폐섬유증 페럿 모델에서 폐 실질과 기도 재형성의 정량적 미세 CT 분석

요약

여기서는 페럿 모델에서 블레오마이신 유발 폐섬유증의 특성을 정량적으로 평가하기 위해 마이크로 CT를 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 페럿 모델은 폐섬유증 이해와 새로운 치료법 시험에 있어 강력한 중개 가능성을 보여줍니다.

초록

폐섬유증(PF)은 반복적인 폐포 손상으로 인해 실질이 두꺼워지고 흉터가 형성되며 호흡 장애를 겪는 만성적이고 진행성 폐 질환입니다. 현재 설치류 모델, 특히 블레오마이신(BLEO)을 사용하는 모델들은 호흡성 기관지의 부재와 같은 해부학적 차이로 인해 인간 특발성 폐섬유증(IPF)과의 번역 관련 성격이 제한적입니다. 이 한계를 해결하기 위해, 우리는 인간과 유사한 호흡 기관지를 가진 페럿의 폐섬유증 대형 동물 모델을 개발했습니다. 3개월 된 야생 페럿은 기관 내 BLEO 주입을 받았습니다. 폐는 치료 후 8주 후에 적취하여 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro-CT) 및 조직학적 평가를 실시하였다. 다중 검출기 CT(MDCT)의 공간 해상도가 제한되어 페럿 작은 기도를 시각화할 수 있었기 때문에, 적절 폐는 마이크로 CT 스캐너를 사용해 통제된 기도 압력(0 cmH₂O 및 25 cmH₂O)에서 외부 체외 영상으로 촬영하여 구기 및 흡기 상태를 시뮬레이션했습니다.

마이크로 CT 영상 검사에서 정상 및 BLEO 처리된 페럿 폐 사이에 뚜렷한 구조적 차이가 확인되었습니다. 정상 폐는 감쇠가 낮고 구조가 보존된 반면, BLEO 처리된 폐는 섬유증과 일치하는 현저히 증가한 감쇠를 보였다. 인간 섬유화성 폐질환의 특징인 낭포 공간이 있는 벌집 모양, 두꺼워진 간중격, 초기 섬유화 또는 염증성 변화를 나타내는 갈마 불투명 등이 명확히 나타났다. 정량적 마이크로 CT 분석을 통해 BLEO 처리된 페럿 폐의 기도는 두 압력 모두에서 요골 확장, 종방향 신축, 부피 변화가 유의미하게 감소하는 것으로 관찰되었습니다. 더 나아가, 세대별 매칭 분석에서는 시각적으로 섬유화가 보이는 부위의 기도벽이 유의미하게 두꺼워진 것으로 나타났습니다. 조직학적 평가, 특히 마송의 삼색 염색 결과, 광범위한 콜라겐 침착과 섬유화가 확인되었다.

이 연구는 BLEO 처리된 페럿이 인간 폐섬유증과 유사한 방사선학적, 기계적 및 조직병리학적 특징을 발현함을 보여줍니다. 더 나아가, 마이크로 CT는 섬유화 분포, 기도 역학, 폐 용적 변화를 고해상도로 평가할 수 있게 합니다. 이 발견들은 족제비가 PF 발병 기전 연구와 새로운 치료 전략 평가를 위한 번역 모델로서의 잠재력을 강조합니다.

서론

폐섬유증(PF)은 반복적인 치포 손상이 실질성 비후, 섬유화, 진행성 호흡 기능 장애를 유발하는 만성적이고 진행성 간질성 폐 질환입니다^. 폐섬유증은 약물, 환경 독소, 감염, 기저 자가면역 질환 등 다양한 노출로 유발될 수 있으며, 특발성 1도^{있습니다.} 특발성 폐섬유증(IPF) 환자를 위해 질병 진행을 늦추기 위한 약물이 개발되었지만, 폐섬유증은 진단 후 3–5년의 생존율로 ^1,2번 질환은 여전히 불치병입니다. 대부분의 경우, 유일한 확실한 치료법은 폐 이식입니다; 따라서 새롭고 더 효과적인 치료법 개발이 시급히 필요합니다.

블레오마이신은 인간에게 악성 종양 치료에 흔히 사용되는 약물입니다; 하지만 폐 독성으로 인해 사용이 제한되며, 이는 빠르게 폐섬유증³단계로 진행될 수 있습니다. 이 부작용이 발견된 후, 블레오마이신은 폐섬유증의 동물 모델 개발을 위한 연구에 사용되었습니다. 마우스는 IV 및 기관내 삽입 등 다양한 블레오마이신 투여 방법으로 일반적으로 사용되어 왔습니다^. 섬유화가 이 모델들에서 발달하지만, 인간에서 관찰되는 폐섬유증의 모든 주요 특징을 모두 포함하지는 않습니다⁸. 폐섬유증의 설치류 모델은 벌집 낭종 형성과 원위 폐포⁹의 기관지화를 포함한 진행성 질환의 주요 특징을 반영하지 못합니다. 또한, 연구에 따르면 블레오마이^{신 유발 폐} 손상은 설치류에서 블레오마이신 치료 후 약 28일 후에 자연적으로 회복되기 시작하는 것으로 나타났습니다. 또한, 이 모델들에서 섬유증 억제를 입증한 약물들은 인간에게서 동일한 효과를 보이지 않아 치료 선택지가 제한되었습니다¹¹.

국내 페럿(Mustela putorius furo)은 해부학적으로 인간^{호흡기계와} 유사하기 때문에 호흡기 생의학 연구에 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 또한, 이들은 인간을 감염시키는 호흡기 융합 바이러스(RSV)와 인플루엔자 등 유사한 호흡기 병원체에 취약하여 생리학적 유사성을 보입니다¹². 블레오마이신의 페럿 모델은 기관지화, 섬유화 초점 형성, 그리고 이상 기둥 유사 세포(KRT7⁺/KRT17⁺/KRT5^–/TP63⁺)의 존재를 보여준다⁹. 블레오마이신 단일 투여는 페럿에게 지속적인 폐섬유증을 유발했으며, 제한적 생리학과 섬유화성 폐 이상이 최소 22주 이상 지속되었습니다¹³. 이 발견은 광범위하게 사용되는 마우스 블레오마이신 모델과는 상당히 다릅니다. 블레오마이신은 섬유증이 일반적으로 자율적으로 발생하며 약 28일 후에 해결되기 시작하고, 6주에서 8주 정도 지나면 상당한 퇴행이 일어나므로, 페럿 모델이 인간 폐섬유증의 만성적이고 진행적인 특성을 더 잘 재현할 수 있음을 시사합니다. 더불어, 페럿은 최근에는 인간과 유사하기 때문에 호흡기에 가장 흔히 영향을 미치는 전신 질환인 낭포성 섬유증 연구에 활용되고^{있습니다.} 따라서 이 동물들은 이전 설치류 모델보다 PF의 더 나은 모델이 될 수 있습니다.

이번 연구는 인간 상태와 더 유사한 폐섬유증의 동물 모델을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 우리는 가정용 페럿에게 기관내 블레오마이신을 투여했습니다. 8주 후, 이 페럿들은 폐섬유증 환자 인간과 유사한 방사선 및 조직학적 변화를 보였습니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 미시간 주립대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 지침과 규정에 따라 수행되었습니다(동물 프로토콜 승인 번호). PROTO202300066). 동물 관리 및 실험 프로토콜은 미시간 주립대학교에서 승인받았으며, 연구에서 동물의 윤리적 사용에 관한 기관 기준을 준수하였습니다.

1. 페럿에 대한 기관지경 주입 블레오마이신

1. 3개월에서 4개월 사이의 수컷 페럿을 입양하세요. 이 나이 수컷 페럿의 평균 체중은 약 0.9–1.6kg이어야 합니다. 동물은 21°C, 습도 40%–50%에서 사육하세요.
2. 정밀 증기 마취기를 사용해 페럿에게 3%–5% 이소플루란 가스를 투여합니다.
3. 페럿의 코를 코에 콘으로 덮어 마취를 유지하고, 3%–5% 농도로 이소플루란 가스를 계속 투여하세요.
4. 페럿이 충분히 진정되고 누워 있으면, 2.7mm 외경 기관지경을 사용해 기관지경 검사를 시작하세요.
5. 블레오마이신(2 U/kg 체중)과 생리식염수 혼합물을 작동 채널을 통해 원위 기관에 주입하여 블레오마이신의 확산을 가능하게 합니다. 주입된 총 부피가 1 mL를 넘지 않도록 주의하세요. 페럿들을 각자의 거주지로 돌려보내고 8주간 관찰하세요.
   참고: 설치는 완료까지 2분을 넘지 않아야 합니다.
6. 정밀 증기 가스 마취기를 사용해 이소플루란을 투여하세요. 페럿의 코를 코 콘으로 덮고 1%–5% 이소플루란을 주입해 눕히세요. 명백한 임상 사망이 확인될 때까지 가스 노출을 계속하세요. 90 mg/kg 용량의 정맥 주사 안락사 용액을 투여하고 사망이 확인될 때까지 활력 징후를 모니터링합니다.
7. 치료 8주 후 폐를 채취하여 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro-CT) 및 조직학적 평가를 실시합니다.

2. 페럿 폐의 고해상도 마이크로 CT 영상

1. 하대정맥 절개를 통해 과즙과 혈액을 제거하여 혈액 배출을 위해 절제된 폐 조직을 영상 촬영 준비합니다. 폐 준비 후 바로 CT를 수행하세요.
2. 마이크로 CT 시스템을 사용하여 다음 이미지 획득 설정을 사용하여 단층촬영 마이크로 CT 이미지를 얻습니다: 90 keV, 88 μA, 전력 설정, 60 μm 구리 필터와 500 μm 알루미늄 X선 콜리메이터 필터, 72 mm 시야각(FOV), 144 μm 등방성 이미지 해상도를 사용).
3. 자동 스티칭 프로토콜을 사용해 18초 표준 갱트리 시간에 총 5장의 이미지를 획득하여 중복 단면을 겹치고, 스티치하며, 중복 단면을 제거하여 기도 파이프라인 분석을 위한 최종 스티치 이미지를 생성합니다; 이로 인해 68mm 원통형 직경의 FOV x 186mm 총 스티치 이미지 깊이(Z 평면)가 144 μm 복셀 해상도에서 완성되어 전체 외부 체 외 페럿 폐 블록을 완전히 포착할 수 있습니다.
   1. 이 영상 프로토콜을 각 체 외 페럿 폐 세트에 대해 0 cmH₂O 및 25 cmH₂O 폐압 모두에서 반복합니다.
   2. 영상 촬영 중 기도 압력을 정밀하게 조절하고 유지하기 위해 폐에 직접 연결된 압력 모니터링 시스템을 사용하세요.
   3. 압력계를 조절된 공기 흐름원에 연결하여 폐 내 압력을 지속적으로 조절할 수 있게 합니다.
   4. 영상 촬영 전에 시스템을 원하는 압력 수준(0 cmH₂O 또는 25 cmH₂O)으로 설정하고, 일정한 공기 흐름을 이용해 폐를 팽창시킵니다.
   5. 영상 촬영 중에는 압력계를 사용해 기도 압력에 대한 실시간 피드백을 제공하고, 공기 흐름원을 이용해 미세한 압력 변동도 보상합니다.

3. 이미지 처리 및 세분화

1. 재구성된 마이크로 CT 영상 볼륨을 DICOM 형식으로 입력하고, 신경영상 정보학 기술 이니셔티브(NIfTI) 형식으로 변환하여 기도 분할 파이프라인에 입력합니다.
2. 마이크로 CT 이미지에서 관심 영역(ROI)을 정의하기 위해 관과 기타 기관 삽입물을 제외하기 위해 상단 끝의 축 절단을 수동으로 잘라내세요( 그림 1A 참조).
3. 다음 주요 단계에 설명된 자동 동결 및 성장 알고리즘^15,16을 사용하여 기도 분할을 수행합니다.
   1. ROI 내 가장 상단 축방향 이미지 단면에 기관 안에 씨앗을 넣으세요; 모든 복셀이 '0'으로 할당된 초기 확신 기도 볼륨(CAV)을 나타내기 위해 입력 이미지 크기의 빈 이미지 배열을 생성; 그리고 시드 복셀을 값을 '1'로 설정하여 CAV에 추가합니다.
   2. 기도 내강의 분할을 위해 초기 보존적 마이크로 CT 강도 임계값을 t = -1000 HU로 설정합니다.
   3. 입력 이미지 크기의 빈 이미지 배열을 만들어 금지 볼륨(FV)을 나타내고, 모든 복셀은 '0'으로 초기화됩니다.
   4. 두 플래그 중 하나에 의해 정의된 기도 루멘 분절의 수렴이 될 때까지 반복 분할을 반복합니다: 1) 전체 임계 범위(-1000에서 -600 HU)를 확인하거나, 2) CAV 이미지에서 '1' 복셀과 인접한 모든 '0' 복셀을 FV 이미지에서 '1'로 표시합니다.
      1. CAV 중심선 트리¹⁷ 을 계산하고 터미널 분기 엔드포인트¹⁸을 식별합니다.
      2. 마이크로CT 이미지에 현재 t값에서 이진 임계값을 적용하고, CAV를 시드로 설정한 새로운 루멘 연결 볼륨¹⁸을 계산합니다(복셀 값 ≤ t).
      3. 각 CAV 엔드포인트에 대해, 해당 엔드포인트에 더 가까운 CAV는 제외하고 새로운 루멘 볼륨 내의 관련 복셀을 계산합니다.
      4. 새로운 내강 부피에서 >150개의 복셀, 0.5 mm³에 해당하는 많은 부피의 CAV 엔드포인트를 잠재적 누설 부위로 감지합니다.
      5. Nadeem 등에서 정의한 자동 기준을 사용하여 잠재적 내강 누출을 확인^한다.
      6. 루멘 부피의 누수를 제거하려면 누설 루트에 가까운 서브트리 부피를 삭제하고, 앞서 설명한^{알고리즘 15}를 사용해 누설 루트 주변에 복셀을 추가하여 FV를 보강합니다.
      7. 누설 제거된 루멘 볼륨을 할당하여 앞서 설명한^{알고리즘 15}를 사용해 CAV를 업데이트합니다.
      8. 임계값 t에 '1'을 올립니다.
      9. 3.3.4단계로 가세요.
4. 다음 주요 단계에서 설명된 이전에 검증된 자동화 알고리즘¹⁷ 을 사용하여 1복셀 두께의 기도 중심선 트리 계산을 수행한다.
   1. 분할된 기도 트리를 이진 NIfTI 이미지로 입력합니다.
   2. 다음 주요 단계에서 설명하는 중간 선호 최소 비용 경로¹⁷ 을 사용하여 초기 기도 중심선 트리를 계산합니다.
      1. 입력 이미지 크기의 빈 골격 이미지 배열을 생성하고, 모든 복셀이 '0'으로 할당됩니다; Step 3.3.1의 자동 시드를 '1' 값의 초기 스켈레톤 복셀로 추가합니다.
      2. 입력 이미지 크기의 빈 이미지 배열을 만들고, 모든 복셀이 '0'으로 할당되어 표시된 기도 볼륨 이미지를 나타냅니다.
      3. 현재 골격에서 가장 먼 무표식 기도 부피 중 복셀을 식별하고, 앞서 설명한 알고리즘¹⁷을 사용해 이 지점과 현재 골격을 연결하는 중간 선호 최소 비용 경로를 계산합니다.
      4. 결과 경로를 골격 이미지 배열에 새로운 골격 분기로 추가하고^{, 앞서} 설명한 대로 분기를 따라 국소 스케일 적응 확장을 적용하여 기도 표시 부피를 업데이트합니다.
      5. 표시된 기도 부피가 채워질 때까지 3.4.2.3–3.4.2.4단계를 반복합니다.
   3. ^앞서 설명한 가지의 길이에 대한 국소 척도 기반 선택 전략을 사용하여 진한 기도 중심선을 유지하면서 가짜 위상 가지를 가지치기합니다.
   4. 위상적 일관성을 보장하고 단일 복셀 두께의 중심선을 유지하기 위해 기도 중심^{선에서 분} 기 종점이 아닌 단순 점(즉, 두 개 이상의 중심선 복셀과 인접한 점)을 제거한다.
5. 0 cmH₂O에서 페럿 폐의 미세 이미지에서 폐 실질의 분절을 수행합니다.
   1. ITK-SNAP²⁰에 내장된 계산 알고리즘과 그래픽 인터페이스를 사용해 다섯 번째 관상 이미지 단면마다 폐 실질을 수동으로 구분합니다.
      참고: 25 cmH₂O 팽창 상태에서 폐 실질과 주변 배경 간의 마이크로 CT 강도 대비가 불충분하여 폐 용적의 신뢰성 있는 분할을 방해했습니다.
   2. 이미지 보간을 적용하여 중간 이미지 단면에서 폐 실질의 분할을 생성합니다.
   3. 축방향과 시상선 양쪽에서 실질의 구조적 연속성을 보장하기 위해 2차 품질 관리 검토를 수행합니다.
   4. 국소 규모 기반 내강 부피 확장을 이용해 폐 실질에서 기도 내강과 벽 부위를 제거한 후, 폐 실질에서 확장된 부피를 빼세요.
6. 기도의 기계적 측정²¹.
   1. 흡기(25 cmH₂O 팽창)와 호기(0 cmH₂O 팽창) 폐 용적 간 공간적으로 일치하는 기도 내강 단면적(CSA) 변화를 측정하여 개별 기도의 호흡 관련 방사선 확장을 정량화합니다. 기도 가지인 b에서의 방사선 팽창을 Δ_air-R(b)로 표기하며, 다음과 같이 계산합니다:
      (1)
      여기서 CSA_ins(b)와 CSA_exp(b)는 흡기 및 호기 폐 용적에서의 기도 내강 CSA를 나타냅니다. b 지점의 CSA는 방사선 추적과 분기 b²²의 중앙 절반에 대한 국소 적응 반최대 방법을 사용하여 계산됩니다.
   2. 호흡 관련 개별 기도의 종방향 신장을 다음과 같이 정량화합니다:
      (2)
      여기서 L_ins(b)와 L_exp(b)는 각각 기도 분기 b 의 흡기 및 호기 폐 부피에서 측지 경로 길이를 나타냅니다. 가지의 측지선 경로 길이는 카리나에서^가지의 원위 끝점까지 중심선 경로를 따라 추적하여 계산합니다.
7. 폐 실질의 강도 기반 측정 값을 정량화합니다.
   1. 기도 나무 맥락에서 건강한 및 섬유화된 페럿의 폐 실질체 부피를 '3D 부피 룩스루 렌더링'을 생성하여 미세 CT 강도 분포를 공간적으로 시각화할 수 있습니다. 마이크로 CT 강도 정의 투명도 매핑과 색상 코딩을 사용하여 룩스루 효과를 구현하세요. 건강한 폐와 섬유화된 페럿 폐 모두에 동일한 투명도 매핑과 색상 구분 척도를 적용하세요. 다음 단계들이 루크스루 3D 볼륨 렌더링을 생성하기 위해 적용됩니다.
      1. 3D 슬라이서²³ 을 사용하여 0 cmH_2O팽창 상태에서 기도 분할의 3차원(3D) NIfTI 이미지를 "분할"로 열어보세요.
      2. 세그멘테이션 모듈을 사용하여 3D 기도 표현을 생성하세요. 기도 부피를 입력으로 선택한 후, Representations 탭에서 닫힌 표면 옵션 아래에서 생성(Create)을 클릭하세요.
      3. 분리된 폐 실질이 있는 마이크로 CT 강도 이미지를 3D 슬라이서의 부피로 가져오세요. 이 이미지에서는 폐 복셀에 대해서는 원본 마이크로 CT 강도 값이 보존된 반면, 모든 비폐 복셀에는 -2000 HU의 값이 할당되어 있습니다.
      4. 부 피 렌더링 모듈을 사용하여 폐 실질의 강도에 대한 색상 및 투명도 매핑을 설정하세요. 지도 강도 값은 -1500 HU, -600 HU, 0 HU, 1500 HU에서 검정, 초록, 노랑, 빨강으로 변환하며, 불투명도는 각각 0, 0.15, 0.3, 1입니다.
   2. 본 연구에서 개발된 알고리즘을 사용하여 미세 CT 영상에서 관찰된 강도 분포를 분석하여 폐 실질체 내 병든 조직의 비율을 추정합니다. 이 방법은 건강한 실질 영역의 강도 값이 가우시안 분포를 따른다고 가정합니다. 반면, 섬유화 부위는 특성상 강도가 높아 관찰된 히스토그램 오른쪽의 가우시안성을 왜곡합니다. 다음 단계로 이 작업을 완료하세요.
      1. 3.7.1.3 단계에서 -1500 HU에서 500 HU 강도 범위 내 50개 빈으로 고립된 폐 실질 영상에 대해 히스토그램을 계산합니다.
      2. 히스토그램의 모드로 목표 가우시안 분포의 평균을 계산하고, 히스토그램 모드 왼쪽의 강도 값을 사용하여 표준편차 매개변수를 유도합니다.
      3. 섬유화 조직 부피를 관찰된 히스토그램 오른쪽에서 평균 및 표준편차 매개변수로 정의된 예상 가우시안 분포 곡선 위에 있는 초과 면적으로 정량화합니다.
      4. 병든 조직 분율을 섬유화 조직 부피와 실질부 부피를 나타내는 총 히스토그램 수치의 비율로 계산합니다.

결과

5마리 페럿 중 1마리의 건강한 페럿과 1마리의 섬유화된 페럿에서 적출된 폐는 마이크로 CT 스캐너로 각각 0 cmH₂O 및 25 cmH₂O의 통제된 기도 압력으로 촬영하여 인기성 폐 팽창과 흡기 폐 팽창을 시뮬레이션하였습니다.

그림 1은 0 cmH₂O 압력에서 체외 내 페럿 폐의 마이크로 CT 영상(그림 1A)을 위한 영상 처리 파이프라인의 중간 결과를 보여줍니다. 그림 1B는 절제된 페럿 폐를 0 cmH₂O로 부풀린 마이크로 CT 이미지에서 반복 간 기도 트리 부피 분할과 해당 임계값 매개변수의 중간 결과를 보여줍니다. 그림 1B는 이후 반복에서 매개변수 완화를 통해 더 작은 기도를 포착하는 FG 알고리즘의 효과를 보여줍니다. 그림 1C는 가짜 가지를 가지치기 전후로 측정한 기도 중심선 나무 탐지 결과를 보여줍니다.

5세대 이후로 섬유화된 폐에서 검출되는 기도 수가 건강한 폐에서 발생 시기에 검출된 것보다 현저히 적은 것으로 관찰되었습니다(그림 2A). 구체적으로, 5세대 이후 건강한 폐에서는 161개의 기도 가지가 검출되었고, 섬유화된 폐에서는 일치하는 세대 동안 91개의 기도 가지만이 발견되었습니다. 일반적으로 섬유화된 폐의 기도벽은 건강한 폐에 비해 두꺼웠다(그림 2B). 계산 분석 결과, 시각적으로 섬유화가 있는 영역에서 건강한 폐의 일치 영역에 비해 내강 직경 정규화 기도벽 두께가 유의미하게 증가한 것으로 나타났습니다.

섬유화된 폐는 벌집 모양, 간막 비중격 두꺼움, 그리고 지면유리 불투명 영역과 일치하는 작고 두꺼운 벽의 낭포성 공기 공간을 보였다. 그라운드글라스 불투명은 두꺼워진 폐 조직과 부분적으로 채워진 공기 공간으로 인해 CT 이미지에서 해당 부위가 흐릿하고 회색빛으로 보이는 폐 부위를 의미합니다. 섬유화된 폐는 섬유화 부위에 대응하는 실질에서 CT 강도 값이 더 높다는 것이 관찰되었습니다. 그림 3A 는 분할된 폐 실질체 부피와 분할된 기도 나무를 함께 "3D 부피 룩스루 렌더링"으로 보여줍니다. 섬유화된 페럿 폐의 실질에 대한 마이크로 CT 강도 값(-502 ± 238 HU)은 건강한 페럿 폐(-588 ± 167 HU)보다 유의하게 높았다(p < 0.001). 지역 강도 상승 분석(그림 3B)에서 섬유화된 폐는 27.8%의 실질부피를 가지며, CT 강도가 높았음을 보여주었습니다(히스토그램의 보라색 영역으로 표시). 반면, 건강한 폐는 CT 강도가 높을 때 실질부피의 1.24%에 불과합니다.

정상 폐와 병든 폐 간의 기도 역학을 시각적으로 비교하면, 건강한 폐와 섬유화된 페럿 폐에서 기도 내 기도 기계 바이오마커가 기도 가지를 통해 분포하고 있음을 알 수 있습니다(그림 4). 건강한 페럿 폐에서는 기도 요골 확장이 66.8%± 9.8%로 관찰되었으며, 이는 섬유화된 페럿 폐(32.4% ± 7.6%)보다 유의하게 높았습니다(p < 0.001). 건강한 페럿 폐(35.7% ± 5.3%)와 섬유화된 폐(16.0% ± 4.9%) 사이에서도 기도 종방향 신장 증가(p < 0.001)가 관찰되었습니다.

대표적인 CT 영상은 마이크로 CT 스캐너를 사용해 각 폐의 두 가지 기도 압력(0 cmH₂O 및 25 cmH₂O)에서 촬영하였습니다. 그림 5는 정상 페럿 폐(그림 5B,C)와 BLEO 처리된 페럿 폐(그림 5E, F)의 차이를 보여줍니다. 정상 폐에서는 CT 스캔에서 낮은 감쇠와 섬유화 징후가 없는 전형적인 폐 구조를 보입니다(그림 5B,C). 반면, BLEO 처리된 페럿 폐는 조직 섬유화를 시사하는 폐 감쇠 증가 등 유의미한 병리학적 변화를 보입니다(그림 5E, F). 또한, 낭포 공간과 두꺼워진 엽 중격이 특징인 뚜렷한 벌집 모양이 관찰됩니다(그림 5E, F). 염증 또는 초기 섬유화 변화 부위를 나타내는 그라운드글라스 불투명(GGO)도 BLEO 처리된 폐에서 관찰됩니다(그림 5E, F).

조직학적 분석(그림 6)은 블레오마이신 치료 페럿 폐에서 상당한 조직 재형성과 섬유화가 확인되었습니다. 헤마톡실린과 에오신(HE) 염색은 정상 폐에서 폐포 구조가 보존된 것으로 나타났으나(그림 6A, C), 섬유화된 폐는 광범위한 구조적 변형, 세포 밀도 증가, 기도벽 두꺼움, 그리고 두드러진 섬유화 병변을 보였다(그림 6B, D). Masson의 삼색 염색은 정상 폐의 기도와 실질에서 콜라겐 침착이 최소화된 것으로 나타났으며(그림 6E, G), 섬유화된 폐에서는 기도(그림 6F)와 실질 영역 전반에 걸쳐 콜라겐이 현저히 축적되었다(그림 6H). 정량적 영상 분석(그림 6I,J)은 섬유화폐에서 기도 및 실질 구획 모두에서 정상 대조군에 비해 콜라겐 양성 면적이 유의미하게 증가함을 확인했으며(P < 0.0001), 광범위한 세포외기질 침착과 진행성 조직 재형성을 나타냈다.

그림 1: CT 영상 처리 및 분할. (A) 마이크로 CT 영상에서 관심 영역(ROI) 선택. 절단선은 절단된 페럿 폐를 팽창시키는 데 사용되는 관과 기타 기관 삽입물을 제외하기 위해 수동으로 선택되었습니다. (B) 절제된 페럿 폐를 0 cmH₂O로 부풀린 마이크로 CT 이미지에서 프리즈-앤 그로우(FG) 알고리즘을 사용한 기도 나무 분절의 중간 결과. (C) 0 cmH₂O 마이크로 CT 이미지에서 기도 분절 부피에 가해진 가짜 골격 가지를 가지치기 전후의 중심선 검출 결과. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

그림 2: 기도 나무 생성의 계산 분석. (A) 건강한 폐와 섬유화된 폐에서 검출된 기도 수. (B) 건강한 폐와 섬유화된 폐에서의 기도벽 두께 차이. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 색상으로 구분된 마이크로 CT 강도의 시각화. (A) 0 cmH2O 팽창 시 건강한 및 섬유화된 페럿 폐의 실질에 걸친 색상 코드 마이크로 CT 강도 분포를 3D 시각화하는 것. (B) 건강하고 섬유화된 페럿 폐의 마이크로 CT 강도 히스토그램으로, 히스토그램 영역은 보라색으로 표시되어 가우시안 모델링에 기반한 CT 강도가 높은 영역을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 건강하고 섬유화된 페럿 폐의 기도 호흡 기계적 바이오마커. 각 바이오마커(A 는 기도 방사선 확장, B는 기도 종방향 신장)에 대해 μ_{x ±} σ 3 x x 범위에 걸친 정규화된 색상 코딩 체계가 적용되었으며, 각 지표의 평균(μ_x)과 표준편차(σ_x)를 건강한 페럿 폐의 모든 가지에서 계산했습니다. 정량적 비교 결과는 본문을 참조하세요. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 마이크로 CT 영상은 블레오마이신 유발 섬유화 페럿 폐에서 광범위한 구조적 재형성과 산소 증가한 폐 부피 손실을 보여줍니다. (A–F) 25cm H₂O 팽창 압력에서 촬영된 대표적인 마이크로 CT 이미지는 건강한 대조군 페럿(A–C)과 블레오마이신 처리 섬유화 페럿(D–F)을 비교합니다. 3차원(3D) 부피 렌더링 재구성(A,D)은 건강한 폐(A)에서 폐 구조가 보존되고 균질하게 확장된 반면, 섬유화된 폐(D)는 폐 확장 감소와 현저한 실질 왜곡을 보입니다. 횡단(B,E) 및 관상(C,F) CT 절편은 그룹 간 차이를 더욱 부각시킵니다. 건강한 폐는 통로가 균일하게 기압화된 실질을 보이며, 기도 분지는 정상이며 조직 밀도(B,C)가 최소입니다. 반면, 섬유화된 폐는 양측 흉막하 및 기저 우세한 불공화, 실질 밀도 증가, 구조 변형, 그리고 벌집 모양 재형성(빨간 화살표)(E,F)과 일치하는 낭포성 공기 공간 확장을 보인다. 노란색 점선이 폐 경계를 구분합니다. 이 영상 소견은 블레오마이신 페럿 노출 후 심각한 섬유화 재형성과 기능성 폐 부피의 현저한 감소를 시사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: BLEO 유발 페럿 폐섬유증의 검증. (A–H) 대표적인 밝기장 헤마톡실린과 이오신(HE) 염색 절편은 정상 폐(A,C)와 섬유화된 폐(B,D) 간의 차이를 보여줍니다. 저배율 HE 영상은 정상 폐(A)에서 보존된 폐포 구조와 섬유화된 폐(B)에서 광범위한 조직 재형성과 섬유화 병변을 보여줍니다. 고배율 HE 영상은 정상 폐의 정상 폐포 구조(C)와 섬유화된 폐의 세포 증가, 기도벽 두꺼움, 구조적 왜곡(D)을 더욱 부각시킵니다. 매슨의 삼색 염색으로 염색된 페럿 폐 절면의 대표적인 밝은 시야 이미지는 정상 폐 기도(E)와 실질(G)에서 콜라겐 침착이 최소화된 반면, 섬유화된 폐 기도(F)와 실질체(H)에서는 콜라겐 침착이 증가함(파란색)을 보여준다. (I,J) 콜라겐 양성 면적의 정량화 결과, 기도 영역(I)과 폐 실질(J) 모두에서 섬유화성 폐에 비해 콜라겐 침착이 정상 폐에 비해 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. P < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

본 연구는 페럿에서 기관내 블레오마이신 투여와 고해상도 체외 미세 컴퓨터 단층촬영(micro-CT)을 결합하여 폐섬유증의 구조적·기계적 특징을 특성화하는 프로토콜을 설명합니다. 마이크로 CT는 0.2mm까지 작은 기도도 감지할 수 있으며, 부피, 기도 두께, 밀도, 형태를 측정할 수 있습니다. 조직 밀도 증가, 부피 손실, 지역적 이질성은 조직병리학과 밀접하게 연관되어 있습니다. 주요 목표는 이 대형 동물 모델과 고급 영상 분석이 결합하여 인간 폐섬유증과 유사한 방사선학, 기도 및 조직병리학적 특징을 포착할 수 있음을 입증하고 실현 가능성을 입증하는 것이었습니다. 프로토콜의 여러 단계는 재현성과 해석 가능성을 위해 매우 중요합니다. 첫째, 기관지경 유도 기관내 블레오마이신 주입은 폐 노출을 가능하게 하면서 근위기 기도 고수를 최소화하는데, 이는 소동물 모델에서 알려진 한계 ^4,7,11. 이 접근법은 특히 더 복잡한 기도 분기가 있는 큰 폐에서 중요한 부위 손상 분포의 변동성을 줄일 가능성이 큽니다. 둘째, 삽입 후 8주 시점을 선택하는 것은 급성 염증보다 확립된 섬유증에 유리합니다. 쥐 모델에서 블레오마이신 유도 섬유화는 시간이 지남에 따라 부분적으로 완화되는 경우가 많아 번역 관련 성격이 제한됩니다 ^4,8,11. 반면, 이 연구에서 페럿 폐는 지속적인 방사선 및 조직학적 섬유성 특징을 보였습니다.

체외 영상 촬영 중 조절된 폐 팽창도 또 다른 중요한 요소입니다. 표준화된 기도 압력(0 cmH₂O 및 25 cmH₂O)에서의 영상 촬영은 기도 요골 확장과 종방향 신장을 정량화하여 폐 부피와 순응도의 변동 현상을 줄였습니다. 이 기도 기계적 바이오마커는 자동화된 세대 매칭 알고리즘을 통해 도출되어, 기존 조직학만으로는 평가하기 어려운 기도 기능 장애의 객관적 측정값을 제공합니다^15,21.

여러 프로토콜 수정이 견고성을 더욱 향상시킬 수 있습니다. 블레오마이신 용량은 반복적으로 저용량으로 조절하거나 투여하여 만성 상피 손상을 더 잘 모델링할 수 있는데, 이는 현재 폐섬유증 발병 기전의 핵심 패러다임입니다 ^1,3. 분절 삽입 전략은 섬유화된 부위와 비교적 보존된 부위 간의 동물 내 비교를 가능하게 할 수 있습니다. 영상 관점에서 기도 압력, 고정 조건, 온도의 신중한 표준화가 체외 스캔 중 조직 변형을 최소화하는 데 필수적입니다. 심한 섬유화는 기도 폐쇄와 높은 조직 밀도로 인해 자동 기도 분절을 복잡하게 만들 수 있습니다; 따라서 적응형 임계값 측정과 수동 품질 관리는 자동화된 파이프라인의 필수 보조 수단으로 남아 있습니다^.

이 방법은 몇 가지 한계가 있습니다. 특히 마이크로 CT로 촬영된 동물 수가 적어 통계적 추론이 제한되며, 이 결과는 기술적 해석으로 해석되어야 합니다. 이 연구는 정량적 마이크로 CT를 이용해 블레오마이신 유도 폐섬유증 모델의 특성을 규명하는 데 있어 파일럿 연구로 설계되었습니다. 이러한 결과를 검증하고 통계적 검정력을 높이기 위해서는 더 큰 코호트를 대상으로 한 향후 연구가 필요할 것입니다. 그러나 설명에서는 영상 바이오마커와 측정값에서 눈에 띄는 차이가 나타납니다.

또한, 널리 사용되고 있지만, 블레오마이신 유발 섬유증은 여전히 독소 유발 손상 모델로 남아 있으며, 노화, 유전적 감수성, 환경 노출 등 특발성 폐섬유증의 다요인 병인을 완전히 재현하지는 못한다 ^3,6,11. 영상 검사는 체외에서 수행되어 가스 교환, 혈관 기여, 종단 질환 진행 여부를 직접 평가할 수 없었다. 그럼에도 불구하고, ex vivo 마이크로 CT는 우수한 공간 해상도를 제공하며, 임상용 다중 검출기 CT로는 현재 페럿에서 달성할 수 없는 작은 기도의 상세한 3차원 분석을 가능하게 합니다.

이러한 한계에도 불구하고, 이 프로토콜은 기존 모델에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다. 페럿은 호흡 세기관지와 기도 분기 패턴이 설치류보다 인간과 더 유사하여, 섬유증의 기도 중심 측면을 연구하는 데 특히 적합하다 ^6,12. 인간과 관련된 기도 해부학과 마이크로 CT 기반 정량 영상을 결합하면 실질, 기도벽 두께, 기도 손실, 그리고 손상된 기도 역학을 동시에 평가할 수 있습니다. 이러한 특징들은 인간 섬유화성 폐질환에서 관찰되는 방사선 패턴, 예를 들어 벌집 모양, 중격 비후, 지역적 이질성 등과 유사합니다 ^1,2.

고해상도 컴퓨터 단층촬영(HRCT)은 임상 실무에서 특발성 폐섬유증(IPF)의 진단 및 종단 모니터링을 위한 핵심 영상 방식입니다. HRCT는 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro-CT)과 유사한 원리를 기반으로 하며^{, 환자의 방}사선 노출을 최소화하면서 실질성 폐 이상을 감지하도록 최적화되었습니다. 중요하게도, HRCT의 발전으로 진단 정확도가 향상되어, 특징적인 영상 특징^{이 존재할} 경우 IPF 진단에 외과적 폐 생검이 더 이상 필요하지 않게 되었습니다. IPF의 특징적인 방사선 소견, 예를 들어 구조적 왜곡, 견인 기관지확장증, 벌집 모양, 낭포성 공기 공간 등은 HRCT로 환자에서 확인할 수 있습니다. 이러한 임상 관찰과 일치하여, 우리의 페럿 모델은 미세 CT로 감지 가능한 기도 왜곡과 낭성 공역 형성을 보여주어, 인간 질병과 매우 유사한 영상 표현형을 제공합니다.

HRCT 외에도 기관지 내광 연쇄 단층촬영(EB-OCT)이 IPF 평가를 위한 유용한 영상 기법으로 부상했습니다²⁶. EB-OCT는 표준 기관지경²⁶을 통해 생체 내 말초폐의 고해상도 3차원 영상을 생성하기 위해 빛파를 이용한 최소 침습 기법입니다. HRCT와 유사하게, EB-OCT는 외과적 생검 없이도 섬유화 재형성을 식별하는 데 유망한 결과를 보여주었습니다. 우리 페럿 모델이 CT 기반 영상으로 감지할 수 있는 구조적 이상을 발견할 수 있는 능력은 EB-OCT와 같은 신흥 임상 영상 기법을 통한 향후 평가에도 적합할 수 있음을 시사합니다.

중요하게도, 설치류 모델에서 섬유증을 완화하는 많은 치료법들이 인간에서 유사한 효과를 입증하지 못했다는 점이다¹¹. 여기서 설명한 접근법은 구조와 기능을 모두 반영하는 민감하고 공간적으로 해상도 있는 영상 바이오마커를 제공함으로써 이 번역 간극을 해소하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 바이오마커는 전 지구적 콜라겐 부하를 넘어 치료 반응을 평가하는 데 사용될 수 있으며, 기도 역학이나 실질 재형성의 지역적 개선을 포착할 수 있습니다.

결론적으로, 본 연구는 페럿의 폐섬유증을 모델링하고 마이크로 CT를 이용해 질병 관련 구조 및 기계적 변화를 정량적으로 평가할 수 있는 실현 가능한 프로토콜을 확립합니다. 비록 초기 단계이지만, 이 접근법은 대형 동물 모델과 첨단 영상 분석을 결합하여 번역적 관련성을 높이고, 폐섬유증의 기전적 이해를 향상시키며, 새로운 치료 전략의 전임상 평가를 지원할 수 있는 잠재력을 강조합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 mL Luer locking syringe	BD	309628
10 mL Luer locking syringe	BD	303134
24 G ´ 3/4" Exel safelet catheter	EXELINT INTERNATIONAL CO.	26751
3 mL Luer locking syringe	BD	309657
30 mL Luer locking syringe	BD	302832
5 mL Luer locking  syringe	BD	309647
BD Precision glide needle 18 G ´ 1 1/1"	BD	305196
BD Precision glide needle 20 G ´ 1"	BD	305175
BD Precision glide needle 23 G ´ 1"	BD	305145
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS -/-)	Gibco	14190250
Endotracheal intubation tubes with cuff oxygen catheter	Caphstion	2.0MM
ET Tube, Uncuffed, 2.0	Teleflex	5-10404
Ethicon Permahand silk suture, Size 2-0, No Needle, 18", 36/Box, A185H	Fisher Scientific	50-209-2809
Invitrogen RNAlater stabilization solution	Fisher Scientific	AM7021
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Lubricant PM ointment	AACE Pharmaceuticals	71406-124-35	눈 연고
MADgic 700 atomizer	Teleflex	MAD700
Manometer, Professional air pressure meter	Leaton	T168
Rodent ventilator model 683	Harvard Apparatus, Inc.	55-3438
Sterile saline, 0.9%	CellPro	DS0329
Veterinary pulse oximeter	uPM60V	UVMI