Protoperithecia 분석법은 정의된 빛-어둠 주기 하에서 프로페리테시아 형성을 측정하여 Neurospora crassa 의 광주기 반응을 정량화합니다. 이 판 기반 방법은 실험 조건 간 광주기 의존적 발달 반응을 비교하는 간단하고 확장 가능한 접근법을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Neurospora crassa 는 생물학적 타이밍과 빛에 의해 조절된 발달을 연구하는 잘 확립된 모델 생물입니다. 프로토페리테시아 분석법(PPA)은 프로토페리테시아 형성을 발생 산출물로 측정하여 광주기 반응을 정량화하는 플레이트 기반 영상 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 명확한 빛과 어둠 주기가 곰팡이 성적 발달에 어떤 영향을 미치는지 평가하기 위한 재현 가능하고 확장 가능한 워크플로우를 제공하는 것입니다. 이 분석에서는 곰팡이 배양물을 합성 교차 배지에서 조절된 광주기 조건에서 배양한 후, 표면 분생자균을 표준화하여 시각화를 개선합니다. 원초염은 수동 이미지 기반 계수로 정량화되며, 광주기 조건 전반에 걸친 통계적 비교에는 판당 평균 개수를 사용합니다. 이전 접근법과 달리 PPA는 표준화된 배양 조건, 통제된 광주기 노출, 사분면 기반 영상을 통합하여 균주 간 재현 가능한 정량적 비교를 가능하게 합니다. 이 워크플로우는 기본 프로토콜을 넘어 정의된 실험 조건 하에서 광주기 의존적 발달 출력을 측정하기 위한 일관되고 확장 가능한 프레임워크를 구축합니다. 이 방법은 접종부터 분석까지 약 일주일이 소요되며, 정의된 환경 조건 하에서 여러 균주에 적용할 수 있습니다. PPA는 통제된 실험실 조건 하에서 균류의 광주기 의존 발달 비교 분석을 위한 간단하고 접근성 높은 플랫폼을 제공합니다.
서론
프로토페리테시아 검사(PPA)는 곰팡이인 Neurospora crassa의 광주기 반응을 정량화합니다. 많은 생물 들은 광주기 1,2,3,4,5,6,7,8이라는 현상에서 생물학적 과정을 조정하기 위해 낮과 밤의 길이를 측정합니다. 이 분석에서 여성 생식 구조인 프로토페리테슘의 발달은 광주기 반응의 측정 가능하고 빛에 의존하는 대리 지표 역할을 합니다. 식물에서는 야간 실험을 통해 광주기가 잘 특징지어졌지만, 균류와 같은 비광합성 진핵생물에서 광주기 반응을 정량화하는 표준화된 접근법은 더 적습니다. N. crassa는 명확한 유전학과 빛에 반응하는 발달 경로 덕분에 이 목적에 적합한 모델 시스템을 제공합니다. 생식 시기에 대한 광주기 의존적 조절이 1,2,3,4,5,6,7,8 생물에서 관찰되었으며, 이는 빛에 의해 구동되는 생리적 반응의 관련성을 뒷받침합니다; 그러나 재현 가능한 분석법이 부족해 균류에 대한 기전 연구는 여전히 제한적입니다.
원초상피아는 N. crassa에서 조기 여성 생식 구조입니다. 이들은 자낭고니아에서 유래하는데, 이들은 서로 다른 교미 유형인9의 균사나 분생자와 융합하는 감긴 트리코가인(trichogynes)을 발달시킵니다. 융합 후, '수수' 파트너의 핵이 프로토페리테슘으로 들어갑니다. 프로토페리테시아의 생산량은 계절에 따라 조절되며, 강한 빛 유도10마리입니다. 광주기 조절은 생태학, 연대생물학, 균류 생리학에서 중심적인 역할을 하는데, 이는 많은 시계 제어 과정이 빛에 의존하기 때문입니다. 빛은 광수용체, 키나아제, 성적 발달과 관련된 빛 전달 메커니즘 등 수많은 유전 경로에 영향을 미친다11. 프로토페리테시아는 현미경으로 쉽게 관찰할 수 있고 빛에 민감하게 반응하기 때문에 광주기 출력을 측정하는 데 매우 적합합니다.
곰팡이에서 광주기가 중요함에도 불구하고, 통제된 빛 주기 하에서 원초주피 생성을 정량화할 수 있는 표준화되고 재현 가능한 분석법은 거의 없습니다. 중간 처리량의 플레이트 기반 분석법은 균류가 저렴하고 유지가 쉬운 모델 생물이기 때문에 빛에 의한 유성 발달과 유전자 기능을 체계적으로 분석할 수 있기 때문에 가치가 있습니다. 대부분의 광주기 연구는 식물에 집중되어 왔으며, 균류 시스템에 대한 동등한 정량적 틀은 여전히 제한적입니다. 곤충을 포함한 다른 생물에서는 휴면과 같은 빛 의존 현상이잘 알려져 있으나, 균류에서는 이에 대응하는 접근법이 부족하다. 이 격차는 변형과 실험 조건 간 광주기 반응의 재현 비교를 제한합니다.
PPA는 2004년 연구를 기반으로 하며, 이 연구는 일주기 연구에 사용된 밴드(bd) 돌연변이(ras-1bd)에서 일정한 어둠에서 빛이 일정한 낮 길이에 따라 증가하는 동안 프로토페리테시아 생성을 측정했습니다. 이 배경에서 원초염 생성의 광주기 의존적 변화가 관찰되었다. 현재 워크플로우는 전체 유전체 시퀀싱 및 노크아웃 자원과 관련된 참조 균주 FGSC 2489를 사용하여 이 접근법을 조정하고 확장한 것입니다13,14. 이 분석법은 1주일 동안 정해진 광주기 내에서 생성된 원초염 평균 수를 정량화하여 광주기 반응의 대리 지표로 합니다. 이 접근법은 배양 조건, 영상 및 정량화를 표준화하여 실험 조건과 균주 간 재현 가능한 비교를 가능하게 합니다. 주요 방법론적 발전으로는 표준화된 플레이트 기반 배양 조건, 정의된 광주기 노출 매개변수, 사분면 기반 영상, 재현 가능한 정량화 워크플로우가 포함됩니다.
이 프로토콜은 정의된 빛-어둠 주기 노출 후 원초주화(protoperithecia) 형성을 측정하여 N. crassa 의 광주기 반응을 정량화합니다. 각 광주기 조건마다 네 개의 생물학적 복제체가 사용되며, 각각 독립적으로 접종된 합성 교차(SC) 플레이트 하나로 구성됩니다. 한 판당 네 장의 이미지를 수집하여 통계 분석을 위해 생물학적 복제당 단일 값을 산출하기 위해 평균화합니다. 판은 보정된 광주기(예: 12시간:12시간 또는 8시간:16시간의 밝은-어둠 주기)에 7일간 인큐베이션됩니다.
성장실 내부에는 데이터 로거가 설치되어 빛의 세기, 온도, 습도를 지속적으로 기록하여 안정적인 환경 조건을 검증합니다. 빛 강도는 1,000럭스 이상으로 유지되며, 낮은 수준은 원초피테시아 생산을 감소시킵니다. 챔버 온도 상승과 열 현상을 방지하기 위해 과도한 조명을 피합니다. 배양 후에는 70% 에탄올이 적신 적신 종이 타월로 부드럽게 제거합니다. 각 판 둘레에 고르게 배치된 네 개의 사분면을 밝시야 조명 하에서 입체 현미경으로 40× 배율로 촬영합니다. 원초피테시아는 이미지 처리 패키지를 통해 수동으로 집계되며, 플레이트당 평균 개체수는 광주기 간 통계적 비교에 사용됩니다.
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프로토콜
사용된 시약, 소프트웨어 및 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 매체 및 재료 준비
(예상 시간: 1–1.5시간 작동 시간; 야간 냉각 선택 사항)
- 합성 교차(SC) 매체 준비
- SC 배지를 준비하세요: 0.2% 자당, 5 μg/L 비오틴, 1.5% 한천, 그리고 웨스터가드 염(pH 6.5, 1 N NaOH)15.
- 오토클레이브를 사용하세요. 50–55 °C까지 식혀 부을 수 있는 상태가 될 때까지 기다립니다.
주의: 플라스크를 오토클레이브에서 꺼낼 때는 내열 장갑을 착용하세요.
- 부어 접시
- 일회용 피펫을 사용해 10mL의 용융 매체를 60mm 페트리 접시에 피펫팅하세요.
- 판을 상온에서 30–45분 정도 굳히세요.
- 접시는 4°C에서 거꾸로 보관해 최대 4주간 보관하세요.
참고: 접시의 수분 섭취를 유지하세요. 4 °C에서 4주 이상 보관하지 마세요.
- 곰팡이 균주를 준비하세요
- 각 균주를 실험실 설명서에 따라 준비된 완전 또는 최소한의 배지가 담긴 작은 유리 시험관에서 배양하세요.
- 관 내부는 30°C의 지속적인 어둠(DD) 환경에서 배양하여 관 표면에 균사가 눈에 띄는 덮개가 형성될 때까지 보관합니다(보통 2-3일).
주의: 균 배양은 표준 미생물학적 관행에 따라 처리하고, 오염을 최소화하기 위해 생물안전 캐비닛 내에서 작업하세요.
2. 판 접종
(예상 소요 시간: 판 세트당 15–30분)
- 전이 균 분생자
- 각 SC 플레이트에 멸균 기법과 접종 루프를 사용해 접종하세요.
- 균일한 성장을 위해 분생자를 판 중앙에 배치합니다(그림 1A). 분생자는 군체 표면을 덮는 가루 같은 밝은 색의 포자 형태로 나타납니다.
- 접종을 표준화하기 위해 약 1–2 μL 농축 원분자 현탁액(또는 동등한 루프 단위)을 적용합니다.
- 부화 플레이트 준비
- 가스 교환을 허용하면서 오염을 막기 위해 플레이트를 단단히 닫아야 합니다.
- 각 판에 균주 이름, 날짜, 광도 상태를 적으세요.
3. 광주기 처리 장비
(예상 시간: 10분 준비 + 7일 부화 기간)
- 성장실 보정
- 챔버 온도를 25°C로 설정하세요.
- 습도를 50%로 설정하여 플레이트 건조를 방지합니다.
- 프로그램 광주기: EQ (춘분): 12시간 빛 / 12시간 어둠 및 SDP(짧은 낮): 8시간 빛 / 16시간 어둠
- 보정된 광도계를 사용해 플레이트 레벨에서 빛 세기를 >1,000 lux로 설정하세요. 챔버 온도가 25 °C 이상으로 올라가는 강도는 피해야 합니다.
참고: 챔버 조명이 내부를 과열하지 않도록 하세요.
주의: 습도를 유지하기 위해 파라필름이나 비닐봉지는 사용하지 마세요. 이들은 가스 교환을 제한하고 곰팡이 성장을 방해합니다. 습도 조절이 불가능하다면 실내 물집을 설치하세요.
- 판을 챔버에 놓으세요
- 선반에 판을 고르게 배치하여 빛 노출이 균일하도록 하세요.
- 실내 데이터 로거를 설치하여 온도와 습도를 지속적으로 모니터링하고 안정적인 환경 조건을 검증합니다.
- 분석 시작
- 프로그래밍된 광주기 아래에서 7일간 교란 없이 배양판을 보관합니다.
4. 영상 촬영을 위한 플레이트 모니터링 및 준비
(예상 시간: 한 판당 15–20분)
- 챔버에서 판을 제거하세요
- 7일 동안 부화 후 플레이트를 제거하세요.
- 원분자형 성장과 원초상피 형성 여부를 검사합니다.
- 가시성을 위한 깨끗한 판
- 찢은 종이 타월을 사용해 플레이트 뚜껑과 한천 표면의 분생분자(표면 분생자)를 제거한다(그림 1B).
- 종이 타월에 70% 에탄올 1–2mL를 적셔주세요. 판 표면을 부드럽게 3–5번 두드려 분열을 제거하세요. 영상 촬영 전에 1–3분간 자연 건조시키세요(그림 1C).
주의: 에탄올은 가연성입니다; 열원에서 멀리 떨어져 있으세요.
참고: 과도한 압력을 가하지 마세요. 수건을 한천 표면 위로 끌지 마세요. 이는 배지를 손상시키거나 원초낭피어를 방해할 수 있습니다.
5. 영상 전복피
(예상 시간: 접시당 5분)
- 영상 촬영 준비
- 일관된 조명과 배율(보통 40×)을 가진 현미경을 설치하세요.
- 플레이트 표면이 건조하고 이물질이 없는지 확인하세요.
- 이미지 캡처
- 판 둘레에 균등하게 배치된 네 개의 사분면을 일정한 배율로 시각화하세요.
- 각 이미지에 변형률, 광주기 상태, 판 번호, 사분면 위치를 표시하세요.
- 분석을 위해 일관된 형식(예: TIFF)으로 이미지를 저장하세요.
6. 정량화 및 데이터 분석
(예상 시간: 판 1개당 10–20분 카운팅; 분석 15–25분)
- 프로토페리테키아 백작
- 각 이미지를 이미지 처리 패키지에서 열어보세요.
- Cell Counter 플러그인을 사용해 원초두막을 수동으로 세세요. 버블, 가장자리 아티팩트, 모호한 구조물을 제외하세요. 군집화된 프로토페리테시아를 개별 구별 가능한 단위로 세어보라.
- 각 사분면별로 기록 수를 계산하고 판 한 대당 평균을 계산하세요.
- 데이터 분석
- 정량화된 데이터를 통계 분석 소프트웨어로 가져오세요.
- 그림 2에 나타난 비교를 위해 웰치 t-검정을 사용하여 통계 분석을 수행하세요.
- 광주기 처리, 균주 또는 복제를 비교하는 그래프를 생성하세요.
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결과
야생형 균주에 접종된 후, 분생자는 36시간에서 48시간 이내에 SC 표면을 덮었습니다. 7일간의 광주기 노출 후 조밀한 분자층이 형성되었고, 70% 에탄올이 적신 종이 타월로 제거되었습니다(그림 1). 이 단계는 구조를 파괴하지 않으면서도 기저의 원초낭피아를 노출시켰습니다. 현미경 검사에서 원초낭피체는 판 표면에 분포된 어두운 원형 구조로 나타났다. 이 구조들은 구형의 형태를 보였으며 주변의 균사와 구별될 수 있었습니다. 판 내에서 프로토페리테시아는 일반적으로 크기가 균일했으며, 광주기 조건에 따라 분포가 달라졌다. 춘분과 유사한 광주기 하에서 성장한 판은 조밀한 원초피테시아 형성을 보였으나, 짧은 일조 조건에서는 구조물이 적게 생성되었다.
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토론
PPA의 목표는 균류의 성적 발달을 대리 지표로 사용하여 유기체가 특정 광주기를 인지하는지 여부를 판단하는 것입니다. 서로 다른 빛 주기에서 생성된 프로토페리테시아의 평균 수를 정량화함으로써, 광주기 반응을 평가하고 조건 간에 비교할 수 있습니다. 이전 관찰 4,16과 일치하게, N. crassa는 춘분과 유사한 광주기 동안 원초두엽 생성이 더 높은 반면, 짧은 일당 조건에서는 구조물이 적게 생성된다(그림 2). 이 검사법은 통제된 실험실 조건 하에서 곰팡이 모델 시스템에서 광주기 의존적 발달 반응을 조사하는 방법을 제공합니다. 곰팡이의 광주기 반응은 표현형적으로 잘 문서화되어 있으나
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공개 사항
저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.
감사의 글
저자들은 이 프로젝트에 대한 지원과 도움, 기여에 대해 Cathyrn Maienza, Myo Thinzar Htin Aung, Aye Thinzar Htin Aung, Morgan Bartleson에게 감사를 표합니다. 저자들은 또한 러트거스 대학교 캠든 캠든 생물학과와 계산 및 통합생물학 센터(CCIB)가 기관 지원, 연구 시설 및 자원을 제공해 준 것에 대해 감사를 표합니다.
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재료
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| Alcohol burner flame | Wards | 470346-104 | 접종 루프 멸균용 |
| Ammonium iron sulfate hexahydrate | Supelco | FX0245-1 | 합성 교차 매체/최소 매체용 |
| Ammonium nitrate (NH4NO3) | BeanTown Chemical | BT134170-250G | 최소 매체용 |
| Autoclave | VWR International | 76683-456 | 유리 제품 및 매체 멸균용 |
| Biological Safety Cabinet | ThermoFischer Scientific | 1323TS | 플레이트 및 실험실의 오염 감소용 |
| Biotin | VWR | 97061-444 | 합성 교차 매체용 |
| Boric acid (H3BO3) | Electron Microscopy Sciences | 100503-696 | 합성 교차 매체/최소 매체용 |
| Calcium chloride (CaCl2) | AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC | JT1311-1 | 합성 교차 매체용 |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 223506-25G | 최소 매체용 |
| Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O) | Sigma-Aldrich | 1002440500 | 합성 교차 매체/최소 매체용 |
| Copper sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O H2O) | BeanTown Chemical | BT121245-1KG | 합성 교차 매체/최소 매체용 |
| Ethanol | Decon Labs | 71001-754 | 접종 루프 멸균 및 판 표면에서 분생포자 제거용 |
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| Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | BeanTown Chemical | BT122545-500G | 합성 교차 매체/최소 매체용 |
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