쥐에서 반복 전신 플레티스모그래피를 위한 터널 처리 및 환경 풍부화

요약

이 프로토콜은 마우스를 대상으로 한 종단 연구 중 스트레스 관련 호흡 변이성을 줄이기 위한 전신 플레티스모그래피 반복 검사를 위한 터널 취급 및 환경 풍부화 절차를 설명합니다.

초록

반복 전신 플레티스모그래피(WBP)는 쥐의 호흡 기능 종단 평가에 널리 사용됩니다. 그러나 취급 유발 스트레스는 생리학적 변동성을 초래하여 치료 효과를 혼란시키고 실험적 재현성을 감소시킬 수 있습니다. 전통적인 꼬리 조작 방법은 반복 세션에서 지속적인 스트레스 반응과 적응 부족을 유발할 수 있어 실험 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜은 반복적인 WBP 세션을 위한 터널 처리와 환경 풍부화를 통합한 정제된 취급 및 하우징 방법을 설명합니다. 야생형 129S1/SvImJ 쥐 6마리(수컷 3마리, 암컷 3마리)가 10주간의 연구 동안 터널 다루기와 지속적인 환경 풍부 치료를 받았습니다. 동물들은 반복적인 WBP 세션을 받았으며, 적응 기간은 기저선, 초기 연구, 중기, 후기 연구 시점에서 분석되었습니다. 초기 챔버 삽입 시 호흡 빈도(초기0–2분)와 안정 기저선(8–10분)을 정량화하여 종방향 적응 패턴을 평가하였다. 연구 기간 전반에 걸쳐 시행 조건 하에서 점진적인 변화가 관찰되었습니다. 초기 평균 호흡 빈도는 기저 시 345 ± 111 SD 호흡/분에서 후기 연구 세션에서는 267 ± 43 SD 호흡/분으로 감소했으며, 변동 계수는 감소(32%에서 16%)로 감소했습니다. 기초 호흡 측정도 255± 67에서 분당 43± 193으로 감소했으며(p = 0.033), 이후 세션에서 측정 안정성이 개선된 것과 일치합니다. 행동 관찰 결과, 배변, 배뇨, 불안은 최소화된 차분한 적응 상태가 나타났습니다. 이 프로토콜은 쥐에서 반복적인 호흡 평가를 수행하는 실험실에 실용적인 접근법을 제공합니다. 터널 조작과 환경 풍부화는 종단 WBP 연구에서 점진적 적응과 호흡 변이성 감소와 연관되어 있었습니다.

서론

전신 플레시스모그래피(WBP)는 의식이 있는 무제한 설치류의 호흡 기능을 비침습적으로 평가할 수 있게 하며, 호흡 생리학, 흡입 독성학, 질병^{모델링 등} 종단 연구에 필수적인 도구가 되었습니다. 비침습적 특성과 반복 측정 적합성 등 이 기법의 주요 장점은 질병 진행, 치료 중재, 노출 시간 경과 전반에 걸친 호흡 변화 추적에 특히 유용합니다. Glaab과 Braun²는 비침습적 머리 밖 체량 측정법이 의식 있는 쥐에서 반복적으로 폐 기능 측정을 위한 신뢰할 수 있는 방법임을 강조하며, 이는 신발 호흡기 감염을 포함한 기도 질환 분야의 중개 연구에 필수적인 도구를 제공한다고 강조했습니다. 그러나 WBP 측정의 질과 재현성은 행동적 평온과 일치하는 낮은 호흡 빈도 상태를 달성하는 데 결정적으로 의존하며, 이는 다루는 스트레스로 인해 손상될 수 있습니다. 스트레스 처리 문제는 생리학적 측정을 혼란스럽게 하고 데이터 품질을 저해할 수 있는 실험적 변동성의 잘 알려져 있지만 종종 과소평가되는 원인입니다. 표준 실험실 실무는 일반적으로 꼬리 조작을 포함하며, 쥐를 꼬리로 잡아 운반과 조작을 합니다 ^3,4.

표준 실험실 실천은 일반적으로 꼬리 조작을 포함하며, 쥐를 꼬리로 잡아 운반과 조작을 합니다. Gouveia와 Hurst³ 는 꼬리 조작이 쥐에서 불안을 유발한다는 것을 입증했으며, 핸들링된 동물은 터널 핸들링 대조군에 비해 고가 미로에서 불안과 유사한 행동을 보였다. 이 불안 반응은 생리학적 매개변수 변화와 관련이 있습니다. Rasid 등은 WBP^{를 사용} 해 일상적인 실험실 절차의 호흡기 영향을 정량화했으며, 구속과 취급이 성별 의존적으로 미분 부피를 유의미하게 변화시키며, 효과가 시술 후 최대 24시간까지 지속된다는 사실을 발견했습니다. 이러한 다루기 유발 효과의 크기와 지속 시간은 꼬리 조작 직후 얻어진 호흡 측정값이 안정적인 기초 기능보다는 급성 스트레스 생리학을 반영할 수 있음을 강조합니다.

억제와 스트레스 관리에 관한 광범위한 문헌은 즉각적인 행동 반응을 넘어서는 영향을 드러냅니다. Buynitsky와 Mostofsky⁵ 는 제압 스트레스가 생리적, 면역학적, 내분비계 및 발달 과정에 미치는 광범위한 영향을 검토하며, 스트레스 관련 혼란 요인이 연구 논문에서 충분히 문서화되지 않는 경우가 많다고 강조했다. 특히 호흡기 연구의 경우, 반복적인 측정이 요구되어 문제가 더욱 복잡해집니다. 각 처리 이벤트는 스트레스 반응을 재설정하여 점진적 습관화를 제한하고 종단 시간대에서 일관되지 않은 기준선 측정값을 생성할 수 있습니다. DeLorme과 Moss¹ 은 알려진 변형 간 생리학적 차이가 있는 쥐에서 제한된 플레티스모그래피와 비제한 용수탐사 접근법을 비교했으며, 억제되지 않은 단일 챔버 시스템이 기도 반응성 분석에 더 큰 도움이 되었음에도 불구하고 재현 가능한 기초 측정을 얻는 데는 여전히 어려움이 있음을 발견했습니다.

터널 핸들링은 쥐가 자발적으로 터널에 들어가 운반하는 방식으로, 다루는 과정에서 유발되는 불안을 크게 줄이는 근거 기반 대안으로 떠올랐습니다. 이 방법의 효능은 여러 균주와 실험 맥락에서 입증되었습니다. Gouveia와 Hurst³ 는 터널 핸들 쥐가 고차원 플래스 미로 테스트에서 조련자와 더 적게 상호작용하고 불안과 유사한 행동이 낮은 것을 보여주었으며, 터널이 낯설 때도 이점이 관찰되었다. 중요한 점은, 이러한 혜택이 처리 직후 기간을 넘어 확장된다는 것입니다. Sensini 등은 성별별 간 다루기 기술과 다루는 빈도의 ^{영향을 조사했으며} , 잦은 꼬리 다루기가 굴파기와 같은 웰빙 관련 행동을 감소시키고 수컷에서는 절망과 유사한 행동을 증가시키는 반면, 터널 다루기는 남녀 모두에게 선호되고 더 긍정적인 접근 행동과 방어 반응이 적은 것과 관련이 있음을 발견했다. 더 나아가 Davies 등은 비꼬리 조작의 이점이 복잡한 절차에서도 지속됨^{을 입증했습니다} . 실험실 경험 전반, 특히 구속 시술 중에도 꼬리 조작에 노출된 쥐들은 부항이나 터널 방식으로만 다뤄진 쥐에 비해 환경 자극에 대한 반응성이 더 높고 다루기 쉬움이 떨어졌습니다.

방법 선택을 넘어, 실험 절차에 체계적으로 익숙해지면 스트레스 유발 변동성을 더욱 줄일 수 있습니다. Sorli 등은 제압 기반 시스템인 헤드아웃 플레티스모그래피(head out plethysmography)를 대상으로 훈련^{을 조사했으며}, 5일 연속 훈련이 내성이 향상되었고, 2일째에는 행동 안정성이 개선되었으나, 모든 세션에서 호흡 지표는 5분 이내에 안정되었다. 마찬가지로, Ueno 등은 행동 검사 전에 수컷 C57BL/6 쥐를 반복적으로 부드럽게 다루면 높은 미로 테스트에서 불안 유사 행동이 감소하고 공간 인지 향상을 보여, 조련사와의 반복적인 접촉이 측정 가능한 습관 효과를 낼 수 있음을 시사했다. 이러한 발견은 비혐오적 취급 방법과 체계적인 습관 프로토콜을 결합하면 반복 측정 시 생리학적 변동성을 줄이는 데 누적적인 이점을 제공할 수 있음을 시사합니다.

환경 풍부화는 스트레스 반응성과 기초 생리학에 영향을 미칠 수 있는 추가 요인이지만, 그 영향은 복잡하고 상황에 따라 다릅니다. 풍부화는 일반적으로 긍정적 복지를 촉진하지만, 과도하거나 예측 불가능한 풍부화는 일부 실험 맥락에서 역설적으로 생리적 변동성과 스트레스 관련 행동을 증가시킬 수 있다(^10,11). 중첩 물질과 같은 핵심 요소를 안정적으로 유지하면서도, 풍부화 항목의 주기적 순환을 통해 관리 가능한 신선성을 제공하는 균형 잡힌 접근법은 혼란 변수¹²를 도입하지 않고 복지를 최적화할 수 있다. 농축, 취급 방법, 습관 프로토콜 간의 상호작용은 반복 호흡 측정 맥락에서 아직 충분히 연구되지 않아 세 가지 요소를 동시에 다루는 통합 프로토콜의 필요성을 강조합니다.

생리학적 측정에 미치는 조작 영향에 대한 인식이 높아지고 있음에도 불구하고, 반복적인 WBP 세션 중 취급 스트레스를 최소화하기 위해 특별히 설계된 표준화된 프로토콜은 여전히 제한적입니다. 기존 WBP 프로토콜은 일반적으로 스트레스로 인한 빈호흡이 가라앉도록 하기 위해 세션당 10–30분의 긴 적응 기간에 의존하지만, 근본적인 취급 방법이나 세션 간 점진적 습관화 여부를 체계적으로 평가하는 경우는 드뭅니다. 더불어, 대부분의 연구는 동물이 문헌에서 보고된 휴면 또는 수면 관련 범위에 근접하는 호흡 빈도와 같은 행동적 정지 상태에 부합하는 생리학적 상태에 도달하는지, 아니면 급성 스트레스에서 만성 저수준 각성으로 전환하는지 평가하지 않습니다. 여기서는 터널 취급, 균형 잡힌 환경 풍부화, 반복 WBP 세션을 10주간의 종단 연구에 통합한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 익숙화와 일치하는 호흡 빈도의 점진적 변화와 관련된 접근법을 설명하며, 세션마다 초기 호흡 빈도를 감소시키고, 문헌에서 보고된 평면 또는 수면 관련 범위에 근접하는 기저선 측정을 포함합니다. 중요한 점은, 이 프로토콜이 단순한 동물 복지 개선책이 아니라 종방향 호흡 측정 시 변동성을 줄이고 일관성을 개선하는 데 도움이 될 수 있는 실험 설계 고려사항으로도 제시된다는 것입니다.

프로토콜

모든 절차를 마이애미 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC 프로토콜 #23-103)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행하십시오. AAALAC 인증 비바리움 시설에서 집쥐를 기용하며, 기관 기준에 따라 환경 조건을 유지하고 있습니다.

1. 동물 선발 및 사육 조건

1. 연구를 위해 동물을 선택하고 준비하세요
   1. 확립된 번식 집단에서 동물을 선택하거나 상업 판매자로부터 구입하세요. 이 연구에서는 야생형 129S1/SvImJ 쥐 6마리(수컷 3마리, 암컷 3마리)를 사용합니다.
   2. 동물을 AAALAC 인증 시설에서 SPF(특정 병원체 없음) 상태로 유지하며, 기관 기준에 따라 정기적인 건강 모니터링을 실시합니다.
   3. 연구 시작 시 동물이 약 6개월(젊은 성체)임을 확인하세요.
      참고: 이 연구에 참여한 쥐들은 일상적인 사육 과정에서 터널 다루는 경험이 있었습니다. 순진한 쥐의 경우, WBP 세션을 시작하기 전에 조건 조절 기간을 설정하세요(Step 3.2 참조).
2. 쥐가 연구 목적에 적합한 나이에 도달하면 실험 절차를 시작하세요. 이 연구에서 쥐들은 WBP 세션 시작 시 약 6개월(젊은 성체)이었습니다. 재현성을 위해 정의된 연령대(예: ±1개월) 내의 쥐를 사용하고, 나이가 기저 호흡 지표와 습관 적응 동역학에 영향을 줄 수 있으므로 구체적인 연령을 보고하세요.

2. 환경 풍요 프로토콜

1. 꾸준한 둥지 재료를 제공하세요
   1. 각 케이지마다 약 5cm × 5cm, ~2.5g의 압축 면 정사각형을 케이지에 넣습니다.
   2. 기존 둥지 구조 대부분을 새 우리로 옮길 때 양손으로 옮기세요.
   3. 누적된 둥지 물질이 약 10g(원래 질량의 약 두 배)을 초과하면, 외부 돔 구조를 보존하면서 가장 오래되고 다져진 부분을 제거하세요.
   4. 깨끗한 케이지에 신선한 면 조각(5cm × 5cm)을 넣어 둥지 건설과 유지보수를 지원하세요.
   5. 번지 재료는 눈에 띄게 젖어 있을 때(표면의 25% 소변 오염 때>25%), 둥지가 파괴되어 48시간 이내에 재건되지 않은 경우에만 교체하세요(그림 1A와 1C).
      참고: 우리 교체와 관련된 스트레스를 최소화하고 연구 전반에 걸쳐 일관된 후각 및 촉각 신호를 유지하기 위해 둥지 구조를 보존하세요. 둥지의 질은 동물의 복지와 건강 상태를 나타내는 지표로 작용합니다¹³.
2. 다음 표준화된 절차를 사용하여 매주 둥지 짓기를 평가합니다
   1. 새장을 교체할 때마다 온전한 둥지를 조심스럽게 양손으로 깨끗한 표면으로 옮기며 구조를 건드리지 마세요.
   2. 카메라를 수면에서 30–40cm 수직으로 위치시켜 둥지를 바로 위에서 촬영하여 전체 구조와 분화구 형성을 시각화하세요.
   3. 둥지 높이에서 둥지를 옆에서 사진으로 찍어 벽의 완전성과 돔 특성을 기록하세요.
   4. 표준화된 5점 디컨 척도¹³을 사용해 둥지를 점수 매기는데, 1 = 거의 손대지 않은 둥지 재료, 5 = 뚜렷한 분화구가 있는 돔 모양 둥지입니다. 점수 5 둥지의 예시는 그림 1A–1C 를 참고하세요.
   5. 둥지를 조심스럽게 깨끗한 우리로 돌려놓으세요.
      참고: 주간 둥지 사진은 연구 전반에 걸쳐 둥지 품질을 객관적으로 기록하는 데 도움을 줍니다. 둥지 짓기 상태가 악화되면 질병, 스트레스 또는 수의의 주의가 필요한 기타 복지 문제를 나타낼 수 있습니다.
3. 주간 순환 농축 제공
   1. 한 가지 강화 아이템을 선택해 우리에 넣으세요. 찢은 종이(흰 종이, 한 줌 크기), 종이 타월(2–3장, 무향, 흰색, 접거나 구겨진 것), 또는 종이 기반 쉼터(골판지 튜브나 작은 상자)를 사용하세요.
   2. 미리 정해진 일정에 따라 풍부화 항목을 매주 순환하세요 (예: 1주차: 파쇄한 종이; 2주차: 종이 타월; 3주차: 판지 튜브; 4주차: 반복) 관리하기 쉬운 신선함을 유지하기 위해서입니다.
      참고: 주간 순환은 쥐를 압도하지 않으면서도 신선한 경험을 제공합니다. 플라스틱 오두막, 공, 단단한 구조물과 같은 플라스틱 풍부화 도구는 생리적 변^{이성을 증가}시킬 수 있으므로 피하세요. 케이지를 교체할 때마다 모든 풍화 아이템을 교체하세요.

그림 1. 종단 전신 플레티스마그래피(WBP) 연구 중 프로토콜 실행 및 복지 지표. (A) 암컷 우리에서 발견된 대표적인 고품질 둥지(Deacon 점수 5)로, 뚜렷한 분화구가 있는 잘 형성된 돔 구조를 보여줌. (B) 홈 케이지 내 둥지 재료와 통합된 투명 폴리카보네이트 취급 터널(길이 약 10cm× 내경 5cm). 터널은 연구 내내 농축 및 취급 장치로 우리에 영구적으로 보관되었습니다. (C) 대표적인 후기 연구 후 둥지 품질 (10주차)에서 수컷과 암컷 우리에서 지속적인 점수 5 번지 건설 결과. (D) 10주 연구 기간 동안 둥지 질 점수. 각 데이터 포인트는 표준화된 5점 디컨 척도¹³을 사용하여 새장의 주간 둥지 점수를 나타내며, 여기서 1 = 손대지 않은 둥지 재료, 5 = 분화구가 있는 완전한 돔형 둥지입니다. 두 케이지 모두 모든 연구 단계에서 일관된 점수 5의 둥지 품질을 유지했습니다. 음영 처리된 녹색 영역은 최적의 복지 조건과 관련된 점수(점수 4–5)를 나타냅니다. 연구 단계는 기준선(0주차), 초기 연구(2–3주차), 중간 연구(5–7주차), 후기 연구(8–10주차)로 표시된 색상 배경 영역으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

3. 터널 처리 구현

1. 취급 터널 준비
   1. 투명한 폴리카보네이트 터널(길이 100mm 또는 130mm× 내경 50mm)을 사용하며, 매끄럽고 둥근 모서리를 갖추세요(그림 1B).
   2. 각 집 우리에 한 개의 터널을 영구적으로 설치해 우리 강화의 일부로 사용하세요.
   3. 처리 이벤트 사이에 터널을 제거하지 마세요.
      참고: 터널을 집 케이지에 두면 익숙한 케이지 냄새가 나고, 집 환경과 연관되어 다루는 절차가 아닙니다. 쥐들은 종종 터널을 피난처나 둥지로 사용합니다.
   4. 케이지를 교체할 때마다 이전 케이지에서 사용한 베드를 소량 닦은 후 깨끗한 케이지에 넣으세요.
   5. 오토클레이브 터널을 만들거나, 사용 사이에 소독이 필요하다면 우리 위생에 쓰이는 동일한 소독제로 세척하세요. 터널을 깨끗이 헹구고 자연 건조한 후 다시 케이지에 넣으세요.
      참고: 후각의 연속성을 유지하는 것은 낯선 냄새로 인한 스트레스를 줄이는 데 도움이 됩니다. 터널은 오토클레이브가 가능하고 재사용이 가능합니다.
2. 터널 취급에 대한 마우스 조건
   1. 순진한 성체 쥐의 경우, WBP 세션 시작 전 최소 1-2주간의 컨디셔닝 기간을^{14, 15}번 마련하세요.
   2. 투명한 폴리카보네이트 터널(3.1단계 참조)을 집 우리에 영구적으로 설치하고, 3–7일간 수동적으로 익숙해지도록 하세요.
   3. 수동적 노출 후에는 매일 부드러운 손길 세션을 수행하세요. 쥐들이 자발적으로 터널 안으로 들어오도록 유도한 뒤, 터널을 수평으로 30–60초 들어 올린 후 쥐를 다시 우리로 돌려놓으세요.
   4. 다음 기준을 사용하여 성공적인 습관화 평가: 10–30초 이내에 자발적으로 터널에 진입, 탈출 시도나 소리 없이 터널 내에서 차분한 행동, 그리고 일상적인 우리 관찰 중 휴식이나 탐색을 위한 자발적 터널 사용^14,15.
   5. 모든 습관 기준이 충족되면 WBP 세션을 시작하세요.
      참고: 이 연구에 참여한 쥐들은 WBP 세션 시작 전에 일상적인 사육 과정에서 터널 다루는 경험이 있었습니다.
3. 비혐오적 처리 실행
   1. 모든 작업 시 분말 없는 니트릴 장갑을 착용하세요.
   2. 터널 핸들링을 주요 처리 방법으로 사용하세요. 쥐가 터널 안에 있다면, 한 손으로 받침대를 받쳐 터널을 수평으로 들어 올립니다.
   3. 쥐가 터널 밖에 있다면, 터널 입구를 쥐로부터 5–10cm 이내에 위치시키고, 쫓거나 강제로 들어가지 않고 자발적으로 들어가는 데 10–30초를 허용하세요.
   4. 만약 마우스가 30초 이내에 들어오지 않으면, 손을 마우스 뒤에 두어 접촉하지 않고 터널 쪽으로 움직이도록 유도하세요.
   5. 두 번(최대 총 60초) 마우스가 들어오지 않으면 컵핑 방법을 사용하세요. 납작한 손을 쥐 근처에 두고, 10–20초 동안 자발적으로 접근하게 한 뒤, 꼬리 만지지 않으면서 양손으로 부드럽게 쥐를 퍼냅니다.
   6. 차분한 행동을 유도하는 핸들링 방법을 사용하세요. 즉, 소리 부재, 탈출 시도, 스트레스 유발 배변 등이 없습니다.
4. 마우스를 플레티스마그래피 챔버로 옮기세요
   1. 터널에서 쥐를 손으로 옮긴 뒤 챔버에 넣으세요.
   2. 터널을 수평으로 잡고 뒷부분(꼬리 쪽)을 약 10–20° 위로 기울입니다.
   3. 쥐가 터널 밖으로 뒤로 물러나서 뒷다리부터 손을 감싸 올려놓게 하세요.
   4. 양손을 챔버 안으로 내리고 쥐가 5–10초 이내에 자발적으로 챔버 바닥에 발을 디딜 수 있게 합니다.
      참고: 이 터널에서 손에서 탄실로 옮기는 방식은 챔버 설치 시 제어를 개선합니다.
   5. 또는 터널을 텐더 구멍 위로 기울여 쥐를 직접 챔버로 옮길 수도 있습니다.
      참고: 직접 터널-챔버 이식은 삽입 시 제어가 적으며, 본 연구에서는 덜 자주 사용되었습니다.
   6. 터널을 수직으로 뒤집거나 흔들지 마세요.
   7. 쥐를 놓은 직후 챔버 뚜껑을 밀봉하고 터널을 다시 집 우리로 돌려주세요.
      중요한 단계: 연구 중 절대 쥐의 꼬리를 잡지 마세요. 만약 쥐가 30초 이내에 터널에 들어오지 않거나 손을 감은 채 다가오지 않는다면, 쫓거나 강요하지 않고 부드러운 침구로 부드럽게 움직임을 유도하세요. 마우스가 개별 선호도에 따라 터널 접근법과 손 접근법을 선택할 수 있게 하세요. 초기 세션에서의 인내심은 비혐오^{적 취급에} 긍정적인 연관성을 형성하는 데 도움이 됩니다. ^3,7.

4. WBP 세션 프로토콜

1. 플레티스모그래피 시스템 준비
   1. 데이터 수집 전에 전신 플레티스모그래프를 하루 한 번 보정하세요.
   2. 챔버가 비고 밀봉된 상태에서 FinePointe 호흡 분석 소프트웨어(목표: 18–22 cm H₂O)를 통해 자동 보정 시퀀스를 시작하세요. 박스 플로우 유효 범위가 부위당 ±40 mL/s를 초과할 때 성공적인 보정을 확인하세요.
   3. 챔버당 1.0 L/min으로 바이어스 유량을 설정하세요.
   4. 디지털 센서를 사용해 챔버 온도(22°C–24°C)와 습도를 지속적으로 모니터링하세요.
   5. 챔버는 조용한 장소에 설치해 조명이 일정하고 진동이 최소화된 곳에 두세요.
      참고: 모든 세션 동안 챔버 상태를 일정하게 유지하세요. 온도 변화는 호흡 패턴을 바꾸고 종단 비교를 혼란스럽게 합니다.¹.
2. 일관된 생체 리디안 단계에서 WBP 세션을 진행하세요
   1. 모든 측정은 빛 주기의 같은 시간 창 내에 수행하세요.
   2. 08:00부터 10:00까지(06:00에 불 켜짐) 세션을 진행하고, 불이 켜진 후 처음 2시간은 생체 리듬이 전환되는 시기를 피하세요.
3. 쥐를 실험실로 옮기기
   1. 세션 시작 약 15분 전에 카트에 실려 케이지를 실험실로 옮깁니다.
   2. 쥐들이 익숙한 집 우리에 머무르면서 실험실 환경에 적응할 수 있도록 하세요.
   3. 플레티스모그래피 챔버 근처에 홈 케이지를 설치하세요.
   4. 터널 핸들링(3.3–3.4 단계 참조)을 사용해 각 쥐를 집 우리에서 손으로 옮긴 후 챔버로 옮기세요.
   5. 쥐는 침착하게 다루고, 이동 중 갑작스러운 움직임을 최소화하세요.
      참고: 개별 마우스 전송은 몇 초밖에 걸리지 않습니다.
4. 마우스를 챔버에 넣어
   1. 손을 모은 쥐를 부드럽게 상자 안으로 옮기세요(3.4단계 참조).
   2. 마우스를 놓은 지 5초 이내에 챔버 뚜껑을 밀봉하세요.
5. 적응 및 기록 시작
   1. 호흡 분석 소프트웨어를 사용해 호흡 신호를 기록하기 시작하세요.
   2. 방해나 개입 없이 적응할 수 있도록 10분을 두세요.
6. 적응 중 행동 안정성을 모니터링하세요
   1. 적응 기간 내내 쥐를 계속 관찰하세요.
   2. 과도한 움직임, 스트레스 징후(예: 경직된 자세), 또는 차분한 행동 없이 반복된 탈출 시도를 세션 로그에 기록하세요.
   3. 이러한 세션이 여전히 유효한 초기데이터를 제공할 수 있음을 인식하세요; 하지만 F기준선 측정은 신뢰할 수 없을 수 있습니다.
   4. 적응 창 동안 관찰 가능한 평온기가 없는 플래그 세션을 연구별 기준에 따라 기초 분석에서 제외할 가능성을 고려합니다.
   5. 적응 행동에 따른 제외 기준을 충족하지 못한 세션은 모두 이 연구에서 유지하라.
      중요한 단계: 10분간의 적응 기간은 익숙화 평가에 필수적입니다. 일부 프로토콜은 20–30분 적응 기간을 사용하지만, 이 연구에서 잘 익숙해진 쥐들은 8–10분 이내에 안정적인 호흡 패턴을 달성하여 장기적인 적응이 불필요하고 움직임 증가로 인해 역효과를 낼 수 있습니다.
7. 적응 과정에서 쥐의 행동을 관찰하세요
   1. 10분 적응 기간 동안 생쥐를 시각 관찰하여 방을 시각적으로 관찰합니다.
   2. 배변, 배뇨, 지속적인 탈출 시도, 장기간 움직임 정지 등 명백한 스트레스 신호를 주목하세요.
   3. 각 세션 후 챔버 내 대변 펠릿과 소변의 존재 및 대략적인 양을 기록하세요.
      참고: 이 관찰은 스트레스 수준과 습관 진행 상황에 대한 정성적 평가를 제공하지만, 본 연구에서는 표준화된 에소토그램을 사용해 공식적으로 점수를 매기지 않았습니다.
8. 적응기 호흡 측정 분석
   1. 호흡 분석 소프트웨어를 사용해 기본 호흡 감지 알고리즘과 기본 임계값 설정을 사용해 압력 신호로부터 자동으로 호흡 빈도를 계산하세요.
   2. 표준 획득 매개변수를 사용하여 안정적인 공기 흐름 조건(4.1단계 참조)에서 호흡 신호를 획득합니다.
   3. 평균 호흡 빈도를 두 기간에 계산합니다: 초기 스트레스 반응과 취급 직후 생리학을 나타내는 초기 f(0–2분), 안정화된 기초 호흡 빈도를 나타내는 f(8–10분)입니다.
   4. 동물의 움직임이나 방 교란과 관련된 비호흡 압력 편향 또는 불규칙한 파형으로 정의되는 가시적 움직임 인공이 있는 기간은 제외합니다.
      참고: 자동 알고리즘에 의한 정확한 호흡 감지를 확인하기 위해 약 10%의 녹음 일부를 육안으로 검사하십시오. 수동 검증 결과, 자동 감지와 관찰된 호흡 패턴 간의 일치가 확인되었습니다.
9. 해당된다면 실험 프로토콜을 진행하세요
   1. 연구 설계에 따라 10분 적응 기간이 지난 후에도 실험적 개입(예: 에어로졸 약물 전달, 저산소 도전, 운동 검사)을 계속하십시오.
      참고: 본 연구에서 습관 평가 세션 중 실험적 개입은 수행되지 않았습니다. 보고된 호흡 지표(초기및 기저선)는 추가 시술 없이 적응 세션 중 얻은 것이었습니다.
10. 쥐를 집 우리로 돌려보내세요
    1. 터널 핸들링이나 손을 모아 쥐를 챔버에서 홈 케이지로 옮기세요.
    2. 세션 후 5분간 쥐를 관찰하여 자발적인 움직임, 그루밍, 우리 동료와의 상호작용, 음식과 물 탐색 등 정상적인 행동을 확인하세요.
    3. 15분 이상 지속되는 이상 행동(장시간 정지(>5분), 숨 곤란, 구부정한 자세, 케이지 동료와의 상호작용 실패 등이 있다면 관찰을 연장하고 수의사와 상담하세요.
       참고: 본 연구에서는 세션 후 비정상적인 행동이 관찰되지 않았습니다.
11. 일정한 세션 빈도를 유지하세요
    1. 종단 연구 기간(이 프로토콜에서는 10주) 동안 정기적으로 WBP 세션을 실시하세요.
    2. 습관 진행 상황을 추적하기 위해 매주 세션을 진행하세요.
    3. 일주기 및 절차적 일관성을 유지하기 위해 일정한 시간에 세션을 일정 조정하세요(4.2단계 참조).

결과

이 터널 취급 및 환경 풍부화 프로토콜을 야생형 129S1/SvImJ 쥐 6마리(수컷 3마리, 암컷 3마리)에 적용한 10주간의 종단 WBP 연구에서 점진적인 적응과 생리적 안정성 향상의 증거가 발견되었습니다. 호흡 빈도 측정은 규칙적인 종단 간격으로 반복 진행된 WBP 세션에서 얻어졌으며, 데이터를 분석한 네 가지 연구 단계(기저선(0주차), 초기 연구(2–3주차), 중간 연구(5–7주차), 후기 연구(8–10주차)에서 분석되었습니다. 그림 2 는 호흡 빈도 변화의 정량적 시간 경과를 보여주며, 초기 스트레스 반응의 감소와 기저선 호흡 측정의 안정화를 보여줍니다.

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토론

이 프로토콜은 종단 WBP 맥락에서 터널 처리, 환경 농축, 반복 노출을 결합한 통합 접근법을 설명합니다. 이러한 조건에서 호흡 빈도 측정은 반복 세션에 걸쳐 점진적인 안정화를 보였으며, 이는 각성 감소와 점진적 익숙화와 일치하였다. 성공적인 프로토콜 성능에는 여러 구현 요소가 중요해 보입니다. 첫째, 실험 절차를 시작하기 전에 터널 핸들링을 도입해야 합니다. 이 연구에서 쥐들은 터널 취급에 노출된 경험이 있었으며; 하지만 이전 연구들은 짧은 컨디셔닝 기간으로도 이점이 나타날 수 있음을 보여주었습니다. Sorli 등은 헤드아웃 플레티스마그래피 훈련 5일 후 내성이 개선되었다^{고 보고했으며}, Gouveia와 Hurst³는 터널이 처음 낯설 때조차도 불안과 유사한 행동이 감소했다. 최적의 구현을 위해 WBP 세션 시작 1-2주 전에 터널을 집 케이지에 도입하여 자발적으로 탐색하고 습관화할 ...

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Aspen Chip Bedding	Lab Supply	Aspen 323	자동화된 아스펜 나무 칩 침대. 사용 전 자동화 처리; 케이지 바닥에 약 1cm 깊이로 배치.
자동화된 물	시설 제공	해당 없음	표준 물병을 통해 자유 공급되는 자동화된 시립 수도.
골판지 튜브	시설 제작	해당 없음	일반 골판지 화장지 롤. 교체되는 환경 개선 및 보호 항목으로 사용.
Crink-I-Nest (Irradiated)	The Andersons / Lab Supply	CNKR	감마선 조사된 파쇄된 종이 환경 개선 자재. 교체되는 환경 개선 자재로 매주 교체하여 제공.
FinePointe 소프트웨어	Data Sciences International	카탈로그 번호 없음	호흡 데이터 수집 및 분석 소프트웨어, 버전 3.0. WBP 데이터 수집 및 파라미터 계산에 사용.
개별 환기 케이지 (IVC) 랙	Allentown	EP5000E	배기 팩 IVC 랙, 140개 케이지 용량. 자동 환기 연결이 있는 양면 고밀도 시스템.
Irradiated Rodent Chow	Envigo	T.2918.15	표준 조사된 설치류 사료. 와이어바 호퍼를 통해 자유 공급.
마우스 이송 터널	Braintree Scientific	TRANS-TUBE 100X50MM	길이 100mm 및 내부 직경 50mm의 투명 폴리카보네이트 터널. 자동화 가능하고 재사용 가능. 저 스트레스 동물 이송 절차에 사용.
Nestlets (Irradiated)	Lab Supply	IRR	감마선 조사된 압축 면 둥지 스퀘어(약 5cm × 5cm, 약 2.5g 각각). 일정한 환경 개선 자재로 제공; 케이지당 하나씩 제공.
분말 프리 니트릴 장갑	Kimberly-Clark	KC500	보라색 분말 프리 니트릴 검사 장갑. 모든 동물 접촉 절차 시 착용.
비직조 거즈 스펀지	Pivetal	21295040	비 멸균, 비 직조 거즈 스펀지, 4중, 4인치 × 4인치 (10.16cm × 10.16cm). 환경 개선 자재로 사용.
종이 수건	Tork (Essity)	MB 540A	멀티폴드 손 수건. 교체되는 환경 개선 자재로 사용.
스마트폰 카메라	Apple	카탈로그 번호 없음	주간 둥지 점수 문서화에 사용되는 iPhone 스마트폰 카메라.
전신 플레티즈모그래피 시스템	Data Sciences International	10222C (2-사이트); 770621 (4-사이트)	쥐용 FinePointe FP 시리즈 무제한 전신 플레티즈모그래피 시스템. 2-사이트 및 4-사이트 구성으로 제공.

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