 모두 25 × 25 × 25 Å로 설정되었습니다. 우레아제 격자는 x = −38.76, y = −44.14, z = 66.88에 중심을 잡았으며, α-글루코시다아제 격자는 x = 21.14, y = −7.56, z = 24.37에 중심을 두고 있었습니다.
도킹 계산은 유연한 리간드 샘플링을 사용한 Glide의 초정밀 (XP) 모드를 사용하여 수행되었습니다. 각 리간드에 대해 여러 개의 결합 포즈를 생성하고, 글라이드 도킹 점수가 가장 낮은 포즈를 선택하여 추가 분석을 수행하였습니다. 도킹 프로토콜은 공결정화된 리간드를 각각의 수용체 그리드에 재도킹함으로써 검증되었습니다. 평균근 편차(RMSD) 값인 ≤2.0 Å는 도킹 프로토콜의 신뢰성과 재현성을 확인시켜 주었습니다.
도킹된 복합체의 결합 구조는 PyMOL(버전 3.1)을 사용해 시각화되었습니다. 수소 결합, 소수성 접촉, 정전기 상호작용 등 단백질-리간드 상호작용을 Discovery Studio Visualizer19를 사용해 분석하였습니다.
밀도 함수 이론(DFT) 분석
모든 밀도 함수 이론(DFT) 계산은 가우시안 09를 사용하여 수행되었으며, 최적화된 분자 기하학과 프론티어 분자 궤도는 가우스뷰 5를 사용해 시각화되었습니다. 합성된 트리아졸 및 옥사디아졸 기반 아세트아마이드 유도체인 8(a–c) 및 9(d–f)는 6-311+G(d,p) 기저 집합20과 함께 베케 3매개변수 Lee–Yang–Parr(B3LYP) 하이브리드 함수를 사용하여 수상 기하학 최적화를 거쳤다. 용매 효과는 도체와 유사한 편극 연속체 모델(CPCM)21을 사용하여 통합되었습니다. 이후 동일한 이론 수준에서 진동 주파수 계산이 수행되어, 모든 최적화된 구조가 허수 주파수가 없음을 나타내는 위치 에너지 곡면상의 진정한 국소 최소값에 해당함을 확인했습니다.
합성 화합물의 전자 전이와 운동학적 안정성을 이해하기 위해, 가장 높은 분자 점유 궤도(EHOMO)와 가장 낮은 비점유 분자 궤도(ELUMO)의 에너지를 계산하였습니다. 각 미생물에 대해 분자 분자 에너지 격차(ΔE = ELUMO - EHOMO)를 산출하여 화학적 반응성과 운동 안정성을 평가했으며, 에너지 격차가 작을수록 반응성이 높음을 나타냅니다.
또한, 전면 궤도 에너지로부터 다음과 같은 표준 연산 방정식22를 사용하여 전역 화학 반응성 기술자—화학 경도(η), 연약성(S), 화학 퍼텐셜(μ), 전기음성도(X), 친전기성 지수(w) 등이 계산되었습니다:
(7)
(8)
(9)
(10)
계산된 전자 특성과 전역 기술자를 시리즈 전반에 걸쳐 체계적으로 비교하여 관찰된 α-글루코시다제 및 우레아제 억제 프로필을 반영하는 구조-활성 관계(SAR)를 확립하였다.
또한, VESTA를 사용하여 분자 정전위(MESP) 맵을 생성하고 시각화하여 최적화된 분자 프레임워크 전반에 걸쳐 전하 분포를 매핑했습니다. MESP 표면은 전자가 부족하고 친핵적 공격이 선호되는 친전자성 영역과 전자가 풍부하고 친전자적 공격을 선호하는 친핵 영역을 식별할 수 있게 했습니다. 이 정전기 퍼텐셜 분포는 궁극적으로 분자 도킹 시뮬레이션에서 관찰된 수소 결합 및 정전기 접촉과 같은 특정 비공유 결합 상호작용과 상관관계가 형성되었습니다.
ADME 분석
합성된 트리아졸 및 옥사디아졸 기반 아세트아마이드 유도체인 8(a–c) 및 9(d–f)의 약물 유사성 및 생체의약학적 특성을 평가하기 위해, 실리코 내 흡수, 분포, 대사 및 배설(ADME) 분석이 수행되었습니다. 모든 합성 화합물의 단순화된 분자 입력 라인 입력 시스템(SMILES) 표현과 참조 억제제인 아카르보스(acarbose)와 티오레아(thiourea)는 분자 모델링 소프트웨어 패키지를 사용하여 생성되어 SwissADME 웹 서버23에 제출되었습니다.
계산된 물리화학적 매개변수에는 분자량(MW), 지질친화성(logP), 위상 극성 표면적(TPSA), 수소 결합 공여체 수(HBD), 수소 결합 수용체 수(HBA), 회전 결합 수(RB) 등이 포함되었습니다.
약물동학적 특성은 위장관(GI) 흡수와 혈액-뇌장벽(BBB) 투과성을 예측하여 평가하였습니다. 또한, 이 화합물들은 경구 생체이용률을 추정하기 위해 리핀스키의 5가지 규칙과 기타 확립된 약물 유사성 기준 준수 여부를 평가했습니다. 마지막으로, 합성 접근성(SA) 점수를 각 화합물별로 1(합성 용이함)에서 10(합성 매우 어려움)까지 계산했습니다. 합성 화합물의 예측된 ADME 및 약물 유사성 프로필을 참조 억제제와 비교하여 신약 개발의 선도 후보자로서의 잠재력을 평가하였습니다.
결과
합성 화합물의 화학 및 특성 분석
표적 트리아졸 및 옥사디아졸 기반 아세트아마이드 유도체는 그림 1에 표시된 합성 경로에 따라 합성되었습니다. 원하는 화합물은 흰색에서 노란색 결정질 고체로서 양호에서 우수한 수율(69%–87%)로 얻어졌습니다. 이들의 순도는 TLC, 녹는점 측정, 분광 분석을 통해 확인되었습니다. 합성된 화합물의 특성적 작용기를 확인하는 대표적인 NMR 스펙트럼은 그림 2에 나와 있습니다. 스펙트럼은 아마이드 카보닐(C=O), N–H, C=N, C–S, 방향족 C–H 작용기와 같은 예상 흡수 밴드를 보여, 표적 유도체의 성공적인 합성을 지원하였습니다.
대표적인 1H NMR 스펙트럼은 그림 3에 제시되어 있습니다. 스펙트럼은 아마이드 NH 양성자, 방향족 양성자, 메틸렌 링커, 메틸 치환기에서 특징적인 공명을 보여주었으며, 이는 제안된 구조와 일치하였습니다. 대표적인 13C NMR 스펙트럼은 그림 4에 나타났습니다. 관측된 탄소 공명은 합성 유도체에 기대되는 카보닐, 방향족, 메틸렌, 헤테로고리 탄소의 존재를 확인시켜 주었습니다. 대표적인 화합물로는 8a(87% 수율), 8c(약 80%–85% 수율), 9e(69% 수율)가 있습니다. 모든 합성 화합물에 대한 완전한 물리화학적 특성화 데이터와 NMR 스펙트럼은 보충 파일 1에 제공됩니다.
α-글루코시다제 억제
합성된 화합물들의 α-글루코시다제 억제 활성은 표 1에 요약되어 있습니다. 모든 화합물은 α-글루코시다아제를 다양한 정도로 억제했습니다. 화합물 9e가 가장 높은 억제 활성을 보였으며, IC50 수치는 0.41 μM± 27.29였고, 그 다음으로 화합물 8a(33.15 ± 0.07 μM)와 화합물 8c(40.93 ± 0.59 μM)가 뒤를 이었습니다. 화합물 8b, 9d, 9f는 상대적으로 약한 억제 효과를 보였으며, IC50 값은 각각 0.18 μM ± 108.19, 0.03 μM ± 108.10, 0.25 μM ± 94.44였다. 화합물 9e는 기준 억제제 아카르보스보다 더 높은 억제 효능을 보였으며(IC50 = 38.25 ± 0.12 μM), 화합물 8a도 비슷한 활성을 보였다. 농도 의존적 억제 프로파일은 그림 5에 제시되어 있습니다.
우레아제 억제 잠재력
합성된 화합물들의 우레아아제 억제 활성은 표 1에 요약되어 있습니다. 화합물 8c가 가장 강한 우레아제(UREAS) 억제를 보였으며, 1.06 μM± IC50 값 6.14를 기록했고, 그 다음으로 화합물 9e(8.14 ± 0.71 μM)와 8a(12.25 ± 0.42 μM)가 뒤를 이었습니다. 이 화합물들은 기준 억제제인 티우레아보다 더 높은 억제 활성을 보였다(IC50 = 21.25 ± 0.15 μM). 화합물 8b, 9d, 9f는 덜 활성적이었으며, IC50 값은 82.15에서 103.05 μM 사이였다. 해당 농도 의존 억제 곡선은 그림 5에 나타난다.
BSA 바인딩
형광 소광 매개변수는 표 2에 요약되어 있습니다. 화합물 8a와 9e의 경우, 스턴-볼머 상수(Ksv)는 온도가 상승할수록 증가한 반면, 소광 상수(Kq)는 최대 확산 제어 한계(2 ×10 10 M ⁻1 s⁻1)를 초과하여 혼합된 정적 및 동적 소냉 메커니즘을 나타냈다. 반면, 화합물 8c는 온도가 상승할수록 Ksv 값이 감소하는 반면, Kq 값은 확산 제어 한계 이상으로 유지되어 주로 정적 소광을 시사했습니다. 열역학 분석 결과 화합물 8a에 대해 음의 ΔH 및 ΔS 값이 나타나, 결합 과정에서 수소 결합과 반데르발스 상호작용이 우세함을 시사합니다. 화합물 8c와 9e에서 얻은 양성 ΔH 및 ΔS 값은 소수성 상호작용이 주요 동인임을 나타냈다. 298 K에서 수행된 결합 친화도 분석에서 화합물 8a가 가장 높은 결합 상수(Kb = 3.92 × 105 M⁻1)를 보였고, 그 다음으로 화합물 8c(1.54 ×10 4 M⁻1)와 화합물 9e(6.78 × 101M⁻1)가 뒤를 이었습니다. 형광 스펙트럼과 스턴-볼머 플롯은 그림 6, 그림 7, 그림 8, 그림 9, 그림 10, 그림 11에 나와 있습니다.
도킹 분석
분자 도킹 결과는 표 3에 요약되어 있습니다. 도킹 프로토콜은 공결정화된 리간드를 각각의 결합 부위에 재도킹하여 RMSD 값≤2.0 Å)을 얻어 도킹 프로토콜의 신뢰성을 확인함으로써 검증되었습니다(보충 그림 1).
생물학적 활성과 도킹 점수를 바탕으로 화합물 8a, 8c, 9e가 상세 상호작용 분석을 위해 선정되었습니다. α-글루코시다제 활성 부위 내 대표적인 도킹 포즈는 그림 12A–D에 제시되어 있습니다. 화합물 8a가 가장 높은 결합 점수(−7.165 kcal/mol)를 보였고, 그 다음으로 화합물 8c(−6.80 kcal/mol)와 9e가 뒤를 이었습니다. 이 화합물들은 D282, D404, D616, R600, S523, H674 등 주요 촉매 잔기와 수소 결합 상호작용을 확립했습니다.
우레아제 활성 부위 내 대표적인 도킹 자세는 그림 12E–H에 나와 있습니다. 화합물 8c는 A636, Q635, R439와 수소 결합을 형성했고, 화합물 9e는 E493, D494, H593, R609, A636과 광범위한 수소 결합 네트워크를 형성했습니다. 화합물 8a는 촉매 부위 잔기와도 유리한 상호작용을 보였습니다. 전반적으로 도킹 분석은 실험적 억제 결과를 뒷받침하였다.
DFT 연구
계산된 양자 화학 기술자는 표 4에 요약되어 있습니다. 참조 화합물의 프런티어 분자 오비탈 분포와 분자 정전기 퍼텐셜 맵은 그림 13에 제시되어 있으며, 합성된 화합물에 대한 해당 분석은 그림 14 와 그림 15에 나와 있습니다.
합성 화합물 중 9e는 가장 작은 HOMO–LUMO 에너지 격차(0.14302 a.u.)를 보였고, 그 다음으로 8c(0.14831 a.u.)와 8a(0.15788 a.u.)가 뒤를 이었습니다. 분자 정전기 퍼텐셜 맵은 분자 간 상호작용에 기여할 수 있는 전자 풍부 및 전자 결핍 영역을 확인했습니다. 이온화 퍼텐셜, 전자 친화도, 전자음성도, 화학 퍼텐셜, 경도, 연도, 친전자성 지수 등 계산된 전역 반응성 기술자들은 표 4에 나열되어 있습니다. 9계열 화합물은 대응하는 8계열 유도체보다 HOMO–LUMO 갭이 더 낮고 친전기성도가 높았습니다.
ADME 분석
예측된 약동학적 특성은 표 5에 요약되어 있습니다. 모든 합성 화합물은 주요 약물 유사성 기준을 충족했습니다. 9계열 유도체는 리핀스키 위반이 없었으나, 8계열의 각 화합물은 각각 한 가지 위반을 보였다. 모든 화합물은 높은 위장 흡수율, 혈액-뇌장벽 투과성 없음, 수용자 수(수소결합 공여자 및 수용자 수)를 가질 것으로 예측되었습니다. 생체이용률 점수는 일관되게 0.55로 예측되었습니다. 합성 접근성 점수는 5.70에서 6.39 사이로, 중간 정도의 합성 복잡성을 나타냈습니다.
데이터 가용성:
이 연구 중 생성된 데이터셋과 지원 자료는 Zenodo 저장소에 보관되었으며 https://doi.org/10.5281/zenodo.21238952 에서 공개되어 있습니다.
그림 1: 트리아졸 및 옥사디아졸 기반 아세트아마이드 유도체 합성 경로. 중간체 및 최종 화합물 8(a–c) 및 9(d–f)의 합성을 보여주는 반응 체계. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 2: 화합물 8a의 NMR 스펙트럼. (A) 화합물 8a의 1H NMR 스펙트럼. (B) 화합물 8a의 13C NMR 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.
그림 3: 화합물 8c의 NMR 스펙트럼. (A) 화합물 8c의 1HNMR 스펙트럼. (B) 화합물 8c의 13CNMR 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.
그림 4: 화합물 9e의 NMR 스펙트럼. (A) 화합물 9e의 1H NMR 스펙트럼. (B) 화합물 9e의 13C NMR 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 5: 합성된 화합물의 α-글루코시다제 및 우레아아제에 대한 억제 활성. (A) 참조 억제제인 아카보스와 티오레아와 비교하여 화합물 3, 4, 8(a–c), 9(d–f)에 의한 α-글루코시다제 및 우레아제의 억제 비율. (B) 동일한 화합물의 IC50 값이 α-글루코시다제 및 우레아제에 대해 검사됩니다. 데이터는 평균 ± SD(n = 3)로 제시됩니다. 통계적 유의성은 해당 참조 억제제에 대해 측정되었습니다(p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001, p < 0.0001; ns = 유의하지 않음). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 6: 화합물 8a에 의한 소 혈청 알부민(BSA)의 형광 소굴 소환 분석. (A) 298 K에서 화합물 8a를 점진적으로 첨가한 후 BSA(3.33 × 10⁻6 M)의 형광 방출 스펙트럼. (B) 298, 308, 313 K에서 얻은 스턴-볼머 플롯. (C) 로그 로그[(F₀ − F)/F]와 로그 Q의 이중 로그 그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
그림 7: 화합물 8b에 의한 소 혈청 알부민(BSA)의 형광 소굴 소환 분석. (A) 298 K에서 화합물 8b를 점진적으로 첨가한 후 BSA(3.33 × 10⁻6 M)의 형광 방출 스펙트럼. (B) 298, 308, 313 K에서 얻은 스턴-볼머 플롯. (C) 로그 로그[(F₀ − F)/F]와 로그 Q의 이중 로그 그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
그림 8: 화합물 8c에 의한 소 혈청 알부민(BSA)의 형광 소멸 분석. (A) 298 K에서 화합물 8c를 점진적으로 첨가한 후 BSA(3.33 × 10⁻6 M)의 형광 방출 스펙트럼. (B) 298, 308, 313 K에서 얻은 스턴-볼머 플롯. (C) 로그 로그[(F₀ − F)/F]와 로그 Q의 이중 로그 그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
그림 9: 화합물 9d에 의한 소 혈청 알부민(BSA)의 형광 소멸 분석. (A) 298 K에서 9d 화합물을 점진적으로 첨가한 후 BSA(3.33 × 10⁻6 M)의 형광 방출 스펙트럼. (B) 298, 308, 313 K에서 얻은 스턴-볼머 플롯. (C) 로그 Q의 로그 [(F₀ − F)/F]의 이중 로그 그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
그림 10: 화합물 9e에 의한 소 혈청 알부민(BSA)의 형광 소멸 분석. (A) 298 K에서 화합물 9e를 점진적으로 첨가한 후 BSA(3.33 × 10⁻6 M)의 형광 방출 스펙트럼. (B) 298, 308, 313 K에서 얻은 스턴-볼머 플롯. (C) 로그 로그[(F₀ − F)/F]와 로그 Q의 이중 로그 그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
그림 11: 화합물 9f에 의한 소 혈청 알부민(BSA)의 형광 소멸 분석. (A) 298 K에서 화합물 9f를 점진적으로 첨가한 후 BSA(3.33 × 10⁻6 M)의 형광 방출 스펙트럼. (B) 298, 308, 313 K에서 얻은 스턴-볼머 플롯. (C) 로그 로그[(F₀ − F)/F]와 로그 Q의 이중 로그 그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
그림 12: α-글루코시다제 및 우레아제 활성 부위 내 참조 억제제 및 선택된 합성 화합물의 결합 모드. (A) α-글루코시다제 활성 부위 내 아카르보스의 결합 자세. (B) 화합물 8a의 결합 자세. (C) 화합물 8c의 결합 자세. (D) 화합물 9e의 결합 자세. (E) 우레아제 활성 부위 내 티우레아의 결합 자세. (F) 화합물 8a의 결합 자세. (G) 화합물 8c의 결합 자세. (H) 화합물 9e의 결합 자세. 수소 결합은 노란색 점선으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 13: 참조 억제제의 프론티어 분자 오비탈 및 분자 정전위(MEP) 지도. (A) 아카르보스. (B) 티우레아. 가장 높은 점유 분자 궤도(HOMO), 가장 낮은 비점유 분자 궤도(LUMO), 그리고 MEP 표면이 나타난다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 14: 트리아졸 유도체의 프론티어 분자 궤도 및 분자 정전위(MEP) 지도. (A) 화합물 8a. (B) 화합물 8b. (C) 화합물 8c. 각 화합물에 대해 HOMO, LUMO, MEP 표면이 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 15: 옥사디아졸 유도체의 프론티어 분자 궤도 및 분자 정전위(MEP) 지도. (A) 화합물 9d. (B) 화합물 9e. (C) 화합물 9f. 각 화합물에 대해 HOMO, LUMO, MEP 표면이 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
| 코드 | 우레아스 | α-글루코시다제 | ||
| 0.5 mM에서의 억제율(%) | IC50 (μM) | 0.5 mM에서의 억제율(%) | IC50 (μM) | |
| 3 | 67.54 ± 1.03 | 41.51 ± 0.01 | 63.09 ± 0.25 | 79.12 ± 0.43 |
| 4 | 62.51 ± 0.42 | 45.14 ± 0.14 | 65.26 ± 0.55 | 70.28 ± 0.42 |
| 8a | 95.22 ± 1.55 | 12.25 ± 0.42 | 95.01 ± 0.57 | 33.15±0.07 |
| 8b | 62.64 ± 1.01 | 82.15 ±1.48 | 38.02 ± 1.71 | 108.19 ± 0.18 |
| 8c | 99.39 ± 0.27 | 06.14 ± 1.06 | 90.51 ± 0.01 | 40.93 ± 0.59 |
| 9펜스 | 47.51 ± 1.01 | 103.05 ± 0.54 | 39.08 ± 0.25 | 108.10 ± 0.03 |
| 9e | 98.57 ± 0.04 | 08.14 ± 0.71 | 91.55 ± 0.34 | 27.29 ± 0.41 |
| 9년 | 58.07 ± 1.68 | 85.15 ± 0.12 | 43.15 ± 0.42 | 94.44 ± 0.25 |
| 티오레아 | 96.24 ± 0.16 | 21.25 ± 0.15 | - | - |
| 아카르보스 | - | - | 92.23 ± 0.14 | 38.25 ± 0.12 |
표 1: 합성 화합물의 α-글루코시다아제 및 우레아제에 대한 억제 활성. IC50 값과 8(a–c) 및 9(d–f) 화합물의 억제 비율을 기준 억제제인 아카르보스 및 티오레아와 비교하였다. 데이터는 평균 ± SD(n = 3)로 제시됩니다. 약어: IC50 = 최대 억제 농도의 절반; SD = 표준편차.
| 복합 | 298K | 308K | 313K | ||||||
| N | Kb (M-1) | ΔG | ΔH | ΔS (J/mol. K) | N | Kb (M-1) | N | Kb (M-1) | |
| (kJ/mol) | (kJ/mol) | ||||||||
| 8a | 1.28 | 3.92 x105 | -32.55 | -218.28 | -623.24 | 1.12 | 6.49 x104 | 0.85 | 4.33 x103 |
| 8b | 1.31 | 6.49 x105 | -34.24 | -306.6 | -913.96 | 1.1 | 6.95 x104 | 0.66 | 1.07 x103 |
| 9펜스 | 1.47 | 2.41 x106 | -36.32 | -204.1 | -563.01 | 1.17 | 1.44 x105 | 1.04 | 4.84 x104 |
| 9e | 0.62 | 6.78 x101 | -10.32 | 243.16 | 850.61 | 0.81 | 1.32 x103 | 0.91 | 7.93 x103 |
| 9년 | 1.11 | 4.69 x104 | -26.35 | 178.13 | 686.21 | 1.26 | 2.99 x105 | 1.41 | 1.67 x106 |
| 8c | 0.91 | 1.54 x104 | -23.98 | 341.31 | 1225.82 | 1.36 | 1.53 x105 | 1.6 | 1.10 x107 |
표 2: 선택된 화합물과 소 혈청 알부민(BSA)의 상호작용에 대한 결합 상수 및 열역학적 매개변수. 결합 상수(Kb), 결합 부위 수(n), 스턴-볼머 소환 상수(Ksv), 이중분자 소환율 상수(Kq), 깁스 자유 에너지(ΔG), 엔탈피 변화(ΔH), 엔트로피 변화(ΔS)는 298, 308, 313 K에서 결정되었습니다. 약어: BSA = 소 혈청 알부민; Kb = 결합 상수; n = 결합 부위 수; Ksv = 스턴-볼머 담냉 상수; Kq = 이분자 소광률 상수; ΔG = 깁스 자유 에너지; ΔH = 엔탈피 변화; ΔS = 엔트로피 변화.
| 복합물 | 알파 글루코시다제 (kcal/mol) | 우레아제(kcal/mol) |
| 아카르보스 | −6.90 | - |
| 티오레아 | - | −5.80 |
| 3 | −4.35 | −4.50 |
| 4 | −4.10 | −4시 30분 |
| 8a | −7.165 | −7.624 |
| 8b | −5.20 | −5.45 |
| 8c | −6.80 | −7.10 |
| 9펜스 | −5.10 | −5.35 |
| 9e | −6.70 | −7.30 |
| 9년 | −5.00 | −5.25 |
표 3: 합성 화합물의 α-글루코시다제 및 우레아제에 대한 분자 결합 점수. 화합물 8(a–c) 및 9(d–f)의 도킹 점수(kcal/mol), 참조 억제제 아카르보스, 티오레아, α-글루코시다제 및 우레아제에 대한 도킹 점수(kcal/mol)를 측정합니다. 약어: kcal/mol = 킬로칼로리당 몰.
| 리간드 | 쌍극자 모멘트 (데바이) | 호모 | 루모 | 에너지 | 이온화 | 전자 친화도(eV) | 일렉트로- 음의 χ (eV) | 일렉트로- 화학 퍼텐셜 μ (eV) | 경도 η (eV) | 부드러움 | 일렉트로- 호의성 |
| (아우리) | (아우리) | 갭 (ΔE갭) | 퍼텐셜 (eV) | S (eV) | ω (eV) | ||||||
| 아카르보스 | 8.1124 | -0.1597 | -0.0336 | 0.12612 | 4.345 | 0.913 | 2.629 | -2.629 | 1.716 | 0.291 | 2.015 |
| 티오레아 | 7.619 | -0.2193 | -0.0179 | 0.20135 | 5.967 | 0.488 | 3.228 | -3.228 | 2.739 | 0.182 | 1.903 |
| 8a | 8.8025 | -0.2044 | -0.0466 | 0.15788 | 5.566 | 1.266 | 3.416 | -3.416 | 2.15 | 0.233 | 2.71 |
| 8b | 8.2451 | -0.2033 | -0.0467 | 0.15659 | 5.534 | 1.27 | 3.402 | -3.402 | 2.132 | 0.234 | 2.72 |
| 8c | 8.319 | -0.2039 | -0.0555 | 0.14831 | 5.55 | 1.511 | 3.53 | -3.53 | 2.02 | 0.247 | 3.08 |
| 9펜스 | 3.8264 | -0.2065 | -0.0621 | 0.14432 | 5.619 | 1.691 | 3.655 | -3.655 | 1.964 | 0.255 | 3.4 |
| 9e | 4.0969 | -0.2052 | -0.0621 | 0.14302 | 5.584 | 1.691 | 3.637 | -3.637 | 1.947 | 0.257 | 3.4 |
| 9년 | 4.298 | -0.2059 | -0.0627 | 0.14324 | 5.604 | 1.704 | 3.654 | -3.654 | 1.95 | 0.256 | 3.42 |
표 4: 합성된 화합물의 밀도 기능 이론(DFT) 기술자. 8(a–c) 및 9(d–f) 화합물의 양자 화학 기술자와 기준 화합물인 아카르보스와 티오레아, HOMO 및 LUMO 에너지, ΔE, 이온화 퍼텐셜(IP), 전자 친화도(EA), 전기음성도(χ), 화학 퍼텐셜(μ), 화학 경도(η), 화학적 연약도(S), 쌍극자 모멘트(D), 친전자도 지수(ω)를 포함합니다. 약어: DFT = 밀도 함수 이론; HOMO = 가장 높은 분자 점유 궤도; LUMO = 가장 낮은 비점유 분자 궤도; ΔE = 호모-루모 에너지 격차; IP = 이온화 퍼텐셜; EA = 전자 친화도; χ = 전기음성도; μ = 화학 퍼텐셜; η = 화학적 경도; S = 화학적 연약성; D = 쌍극자 모멘트; ω = 친전성 지수.
| 복합 | 하 | RB | HBA | HBD | TPSA (Ų) | 아이로그프 | 합의 LogP | 위장 흡수 | BBB 투과성 | 리핀스키 위반 | 생체이용률 점수 | SA 점수 |
| 8a | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.86 | 4.41 | 4.71 | 높게 | 아니 | 1 | 0.55 | 6.32 |
| 8b | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.06 | 4.41 | 4.62 | 높게 | 아니 | 1 | 0.55 | 6.34 |
| 8c | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.26 | 4.41 | 4.11 | 높게 | 아니 | 1 | 0.55 | 6.39 |
| 9펜스 | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.95 | 3.08 | 2.75 | 높게 | 아니 | 0 | 0.55 | 5.71 |
| 9e | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.82 | 3.08 | 2.27 | 높게 | 아니 | 0 | 0.55 | 5.7 |
| 9년 | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.85 | 3.08 | 2.77 | 높게 | 아니 | 0 | 0.55 | 5.73 |
표 5: 합성 화합물의 예측 흡수, 분포, 대사 및 배설(ADME) 특성. SwissADME 웹 서버를 사용하여 8(a–c) 및 9(d–f) 화합물의 물리화학적, 약동학적, 약물 유사성 예측이 생성되었습니다. 약어: ADME = 흡수, 분포, 대사, 배설; MW = 분자량; LogP = 옥타놀/물 분배 계수; TPSA = 위상 극지 표면적; RB = 회전 가능한 결합; HBA = 수소 결합 수용체; HBD = 수소 결합 공여자; GI = 위장관; BBB = 혈액-뇌 장벽; SA = 합성 접근성.
보조 그림 1: 천연 리간드의 재도킹을 통한 도킹 검증. (A) 공동결정화된 리간드(참조 자세)와 재결합된 아카르보스를 α-글루코시다아제(PDB ID: 5NN8) 활성 부위에 중복하여 결합 구조의 밀접한 정렬을 입증함. (B) 활성 부위 내 티우레아의 결합 포즈(PDB ID: 4H9M)는 우레아제 시스템의 도킹 검증에 사용되어 촉매 포켓 내 주요 상호작용 보존을 보여준다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보충 파일 1: 화합물 3, 4, 8(a–c), 9(d–f)의 물리화학적 특성화 데이터와 13CNMR 스펙트럼 완성.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
토론
이 연구는 트리아졸 및 옥사디아졸 기반 아세트아마이드 유도체들을 합성하고 이들의 구조적, 생물학적, 계산적, 약물동학적 특성을 평가하였습니다. HRMS에 의한 분광학적 특성, 원소 분석, 1H NMR, 13C NMR을 통해 표적 분자의 성공적인 합성이 확인되었습니다. 관찰된 화학적 변화, 결합 패턴, 탄소 공명은 제안된 구조와 일치했습니다. 특징적인 아미드 NH 신호, 메틸렌 공명, 방향족 양성자 분포, 4차 탄소 신호는 치환된 아세트아마이드 모에이트가 트리아졸과 옥사디아졸 스캐폴드에 성공적으로 통합되었음을 확인했다. 이러한 유도체에서 일반적으로 높은 합성 수율을 얻은 것은 합성 경로의 효율성을 입증하며, 이러한 이종고리형 프레임워크가 추가 구조 변형에 적합함을 시사합니다.
치환기 패턴이 우레아아제 억제 활성에 명확한 영향을 미치는 것이 관찰되었습니다. 2,6-디메틸 치환기를 가진 화합물 8c가 가장 높은 우레아아제 억제 활성을 보였고, 그 다음으로 화합물 8a(2,3-디메틸)와 9e(2.5-디메틸)가 이들 분자를 유망한 선도 후보로 확인했습니다. α-글루코시다제에 대해서도 유사한 경향이 관찰되었으며, 9e 화합물이 가장 강한 억제 효과를 보였고, 8a와 8c 화합물도 상당한 활성을 보였습니다. 화합물 8a와 8c는 방향족 고리 내 메틸 치환기의 위치에서만 차이가 있는 반면, 화합물 9e는 치환 패턴과 헤테로고리 스캐폴드 모두에서 차이가 있기 때문에, 이 발견들은 메틸치환 패턴과 스캐폴드 구조가 이 계열 내에서 생물학적 활성에 기여함을 시사한다. 화합물 8c의 우수한 활성은 효소 활성 부위 내에서 더 유리한 방향성을 반영할 수 있으며, 화합물 9e의 강한 활성은 옥사디아졸 스캐폴드와 2,5-디메틸 치환 패턴의 추가적인 기여를 시사합니다. 이 관찰은 페닐 치환으로 인한 입체 효과가 트리아졸 및 옥사디아졸 기반 효소 억제제의 활성 부위 결합에 영향을 미칠 수 있다는 이전 보고와 일치합니다 24,25,26,27. 그럼에도 불구하고, 명확한 구조-활성 관계를 확립하려면 더 많은 영역 이성질체 유도체의 평가가 필요합니다.
가장 활성적인 화합물과 소 혈청 알부민(BSA) 간의 상호작용을 형광 소결 및 열역학 분석을 통해 8a와 9e 화합물은 혼합 정적/동적 소결 메커니즘을 따르는 반면, 8c 화합물은 주로 정적 소결 작용을 보였다. 열역학적 매개변수는 화합물 8a의 결합이 주로 수소 결합과 반데르발스 상호작용에 의해 촉진되는 반면, 소수성 상호작용이 화합물 8c와 9e 결합에서 우세함을 나타냈다. 화합물 8a는 BSA에 가장 강한 친화력을 보였으며, 결합 상수는 3.92 × 105 M⁻1 이고, 결합의 음의 깁스 자유 에너지를 보였다. 이 결과들은 안정적인 단백질-리간드 복합체 형성을 시사하며, 생리적 조건에서 알부민 매개 수송 가능성을 시사합니다.
이 실험 결과는 분자 결합 연구로 더욱 뒷받침되었으며, 8a, 8c, 9e 화합물이 α-글루코시다제와 우레아아제의 활성 부위 내에서 유리한 결합 구조를 채택했다. 이 화합물들은 α-글루코시다아제에서 D282, A284, D404, R600, D616, H674와 우레아제에서 A636, Q635, R439, A440 등 주요 잔기와 수소 결합을 형성했습니다. 유사한 상호작용이 구조적으로 관련된 효소 억제제에 대해서도 이전에 보고된 바 있다28,29. 결합 점수와 실험 활성 간 가장 큰 차이는 화합물 8a에서 관찰되었으며, 8a는 α-글루코시다제에 대해 가장 유리한 도킹 점수(−7.165 kcal/mol)를 보였고, 9e는 시험관 내 억제 효능이 가장 높았다(IC50 = 27.29 μM). 이 차이는 도킹 점수가 비교적 강단한 단백질 구조 내 리간드 결합을 추정하며, 리간드 용해도, 구조 유연성, 용해, 단백질 역학 또는 실험적으로 결정된 IC50 값에 영향을 미치는 용액상 효과와 같은 요인을 고려하지 않기 때문에 예상 밖에 없는 일입니다. 따라서 예측된 결합 친화도와 측정된 생물학적 활성의 차이는 계산 결과 간의 모순이 아니라 분자 결합의 한계를 나타내는 인식된 한계를 나타냅니다. 전반적으로 도킹 및 효소 억제 데이터는 8a, 8c, 9e 화합물이 이 시리즈에서 가장 유망한 유도체임을 일관되게 확인한다.
가장 활성 화합물의 전자 특성은 프론티어 분자 궤도(FMO) 및 분자 정전기 퍼텐셜(MEP) 분석을 통해 추가로 조사되었습니다. HOMO–LUMO 에너지 갭이 낮은 화합물은 일반적으로 더 큰 전자 반응성을 보였으며, 이는 구조적으로 관련된 트리아졸 및 옥사디아졸 기반 유도체에 대한 이전 DFT 연구와 일치한다30. 합성된 화합물 중 8a, 8c, 9e는 비교적 작은 HOMO–LUMO 에너지 간격을 보였으며, 이는 유리한 전자 전달 특성을 나타냈다. 이들의 MEP 지도는 전자 풍부 및 전자 결핍 영역을 뚜렷하게 드러냈으며, 8c와 9e 화합물은 효소 상호작용과 생물학적 활성에 기여할 수 있는 특히 뚜렷한 친핵 영역을 보였다. 전역 반응성 기술자는 실험 및 계산 결과를 더욱 뒷받침했다. 화합물 9e는 이온화 전위, 전자 친화도, 연도, 친전자성 지수가 유리한 조합을 보였고, 화합물 8a와 8c는 강한 억제 활성과 일치하는 비교적 높은 연기 값을 보였다. 특히 9e호 화합물에서 관찰되는 더 높은 친전자성과 연약성은 촉매 잔기와의 강한 상호작용과 생물학적 활성의 증진에 기여할 수 있습니다.
실리코 화합물 8(a–c) 및 9(d–f)의 ADME 프로파일링은 높은 위장 흡수, 허용 가능한 약물 유사성, 만족스러운 경구 생체이용률 등 유리한 약동학적 특성을 예측하였습니다. 평가된 매개변수 내에서 주요 ADME 부책임은 확인되지 않았습니다. 시험 관 내 생물학적 데이터, BSA 결합 분석, 분자 도킹, DFT 계산, 그리고 실리코 내 ADME 예측은 이러한 트리아졸 및 옥사디아졸 기반 아세트아마이드 유도체를 이중 우레아제와 α-글루코시다아제 억제제로서 계속 연구할 수 있도록 지원합니다.
이 결과들을 종합해 보면, 8a, 8c, 9e 화합물이 우레아제와 α-글루코시다제를 표적으로 하는 트리아졸 및 옥사디아졸 기반 아세트아마이드 유도체 개발의 유망한 후보 물질로 확인되었습니다. 분광, 생물학, BSA 결합, 분자 도킹, DFT, ADME 데이터를 결합하여 향후 연구를 위한 강력한 토대를 제공합니다. 추가 연구에는 단백질-리간드 안정성을 시간에 따른 평가를 위한 분자 동역학 시뮬레이션, 억제 메커니즘을 규명하기 위한 효소 동역학 연구, 그리고 BSA 결합 분석을 나머지 유도체로 확장하는 것이 포함되어야 합니다. 마지막으로, 유망한 시험관 및 실리코 내 결과를 검증하고 이 화합물 시리즈의 치료 잠재력을 더욱 평가하기 위해 생체 내 연구가 필요합니다.
공개 사항
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다
감사의 글
저자는 사우디아라비아 알 바하 대학교 임상약학부에도 감사의 뜻을 전합니다.
재료
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