옥수수 감수세포에서의 3차원 면역 위치

요약

이 수컷 옥수수 감수세포의 면역 국소화 프로토콜은 감수분열 동안 세포의 3차원적 완전성을 유지합니다. 이 방법은 보존된 파라포름알데히드 고정 물질 내에서 최대 세 개의 독립 항체의 세포 내 위치를 동적으로 추적할 수 있게 하며, DNA를 염색하는 DAPI도 포함됩니다.

초록

감수분열 전기 I에서는 염색체의 물리적 구성이 발달 단계마다 크게 다르지만, 다행히도 이러한 단계별 구성 덕분에 각각 렙토텐(예: '가느다란 실'), 접합체(예: '결합된 실'), 파키텐(예: '두운 실'), 디플로텐(예: '이중 실'), 이악 분열(예: '반발 운동')로 알려진 고전적 감수분열 단계를 올바르게 식별할 수 있다. 재조합, 쌍, 시냅스 등 전상 1기 동안 발생하는 여러 세포유전학적 현상의 시각적 분석은 매우 신뢰할 수 있는 면역 위치화 기법을 필요로 합니다. 모든 세포 내 및 핵 이하 정보를 억제하는 전통적인 확산 및 압착 기법과 달리, 여기서 설명하는 3D 보존 절차는 주요 감수분열 단백질을 원래 세포 내 위치 부위(세포질, 핵, 아핵: 유크로마틴, 이종 크로마틴, 핵 단백질)에 보존할 수 있게 합니다. 따라서 이 프로토콜은 감수분열 꽃약을 효율적으로 고정하고, 감수세포를 해부하여 방출하며, 옥수수 수컷 감수세포에서 세 가지 핵심 단백질의 동시 면역 위치화를 수행하는 방법을 설명합니다.

서론

감수분열은 모델 식물과 작물에서 형질 전달을 조절하는 핵심 과정입니다; 따라서 단백질 위치를 일관되고 충실하게 시각화할 수 있는 간단한 현미경 방법은 이러한 형질이 어떻게 더 효율적으로 전달될 수 있을지 이해하는 데 도움을 줍니다. 안타깝게도, 감수세포 내 단백질의 위치 시각화는 사용되는 기술에 따라 크게 달랐습니다 ^1,2. 따라서 이 프로토콜의 목표는 감수세포 관찰 중 아티팩트를 제거하는 간단하고 재현 가능한 방법을 제공하는 것입니다. 예를 들어, 감수분열 염색체 관찰은 단순한 눌림 또는 더 파괴적인 확산 기법(^3,4,5)으로 세포를 분쇄하여 촉진되는 섬세한 과정임이 오랫동안 인정되어 왔습니다. 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서는 연구자들이 흔히 카르노이 고정제(에탄올과 아세트산의 3:1 혼합물)와 립솔(Lipsol), 트윈-20(Tween-20), 트라이톤X-100(TritonX-100) 같은 세제, 셀룰라아제, 펙티나아제, 사이토헬리카제를 포함한 효소 혼합물을 이용한 확산 방법을 사용하여 세포를 분해하고 작은 염색체에서 효과적인 면역 위치 형성을 가능하게 합니다 ^1,2. 이 기법들은 3D 염색체 구조를 2차원 형태로 변환하여 인위적으로 분산된 전체 염색체를 한 이미지에서 빠르게 관찰할 수 있게 합니다. 이러한 가혹한 치료를 견디는 염색체의 특정 특징이 뚜렷하게 나타날 수 있습니다; 하지만 이들은 종종 6생체 내 세포와 염색체의 전형적인 행동을 나타내지 못^합니다. 옥수수 7,8,9,10,11을 포함한 다양한 식물 종에서 2D 확산 기법을 통해 최대 두 개의 항체를 빠르고 광범위하게 검출할 수 있습니다.

그럼에도 불구하고, 기존 2D 기법의 편리함에도 불구하고, 일부 현상은 파괴적 방법에 민감하며, 세포, 핵, 염색체가 확산되거나 눌리는 과정에서 손상되면 관찰할 수 없다는 점이 인정되고 있습니다. 예를 들어, 렙토텐 단계나 중심체 결합(렙톤종/지고네마) 동안 RAD50 단백질이 세포질에서 핵으로 이동하는 현상은 온전한 3D 감수세포에서만 관찰되었습니다¹². 여기서 독자들은 4% 파라포름알데히드에 고정된 꽃찌를 사용해 옥수수 수컷 감수세포의 세 가지 핵심 단백질을 면역국소화하여 구조적 완전성을 보존하는 상세한 4일 3D 프로토콜을 제공합니다. 유사한 옥수수 3D 면역국소화^방법론과 비교하면, 연구자들을 위한 실용적인 노트와 문제 해결 팁을 추가했습니다. 이 프로토콜은 시냅톤 복합체에 의한 감수분열 재조합 조절과 같은 다양한 감수분열 과정을 연구하려는 식물 생물학자와 육종가들의 연구에 도움이 될 것입니다.

프로토콜

주의: 적절한 개인 보호 장비와 화학 후드를 사용하여 포름알데히드와 아크릴아마이드를 다룰 것; 두 성분 모두 독성이 있습니다(아크릴아마이드도 중합 전에는 신경독성입니다). 연구에 사용된 모든 자료는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 감수세포의 온전한 구조를 보존하기 위한 옥수수 꽃약의 고정

1. 꽃차례가 아직 줄기 안에 자라는 V13 단계의 옥수수 식물을 사용하세요. 감수분열 주간 동안 장갑을 끼고 부드럽게 부드럽게 줄기를 눌러서 부드럽고 잘라낼 수 있는지 확인하세요.
   참고: 이 고정 및 면역 위치 지정 프로토콜은 옥수수와 애 기장대(Arabidopsis thaliana thaliana taliana ) 감수분열 꽃봉오리(400 μm 미만) 모두에 적용될 수 있습니다. 하지만 옥수수의 경우, 사용되는 품종과 계절에 따라 다르지만(봄에 더 빠른 성장이 있습니다), 기준 근친교배 계통 B73은 심은 후 약 8주가 걸리지만, 조기 개화 계통 A344는 단 6주에 불과합니다.
2. 완충제 준비.
   참고: 화학적 고정 전날에는 다음과 같은 작동 용액을 준비하고 신중하게 사용하며, 모든 병에 라벨을 제대로 붙이세요.
   1. 100 mL의 10x 완충 A(BA) 염을 준비하는데, 최종 농도 150 mM의 4.53 g PIPES(피페라진-N, N′-bis, 2-에탄설폰산), 5.96 g KCl(최종 농도 800 mM), 1.17 g NaCl(최종 농도 200 mM), 0.74 g EDTA(최종 농도 20 mM), 0.19 g EGTA(최종 농도 5 mM), 90 mL H₂O를 첨가하여 준비합니다. 먼저 KOH로 pH를 6.8–7로 조절한 후, 부피를 100mL로 조절합니다.
   2. 마지막으로, PES 두께 0.45 μm (4 °C에서 보관하되 얼리지 말고, 몇 달간 보관할 수 있음)의 일회용 Rapid-Flow 멸균 필터를 사용해 소독하세요.
   3. 준비하세요:
      -50 mM 파이프 (KOH를 사용해 pH를 7로 조정).
      - 0.4M 농도의 정자민 재고 (이전에 50 mM 파이프에 용해, KOH로 pH를 7로 조절, -20 °C에서 50 μL 알리코틀 보관).
      - 0.4M 농도의 스페르미딘 재고 (50 mM 파이프에 용해, KOH로 pH를 7로 조절, 125 μL 얼린 알리코트 보관, -20°C).
      - 디티오트레이톨(DTT) 1M 재고 (0.01M 아세테이트 나트륨에 용해, pH 5.2로 설정, -20 °C에서 100 μL 얼린 알리코트 보관).
      - 소르비톨 2 M, 4 °C에서 유지.
3. 얼음 위에 2x 버퍼 A(BA) 50mL를 준비하고, 10mL 10x 버퍼 A 염(4°C에서 보관), 50 μL 정자(50 mM 파이프에 0.4 M, KOH로 pH 7 조절), 125 μL 스퍼미딘(50 mM PIPES에 0.4 M, KOH로 pH 7 조절) 100 μL DTT(1 M, 0.01 M 아세테이트 나트륨, pH 5.2)가 격렬하게 소용돌이를 일으켜 용해합니다; 그리고 가열하지 않습니다.
   1. 그 다음 2M 소르비톨 16mL를 추가합니다. 최종 부피를 멸균수로 50mL로 조절하세요. 일회용 Rapid-Flow 멸균 필터를 사용해 필터 멸균하고 4°C에서 보관하세요.
4. 5장에서 10장의 가습 종이 타월을 플라스틱 상자에 넣어 습한 챔버를 준비하세요. 뚜껑이 잘 밀봉되는지 확인하세요. 과도한 물은 제거하세요.
5. 그 다음 쟁반에 다음 물품을 넣으세요: 습한 챔버, 면도날, 70% 에탄올로 멸균된 미세한 겸자, 멸균수 한 병, 마스킹 테이프. 트레이와 그 내용물을 1.1단계에서 확인한 옥수수 식물로 가져가세요.
6. 면도날로 꽃차례 높이에서 울퉁불퉁한 줄기를 잘라내세요. 주요 술 가지와 꽃차례의 측면 가지는 감수분열 꽃을 수확하는 데 사용할 수 있습니다.
   참고: 이 술 가지에는 감수분열 꽃서를 수집하는 데 관심 있는 꽃송이가 들어 있습니다. 각 꽃봉오리에는 여섯 개의 꽃약이 있으며, 위쪽에 있는 세 개의 더 큰 꽃약이 보통 분석에 사용됩니다. 화의 대략적인 크기와 색상은 각 감수분열 단계에 따라 다릅니다. 길이 약 1mm의 거의 투명한 꽃약은 렙토텐 단계에 있고, 반투명한 꽃藥(길이 1.5mm)은 접합 단계에, 2 mm 길이의 희끄는 꽃가는 파키텐 단계에 있으며, 길이 > 2mm의 노란 꽃약은 디플로텐, 사각형, 꽃가루 알갱이 있어 배우자 형성을 마무리할 수 있습니다. 옥수수 유전적 배경마다 또 다른 길이-단계 상관관계가 달라질 수 있으며, 환경적 요인(예: 고온)이 감수분열 진행을 가속화하고 이 관계를 변화시킬 수 있다는 점에 유의하세요. 연구자들은 각 특정 옥수수 유전자형과 성장 조건에 대한 다른 크기 단계 상관관계를 검증할 것을 권장합니다(아세토카민 눌러짐, cf 1.6을 통해).
7. 가는 겸자를 사용해 꽃차례의 측면 가지를 해부하고 조심스럽게 모아 습한 방의 종이 타월 안에 감싸세요.
   참고: 연습을 통해 줄기에 3–4cm 정도의 짧은 직선 절개만 있으면 감수분열 술의 가지를 뽑을 수 있습니다. 이 절개 부위는 표준 마스킹 테이프로 세 번에서 네 번 감아 닫을 수 있는데, 이 경우 남은 해부되지 않은 꽃차례를 사용해 같은 식물을 수확할 수 있습니다. 조직은 계속 성장하며 나중에는 수분에 사용될 수 있습니다.
8. 챔버를 실온에 유지하세요. 감수분열 단계에서 꽃송이가 있는 꽃차례 가지만 사용하세요. 가지를 습한 수건의 절반으로 덮으되, 물에 담그지 마세요.
9. 수건이 마르면 다시 가습하세요. 꽃약을 해부할 때까지, 가능하면 개골 채취 시작 30분 전까지는 상자를 닫아두세요.
10. 보정된 눈금이 장착된 쌍안 입체 현미경을 사용해 꽃포에서 신선한 꽃약을 2mL 1x BA에 35mm 페트리 접시에 담아 감수분열 단계를 정확히 식별하여 크기와 색상의 대리 지표로 확인합니다.
    참고: 샘플링된 꽃약에서 감수세포 단계를 정확히 결정하기 위해, 각 꽃집당 3개의 동기화된 꽃약체 중 하나를 3:1 에탄올-아세트산 고정, 아세토카민 염색, 전통적인 호박 현미경¹³을 통해 신속히 분석합니다.
11. 4% 포름알데히드 고정제를 1x BA와 0.0025% Tween-20에 준비합니다
    참고: 3mL의 경우 포름알데히드 750 μL 16%, H₂O 750 μL H, 1.5 mL 2x BA, 7.5 μL Tween-20 1% 첨가.
12. 초기 BA 완충제를 제거하고 이 신선한 고정액 3mL를 단계화된 화제에 추가한 후, 포름알데히드 증발을 방지하기 위해 파라필름으로 밀봉한 새로운 35mm 페트리 접시 안에 45분간 고정한 후, 회전식 셰이커(40–60rpm으로 설정)에 놓인 더 큰 페트리 접시에 올려놓습니다. 또는 0.2 x g). 실온에서 하세요. 앤서가 약간 소용돌이치도록 고정해야 합니다. 보통 수면 위에 떠 있습니다.
13. 1x BA 3mL로 세척한 후 샘플을 작은 페트리 접시에 옮긴 뒤, 실온에서 회전식 셰이커(40–60rpm)에 45분간 올려놓습니다.
14. 깨끗한 겸자를 사용해 신선한 3mL 1X BA가 들어있는 작은 35mm 페트리 접시에 옮깁니다. 페트리 접시를 파라필름으로 단단히 밀봉하세요. 그 다음 작은 페트리 접시를 페트리 접시 안에 보관하고, 알루미늄 호일로 덮어 어둠 속에 두고, 사용 전까지 4°C에 보관합니다. 필요하다면 몇 달간 보관할 수도 있습니다.

2. 옥수수 감수세포를 폴리아크릴아마이드 샌드위치 패드에 삽입하는 것

1일차: 3D 슬라이드 준비

1. 아크릴아마이드 용액 2mL를 같은 부피(1:1)와 2x BA를 혼합하여 준비합니다. 황산나트륨(NaS)과 과황산암모늄(APS)을 첨가하기 전에, 아크릴아마이드 용액을 진공 상태에서 5–10분간 탈기합니다.
2. 아크릴아마이드와 2개의 BA 1:1 비율 혼합물을 1.5 mL 튜브에 피펫팅하여 알리코트합니다.
   준비하는 튜브 수는 준비할 슬라이드의 수에 따라 달라집니다.
3. 1mL 1x BA를 만드세요.
4. 페트리 접시 위에 2cm x 2cm 크기의 파라필름을 덮은 뒤 해부 현미경 아래에 두세요. 50 μL 백색농액과 앤더를 파라필름에 피펫 흡입. 피펫 끝을 가위로 다듬어 넣기 쉽게 하세요.
   1. 25 μL BA 용액을 다른 곳의 파라필름에 피펫 주입.
5. 겸자로 꽃골을 고정하고, 메스로 꽃골 끝을 잘라내서 감수세포를 부드럽게 짜내세요. 피펫으로 감수세포를 25 μL BA 드롭에 부드럽게 옮기고 부드럽게 혼합합니다.
6. 감수세포 혼합물에서 10 μL를 별도의 커버 슬립에 피펫 흡입합니다.
7. 빠르게 피펫으로 20% (0.2g/1mL) NaS 5 μL 및 20% (0.2g/1mL) APS 5 μL 양을 1.5 mL 튜브에 아크릴아마이드/2x 버퍼 A를 넣습니다.
8. 위 혼합물을 5 μL을 빠르게 피펫 덮개 위에 옮기고 감수세포와 혼합합니다. 폴리-L-라이신 캡 커버슬립을 위에 올려놓되 45도 회전시키세요. 폴리-L-라이신 커버슬립 한 장만 사용하면(상업적으로 구할 수 있거나, 새 깨끗한 페트리 접시 가장자리에 폴리-L-라이신 용액에 몇 분간 담갔다가 건조시켜 만든 것) 중합 후 완전한 패드가 분리되는 데 도움이 됩니다. 커버슬립은 용액에서 빠르게 들어 올려 건조 후 사용 후에 사용됩니다. 초해상도 현미경을 위해서는 표준 두께(≤170 nm)의 고성능 커버슬립을 사용해야 합니다¹⁴.
9. 샘플이 실온에서 완전히 중합될 수 있도록 30분에서 50분 동안 커버슬립을 만지지 마십시오(빠른 중합 과정은 패드의 건조 기간을 단축시켜 결과물이 최적에 미치지 못합니다).
10. 준비하고 싶은 각 슬라이드마다 '2.6–2.9' 단계를 반복하세요.
11. 모든 커버슬립은 면도날로 조심스럽게 분리하세요. 모든 커버슬립을 패드 쪽이 위로 향하게 하여 폴리아크릴아마이드 패드(또는 대부분의 패드) 위에 올려놓고, 6웰 플레이트에 넣습니다.
12. 각 커버슬립을 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 2mL가 담긴 패드로 10분간 세척하세요. 이 세척을 한 번 반복하면 상온에서 총 20분 정도 세척할 수 있습니다.
13. 50 mL는 49.4 mL PBS 1x, 100 μL EDTA 0.5 M, 500 μL Triton을 혼합하여 준비합니다.
14. 각 커버슬립을 1mL에 1 mM EDTA와 1% 트리톤을 보충한 채 실온에서 2시간 동안 패드로 세척하세요.
15. 1x PBS, 1 mM EDTA, 0.1% Tween-20, 3% BSA(슬라이드당 1mL)를 포함한 신선한 블로킹 버퍼 배치를 준비합니다. 차단 완충액 50mL를 위해 PBS 1x 44mL, EDTA 0.5 M 100 μL, 1% Tween-20 용액 5 mL, BSA 1.5 g을 혼합합니다. BSA는 여러 주차항체와 2차항체를 사용할 때 비특이적 신호를 최소화하는 데 도움이 되기 때문에 당나귀 혈청보다 차단제로 선호됩니다.

3. 면역 국소화

1. 블로킹 버퍼를 사용해 원하는 희석 비율로 1차 항체(또는 항체)를 준비합니다. 1차 항체를 함께 사용할 때 서로 다른 신호를 생성하는 능력에 따라 결합하세요. 이들은 토끼, 쥐, 기니피그, 닭 등 특정 형광 표지된 2차 항체로 식별할 수 있는 다양한 생물에서 유래해야 합니다. 당나귀나 염소 항체는 2차 항체로 사용되기 때문에 피합니다. 우리는 단일 종의 2차 항체(예: 그림 1에 나타난 실험에서 염소)를 사용할 것을 권장합니다.
2. 이 희석된 1차 항체 50 μL을 각 커버슬립 중앙에 패드와 함께 넣습니다.
   우물 사이에 물을 넣어 증발을 늦추세요. 접시를 습한 챔버(뚜껑이 달린 플라스틱 상자)에 넣으세요. 하룻밤 떠나세요.

2일차: 세탁

3. 500mL의 워시 버퍼(1x PBS + 0.1% Tween-20 + 1 mM EDTA)를 준비합니다.
4. 피펫으로 흡입하여 웰에서 하룻밤 동안 묻은 용액을 제거하세요.
5. 각 커버슬립을 패드로 1mL 세척 버퍼로 두 번 빠르게 세척한 후 웰에서 꺼내세요.
6. 패드와 함께 커버슬립 1mL를 더 피펫팅하고 실온에서 1시간 동안 방치하세요.
   7번 더 반복하세요. (총 8시간)
7. 최종 세척 후에는 우물 사이에 물을 넣고, 플레이트를 덮은 뒤 습한 챔버에 하룻밤 두세요.

3일차: 2차 항체, 세척, 마운트 슬라이드

8. 2차 항체는 차단 버퍼에서 1:50 비율로 희석하여 준비합니다.
   세척액을 흡입하세요. 피펫을 사용해 각 패드 중앙에 희석된 2차 항체 50 μL을 분사합니다.
   참고: 모든 2차 항체는 방출 파장이 겹치지 않는 독특한 형광 염료와 함께 사용해야 합니다. 예를 들어, 2차 항체 중 하나는 AlexaFluor488(녹색), 다음 항체는 AlexaFluor555(주황색), 세 번째 항체는 AlexaFluor647(빨강)로 표지해야 하며, 이는 DAPI(461 nM에서의 흥분, 파란색)와 결합할 수 있습니다. DyLight(Dyomics GmbH)와 같은 다른 형광 염료도 사용할 수 있습니다. 또한, 이 모든 2차 항체는 1차 항체 혼합물에 사용되는 다른 종과 교차 반응을 일으키지 않아야 합니다. 예를 들어, 항토끼 2차 항체는 토끼 항체를 선택적으로 인식하도록 교차 적응되어야 하며, 쥐나 기니피그 항체를 인식하지 못해야 합니다. 모든 2차 항체도 마찬가지입니다. 공동면역국소화를 수행할 때 이 모든 요구사항을 동시에 검증하기 위해 잘 설계된 실험을 사용해야 합니다.
9. 우물 사이에 물을 넣고, 습한 챔버에 접시를 놓은 뒤 실온에서 2시간 동안 두세요.
10. 우물에서 용액을 흡입하세요.
11. 각 웰당 1mL를 사용해 4번의 세척을 수행하며, 각 세척액은 상온에서 1시간씩 사용하세요(총 4시간).
12. 각 웰을 1mL 1x PBS로 실온에서 10분간 세척한 후 이 과정을 두 번 더 반복합니다. (총 30분)
13. DAPI를 1x PBS에 희석하세요.
14. 최종 농도는 1 μg/mL DAPI(물에 녹인 DAPI 분말)로 실온에서 30분간 염색한 후 500 μL/우물에 넣습니다.
15. 4°C 냉동고에서 ProLong™ Gold 안티페이드를 꺼내 해동하고 실온에 도달할 시간을 주세요.
16. 슬라이드를 1x PBS에 실온에서 30분간 세척하고, 1mL/웰로 세척하세요. 두 번 더 해. (총 1시간 30분)
17. 마지막 세탁물을 제거하세요.
18. 그 다음 각 패드 중앙에 ProLong™ 골드 안티페이드 두 방울을 떨어뜨립니다.
19. 각 슬라이드에 덮개 슬립을 장착하고, 라벨을 붙인 뒤, 미세한 겸자로 뚜껑 슬립을 웰에서 들어 올려 천천히 슬라이드 위에 올려놓으세요. 가는 겸자를 사용해 두 번째 커버슬립을 천천히 첫 번째 위에 내리세요. 진공청소기를 사용해 커버슬립 가장자리에 남은 글리세롤을 제거합니다. 커버슬립 가장자리는 매니큐어를 두 번 바르며 밀봉하세요.
20. 슬라이드를 즉시 형광 현미경으로 검사하지 않는다면, -20 °C 냉동고에 빛을 차단한 채 관찰할 때까지 보관하세요. 이후에는 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 슬라이드 박스에 수평으로 어둠 속에 두어 결로를 방지합니다.

4일차: 현미경 관찰

21. 적절한 여기 파장과 필터 하에서 슬라이드를 관찰합니다. 표준 공초점 현미경으로도 충분하지만, 0.2 μm마다 z-스택을 사용해 전체 세포를 3차원 이미징하고, 순차적인 이미지 획득과 Applied Precision SoftWoRx^® 소프트웨어를 이용한 디컨볼루션 처리를 가능하게 하려면 60배 대물렌즈 현미경을 사용하는 것이 권장됩니다.

결과

이 프로토콜을 사용하면 옥수수 내 세 가지 주요 감수분열 단백질의 위치 패턴을 동시에 관찰할 수 있습니다(그림 1). 감수분열 단백질인 ABSENCE OF FIRST DIVISION 1(AFD1)은 감수분열 코헤신 복합체의 알파-클레이신 REC8 소단위체의 상동체입니다. ASYNAPTIC 1(ASY1)은 중요한 축 요소이며, ZYPPER1(ZYP1)는 시냅톤 복합체¹⁵의 횡단적 요소입니다. DAPI 염색은 명확한 핵과 염색질을 보여 감수분열 하위 단계를 인식할 수 있게 하지만, 플라스티드와 미토콘드리아의 DNA에 대한 더 희미한 자연 세포질 염색도 보입니다(그림 1A와 C, DAPI 채널 두 번째 열, 화살촉). 마찬가지로, 이 프...

토론

이 프로토콜은 감수분열 염색체 단백질 로딩에 관한 필수 3차원 데이터를 보존한다는 점에서 다른 프로토콜에 비해 중요한 장점을 제공합니다. 이러한 특징들은 일반적인 확산 기법으로는 보존할 수 없습니다^{. 1,2}. 그럼에도 불구하고 이 프로토콜에는 두 가지 한계가 있습니다: 하루 이내에 시행하는 일반 전파 기법에 비해 느리고 기술적으로 까다롭습니다. 반면, 저희 프로토콜은 4일간의 작업이 필요하며, 이는 광범위한 세척 단계와 1차 및 2차 항체의 하룻밤 배양 때문이며, 이를 단축하면 신호 대 배경 반응 비율이 손실됩니다.

기술적인 측면에서 이전 3D 프로토콜^{8, 12,}

재료

```html

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL microtubes Axygen	Corning	MCT-150-C
15 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
50 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6 well plate Falcon polystyrene microplate	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B
Acetic acid, 60%	Thermo Fisher Scientific	A38-212
Acrylamide 30%  and bis-acrylamide solution, 29:1	Biorad	1610157
Aluminum fold	Reynolds	U07211R0
Amonium Persulfate (APS)	Merck	A3678
Binocular stereomicroscope	NA	NA
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	A9418
DAPI	Merck	D9542
DelltaVision microscope	Olympus	NA
Distilled H2O	NA	NA
Disposable Filter Units with PES filters of 0.45 μm pore	Thermo Fisher Scientific/Nalgene	09-740-63B
Fine forceps FST Dumont SS	Fine Science Tools	11200-33
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed  anti-rat labelled by AlexaFluor647	Invitrogen	A-21247
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-rabbit labelled by AlexaFluor568	Invitrogen	A-21428
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-guinea pig labelled by AlexaFluor488	Invitrogen	A-11073
Gloves	Merck	Z412392
Growing chambers / greenhouse / or field	NA	NA
DTT	Merck	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
Masking tape 3M	Fisher Scientific	19-047-259
Maize seeds	NA
Microscope 22 x 22 mm-1,5 glass coverslips	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope 22 x 22 mm-H coverslips	Deckgläser, Zeiss	474030-9020-000
Microscopic glass slides	Fisher Scientific	22-230-900
Microscope slide box	Fisher Scientific,	03-448-9
Micropipets P20, P200, P1000	Merck	CLS4069
NaCl	Merck	S7653
Nail polish	Electron Microscopy Science	72180
Paper towels	Merck	Z188956
Parafilm	Merck	P7668
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Grade	15710
PBS	Merck	P4474
Plastic box with lid	Tupperware	NA
Poly-L-Lysine	Merck	P4707
Primary antibodies (rat anti-ZmAFD1, rabbit anti-ZmASY1, guinea-pig anti ZmZYP1)	NA
Prolong Antifading	Molecular Probes	P36934
Petri dish (D x H: 35 mm x 10 mm	Corning	351008
Petri dish regular size	Merck	P5731
PIPES	Merck	P1851
Pipet tips (0.5-10 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT300
Pipet tips (200 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT200Y
Pipet tips (1000 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT1000BRS
Razor blade - single edged	Fisher Scientific	12-640
Rocking platform shaker	NA	NA
Spermine	Merck	85590
Spermidine	Merck	S2626
Sorbitol	Merck	S8143
Tween-20	Merck	P9416
Triton X-100	Fisher Scientific	9002-93-1
Ultra pure Acrylamide	Invitrogen	15512023
Vacuum

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