쥐 폐 내 세포 침투 펩타이드를 통한 전도 효율 및 세포 표적 평가

요약

이 프로토콜은 폐 표적 펩타이드인 순환화된 R11A(cR11A)를 사용하여 세포 침투 펩타이드의 전도 효율과 세포 특이성을 평가하는 통합 워크플로우를 설명합니다. 예를 들어 KAPWHLSSQYSAT). 이 워크플로우는 쌍분획 FACS, 단세포 RNA 시퀀싱, AT2 리포터 마우스에서의 유세포 분석, 공초점 z-스택 이미징을 결합하여 AT2 관련 펩타이드 표적 결합을 확인합니다.

초록

세포 침투 펩타이드(CPP)는 세포막을 통과하고 트랜스펙션 시약 없이도 고분자 화물을 전달할 수 있는 짧은 펩타이드(5–30개의 아미노산)입니다. 하지만 생체 내에서 정의하는 데는 세포 유형 수준에서의 검증이 필요합니다. 생쥐에서 후안도 정맥 주사 후 폐포 상피 II형(AT2) 세포 내에서 Cy5.5 표지된 고리화된 CPP(cR11A)의 전이 효율을 평가하기 위한 통합 워크플로우를 제시합니다. 주사 후 15분 또는 60분 후에 폐를 채취하여, 쌍분획형 형광활성화세포 분류(FACS)를 포함한 보완적 측정값을 사용해 Cy5.5⁺ 및 Cy5.5⁻ 폐 단세포 현탁액을 분리하고, 이후 Sftpc-CreERT2^(+/−)에서 폐 단세포 단세포 단일세포 시퀀싱과 단세포 시퀀싱을 포함한 보완 측정값을 사용해 분석했습니다; LSL-GFP^(+/−) AT2 리포터 마우스를 이용해 GFP⁺/Cy5.5⁺ 이벤트를 정량하고, 폐 냉동절개를 공초점 z-스택 영상으로 사용하여 cR11A-Cy5.5와 AT2 관련 신호의 공동 위치성을 확인했습니다. 이 프로토콜은 여러 상호보완적 측정값을 사용하여 세포형 상호작용에 대한 일치 증거를 제공하며, 다양한 표적 기관에 대한 수정과 함께 CPPs의 세포 특이적 표적 평가를 재현 가능한 틀로 제공합니다.

서론

세포 침투 펩타이드(CPP)는 세포막을 통과하여 전접 시약 없이도 완전하고 기능적인 형태로 고분자 화물을 세포 내 전달을 촉진하는 5–30개의 아미노산 펩타이드^입니다. 시험관 내 및 생체 내 파지 디스플레이 조합 방법론을 사용한 이전 연구에서는 심근세포가 단 5분 ^3,4 이내에 특이적으로 흡수하는 12-아미노산 심장 표적 펩타이드(APWHLSSQYSRT)가 확인되었습니다. 전이의 기전을 조사하기 위해 알라닌 스캔이 실시되었고, 그 결과 예상치 못하게 생체 내에서 폐 농축을 보이는 S7A와 R11A(APWHLSSQYSAT) 두 가지 변이체가 발견되었습니다. 따라서 이들은 폐 표적화 펩타이드(LTPs^)라고 불렸습니다. 더 나아가, N-말단 라이신 첨가와 머리에서 꼬리까지의 고리화 과정은 선형 대응⁵에 비해 혈청 안정성이 크게 개선되고 세포 내 흡수가 현저히 향상된 순환형 R11A(cR11A)를 생성했다.

LTP는 폐포 상피 II형(AT2) 세포를 포함한 원위 폐 상피 집단에 정밀하게 치료제를 전달할 잠재력을 가지고 있습니다. 이 세포들은 계면활성제 항상성 유지에 매우 중요하며, 폐포 재생의 전구적 역할을 합니다^. 그러나 LTP 개발에서 가장 큰 도전 과제는 생체 내 세포 선택성을 엄격히 평가하는 것입니다. 장기 수준의 생물분포만으로는 진정한 세포 전도와 혈관 신호, 세포 외 저류, 식세포 제거를 구분할 수 없으므로, 단세포 해상도 측정과 보완해야 합니다^. 이 한계를 해결하기 위해 이 워크플로우는 단일 세포 전사체 할당, 리포터 기반 유세포분석, 공초점 Z-스택 영상을 통합하여 장기 수준 형광 또는 생체 분포 측정을 넘어 세포 유형 수준의 펩타이드 교동 증거를 생성합니다 ^8,9.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 원위폐에서 Cy5.5 표지된 cR11A의 생체 내 전이 효율과 세포 특이성을 검증하기 위한 재현 가능하고 다중 판독 워크플로우를 제공하는 것이며, 특히 후방안과 주입 후 AT2 세포에 중점을 둡니다. 이 프로토콜은 페프타이드 관련 세포 정체성을 상보적이고 독립적인 판독을 통해 정의하며, 여기에는 쌍분획형 형광활성화 세포 분류(FACS)(Cy5.5⁺ 대 Cy5.5⁻)와 이어서 단일 세포 RNA 시퀀싱을 통해 펩타이드 관련 집단을 지도화하고, AT2 보고자 폐에서 유세포분석을 통한 정량적 흡수 평가, cR11A-Cy5.5와 AT2 관련 신호의 공동 위치를 확인하기 위한 폐 냉동절부 공초점 z-스택 영상 등이 포함됩니다. 이 프로토콜은 다른 LTPs나 전달 벡터에 쉽게 적용할 수 있으며, 폐 또는 기타 장기계에 적용하여 개발 중인 CPPs의 세포 특이성을 평가할 수 있습니다. 이는 장기 수준 축적만을 평가하는 것보다 생 체 내 세포 유형 수준의 CPP 표적 검증이 필요한 응용 분야에 특히 적합합니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 메이요 클리닉의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 지침에 따라 진행되었으며, 프로토콜 번호 A00006842-22-R25에 따라 승인되었습니다. 동물의 고통을 최소화하고 관련 국가 및 기관 규정을 준수하는 윤리적 취급을 보장하기 위한 모든 노력이 이루어졌습니다. 이 프로토콜에 사용되는 연구 도구들은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 동물

1. 잭슨 연구소에서 채취한 성체 혼합 성별 C57BL/6J 쥐(6–8주령)를 사용하세요(품종 #000664).
2. AT2 특이적 정량화를 위해 Sftpc-CreERT2^(+/+) (Jax Strain #028054)와 LSL-GFP^(+/+) (Jax Strain #007906)를 교배하여 Sftpc-CreERT2^(+/−)를 생성합니다; LSL-GFP^(+/−) AT2 리포터 마우스.
3. 개별 환기된 우리에 있는 집쥐들. 모든 동물 프로토콜이 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받는지 확인하세요.
4. Sftpc-CreERT2^(+/−)에서 타목시펜 유도 시행; LSL-GFP^(+/−) 마우스. 쥐가 ≥6주일 때, 옥수수 기름에 용해된 100 mg/kg의 타목시펜을 경구 가비지를 통해 7일간 3회 투여합니다. 최대한의 재조합 효율을 위해 최종 투여 후 최소 2주 후에 실험을 수행하세요.

2. 시약 및 장비 준비

1. 마취제(케타민/자일라진 작업 혼합물)를 준비하세요.
   1. 5 mL 작동 용액을 준비합니다: 케타민(50 mg/mL 1 mL), 자일라진(100 mg/mL 50 μL), 멸균 생리식염수(3.95 mL).
   2. 1 μL/g 체중을 투여합니다.복막 내 주사 (최종 용량: 케타민 10 mg/kg 및 자일라진 1 mg/kg).
2. 펩타이드(cR11A-Cy5.5)를 준비합니다.
   1. CPP는 동결 분말로 구하세요. 분말은 −20°C에서 최대 2년간 보관하거나, DMSO의 −80°C에서 최대 6개월간 광차단 튜브에 보관할 수 있습니다. 동결-해동 사이클을 피하고 빛 노출을 최소화하세요. 10 mM 용량의 cR11A-Cy5.5를 DMSO에 준비합니다.
   2. 마우스의 무게를 재고, 용량을 계산한 후, 핵효소가 없는 물에 1 mg/kg으로 희석하여 각 마우스 한 마리당 100 μL의 최종 부피를 만듭니다.
3. 소화 버퍼(신선함; 얼음 보관)를 준비하세요.
   1. 2 mg/mL 디스파제 II, 0.1 mg/mL DNase I, DMEM/F12, 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 소화 완충제를 준비합니다.
   2. 마우스 한 마리당 3mL를 사용하세요.
4. 비특이적 프로테아제 효소 워시 버퍼를 준비하세요(얼음 보관).
   1. DMEM/F12는 0.05 mg/mL DNase I와 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신을 함유하고 있습니다.
   2. 쥐 한 마리당 10mL를 사용하세요.
5. 적혈구 용해 완충제를 준비하세요(얼음 보관).
   1. 10× 용해 버퍼를 PBS로 1×로 희석합니다.
   2. 샘플당 2mL를 사용하세요.
6. 관류 완충제를 준비하세요.
   1. 얼음처럼 차갑게 식은 DMEM/F12(마우스당 10mL)를 사용하세요.
7. 세척 버퍼 준비하세요.
   1. DMEM/F12에 2% FBS를 사용하세요.
8. 원심분리기를 4°C까지 미리 냉각하세요.

3. cR11A-Cy5.5의 역안과 투여

1. 케타민/자일라진 작업 용액으로 쥐를 마취하세요. 발가락 꼬임에 반응해 사지가 철수하지 않아 적절한 마취를 확인하세요.
2. 인슐린 주사기를 이용해 후안도 정맥 주사 로 100 μL cR11A-Cy5.5(1 mg/kg)를 주입합니다.
3. 타이머를 켜고 마우스를 온열 패드에 15분 또는 60분 정도 적절히 모니터링하며 유지하세요.

4. 폐 채취 및 관류

1. 승인된 프로토콜(예: CO₂ 흡입 후 경부 탈구)에 따라 쥐를 안락사시키세요. 쥐를 누운 자세로 눕히고 가슴에 70% 에탄올을 뿌리세요.
2. 흉강을 열어 심장과 폐를 노출시켜.
3. 관류 시 배액을 위해 오른쪽 심방에 절개를 하세요.
4. 얼음처럼 차가운 DMEM/F12가 들어 있는 10mL 주사기에 연결된 26G 바늘을 우심실에 삽입합니다. 관류 과정 내내 오른쪽 심방 절개를 열어 배액이 잘 되도록 하세요.
5. 주사기 펌프 없이 약 1-2분 동안 10mL의 DMEM/F12를 천천히 꾸준히 주입하여 수동으로 관류합니다. 주사 시에는 저압을 유지하고, 심실벽에서 눈에 띄는 폐 과팽창이나 누출을 피하세요. 폐가 완전히 창백해질 때까지 계속하세요.

5. 폐 팽창 및 소화

1. 기관에 20G 정맥 카테터를 꽂고 3-0 실크 봉합사로 고정하세요. 1mL 주사기 로 1mL 소화 완충제를 주입하여 폐를 팽창시킵니다.
2. 폐를 하나의 온전한 단위로 해부한 후 즉시 얼음 위에 미리 냉장된 100mm 접시로 옮깁니다.
3. 폐엽을 분리하여 15mL 원뿔형 튜브에 2mL 냉냉소화 완충제(튜브당 폐 하나)로 옮깁니다.
4. 회전식 로커(10–15rpm)에서 4°C에서 20시간 부양합니다.
   참고: 자세한 방법론은 Janas PP. 외 ¹⁰ 을 참조하십시오.

6. 조직 해리

1. 100 μm 세포 체를 50 mL 원뿔형 튜브 위에 놓고 1 mL 비특이적 프로테아제 효소 세척 완충제로 미리 적셔 두세요.
2. 폐 조직을 체에 옮기고 멸균 주사기 플런저로 부드럽게 해리합니다.
3. 10mL 비특이적 프로테아제 효소 워시 버퍼로 헹구세요.
4. 원심분리기는 130 × g에서 4°C에서 15분간 돌립니다.
5. 펠릿을 2 mL 1 × 적혈구 용해 완충액에 실온에서 90초간 재현탁합니다.
6. 10 mL 세척 버퍼로 용해를 소환합니다.
7. 40 μm 체에 걸러진 후 세척 버퍼로 헹군 후
8. 300 × g에서 4 °C에서 5분간 원심분리기.
9. 세포를 500–1,000 μL PBS + 2% FBS (≥1 ×^{10 6} 세포/mL)에 재현탁합니다.
10. 35 μm 필터 캡을 통과해 FACS 튜브로 통과시킵니다.
    참고: 자세한 방법론은 Konishi S. 외 ¹¹ 편을 참조하십시오.

7. 쌍분수 FACS 정렬

1. 유세포계를 이용해 분류를 수행하세요.
2. PBS 주입된 폐를 음성 대조군으로 사용하여 Cy5.5 게이트를 정의하세요.
3. 표준 게이팅: 잔해 제거, 싱글렛, 그리고 Cy5.5⁺ 셀을 적용하세요.
4. Cy5.5⁺과 Cy5.5⁻ 개체군을 별도의 튜브로 분류하세요.

8. scRNA-seq 샘플 준비

1. 분류된 샘플은 얼음 보관하세요.
2. 300 × g에서 4 °C에서 5분간 원심분리한 후 500 μL 버퍼에 재현탁합니다.
3. 생존 가능성이 ≥80%일 때만 진행하세요.
4. 필요에 따라 라이브러리와 시퀀싱을 준비하세요.

9. AT2 리포터 마우스에서의 유세포 분석

1. 5-6절에 설명된 폐 단세포 현탁액을 준비합니다.
2. 고칠 수 있는 생/죽음 염료(1:1,000)로 30분 동안 스테인을 사용하세요(빛으로부터 보호).
3. 세척 후 300 × g에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
4. 여과해서 샘플을 얼음 위에 보관하세요.
5. 유세포계로 데이터를 수집하세요.
6. 게이팅을 수행하여 세포를 식별하고, 싱글렛을 선택하며, 죽은 세포를 제거하고, GFP 및 Cy5.5 개체군을 정의합니다.
   1. GFP⁺/Cy5.5⁺ 사건을 GFP⁺ 세포 비율로 정량화합니다.

10. 고정 및 냉동 보호

1. 폐를 1mL 4% PFA로 부풀리고 기관을 고정하세요.
2. 4°C에서 하룻밤 10mL 4% PFA를 고정하세요.
3. PBS로 세척하세요 (3×).
4. 15% 자당에 하룻밤 배양하세요.
5. 30% 자당으로 옮기면 ~48시간 만드세요.

11. 임베딩 및 냉동 절단

1. OCT가 포함된 냉동 몰드를 준비하고 폐를 위치시키고 OCT에 삽입하세요.
2. 액체 질소를 사용해 얼리세요. 보관 온도는 ˗80 °C입니다.
3. 평형 후 10 μm 절단. 하룻밤 동안 자연 건조 미끄럼틀.

12. 영상 및 분석

1. PBS로 세척 구역(3×).
2. DAPI 미디엄으로 장착하세요.
3. 공초점 Z-스택을 획득하세요.
4. 적절한 영상 설정을 사용하세요.
5. 3D 재구성을 수행하세요.
6. 일관된 임계값을 사용하여 공동위치 정량화를 하세요.
   선택적 방법:
   이러한 선택적 방법들은 대표적인 워크플로우에는 포함되지 않지만, 폐세포의 큰 비중을 차지하는 CD45⁺ 면역세포 집단의 고갈이나 분석을 가능하게 하는 데 포함될 수 있다¹².
   참고: 비면역 폐 집단에 초점을 맞춘 분석에서는 CD45⁺ 고갈 또는 배제를 사용하는데, 이 단계들은 면역 세포 흡수 신호를 제거하거나 분리하여 샘플의 세포 구성을 변화시킵니다. CD45 염색은 CD45⁺ 면역세포 집단을 별도로 분석하는 데에도 사용될 수 있습니다.

13. CD45⁺ 세포 집단 감소

1. 조직 해리(6단계) 후, CD45 항체를 자기 구슬에 접합한 것(Miltenyi Biotech 130-052-301) 또는 Cy5.5, GFP, 그리고 생염색/죽음 염색과 호환되는 형광체에 결합된 CD45 항체(예: CD45-BV605 (BioLegend #103140)를 사용합니다. 어두운 곳에서 4°C에서 20분간 스테인을 발라.
2. CD45 자기 비드 고갈을 수행할 경우, 제조사의 계통 고갈(LD) 컬럼 사용 지침(Miltenyi Biotech 130-042-901)을 따르고 자기 셀 분리(MACS)(Miltenyi Biotech)를 진행하세요. 그 다음 페어드 프랙션 FACS 정렬(7단계)으로 진행합니다.
3. 형광 결합 항체를 이용해 CD45 소모를 수행할 때는 먼저 세포 부탁액을 워시 버퍼로 세척하여 과도한 항체를 제거합니다. 그다음 7단계로 진행하세요. 더블렛과 이물질을 배제하는 게이트를 설정한 후(7.3단계), CD45⁺ 집단을 배제하는 추가 게이트를 삽입합니다. 그 다음 7.4단계로 진행하세요.

14. 유세포 분석 중 CD45⁺ 세포 집단 분석

1. 9.3단계 이후에는 Cy5.5, GFP, 그리고 생/죽음 염색과 호환되는 형광체에 결합된 CD45 항체(예: CD45-BV605 (BioLegend #103140)를 사용하세요. 어두운 곳에서 4°C에서 20분간 스테인을 발라.
2. 과도한 항체를 제거하기 위해 세척 버퍼로 세포 현탁물을 세척하세요. 그 다음 9.4단계로 진행하세요. 더블렛과 이물질을 배제하는 게이트를 구축한 후(단계 9.6), CD45⁺ 집단을 배제하는 추가 게이트를 삽입한 후 GFP⁺ 및 Cy5.5⁺ 집단을 확립하기 위해 게이팅을 한다¹².

결과

이 프로토콜의 성공적인 적용은 세 가지 상호 보완 측정값인 쌍분획 scRNA-seq, 리포터 기반 유세포분석, 공초점 z-스택 영상에서 일치하는 증거를 생성할 것입니다.

쌍분획 scRNA-seq 분석에서는 cR11A-Cy5.5를 전신 투여한 후 Cy5.5⁻ 및 Cy5.5⁺ 폐 단세포 분획을 회수하여 별도로 분석하였습니다. UMAP 시각화는 면역, 내피, 상피, 중간엽 구획을 포함한 주요 폐 세포 집단을 확인했습니다(그림 1A, B). 두 분류된 분획에서 면역 세포가 우세했지만, Cy5.5⁺ 분획은 상피세포를 포함한 비면역 구획의 상대적 농축을 보였다(그림 1C). 상피 아세트 분석에서는 Cy5.5⁺ 분획에서 AT2 세포가 Cy5.5⁻ 분획보다 더 많이 나타난 반면, AT1 세포는 두 분획 모두에서 낮은 비율을 유지하였다(그림 1D). 이 결과는 쌍분획 scRNA-seq가 cR11A-Cy5.5 양성 폐세포 분획 내 AT2 세포의 농축을 식별할 수 있음을 시사합니다.

유세포검사법을 사용하여 보고자가 정의한 AT2 세포 내에서 cR11A-Cy5.5 신호를 정량하였습니다. 대표적인 게이팅에는 FSC-A/SSC-A에 의한 전체 세포 선택, 두 개의 순차적인 싱글렛 게이트, 생세포 게이팅, 최종 GFP 대 Cy5.5 분석(그림 2A–E). 대조군 샘플에서는 GFP⁺/Cy5.5⁺ 사건이 최소화되어 배경 형광 임계치를 설정하였습니다. cR11A-Cy5.5 투여 후, GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2 보고자 양성 반응은 주사 후 15분에 7.99%, 60분에 7.41%로 증가했습니다(그림 2E). 이 결과들은 생체 내 AT2 리포터 양성 세포에서 검출 가능한 cR11A-Cy5.5 신호를 지지합니다.

동초점 z-스택 영상은 폐 조직 절편에서 펩타이드 관련 형광의 공간적 검증을 제공합니다. 비보고자 대조군을 배경 형광 평가를 위해 포함되었고, GFP와 Cy5.5 채널에서 신호가 최소한으로 나타났습니다. cR11A-Cy5.5 처리된 AT2 리포터 폐에서는 GFP⁺ AT2 리포터 양성 세포 근처에서 Cy5.5 형광이 검출되었고, Imaris가 생성한 공존 위치 채널은 GFP와 Cy5.5 신호 간의 중복을 확인했습니다(그림 3A). 대표적인 Imaris 공존 위치 분석 결과, GFP⁺ AT2 구획 내에서 각각 15분과 60분 시점에 89.6%와 86.8%의 공소 위치가 나타났다(그림 3B).

비최적 결과로는 대조군 샘플에서 높은 배경 Cy5.5 형광, 상피세포 회복 불량, 낮은 세포 생존성, GFP⁺/Cy5.5⁺ 사건의 약한 분리 등이 포함될 수 있습니다. 이러한 문제들은 일반적으로 불완전한 관류, 과도한 조직 파손, 불충분한 보상, 또는 영상 임계값 불일치를 나타냅니다.

그림 1: 쌍분획 scRNA-seq는 cR11A-Cy5.5 양성 폐 분획에서 폐포상피 농축을 확인한다. cR11A-Cy5.5의 역안도 주입 후 폐 단세포 현탁액은 Cy5.5⁻와 Cy5.5⁺ 분획으로 분류되었으며, 각 분획은 단세포 RNA 시퀀싱으로 분석되었습니다. (A) UMAP 플롯은 대표 마우스의 일치 분획에서 세포형 군집을 보여줍니다. (B) UMAP 오버레이는 Cy5.5⁻와 Cy5.5⁺ 셀의 분포를 보여줍니다. (A)와 (B)에 동그라미 친 영역은 상피 하위 집합 분석을 위해 강조된 상피 구획을 나타냅니다. (C) 면역 집단은 두 분중 모두에서 매우 널리 퍼져 있으며, 각각 80% 이상을 차지합니다. Cy5.5⁻ 분획과 비교할 때, Cy5.5⁺ 분획은 내피, 상피, 중간엽 집단의 비율이 더 높아 이들 집단 내에서 cR11A의 흡수가 있음을 나타냅니다. (D) 상피 집단 내에서 AT2 세포는 Cy5.5⁺ 분획에서 Cy5.5⁻ 분획보다 더 많이 대표되는 반면, AT1 세포는 두 분획 모두에서 낮은 분량을 유지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: AT2 보고자 폐에서 cR11A-Cy5.5 흡수에 대한 유세포검사 검증. AT2 리포터 마우스는 후안도 정맥 주사 로 cR11A-Cy5.5를 투여했으며, 폐는 주사 후 15분 또는 60분 후에 단세포 제제를 위해 채취하였습니다. PBS 차량 대조군(Ctrl)과 cR11A-Cy5.5 처리 샘플에 대한 대표적 게이팅이 나타났습니다: (A) 세포는 FSC-A/SSC-A로 선택되었고, (B, C) 싱글렛은 산란 기반 이중체 배제로 게이트되었으며, (D) 생존 염료 배제로 생세포가 확인되었으며, (E) GFP(AT2 리포터) 와 비교되었습니다. Cy5.5는 GFP⁺/Cy5.5⁺ 사건을 정량화하는 데 사용되었습니다. 이 대표적인 데이터셋에서 GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2 사건은 cR11A-Cy5.5 투여 후 15분과 60분 모두 약 8%였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: AT2 보고자 폐에서 cR11A-Cy5.5 흡수에 대한 공초점 영상 및 Imaris의 공동 위치 분석. (A) 비보고자 대조군(Ctrl) 및 cR11A-Cy5.5 처리된 AT2 리포터 폐에 대한 대표 필드가 제시되며, 주사 후 15분 또는 60분 후에 냉동 절개 및 공초점 Z-스택 영상을 위해 채취됩니다. GFP 신호(녹색)는 AT2 세포를 표시하고, cR11A-Cy5.5 형광(빨간색)은 펩타이드 관련 신호를 나타냅니다. "Coloc" 패널은 Imaris(노란색)로 분류된 픽셀이나 객체를 표시하며, 병합된 이미지는 두 채널 간의 공간적 겹침을 보여줍니다. 비보고자 대조군은 GFP 및 Cy5.5 채널의 배경 형광을 평가하기 위해 포함되었습니다. (B) GFP⁺ AT2 구획 내 공위치화 정량화는 각각 15분과 60분에 89.6%와 86.8%의 GFP 신호가 cR11A-Cy5.5와 공소 위치함을 보여줍니다. 이 데이터는 두 시점 모두에서 GFP⁺ AT2 세포와 강한 중복이 있음을 보여주며, 생체 내에서 AT2 구획의 우선적 참여를 뒷받침합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

토론

이 프로토콜은 상호보완적인 해상도로 작동하는 여러 독립 읽기(전사체 수준 매핑(paired-fraction scRNA-seq), 정량적 사건 기반 측정(리포터 플로우 사이토메트리), 공간 확인(공초점 z-스택)을 사용하여 특정 세포군의 펩타이드 표적을 식별합니다. 이 방법들은 혈관 형광 또는 세포외 저류의 교란, 펩타이드 관련 신호를 특정 폐세포 집단에 할당할 수 없는 등 장기 수준에서 형광 또는 대량 생물분포 기반 연구에서 내재된 공통적인 모호성을 줄여^줍니다.

특히 주의가 필요한 단계가 몇 가지 있습니다. 관류 품질은 배경 형광과 하위 분류 성능에 큰 영향을 미칩니다; 충분한 관류는 모든 폐엽이 균일하고 상아빛 흰색으로 보이는 것이 특징이며, 불완전한 관류는 비표적 구획에서 Cy5.5 신호를 증가시킬 수 있습니다. 조직 해리의 경우, 일반적인 소화 조건(37°C, 1–2시간) 대신 장기간 냉 소화(4 °C, 20 h)를 사용하여 상피 집단을 보존하고 특히 폐포 I형(AT1) 세포 등 취약한 세포 회복을 촉진합니다¹⁰. AT1 세포는 크고 얇은 형태 때문에 기계적 소화에 매우 민감하기 때문에 분리 과정에서 쉽게 손실됩니다. 일관된 소화, 보상, 게이팅, 임계값 등 표준 실험실 관행을 넘어, 3D 공동위치 분석은 펩타이드 신호가 AT2 리포터 신호와 겹치는지 여부를 판단하는 데 도움을 줍니다. 2차원 형광 중복에만 의존하는 것이 아^닌데요.

scRNA-seq 또는 유세포검사 정량 전에 CD45⁺ 면역 세포 소모 단계가 고려될 수 있습니다. 면역 세포는 폐 세포 집단의 큰 비중을 차지하며, 이물질에 대한 전형적인 면역 반응의 일환으로 CPP를 흡수할 수 있습니다. 내피, 상피, 간엽 구획 등 비면역 집단에서 CPP 흡수를 보다 정량화하기 위해 CD45⁺ 세포 고갈이 민감도를 향상시킬 수 있습니다. 이는 분류 전 구슬 기반 고갈을 사용하거나 유^{세포 분석 중} CD45⁺ 세포를 제외함으로써 달성할 수 있습니다. 그러나 이 변형은 면역 세포 흡수 정보를 제거하고 분석된 샘플의 세포 구성을 변화시키기 때문에 선택적으로 사용해야 합니다.

이 워크플로우의 여러 한계를 고려해야 합니다. Cy5.5 형광은 펩타이드 관련 신호를 식별하지만, 내부화된 펩타이드와 막 부착 또는 세포 주변 신호를 구분하지는 않습니다. 쌍분획 scRNA-seq는 조직 해리, 세포 회복, 분류 임계값, 그리고 각 폐 세포 집단의 상대적 개체 수에 의해서도 영향을 받습니다. 따라서 기저세포나 이온세포와 같은 희귀 집단은 과소대표되거나 놓칠 수 있습니다. 리포터 마우스 유동 세포검사는 더 강력한 세포 유형 할당을 제공하지만, 적절한 리포터 라인이나 검증된 항체 패널이 필요합니다. 또한, 리포터 마우스를 이용한 차량 대조는 영상 분석에서 GFP⁺ AT2 세포 내 배경 공동위치 정의를 더 잘 정의할 수 있습니다. 따라서 해석은 단일 결과가 아니라 scRNA-seq, 플로우 사이토메트리, 공초점 영상 전반에 걸친 일치 증거에 의존해야 합니다.

이 워크플로우는 모듈화되어 대체 형광체, 리포터 마우스 라인, 투여 방식, 수확 시점에 맞게 조정할 수 있습니다. 추가 세포 또는 장기 특이적 CPP를 개발하는 연구에서는 쌍분획 scRNA-seq 설계를 간, 신장, 뇌 등 다른 장기에도 수정하여 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 동일 동물의 단일 기관 내 펩타이드 관련 개체군을 효율적으로 비교하여 해석 가능성을 높이고 동물 간 변동성을 줄입니다. 향후 응용 분야로는 추가 CPP 스크리닝, CPP-화물 결합체 시험, 선형 및 고리 펩타이드 설계 비교, 조직 구조나 표적 세포 풍부도가 변화하는 질병 모델에 워크플로우를 적용하는 것이 포함됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Anti-mouse CD45-BV605 항체	BioLegend	103140	CD45+ 세포의 식별 또는 배제에 사용
C57BL/6J 마우스	The Jackson Laboratory	Strain #000664	실험에 사용된 야생형 마우스
CD45 MicroBeads, 마우스	Miltenyi Biotec	130-052-301	CD45+ 세포의 마그네틱 제거에 사용
세포 계수기	Invitrogen	Countess 3; AMQAX2000	자동 세포 계수
CO2 인큐베이터	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i; TSH160IDS	세포 인큐베이션
공간 현미경	Zeiss	LSM 980; 1872-551	z-stack 이미지 획득에 사용
cR11A-Cy5.5 펩타이드	Mayo Clinic Proteomics Core	맞춤형 합성; 카탈로그 번호 없음	in vivo 전달에 사용된 형광 표지 CPP
냉동 절편기	Leica Biosystems	Leica CM1950	조직 절편에 사용
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	폐 조직 소화에 사용된 효소
DMEM/F12	Gibco	11330-032	세포 분리 및 세척 버퍼
DNase I	Roche	10104159001	DNA 매개 세포 응집 감소
FACS 세포 분류기	BD Biosciences	BD FACSAria II, 4 레이저 시스템	Cy5.5+ 및 Cy5.5- 세포 분류에 사용
FBS	Gibco	A52567-01	세포 생존율 향상을 위해 버퍼에 추가
FlowJo 소프트웨어	FlowJo	버전 10.10.0	유세포 분석 데이터 분석
GraphPad Prism 소프트웨어	GraphPad Software	버전 10	통계 분석 및 플로팅
Imaris 소프트웨어	Oxford Instruments	버전 9.9.1	3D 시각화 및 공-위치 분석
인큐베이터 궤도 셰이커	Thermo Scientific	Solaris; 01-258-086	조직 소화에 사용
케타민	WestWard (Hikma)	NDC 0143-9508-01
LD 칼럼	Miltenyi Biotec	130-042-901	마그네틱 세포 분리(MACS)에 사용
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생/사 고정 가능 노란색 사망 세포 염색 키트	Invitrogen	L34968	유세포 분석 생존성 염색에 사용
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LSL-GFP 리포터 마우스	The Jackson Laboratory	Strain #007906	Cre-유도 GFP 리포터 라인
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마이크로 원심분리기	Eppendorf	EPP-5427R	샘플 원심분리
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DAPI가 있는 마운팅 미디어	Abcam	AB104139	이미징을 위한 핵 카운터스테인
DAPI가 있는 마운팅 미디어	Abcam	AB104139
핵산분해효소 없는 물	Qiagen	175034992
구강 관류 바늘	Braintree Scientific	N-PK 020
PBS	Gibco	10010-023	일반 세척 버퍼
PBS	Gibco	10010-023
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15140-122	세균 오염 방지
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냉장 원심분리기	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R	제어된 온도에서 세포 침전
냉장 원심분리기	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R
삼투압 생리식염수	Baxter	2F7124
Sftpc-CreERT2 마우스	The Jackson Laboratory	Strain #028054	AT2 특이적 유도 Cre 라인
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Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 리포터 마우스	사내 번식	Sftpc-CreERT2(+/+) 마우스와 LSL-GFP(+/+) 마우스를 교배하여 생성	AT2 특이적 GFP 라벨링에 사용
Sftpc-CreERT2(+/−)