간종 세포에서 유사분열 중 지질 방울과 소기관의 역학을 시각화하는 형광 기반 방법

요약

이 프로토콜은 동기화된 간종 세포를 이용해 유사분열 중 지질 방울과 소기관 역학을 재현 가능하게 합니다.

초록

세포 내 지질 방울(LDs)은 여러 세포 유형에서 널리 존재합니다. LD는 트리아실글리세롤과 콜레스테릴 에스터와 같은 중성 지질을 저장하며, 에너지 대사, 신호 전달, 스트레스 반응에서 중요한 역할을 합니다. LD는 세포 내 소기관으로 인식되고 있지만, 세포 주기 진행 중 그 행동은 여전히 명확하지 않습니다. 유사분열 과정에서 미토콘드리아와 골지체 등 여러 소기관이 광범위한 재형성과 재조립을 겪으며, LD도 세포 주기 의존적 변화를 겪는지 의문이 제기된다. LD는 에너지원이자 신호 전달 허브 역할을 할 수 있기 때문에, 유사분열 중 이들의 역학을 명확히 하는 것이 특히 중요합니다. 이를 해결하기 위해 간종 세포에서 세포 주기 동기화와 형광 LD 염색을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 세포는 사이클린 의존성 키나제 1 억제제 기반 접근법으로 G2/M 경계에서 동기화되어 세포 주기에 방출되고 특정 시점에 수집됩니다. LD는 중성 지질 염료로 표지하고 형광 현미경으로 시각화됩니다. 이 방법은 유사분열 중 LD 재분포를 재현 가능하게 하여 소기관 생물학, 대사 조절, 암세포 생리학 연구에 폭넓게 적용할 수 있습니다.

서론

세포 주기는 염색체 DNA의 정확한 복제와 분리를 보장하는 매우 조직적인 사건입니다 ^1,2 이 과정에서 세포 내 소기관이 동적으로 재조직됩니다³. 이 단계는 G1, S, G2, 그리고 M ^1,2의 네 주요 단계로 구성되어 있습니다. 유사분열 동안 중복된 염색체는 양극성 방추의 적도면에 정렬되어 두 개의^딸세포로 옮겨집니다. 미토콘드리아와 골지체 같은 소기관은 ^5,6,7,8 단계의 유사분열 동안 광범위한 재형성을 겪습니다. 이 소기관들은 작은 소포로 분해되어 두 딸세포로 분포되고, 이후 세포주기³에 걸쳐 재조립됩니다.

지질 방울(LDs)은 중성 지질의 핵과 인지질 단일층으로 둘러싸여 있는 중성 지질 함유 소기관입니다. 이들은 다양한 단백질 집합과 연관되어 있으며, 증식 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 널리 발견됩니다 ^9,10. LDs의 단백질과 지질 조성은 세포 및^{조직 유형에} 따라 다릅니다. 이들 단백질 중 페리리핀(PLIN) 계열이 광범위하게 연구되었으며, PLIN2는 간세포 내 LD를 안정화시킵니다^12,13. 구조 안정화 외에도, PLIN 계열 단백질은 LD 역학 조절과 다른 세포 구성 요소와의 상호작용에 관여하는 것으로 알려져 있습니다¹⁴. LD는 트리아실글리세롤과 콜레스테릴 에스터의 저장고일 뿐만 아니라 에너지 대사⁽¹⁵), 신호 전달 경로⁽¹⁶), 스트레스 적응(¹⁷)의 허브 역할도 합니다. 대사 기능 장애 관련 지방간염(MASH, 이전 명칭 NASH)과 같은 병리적 상태에서는 LD 축적이 건강한 대조군에 비해 현저히 증가하여 질병 생물학에서 그 중요성을 강조합니다^18,19. 그러나 미토콘드리아, 소포체, 골지체 기관의 유사분열 중 역학에 대한 광범위한 연구에도 불구하고, 분열 세포에서 LDs의 공간적 위치 측정은 제한적이었다. 우리는 여기서 제시한 방법을 사용하여 유사분열 중 LD 위치화를 분석했습니다. 우리는 이전에 LD가 다른 세포 내 소기관과 구별되는 공간적 분포 패턴을 보인다는 것을 보고한 바 있다²⁰.

여기서는 간종 세포에서 유사분열 중 LDs와 기타 세포내 소기관의 분포를 조사하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 세포 주기 동기화와 형광 염색을 포함하여 유사분열 중 LD 역학을 재현 가능하게 합니다. 대표적인 결과는 LD가 간기와 유사분열 사이에 세포 주기 의존적 공간 분포 변화를 보임을 보여주며, 세포 분열 중 LD 위치 분석에 대한 비교 분석을 용이하게 합니다. 이 접근법은 생리학적·병리학적 맥락 모두에서 소기관의 위치, 동역학, 대사 조절을 연구하는 데 널리 적용될 수 있습니다.

프로토콜

1. 이 프로토콜에 필요한 기본 솔루션

1. 150 mM NaCl에 용해된 24% 지방산 프리 소 알부민(BSA) 용액을 준비합니다.
2. 멸균 조건에서 DMSO에 용해한 10 mM RO-3306(선택적 사이클린 의존성 키나제 1(CDK1) 억제제) 스톡 용액을 준비합니다.
   참고: NaOH, NaCl, 인산 완충 식염수(PBS)와 같은 다른 일반적으로 사용되는 용액들은 표준 실험실 관행에 따라 조제되었습니다. PBS는 증류수에서 NaH₂PO₄·2H₂O 2.6g, Na₂HPO₄·12H₂O 29g, NaCl 80g, KCl 2.0g을 증류수에 용해시키고 최종 부피를 1L로 조절하여 제조했습니다.

2. BSA와 결합된 올레산 제제

1. 50mL 비커에 올레산 90mg을 넣고 에탄올 2mL(99.5%)를 넣어 녹입니다.
2. 용액에 5 N NaOH 100 μL 넣고 완전히 섞일 때까지 저어줍니다.
3. 질소 가스 흐름 아래에서 에탄올을 증발시킵니다.
4. 150 mM NaCl 10mL를 추가하고 60°C에서 5분간 배양합니다.
5. 얼음에 냉각된 24%(w/v) BSA 스톡 용액 12.5mL를 천천히, 떨어지는 방식으로 올리산 용액(2.4)에 넣고, 혼합물을 10분간 부드럽게 저어 상온에서 점진적이고 균일하게 혼합할 수 있도록 합니다.
6. pH를 7.4로 조절하고 최종 부피를 150 mM NaCl과 함께 25mL로 만듭니다. 최종 올레산 농도는 12.8 mM입니다.
7. 0.22 μm 필터를 통해 멸균 조건에서 용액을 걸러내고, 알리쿼트를 4 °C에서 최대 2주간 보관하며, -20 °C에서 보관하면 더 오래 보관합니다.

3. 세포의 G2/M 경계 동기화

1. 필요한 조작 장치를 준비하세요.
   1. RO-3306 처리가 없는 비동기 세포를 기초 대조군으로 준비합니다.
   2. 올레산 처리 조건의 경우, 동기화 없이 올레산만 처리한 세포를 기저선 대조군으로 준비합니다.
   3. 형광 염색의 경우, 각 형광체에 대해 단일 염색 대조를 수행하여 신호 특이성을 확인하고 채널 간 스펙트럼 중첩을 제거합니다(보충 그림 1).
   4. 스펙트럼 중첩과 채널 크로스톡을 최소화하기 위해 순차 획득 설정이나 적절한 필터 구성을 사용하여 이미지를 획득합니다.
      참고: 이 대조군들은 세포 주기 의존적 변화와 기저선 소기관 분포를 구분하고 형광 특이성을 검증하는 데 필수적입니다.
2. Dulbecco의 변형 이글스 배지에 HuH7 세포를 10% 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 유지합니다.
3. 유리 커버슬립을 35mm 배양 접시에 넣으세요. 위에서 설명한 배지에 35mm 접시당 10개의⁵ 세포 2개× 씨앗을 뿌리고, 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 배양합니다.
4. 세포를 PBS로 두 번 세척한 후, 9 μM RO-3306과 0.5 mM 올레산이 포함된 신선한 배양지로 배양합니다.
5. 표준 배양 조건에서 세포를 20시간 배양합니다.

4. 동기화된 세포에서 RO-3306 시약을 제거하여 유사분열기에 진입

1. PBS와 함께 세척 셀(3.4단계)을 3번에서 5번 사용하세요.
2. 세포를 신선한 배양지로 한 번 세척하세요.
3. 세포를 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C의 신선한 배지에 1시간 배양하여 유사분열에 진입할 수 있도록 합니다.
   참고: RO-3306을 제거하면 동기화된 세포가 G2/M 경계에서 유사분열기에 진입할 수 있습니다. 시약을 씻어낸 후, 상당수의 세포가 약 1시간 이내에 유사분열기에 진입하며, 이 기간 동안 세포 둥글림과 염색체 응축을 통해 유사분열 세포를 식별할 수 있습니다. 유사분열의 특정 단계를 관찰하는 최적의 시기는 세포 유형과 배양 조건에 따라 달라질 수 있습니다.

5. 유사분열 세포 샘플 준비

1. 4% 파라포름알데히드가 포함된 세포를 PBS에 10분간 상온에서 고정합니다.
   주의: 유사분열 세포는 접시에서 떨어져 나가는 경향이 있습니다; 고정 전에 세척하는 것을 피하세요.
   참고: PLIN3 염색 시 세포는 2% 파라포름알데히드와 2% 글루타알데히드의 혼합으로 고정되었습니다.
2. 0.1% (w/v) Triton X-100을 PBS에 넣어 상온에서 10분간 고정 세포를 투과시킵니다.
3. 1% BSA를 PBS에 넣어 상온에서 1시간 동안 차단합니다.

6. LD 및 기타 세포 소기관 염색

1. 미세한 겸자로 배양 접시에서 유리 커버슬립을 조심스럽게 제거하고, 건조를 방지하기 위해 세포 면을 위로 향하게 하여 가습 챔버에 보관하세요.
   참고: 이후 모든 염색 단계는 형광 신호를 보존하기 위해 가습되고 빛이 차단된 환경에서 수행해야 합니다.
2. 세포를 PBS로 두 번 세척하고, PBS에 희석된 1차 항체와 함께 실온에서 1시간 인큐베이팅합니다.
3. PBS로 세포를 두 번 세척하고, PBS에 희석된 2차 항체와 상온에서 1시간 인큐브합니다.
4. 세포를 PBS로 두 번 세척한 후 중성 지질 형광 염료로 실온에서 10분간 염색합니다.
   참고: 유연한 다색 이미징을 가능하게 하고 다른 소기관과의 스펙트럼 중복을 최소화하기 위해 뚜렷한 스펙트럼 특성을 가진 염료를 선택했습니다.
5. PBS로 세척 세포를 두 차례 사용하고, DNA 결합 형광 염료(DAPI: 여기, 350–410 nm; 방출, 420–450 nm)로 염색 핵을 두 번 사용하고, PBS에서 1:1,000 희석하여 5분간 사용했습니다.
6. PBS로 세포를 두 번 세척한 후, 표지 슬립을 안티페이드 마운팅 매체를 사용해 유리 슬라이드에 부착하여 영상 촬영 중 형광을 보존합니다.
7. 커버슬립 가장자리를 투명 매니큐어로 밀봉하여 영상 촬영 중 건조와 움직임을 방지하세요.
   참고: 형광 신호는 점차 희미해지므로, 염색 후 1주일 이내에 이미지를 획득하세요.

7. 세포 내 소기관과 그 세포 내 위치 관찰

1. 광시야 형광현미경을 이용해 여러 세포를 신속히 선별하고 대표적인 간기 및 유사분열 세포를 선별하며, 낮은 여기 강도와 빠른 획득 설정을 사용하여 광표백을 최소화합니다.
2. 형광 염색 분석을 위해 적절한 배율로 선택한 세포의 이미지를 획득하세요.
   참고: 간기 세포는 일반적으로 세포질 중앙에 위치한 온전한 단일 핵을 보입니다. 반면, 유사분열 세포는 양극 방추의 적도 평면에 응축된 염색체를 보입니다. 이러한 형태학적 특징은 간기 세포와 유사분열 세포를 구별하는 시각적 기준으로 활용될 수 있습니다.
3. 광시야 형광현미경을 통해 중성 지질 형광염료와 DNA 결합형 염료에 적합한 필터 세트를 사용하여 LD와 핵 형태를 시각화합니다.
   참고: 사용되는 현미경 시스템의 사양에 따라 필터 세트를 선택하세요.
4. 고해상도 검증을 위해서는 고수치 구경 대물렌즈(예: 60×, NA ≥1.2)가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 형광 이미지를 획득하십시오. 적절한 여기 레이저와 방출 필터 설정을 사용하여 중성 지질 형광 염료와 DNA 결합 형광 염료의 형광 신호를 검출합니다. 일반적으로 사용 가능한 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다.
   참고: 현미경 시스템에 따라 수중 또는 오일 침수 대물렌즈가 사용될 수 있습니다. 침지 매체의 선택은 제조사의 권고와 실험 목적을 따라야 합니다. 광시야 형광 현미경은 간기 세포와 유사분열 세포 간 LD 분포의 일상적인 관찰과 비교에 적합하며, 더 높은 공간 해상도가 필요할 때는 공초점 현미경이 권장됩니다.

8. LD의 수와 크기의 정량화

1. 모든 조건에서 동일한 영상 설정으로 세포의 형광 이미지를 획득합니다.
2. 이미지 분석 소프트웨어로 획득한 이미지를 열어보세요.
3. LD를 식별하기 위한 적절한 임계값을 설정하고, 지질 방울 수와 면적을 정량화하기 위해 입자 분석을 수행하세요.
   참고: 영상 매개변수는 LD 수와 면적의 정확한 비교를 위해 모든 조건에서 일정하게 유지되어야 합니다.

결과

RO-3306을 이용한 G2/M 경계에서의 간종 세포 동기화

유사분열 중 세포내 소기관의 역학을 조사하기 위해, 선택적 CDK1 억제제인 RO-3306을 사용해 G2/M 경계^20,21에서 세포를 동기화시켰습니다. CDK1 억제제로 20시간 처리한 후 신선 배지에서 추가로 1시간을 투여했을 때, 세포의 50% 이상이 G2/M 경계에서 동기화되었습니다(그림 1). RO-3306을 제거함으로써 세포가 세포 주기에 진입할 수 있게 됩니다. 시약을 씻어내기 전, HuH7 세포는 상피세포와 유사한 형태를 보였습니다(그림 2). RO-3306을 세척한 지 1시간 후, 유사분열 세포는 둥근 형태를 보였고 부분적으로 접시에서 분리되어 이후 분석에서 식별이 ...

토론

유사분열 중 관찰된 LDs 재분포는 LD의 위치가 무작위가 아니라 세포골격 재조직 및 세포 주기 진행과 조화를 이루고 있음을 시사합니다. 특히, LD가 방추 영역에서 제외되는 것은 유사분열 방추체 조립이나 세포 분열 중 소기관 분리를 유지하는 능동적 수송 메커니즘에 의해 부과되는 공간적 제약을 반영할 수 있습니다. 본 연구에서는 세포 분열 중 LD를 시각화하면서 유사분열 세포를 면역형광 염색을 준비하는 간단하고 재현 가능한 접근법을 제시합니다. LD 시각화를 위해 스펙트럼적으로 구별되는 두 가지 중성 지질 염료(녹색 형광과 적색 형광)를 사용했습니다. 이러한 프로브의 기존 사용 외에도, 이 프로브들은 스펙트럼 특성에 따라 선택되어 다른 형광 마커와의 유연한 조합이 가능했습니다. 구체적으로, 이 염료들은 녹색 또는 적색 채널 중 어느 쪽에서도 LD를 표지할 수 있게 하며, 다색 영상 실험에서 다른 소기관과의 스펙트럼 중복을 최소화합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.25% Trypsin/EDTA	Wako	201-16945	세포 분리
10 cm 접시	Corning	430167	세포 배양
35 mm 조직 배양 접시	IWAKI	3000-035	세포 배양
6 cm 조직 배양 접시	IWAKI	3010-060	세포 배양
Anti-PLIN2 (ADRP) 항체	Proteintech	15294-1-AP	지질 방울 마커
Anti-PLIN3 (TIP47) 항체	Proteintech	10694-1-AP	지질 방울 마커
Anti-α-tubulin 항체	Sigma-Aldrich	T6199	유사분열 방추 마커
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	중성 지질 염색
병 상단 필터 (0.22 μm)	NEST	WNB343001	OA–BSA 용액의 멸균 여과
우 혈청 알부민 (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	차단 시약
클리어 네일 폴리쉬	상업적으로 사용 가능	해당 없음	덮개 유리 슬라이드 밀봉
콘포컬 현미경	Olympus	FV1200	고해상도 이미지
DAPI	Dojindo	340-07971	핵 염색
D-PBS (–)	Wako	049-29793	세포 배양
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Wako	041-30081	세포 배양 배지
에탄올 (99.5%)	Wako	057-00456	올레산 용매
지방산 프리 BSA	Sigma-Aldrich	A7030	올레산의 운반 단백질
태아 소 혈청	Gibco	10270-106	배지 보충
형광 2차 항체 (Alexa Fluor–결합)	상업적으로 사용 가능	해당 없음	면역형광을 위한 종 특이적 2차 항체
FV10-ASW 소프트웨어	Olympus	해당 없음	이미지 획득 및 처리
유리 덮개 슬라이드 (φ15 mm)	Matsunami	2-176-03	현미경 씨앗 파종
유리 현미경 슬라이드	Matsunami	SFF-001	덮개 슬라이드 장착용 유리 슬라이드
글루타르알데하이드 (25% 용액)	Wako	073-00536	PLIN3의 대체 고정
HuH7 세포	JCRB 세포 은행	JCRB0403	인간 간세포종 세포주
LipidTOX Red 중성 지질 염색	Invitrogen	H34476	대체 지질 방울 염색
질소 가스 (N2)	상업적으로 사용 가능	해당 없음	에탄올의 증발
올레산	Sigma-Aldrich	O1383	올레산-BSA 접합체 제조용
파라포르말데히드, PBS에 4%	Nacalai Tesque	09154-85	고정
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15140-122	항생제
인산염 완충 식염수 (×10)	해당 없음	해당 없음	모든 공급업체로 대체 가능
RO-3306	Sigma-Aldrich	SML0569	G2/M 동기화를 위한 CDK1 억제제
SlowFade Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	S36963	마운팅 매체
나트륨 염화물 (NaCl)	Wako	191-01665	150 mM NaCl 준비
수산화 나트륨 (NaOH)	Wako	080-01061	올레산의 사포니피케이션에 사용
Tali 세포 분석 슬라이드	Thermo	T10794	세포주기 분석에 사용
Tali 이미지 기반 사이토미터	Thermo	해당 없음	세포주기 분석에 사용
트리톤 X-100	Sigma-Aldrich	T8787	세포 투과
와이드필드 형광 현미경	KEYENCE	BZ-9000	유사분열 세포의 빠른 스크리닝