소아 코호트 내 제1형 간핵병증에서 흔히 나타나는 혈관염 관련 유전적 변이 유형

요약

자가염증 질환이 의심되는 소아 환자 1,204명에 대한 전엑솜 시퀀싱에서 132건의 간간증병증 관련 변이가 확인되었으며, 이 중 79건은 새로운 돌연변이가 발견되었습니다. 대부분은 이형접합이며 혈관염 표현형과 연관되어 있었습니다. 이 발견들은 유전자 검사의 진단적 가치와 소아 혈관염에서 조절 장애가 있는 제1형 인터페론 신호전달의 중심적 역할을 강조합니다.

초록

소아 혈관염은 전통적으로 조직병리학적 평가를 통해 진단됩니다; 그러나 임상 실무에서는 점점 더 덜 침습적인 영상 기반 접근법이 사용되고 있습니다. 이러한 발전에도 불구하고, 기저 단일유전자 원인의 규명은 질병 기전 이해, 예후 예측, 표적 치료 전략 수립에 여전히 필수적입니다. 제1형 간간병증은 구성성 인터페론 신호 전달과 빈번한 혈관염 또는 혈관병증 증상을 특징으로 하는 이질적인 면역 매개 질환군으로 구성됩니다. 핵산 감지 경로의 지속적인 활성화와 세포 내 항상성 저하는 내피 기능 장애와 만성 혈관 염증에 기여합니다.

본 연구는 소아 자가염증 질환 코호트 내에서 간간증 관련 유전자에서 혈관염 관련 변이를 탐지하기 위한 포괄적인 유전적 분석 워크플로우를 제시합니다. 전체 엑솜 시퀀싱은 자가염증 질환이 의심되는 1,204명의 환자에서 수행되었습니다. 코딩 영역과 접합 부위에 영향을 미치는 변이들은 미국 의학 유전학 및 유전체학 협회 가이드라인을 기반으로 한 생물정보학 파이프라인을 사용하여 이산 푸리에 변환(DFT)과 통계 분포에서 영감을 받은 통계 필터링 및 신호 처리 기법을 통합하여 변이 우선순위 지정과 해석을 개선하였습니다.

류마티스 클리닉 데이터베이스를 통해 평가한 132명의 소아 환자에서 간섭병증 관련 변이가 확인되었습니다. 전체적으로 92개의 고유 변이가 검출되었으며, 이 중 13개는 이전에 보고된 병원성 또는 가능성이 높은 변이형이고, 79명은 2026년 2월 기준 공개 데이터베이스에 존재하지 않았습니다. 임상 증상은 주로 반복적인 발열, 혈관염 증상, 복잡한 자가염증 증상을 포함했습니다.

변이체는 인터페론 신호 조절 이상과 선천 면역 활성화와 관련된 유전자를 포함하며, STING 활성화, 핵산 대사, 세포 내 운송 기능 장애와 관련된 경로가 포함되었습니다. 이러한 학제간 워크플로우는 소아 혈관염에서 유전체 분석의 진단적 유용성을 입증하며, 혈관 손상 및 자가염증성 질환 발병 기전에서 지속적인 인터페론 신호전달의 중요성을 강조합니다.

서론

소아 혈관염은 전통적으로 조직병리학적 평가를 통해 진단되어 왔으며, 이것이 여전히 금본위로 자리 잡고 있습니다. 하지만 최근 진단 전략에서는 특히 영상 기반 치료법과 같은 덜 침습적인 접근법이 점점 더 선호되고 있습니다. 이러한 진전에도 불구하고, 소아 혈관염에서 기저 단일유전자 원인을 규명하는 것은 질병 기전, 예후, 표적 치료의 기회에 대한 중요한 통찰을 제공하기 때문에 매우 중요합니다 ^1,2.

전신 염증과 다기관 침범이 있는 어린이는 소아 혈관염을 의심해야 합니다. 진단을 확립하고 모방자를 배제하기 위해서는 철저한 병력 청취, 종합적인 신체 검사, 실험실 검사, 영상 검사, 경우에 따라 조직 생검이 필요합니다. 조기 발견과 치료는 필수적인데, 치료하지 않으면 생명을 위협하는 합병증이나 장기적인 후유증으로 이어질 수 있기 때문입니다^.

제1형 간간병증은 지속되는 제1형 인터페론 경로 활성화와 반복성 혈관염 또는 혈관병증적 특징을 특징으로 하는 다양한 단일유전자 및 복합 면역 매개 질환을 포함합니다 ^3,4. 핵산 감지 조절 이상과 세포 내 항상성 저하는 지속적인 인터페론 과생성과 혈관 염증 및 손상을 연결하는 중심 병원성 기전입니다. TMEM173에서 기능 획득 돌연변이(STING1)가 유아기에 발병하는 STING 관련 혈관병증(SAVI)을 유발하며, 상염색체 우성 COPA 돌연변이는 소포체-골지체 수송을 방해하여 STING 활성화가 이상하고 혈관염 표현형 ^3-5를 초래합니다. 핵산 대사 유전자(TREX1, RNASEH2A/B/C, SAMHD1, ADAR1, IFIH1)의 결함으로 인한 추가 간에로노병증은 인터페론 조절 이상과 혈관 병리3 간의 기전적 연관성을 더욱 강조^합니다(그림 1 참조).

그림 1. 소아 코호트에서 내피 기능 장애와 미세혈관 손상을 유발하는 제1형 간핵병증의 상세한 병원체 구조. (왼쪽) 소아 제1형 간섭병증의 전신적 맥락: 결함 있는 자기 대 비자기 구별 및 이상한 숙주 핵산 감지가 전신 자가염증을 유발합니다. 임상 표현형은 조기 발병 피부 혈관병증과 전신 침범으로 두드러지며, 종종 동상과 유사한 피부 병변으로 나타납니다. (중간) 전신 조절 장애에 대한 유전적 결함의 기전적 연쇄 반응: 핵산 제거 효소(예: DNASE1, TREX1)의 기능 상실 돌연변이가 세포질 내에 내인성 DNA와 RNA의 비정상적 축적을 초래합니다. 동시에, STING1과 같은 센서의 이득 오브 기능 돌연변이는 바이러스 유발 요인과 무관하게 cGAS-STING 경로의 본질적인 활성화를 유도합니다. 이 병원성 세포질 내 감지는 인터페론 조절 인자를 과활성화하여 유형 I 인터페론(IFN-α/β)의 연속적인 합성을 이끕니다. 만성 사이토카인 배출은 IFNAR1/2 수용체를 통해 자가 지속 전신 증폭 루프를 형성하며, 이는 손상된 클리어런스 메커니즘과 양성 피드백 조절에 의해 악화됩니다. (오른쪽) 병리학적 결과: 순환 중인 IFN-α/β가 내피 세포 수용체 복합체에 지속적으로 결합하면 지속적인 JAK-STAT 활성화가 유도됩니다. 이러한 지속적인 항상성 교란은 지속적인 내피 스트레스를 유발하고 생리적 혈관 이완 기전을 저해합니다. 모세혈관 수준에서는 이 과염증 상태가 직접 내피세포 손상, 혈관벽 두꺼움, 기관내 미세혈관 혈전증을 유발하며, 결국 자가항체 매개 자가면역 경로 없이 심각한 조직 허혈과 괴사성 미세혈관병증으로 이어집니다. 약어: cGAS-STING = 인터페론 유전자의 순환형 GMP-AMP 합성효소 자극제; DNASE1 = 디옥시리보뉴클레아제 1; GoF = 이득 함수; IFN = 인터페론; IFNAR = 인터페론 알파/베타 수용체; IRF = 인터페론 조절 인자; JAK-STAT = 야누스 키나제 신호 전현자 및 전사 활성화자; STING1 = 인터페론 반응 자극제 cGAMP 상호작용자 1; TREX1 = 3개의 프라임 수리 엑소뉴클레아제 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

이 접근법은 소아 자가염증 코호트에서 간호로노병증 관련 유전자 변이를 검출하기 위해 개발되었으며, 기존 방법들은 희귀 돌연변이의 초기 우선순위 결정에서 분석적 어려움에 직면할 수 있고, 호중구 이질성이 재발 위험 예측에 중요한 역할을 하기 때문입니다⁶. 문헌에서는 소혈관염에서 인터페론 신호 전달 조절 이상이 단일 세포 분석을 통해 밝혀졌으며, 소아 코호트에서 조기 진단에 있어 전엑솜 시퀀싱(WES)의 이점을 강조했습니다⁶.

단일유전자 자가염증 증후군은 혈관염 또는 혈관염과 유사한 증상을 보일 수 있습니다. 예를 들어, SAVI는 소혈관 또는 중혈관혈관염⁷을 모방할 수 있습니다. 마찬가지로, 소아 특발성 관절염(JIA)은 성인기까지 지속될 수 있는 이질적인 소아 발병 염증성 질환군으로, 간간섭병증과 유사한 조절 장애와 연관되어 소아 코호트에서 유전적 분석의 필요성을 강조합니다⁸.

제1형 간간병증은 숙주 유래 핵산에 의해 촉발된 항바이러스 센서가 활성화되는 멘델식 선천적 면역 오류로, 자기 자신과 비자기 구별 실패를 나타냅니다 ^3,4. 이 질환들은 제1형 인터페론 신호의 상향 조절로 정의되며, 피부학적 증상은 종종 중요한 진단 단서를 제공합니다. SAVI는 TMEM173에서 기능 향상 돌연변이와 연관되어 있으며, 조기 발병 피부 혈관병증과 폐 염증을 동반합니다.^9. p.V155M 돌연변이는 가장 자주 보고된 변이¹⁰입니다. SAVI는 STING1 돌연변이와 관련된 희귀 자가염증 질환으로, 초기 간질성 폐질환(ILD)과 피부 병변이 특징이며, 임상적으로 전신성 홍반성 루푸스(SLE)와 유사할 수 있습니다¹¹. 조절 장애가 있는 제1형 인터페론 신호전달은 항호중구 세포질 항체(ANCA) 관련 혈관염(AAV)에도 연관되어 있습니다. AAV에서는 1형 인터페론 서명이 현미경 다혈관염/미엘로퍼옥사이드-ANCA 관련 혈관염(MPA/MPO-AAV)에서 우세하며, 신장 예후와 연관되어 희귀 변이체가 인터페론 조절 이상에 기여함을 강조합니다¹².

단일유전자 자가염증 증후군은 혈관염 또는 혈관염과 유사한 증상을 보일 수 있습니다. 예를 들어, SAVI는 소혈관 또는 중혈관혈관염⁷을 모방할 수 있습니다. 이전에는 활성화성 STING1 돌연변이를 보유한 전 세계 최대 환자 코호트를 기술하여 SAVI¹³의 임상 및 면역학적 표현형 특성을 확장했습니다. 지난 20년간 조혈 세포와 비조혈 세포 모두에 의한 병원체 인식에 대한 이해가 눈에 띄게 진전되었습니다. 미생물 성분은 생식계 암호화 수용체를 통해 검출되며, 이는 이 반응을 시작하는 데 중요한 단계입니다¹⁴. 2006년에는 DNA를 다양한 세포 유형으로 전환하는 것이 Tll 유사 수용체(TLR) 독립적인 방식으로 Type I 인터페론의 상향 조절을 유도한다는 것이 입증되었습니다. 이 맥락에서 소포체에 국한된 막관통 단백질인 STING은 2008년에^{합성 및 바이러스} DNA에 대한 Type I 인터페론 반응의 핵심 매개체로 확인되었습니다. STING1에서 기능성 돌연변이가 나타나 SAVI⁹˒¹⁰˒¹⁴로 알려진 제1형 간핵병증을 유발합니다. 이 중증 질환은 조기 전신 염증, 피부 혈관병증, 간질성 폐질환(ILD)으로 다양하게 특징지어집니다¹⁴. SAVI는 드물며, 현재까지 37개 가족에서 52명의 환자가 보고되었고 대부분 신발로 발생하지만 상염색체 우성 유전도 보고되었습니다. 이전에는 활성화성 STING1 돌연변이를 보유한 전 세계 최대 환자 코호트를 기술하여 SAVI ^9,10,11˒¹⁴의 임상 및 면역학적 표현형 특성을 확장했습니다.

이 프로토콜은 자가염증 특징을 가진 소아 환자에서 WES 기반 유전 분석을 통해 간과병증 관련 유전자 변이를 조기에 발견할 수 있도록 개발되었으며, 기존 접근법으로는 희귀 돌연변이를 식별하기에 부족하고 조기 개입의 기회를 놓칠 수 있기 때문입니다. 문헌은 혈관염 유사 표현형에서 인터페론 상향 조절의 역할이 멘델 장애 연구를 통해 명확히 밝혀졌음을 보여주며, 희귀 변이 검출에 있어 WES의 장점을 더욱 강조합니다 ^4,7,12.

이 방법의 주요 목표는 물리학 기반 신호처리 원리와 단순화된 생물물리학적 계산 모델링을 통합하여 제1형 간섭병증에 대한 WES 데이터 내 변이 검출을 지원하고, 특히 Janus 키나아제-신호 변환기 및 전사 활성화자(JAK-STAT) 연쇄 반응에 미치는 후속 영향을 해석하는 것입니다. 이 탐색적 접근법은 면역 매개 질환의 시퀀싱 노이즈와 비균일한 커버리지로 자주 영향을 받는 유전체 영역 분석을 보완하는 것을 목표로 하며, 이들 영역에서는 조절 불균형한 인터페론 활성화가 혈관염 표현형을 유발합니다. 표준 생물정보학 워크플로우는 일반적으로 표준 품질 지표에 집중하여, STING1이나 TREX1과 같은 유전자의 복잡한 영역에서 변이를 식별할 때 추가적인 지원 필터링의 여유가 있을 수 있습니다. 이산 푸리에 변환(DFT)과 통계 분포에서 영감을 받은 신호 처리 기법을 적용함으로써, 이 방법은 뉴클레오타이드 서열에서 기저 유전체 특징을 추출하고, 염기(A, T, C, G)를 이진 지표로 매핑하여 돌연변이 패턴 분석을 수행합니다¹⁵. 더 나아가, 인터페론 경로의 생물물리학적 모델링은 역치 행동과 누적 신호 증폭을 포함하여 유전적 변이가 내피 기능 장애를 지속할 수 있는 방식을 평가하며, 특히 제1형 인터페론(IFN-α/β) 신호 전달에서 JAK-STAT 경로의 역할에 중점을 둡니다.

이 탐색적 응용 프로그램은 저보장 영역에서 정렬 프로파일을 연구하기 위해 설계되었습니다. 표준 계산 도구가 1차 변이 여과를 제공하는 반면, 지원 모델은 SNR 기반 평가가 비균일 리드 분포에 영향을 받는 코딩 단일 염기체 변이체(SNV)에 대해 2차 정성적 게이팅을 제공할 수 있는지 조사합니다. 이 물리 기반 접근법은 SNR 최적화를 사용하여 유전자형 품질과 소수 리드 비율을 평가합니다. 더 넓은 문헌에서는 유사한 확률 모델링이 전부 또는 전무 동역학이 아닌 JAK-STAT 경로에서 점진적 반응을 밝혀내어 인터페론 과잉 생산을 더 잘 예측할 수 있게 했다¹⁶. IN1/IFNAR2 수용체에 결합하는 제1형 인터페론(IFN)에 의해 활성화되는 JAK-STAT 경로는 자누스 키나아제(JAK1, TYK2)가 STAT1과 STAT2를 인산화하여 IRF9와 함께 ISGF3 복합체를 형성하여 핵전위 및 ISG 전사¹⁷을 수행합니다. 이는 IFN-β 유도에 대해 상미분방정식(ODE)을 사용하여 모델링할 수 있습니다:

여기서 나열된 매개변수는 인산화율, 탈인산화, 그리고 SOCS1을 통한 음의 피드백을 나타내며, 임계값 의존 증폭을 강조합니다¹⁷. 추가 세부사항으로는 IFN-γ 신호를 위한 STAT1 호모디머 형성이 있지만, 제1형 간방해증에서는 지속적인 활성화가 과도한 ISG 발현을 초래합니다. 확률 시뮬레이션은 또한 Gillespie 알고리즘을 사용하여 수용체-리간드 결합과 핵 유입의 잡음을 모델링하여 IFN 반응의 세포 간 이질성을 밝혀내어 변동성을 추가로 설명한다¹⁶. 이 방법은 자가염증성 혈관염을 연구하는 연구자들에게 특히 적합한데, 이는 파라크린 효과를 포함하는 확장된 ODE와 같이 변이체와 경로 조절 장애를 연결하는 정량적 틀을 제공하기 때문입니다:

여기서 나열된 매개변수들은 생산 속도, 열화, 파라크린 강화¹⁸을 나타냅니다. 고처리량 시퀀싱 데이터와 계산 자원에 접근할 수 있는 사용자는 이 접근법을 적용해 후보 변이의 우선순위를 정하고 잠재적 경로 효과를 탐색할 수 있습니다.

본 연구는 혈관염 분류의 어려움과 전통적 접근법의 한계로 인해 임상 엑솜 시퀀싱(CES)/WES 기반 유전 분석 프로토콜을 사용하여 자가염증 특징을 보이는 대규모 소아 코호트에서 혈관염 관련 변이를 규명하기 위해 다학제적 류마티스학 및 유전학 접근법을 사용하여 계획되었습니다. 또한, 이 연구는 소아 혈관염에서 유전적 평가의 진단적 가치를 강조하는 것을 목표로 했습니다.

2012년 채플 힐 혈관염 분류에는 단일성 자가염증성 혈관염¹⁹번은 포함되지 않습니다. 이 연구는 자가염증 증상을 가진 소아 환자 집단에서 간호병증 관련 변이의 빈도를 규명하고, 희귀질환 데이터베이스 확장에 기여하며, 소아 혈관염에서 유전적 평가의 중요성을 강조하는 것을 목표로 했습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 에게 대학교 의과대학 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 말초혈액 샘플은 헬싱키 선언에 따라 환자 또는 그 법적 보호자로부터 서면 동의를 받은 후 채취되었습니다. 이 회고적 단일 기관 연구는 의심되는 자가염증 질환에 대한 유전적 분석을 받는 환자들 사이에서 간간증 관련 변이의 빈도를 평가하고, 혈관염과의 관계를 조사하기 위해 설계되었습니다. 2022년부터 2025년 사이에 자가염증 질환의 예비 진단과 함께 Ege 대학 분자 의학 연구소로 보내진 말초혈 샘플이 포함되었습니다. 총 1,204개의 샘플이 유전 분석을 받았습니다. CES/WES는 엑손과 인접 인트론 서열을 표적으로 하는 차세대 시퀀싱(NGS) 접근법으로 사용되었습니다. 변이들은 ACMG 기준과 생물정보학 분석을 통해 분류되었습니다. 양성 및 잠재적으로 양성 변이는 제외되었다. 이 중 포함 기준을 충족하는 간섭병증 관련 변이가 확인된 소아 환자 132명이 최종 연구 코호트에 포함되었습니다.

이 소아 코호트 내에서 임상 데이터는 류마티스과 클리닉 데이터베이스에서 수집되었습니다. 전체적으로 132명의 환자 중 92개의 고유 유전 변이가 확인되었으며, 이 중 13개는 이전에 보고된 병원성 또는 병원성 가능성이 높은 변이(예: ClinVar)와 2026년 2월 기준으로 공개 데이터베이스에 없는 79개의 신규 변이입니다. 대부분의 변이형은 이형접합형이었으며, CAPS 유사 표현형 또는 복합 자가염증성 혈관염 증상과 연관되어 있었습니다. WES는 단백질 코딩 영역(엑손)과 인접 인트로닉 서열을 표적으로 하는 NGS 접근법을 사용하여 접합 부위 및 조절 변이를 검출했습니다. WES는 인간 게놈의 약 1%–2%를 차지하지만, 알려진 질병 유발 돌연변이의 거의 85%를 포착하여 희귀 변이 탐지에 매우 효율적인 도구입니다.

실험실 워크플로우에는 말초혈액에서 유전체 DNA 추출, DNA 단편화, 어댑터 연결 라이브러리 준비, 그리고 비오틴-스트렙타비딘 풀다운을 통한 하이브리드화 기반 캡처 프로브를 이용한 엑솜 풍부화가 포함되었습니다. DNA 나노볼 시퀀싱 플랫폼에서 고속 쌍 종단 시퀀싱이 수행되었으며, 평균 커버리지 깊이 100–200배를 달성하여 변이의 신뢰성 높은 검출을 보장했습니다. 생물정보학 분석은 참조 게놈과의 정렬, 변이 호출, 그리고 엄선된 변이 데이터베이스를 이용한 주석 작성을 포함했으며, 변이 분류는 미국 의학유전학 및 유전체학회(ACMG) 지침에 따라 수행되었습니다. 변이들은 이전에 보고된 것으로 분류되었습니다. 선정된 변이들은 생거 시퀀싱으로 검증되었습니다.

표준 생물정보학 파이프라인 외에도, 물리학 기반 신호처리 원리와 단순화된 계산 모델링을 적용하여 시퀀싱 깊이, 커버리지 균일성, 신호 대 잡음 특성을 평가하여, 원시 시퀀싱 깊이와 지역 커버리지를 분석할 탐색적이고 보조 계층을 제공하였습니다. 더 나아가, 생물물리학적 모델링 개념을 활용해 혈관염 관련 유전적 변이의 누적 영향을 평가하였습니다.

이 학제간 틀은 탐색적 연구 맥락에서 변이 필터링 특성을 연구하는 예비 실험실 모델 역할을 하며, 특히 항인터페론 치료 전략을 안내하는 데 활용됩니다. 제한 사항은 저수준 모자이크 변이에 대한 민감도 저하와 새로운 발견에 대한 기능적 검증이 요구된다는 점입니다. 잠재적 응용 분야로는 소아 혈관염의 조기 진단, 개인 맞춤형 치료 의사결정, 면역학, 류마티스학, 혈관 의학과 관련된 변이 데이터베이스 확장이 포함됩니다.

DNA 분해

희석된 DNA 20마이크로리터가 새로운 멸균 PCR 튜브에 이식되었습니다. 각 튜브에는 2 μL 분편화/아데닐화 완충제와 3 μL 분편화/아데닐화 효소 혼합액이 첨가되었으며; 총 반응 부피는 25 μL였습니다. 혼합물을 부드럽게 혼합하고 잠시 원심분리한 후 열순환기에서 파편화 프로그램이 실행되었습니다. 완성 직후 튜브들은 잠시 원심분리되어 얼음 위에 올려졌습니다. 예상 결과는 평균 DNA 조각 크기가 200–300 bp였습니다.

어댑터 연결(Adapter ligation)

각 분절 산물에는 2.5 μL의 시퀀싱 어댑터가 추가되고, 이어서 10 μL의 리게이션 마스터 믹스(소용돌이 없음)가 추가되었습니다. 혼합물을 부드럽게 피펫화하여 균질성을 확인하고, 잠시 원심분리한 후 열 사이클러 뚜껑을 열어 20°C에서 15분간 배큐했습니다. 부화 후에는 튜브를 잠시 원심분리하여 얼음 위에 보관했습니다.

구슬 기반 정제

각 샘플에 30마이크로리터의 자기 비드를 첨가하고 피펫팅으로 완전히 혼합하여 균질한 현탁액을 얻었습니다. 혼합물은 상온에서 5분간 배양한 후, 튜브를 자기 스탠드 위에 3분간 올려놓았습니다. 상정액이 배출된 후에는 조심스럽게 제거되었습니다. 펠릿은 80% 에탄올 100μL로 두 번 세척되었고, 최종 세척 후 잔류 에탄올을 제거했다. 구슬들은 마그네틱 스탠드 위에서 최대 5분간 자연 건조되었습니다. 뉴클레아제 무첨가물 9마이크로리터가 추가되었고, 펠릿은 피펫팅으로 재현탁되어 실온에서 2분간 배큐되었다. 3분간 자기 분리를 거친 후, 7.5 μL의 상원액이 새로 표시된 PCR 튜브로 옮겨졌습니다.

PCR 증폭

시험관 내 전사(IVT) 프라이머는 희석되었습니다(프라이머 스톡 20 μL + 뉴클레아제 무 물 80 μL 포함). PCR 반응(총 부피 17.5 μL)에는 IVT 프라이머 1 2.5 μL, IVT 프라이머 2 2.5 μL 및 라이브러리 증폭 마스터 믹스 12.5 μL가 추가되었습니다. 혼합물을 부드럽게 피펫팅하고 PCR-3 프로그램이 수행되었습니다.

PCR 정제 후

각 PCR 제품에 25마이크로리터의 자기 비즈가 첨가되었습니다. 상온에서 5분간 배양하고 자기장 분리한 후, 구슬을 80% 에탄올 100μL로 두 번 세척했습니다. 최대 5분간 자연 건조한 후 11 μL의 뉴클레아제가 없는 물을 추가했습니다. 상정액 10마이크로리터가 새 튜브로 옮겨졌다. 도서관 농도가 측정되었고; 목표 기준: >25 ng/μL.

풀링 및 하이브리드화(풀당 샘플)

라이브러리는 8개의 환자 샘플(샘플당 93.75 ng, 총 750 ng)으로 통합되었습니다. 필요 시 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 부피를 12.5 μL로 조절했습니다. 하이브리드화 혼합물은 65°C에서 15분간 사전 인큐베이팅되었습니다. 차단액, 범용 차단 올리고뉴클레오타이드, 엑솜 캡처 프로브, 뉴클레아제 무첨가수, 하이브리다이제이션 강화제가 순차적으로 첨가되었습니다. 16시간 교배 프로그램이 시작되었습니다(18:00–10:00).

스트렙타비딘 구슬에 잡종 표적을 포획하는 방법

스트렙타비딘 구슬은 결합 완충제로 세 번 세척되었습니다. 16시간 교배 후 혼합물을 구슬에 첨가하여 25°C에서 30분간 배양하고, 5분마다 부드럽게 혼합했습니다. 세척은 상온에서 캡처 워시 버퍼 1을 사용했고, 이어서 48 °C에서 배큐 포함 48 °C에서 예열된 캡처 워시 버퍼 2를 사용한 세 차례의 세척이 수행되었습니다. 최종 세척 후, 펠릿은 23 μL 무뉴클레아제 물에 재현탁되었습니다.

단가닥 DNA(ssDNA) 준비

TE 완충제를 24마이크로리터 첨가하고, 혼합물을 95°C에서 3분간 변성시킨 후 즉시 얼음 위에 올려놓았습니다. 스플린트 리게이션 버퍼와 신속 DNA 리게아제가 포함된 마스터 믹스가 추가되었고, SS-2 프로그램(37°C, 30분)을 실행하여 단일 가닥 DNA를 원형화하였습니다. 소화 완충제와 소화 효소 혼합물이 추가되었고, SS-3 프로그램(37 °C, 30분)이 실행되었습니다. 그 후 3.75 μL의 소화 중단 버퍼를 추가했습니다. 85마이크로리터의 자기 비드가 추가된 후 표준 비즈 정제가 이루어졌습니다. 15마이크로리터의 상청액이 새로운 튜브로 옮겨졌고; 예상 농도는 0.8–2 ng/μL였습니다.

DNA 나노볼(DNB) 준비

ssDNA 산물은 DNB 형성에 사용되었습니다. DNB 형성 완충제, 저 EDTA TE 완충제, DNB 효소 혼합물 1 및 2가 추가되었습니다. DNB-1과 DNB-2 프로그램은 순차적으로 진행되었습니다. 완료 후 20 μL DNB 반응 정지 버퍼를 추가하고 넓은 피펫 팁을 사용해 5–8배 정도 부드럽게 혼합했습니다; 예상 농도는 8–40 ng였습니다. 준비된 DNB는 고속 처리량 시퀀싱을 위해 DNA 나노볼 시퀀싱 플랫폼에 로드되었습니다.

시퀀싱 데이터 처리 및 신호 분석

원시 시퀀싱 리드는 FastQC(v0.11.9)와 fastp(v0.23.1)를 사용하여 품질 관리되었습니다. 신호-잡음비(SNR) 임계값인 20 dB는 수신기 작동 특성(ROC) 곡선 분석을 통해 알려진 자가염증 변이의 벤치마크 데이터셋을 기준으로 최적화되었으며, 저주파 변이체의 경우 <1%의 거짓 발견률(FDR)과 >95%의 표적 민감도를 균형 있게 조정했습니다; 이 20 dB 임계값 이하로 떨어지는 리드는 폐기되었습니다. 유전체 참조 컨소시엄 휴먼 빌드 38(GRCh38) 참조 유전체와의 정렬 및 초기 변이 호출은 BWA-MEM(v0.7.17)과 게놈 분석 도구 키트(GATK, v4.2.6)를 사용하여 수행되었습니다.

물리 기반 신호 처리 단계에서는 뉴클레오타이드 서열을 이진 수치 신호(0은 퓨린, 1는 피리미딘)로 변환되었습니다. DFT를 계산하기 위해 이진 신호는 국소화된 유전체 해상도를 유지하기 위해 N = 512염기쌍의 슬라이딩 윈도우와 50% 중첩(256 bp 단계)으로 처리되었습니다. DFT는 다음과 같이 정의되었습니다:

고주파 시퀀싱 아티팩트를 과도하게 부드럽게 하지 않으면서도 날카로운 고주파 국소 전이로 나타나는 진정한 단일 염기염기 변이(SNV)를 필터링하기 위해, 저역 통과 디지털 필터가 프로그래밍적으로 보정되었습니다. 최적 정규화 컷오프 주파수(fc)는 0.05–0.25 사이클/베이스 범위를 탐색하여 반복적으로 결정되었습니다. 최적화 알고리즘은 fc = 0.15 사이클/베이스를 선택했으며, 이는 신호 출력 스펙트럼이 알려진 진양성 대조 변이의 전체 분산의 ≥85%를 유지하면서 배경 기술적 잡음을 제거하는 전환점으로 정의되었습니다. Python(v3.9)으로 작성된 맞춤형 스크립트를 사용하여 NumPy(v1.23.0)와 Scipy(v1.9.1) 라이브러리를 활용해 고주파 잡음을 줄이면서 돌연변이 관련 스펙트럼 특징을 보존하는 데 DFT 기반 필터링이 적용되었습니다. 필터링 매개변수는 희귀 변종 신호의 과도한 부활화를 방지하기 위해 반복적으로 프로그램적으로 보정되었습니다. 신호 처리와 생물물리학 모델링을 위한 통합 워크플로우는 그림 2에 요약되어 있습니다.

인터페론 신호의 생물물리학 및 확률적 모델링

확인된 변이의 기능적 결과를 조사하기 위해, JAK–STAT 경로 역학은 다음과 같이 정의된 상미분방정식(ODE)을 사용하여 모델링되었습니다:

결정론적 ODE 시뮬레이션은 COPASI(복합 경로 시뮬레이터, v4.36)를 사용해 수행되었고, scipy.integrate.solve_ivp 모듈을 이용한 맞춤형 Python 스크립트와 상호 확인되었습니다. 생물학적으로 현실적인 초기 조건이 설정되었고, 증폭률 상수에 대한 감도 분석을 SALib(Python의 민감도 분석 라이브러리 v1.4.5)를 사용해 수행되었습니다. TYK2 매개 IFN-α 신호 전달 동역학을 도입하여 기능 이득 기반 STAT2 증폭을 시뮬레이션하였다.

확률 효과는 랑주뱅 공식화를 사용하여 도입되었습니다:

dX = f(X) dt + g(X)dW

또한, Gillespie 확률 시뮬레이션을 GillesPy2(v1.7.0) Python 라이브러리를 활용하여 전사 폭발과 이질적인 IFN-β 유도 인터페론 자극 유전자(ISG) 활성화를 모델링하였습니다. 감마 커널 공식화로 표현된 분산 지연 함수는 파이썬에서 수치 적분을 사용하여 지연된 전사 피드백 메커니즘을 시뮬레이션하는 방식으로 구현되었습니다. 신호 필터링과 수학적 모델링을 포함한 모든 계산 파이프라인은 리눅스 기반 고성능 컴퓨팅(HPC) 환경에서 실행되었습니다.

그림 2. JAK-STAT 신호 전달의 신호 처리 및 생물물리학적 모델링을 위한 통합 프레임워크. 1: 신호 처리 단계: 뉴클레오타이드 서열의 이진 매핑(퓨린 = 0, 피리미딘 = 1) 이후 DFT 기반 필터링. 정확한 변형 호출을 위해 20 dB의 임계 SNR 임계값을 주목하세요. 2: 생물물리학 모델링: 초기 조건에서의 작은 교란이 지속 신호의 임계값 이동을 초래하는 증폭률의 ODE 기반 시뮬레이션. 3: 생물학적 표현형: IFN-α 경로에서 TYK2 이득 기능 변이체를 모델링하여 STAT2 활성화 증폭과 그에 따른 간핵병증 표현형을 유발합니다. 약어: DFT = 이산 푸리에 변환; IFN-α = 인터페론 알파; JAK-STAT = 야누스 키나제 신호 전현자 및 전사 활성화자; ODE = 상미분 방정식; SNR = 신호 대 잡음비; STAT2 = 신호 전사자 및 전사 활성화자 2; TYK2 = 티로신 키나제 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2는 탐색적 계산 워크플로우에서 사용되는 ODE 및 확률 모델링 구성 요소와 DFT 기반 신호 처리의 통합을 요약합니다. 이 포괄적인 프로토콜은 첨단 분자 유전학, 고처리량 시퀀싱 기술, 신호 처리 알고리즘, 생물물리학적 모델링을 통합하여 소아 자가염증 혈관염에서 간간요법 관련 변이의 탐지 및 기능적 해석을 지원합니다.

통계적 틀과 신호 매핑 확률 분포

신호 필터링 이전에 유전체 서열의 디지털 매핑을 공식화하기 위해, 뉴클레오타이드 생화학을 기반으로 한 이진 변환 프레임워크가 확립되었습니다. 길이 N인 임의의 구조 유전체 윈도우에 대해 퓨린 {A, G}는 디지털 값 0에, 피리미딘 {C, T}는 1로 매핑됩니다. 편향 없고 균일한 배경 유전체 분포의 귀가설(H0) 하에서, 이 이진 변환은 베르누이 시험 틀을 따릅니다. 매핑된 신호 X의 확률 질량 함수(PMF)는 다음과 같이 정의됩니다

P(X = x) = p^x(1 - p)^1-x 에 대해 x ∈ {0,1}

여기서 p = 0.5는 선택되지 않은 배경 트랙에서 피리미딘 잔류물을 만날 확률을 나타냅니다. DFT를 통해 전력 스펙트럼 밀도(PSD) 계산을 위해 순차 기저 변환을 확장할 때, 누적 배경 잡음 분포는 무작위 보행으로 작용하며 중심극한정리에 의해 가우시안 백색소음 분포로 수렴합니다. 따라서 이 영분포의 정규화된 몼수 스펙트럼은 2개의 자유도를 가진 카이제곱(χ²) 분포를 따릅니다. 엄격한 통계적 유의성 임계값(α = 0.05)을 유지하기 위해, 진정한 병원성 변이 신호 스파이크를 정의하는 임계 파워 강도 임계값을 다음과 같은 확률 밀도 통합을 통해 분석적으로 계산했습니다:

임계값 = - In(a) x^{a 2}

여기서^{σ 2} 는 국소 배경 유전체 잡음 바닥의 작동 분산을 나타냅니다. 이 임계값(p < 0.05, 20 dB > SNR에 해당)을 초과하는 스펙트럼 피크는 하류 인 실리코 필터링 게이트에 우선순위를 두어, 변형 호출이 데이터 기반이고 확률적 시퀀싱 잡음의 영향을 덜 받게 했습니다.

운영 효율성 및 비용 분석(그림 3)

전환 및 임상 구현 관점에서, 이 통합 프로토콜의 운영 효율성, 임상 처리 시간(TAT), 경제적 타당성은 순차적 생거 시퀀싱이나 제한된 표적 유전자 패널과 같은 전통적인 진단 경로와 비교하여 벤치마킹되었습니다. 소아 혈관염이나 의심되는 제1형 간간증 진단은 단일 유전자 검사 반복으로 인해 8주에서 12주에 걸쳐 진행되는 경우가 많지만, 고처리량 WES, 최적화된 16시간 하이브리다이제이션, 고성능 컴퓨팅(HPC) 클러스터에서의 병렬 DFT 신호 필터링을 포함한 간소화된 워크플로우는 초기 샘플 수령부터 최종 분자 보고까지 총 임상 TAT를 10–14일간 달성합니다. 또한, 효율적인 샘플 다중화(하이브라이다이제이션 블록당 8개의 환자 샘플을 풀어줌)로 인해, 핵심 시약 및 시퀀싱 비용은 환자당 약 $250–$300으로 보고되며, 이는 전통적인 종합 패널이 종종 $1,200–$1,800을 초과하는 것과 비교됩니다. 진단 일정과 비용 프레임워크의 이러한 압축은 제안된 물리학 기반 생물정보학 워크플로우가 일상적인 임상 유전학 실험실에서 실현 가능하고 확장 가능할 수 있음을 시사합니다.

결과

이 코호트는 간간증 관련 변이가 확인된 132명의 환자들로, 광범위한 유전적 변이가 확인되었습니다(표 1). 환자 중 53명(40.2%)은 여성, 79명(59.8%)은 남성이었습니다. 평균 연령은 10.2세(범위: 0–18세)였습니다. 최종 코호트에 해당하는 환자 수준 데이터는 보충 표 S1에 제공되어 있습니다.

표 1: 소아 자가염증 코호트 내에서 확인된 제1형 간섭병증 관련 유전 변이의 분포 및 분류 (n = 132). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하세요

가장 자주 영향을 받은 유전자는 ADAR(25명, 18.94%)와 DNASE1(24명, 18.18%)입니다. DNASE1 변이는 전적으로 클래스 3(유전자 내 100%; 전체 코호트의 18.18%)에 속했습니다. 마찬가지로, ADAR 변이의 대다수는 클래스 3(24명, 96.00%; 코호트의 18.18%)이었으며, 클래스 2 변이는 단 한 건(유전자 내 4.00%; 코호트의 0.76%)이었습니다(표 2).

표 2: 희귀질환 NGS 패널에서 확인된 변이. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하세요

STING1(20명, 15.15%)과 RNASEH2B(14명, 10.61%)에서도 변이가 흔하였다. 모든 STING1 변형은 클래스 3(100%)였습니다. RNASEH2B 중 10명(71.43%)이 3군 변이(7.58%), 4명(28.57%)이 2군 변이(3.03%)를 보였습니다.

13명의 환자(9.85%)에서 RNASEH2A개의 돌연변이가 확인되었으며, 이들 모두가 클래스 3 변이를 보유했습니다(100%). TREX1 돌연변이는 10명(7.58%)에서 발견되었으며, 이 중 8건의 클래스 3 변이(80.00%; 코호트의 6.06%)와 2개의 클래스 2 변이(20.00%; 코호트의 1.52%)가 포함되었습니다.

SAMHD1 변이체는 9명(6.82%)에서 검출되었으며, 7명이 3급 변이를 보유했고(77.78%; 코호트의 5.30%), 1명이 1급 변이를 보유했으며(11.11%; 0.76%), 1명은 2급 변이를 보유했으며(11.11%; 0.76%)가 있었습니다.

8명의 환자(6.06%)에서 RNASEH2C 돌연변이가 발견되었으며, 모두 3급 환자였습니다. 6명의 환자(4.55%)에서 DNASE1L3 돌연변이가 확인되었으며, 여기에는 5개의 클래스 3 변이(83.33%; 코호트의 3.79%)와 1개의 클래스 2 변이(16.67%; 0.76%)가 포함되었습니다. PSMB8과 COPA 돌연변이가 각각 5명(3.79%)에서 발견되었으며, 모든 변이가 클래스 3(100%)에 해당하였습니다. DNASE2와 STAT4 돌연변이는 각각 3명(2.27%)에서 발견되었으며, 모든 변이가 3급으로 분류되었습니다.

전반적으로 클래스 3 변이체는 코호트 내 거의 모든 유전자에서 우세한 변이 클래스를 구성했다. 표적 유전자에 걸친 상세한 뉴클레오타이드 치환 및 이에 따른 아미노산 변이와 같은 구체적 변이 부위는 표 3에 정리되어 있습니다.

신호 처리 성능의 탐색적 분석

DFT 기반 신호 처리 파이프라인의 견고성과 민감도를 탐구하기 위해, 표준 GATK 전용 변이 호출 워크플로우와 비교 벤치마크를 수행했으며, 특히 30배 깊이의 저포괄 유전체 영역에 초점을 맞추<. 예비 벤치마킹에서 통합 DFT 필터링 레이아웃은 선택된 저보장 영역에서 우선순위 개선 추세를 보여주었으며, 특정 실험실 제어 조건에서 탐색적 회복률이 최대 96.8%에 이를 것으로 추정됩니다. 중요한 점은, 이러한 매개변수와 수치 효율성 지표가 보편적으로 검증된 임상 파이프라인이 아니라 특정 기관 코호트 맥락 내에서 조정된 예비적이고 탐색적인 결과임을 의미합니다. 파이프라인은 또한 고잡음 지역에서 이전에 폐기된 진양성 변이체를 회수했습니다. 더불어 FDR은 6.4%에서 1.2%로 감소하여, 저주파 시퀀싱 아티팩트를 제거하는 데 있어 저역 통과 필터의 잠재적 견고성을 강조했습니다. 코호트에서 확인된 새로운 변이 중 14개의 변이(신규 발견의 17.7%)는 주로 STING1과 TREX1의 비균일한 범위 영역에 위치했으며, 표준 알고리즘 임계값에 의해 저품질 인위물로 분류되었으나, 신호-잡음 향상 프로토콜에 따른 Sanger 시퀀싱으로 성공적으로 복구 및 검증되었습니다. 이러한 분석적 관찰은 물리적 신호 특성 평가가 탐색적 연구 워크플로우에서 유용한 도구가 될 수 있음을 시사합니다.

표준 워크플로우와의 비교 벤치마킹

이 통합 프레임워크의 성능을 평가하기 위해, 두 가지 표준 변종 호출 파이프라인인 GATK 베스트 프랙티스 워크플로우(BWA-MEM + GATK HaplotypeCaller v4.2.6)와 DeepVariant(v1.5)를 나란히 비교하여 벤치마킹 분석이 수행되었습니다. 성과 지표는 코호트의 고신뢰 검증 하위 집합을 사용하여 계산되었으며, 낮은 범위(깊이 <30배)와 높은 잡음이 있는 유전체 영역을 평가하였다. 비교 아키텍처는 표 4에 요약되어 있습니다.

계산 모델의 정량적 매개변수화 및 검증

생물물리학 및 확률적 틀을 정량적으로 기초화하기 위해, ODE와 길레스피 시뮬레이션은 실험적 대조 조건에 맞춰 보정된 경험적 동역학 값을 사용하여 매개변수화되었다. 연속 ODE 시뮬레이션은 1형 인터페론 노출 후 720분 동안 인산화된 STAT2([STAT2p])의 절대 농도를 추적합니다. 야생형(WT) 계산 모델에서 신호 전달 연쇄 반응은 빠른 항상성 감쇠를 보여주었으며, 이는 t = 45분에 활성화 피크가 나타나고, 이후 프로그래밍된 음의 피드백(k3 = 0.45분-1)에 의해 시뮬레이션된 SOCS1 발현에 의해 빠른 클리어런스가 나타나는 것이 특징입니다. 반면, STING1과 TYK2 경로의 기능 증진(GoF) 변이를 모델링하면 심각한 임계값 이동이 나타나 지속적이고 비감쇠성 고염증 상태가 나타났습니다. 신호 반감기(t1/2)와 정상 상태 접힘 변화는 표 5에 요약되어 있습니다.

데이터 가용성 명세서

최종 코호트에 해당하는 임상 데이터는 보충 표 S1에 제공되어 https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-MethodologyPatient-level. DFT 필터링 및 생물물리학적 경로 시뮬레이션(ODE 및 확률 모델링)을 복제하는 데 필요한 이산 디지털 신호 처리 임계값, 수학적 공식, 소프트웨어 환경 설정, 계산 매개변수 등이 공개되었습니다. 독자들의 영구적이고 방해받지 않는 접근을 보장하기 위해, 이 복제 프레임워크는 GitHub에 보관되고 DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497 를 통해 Zenodo에 영구 보관되었습니다. GitHub: https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-Methodology. NumPy, SciPy, COPASI 등 표준 오픈 소스 소프트웨어 라이브러리와 수치 컴퓨팅 플랫폼은 이 워크플로우에서 공개적으로 접근 가능합니다.

그림 3. 1형 간섭병증 관련 변이의 식별 및 생물물리학적 모델링을 위한 운영 스토리보드 및 데이터 기반 파이프라인 아키텍처. 도식은 임상 코호트 분석과 생물학적 신호 처리를 통합한 연대순 4단계 실험 및 계산 워크플로우를 개략적으로 제시합니다. (A) 코호트 층화 및 NGS 파이프라인: WES를 진행 중인 소아 자가염증 코호트(n = 132)의 워크플로우. 삽입 화면에는 대표적인 원본 FastQ 품질 관리 Phred 점수 트랙이 표시되며, GATK/DeepVariant 변형 호출과 최종 VCF 행렬 생성으로 전환됩니다. (B) DFT 기반 신호 처리: 노이즈 감소를 위해 유전체 텍스트를 수치 게놈 신호로 알고리즘적으로 번역하는 방법. 내장된 데이터 기반 그래프는 SNR 임계값이 >20 dB인 유전체 배경 잡음과 함께 병원성 변이 주파수(신호 스파이크)를 식별하는 파워 스펙트럼 분포를 그립니다. (C) 실리코 큐레이션 게이트: ACMG 5단계 병원성 가이드라인, HGMD, 인페버스 교차 검사를 통합하여 79개의 신규 변이와 13개의 보고된 변이를 우선순위로 정하는 다층 우선순위 지정 깔때기. (D) 기능적 생물물리학 모델링 검증: 생물학적 검증 계층. 결정론적 ODE 프레임워크와 확률적 질레스피 시뮬레이션 곡선은 그래픽 구성 요소로 통합되어, 야생형과 모의 돌연변이 세포 동역학의 720분 시간 경과 회복 및 지속 신호 전달을 도표합니다. 약어: ACMG = 미국 의학 유전학 및 유전체학회; DFT = 이산 푸리에 변환; GATK = 게놈 분석 툴킷; HGMD = 인간 유전자 돌연변이 데이터베이스; NGS = 차세대 시퀀싱; ODE = 상미분 방정식; SNR = 신호 대 잡음비; VCF = 변형 호출 형식; WES = 전체 엑솜 시퀀싱. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 3: 소아 코호트 내에서 확인된 제1형 간핵병증 관련 유전적 변이에 대한 포괄적인 주석 및 위치 데이터베이스 통제(n=132). ACMG 기준(2015년 ACMG/AMP 가이드라인에서): ACMG/AMP 증거 코드는 근거 강도에 따라 그룹화되었습니다. 매우 강력한 증거에는 기능 상실이 확립된 질병 기전인 유전자에서 예측되는 기능 상실 변이가 나타나는 PVS1이 포함되어 있습니다. 강력한 근거로는 이전에 확인된 아미노산 변화, 확실한 신발 발생, 지지 기능적 근거, 그리고 환자 내 변이 빈도 증가가 포함되었습니다. 중간 수준의 근거로는 PM1–PM6이 포함되었으며, 여기에는 중요한 도메인이나 돌연변이 핫스팟에 위치함, 집단 데이터베이스에서 부재 또는 매우 낮은 빈도, 열성 질환에서의 트랜스젠스 발생, 단백질 길이 변화, 알려진 병원성 변이가 있는 잔기에서의 새로운 오센스 변화, 그리고 신규 발생 추정이 포함되었습니다. 뒷받침 증거로는 PP1–PP5가 포함되었으며, 여기에는 동시분류, 유전자 특이적 오감 억제, 실리코 증거, 표현형 특이성, 그리고 독립적인 증거가 없을 때 신뢰받는 병원성 이전 보고가 포함되었습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하세요

표 4: 고잡음 유전체 영역에서 변종 호출 파이프라인의 나란히 성능 비교. 벤치마킹 평가는 저보장(<30배) 영역에서 수행되어, 표준 알고리즘 구성과 비교했을 때 물리 기반 DFT 저역 통과 필터가 시퀀싱 잡음을 제거하고 진양성 신호를 보호하는 성능을 평가했습니다. 약어: DFT = 이산 푸리에 변환. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하세요

표 5: 하류 JAK-STAT 신호의 정량적 동역학적 매개변수 및 정상 상태 변화. 720분 시간 경과 동안 ODE 및 확률적 길레스피 시뮬레이션 경계를 요약하며, 병원성 STING1 및 TYK2 변이를 가진 모델에서 세포 항상성 감쇠의 실패를 강조합니다. 약어: JAK-STAT = Janus 키나아제 신호 변환기이자 전사 활성화자; ODE = 상미분 방정식; STING1 = 인터페론 반응 자극제 cGAMP 상호작용자 1; TYK2 = 티로신 키나제 2. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하세요

보충표 S1. 간간증 관련 변이가 있는 소아 코호트의 환자 수준 데이터셋. 표는 원 고에서 분석된 최종 132명 환자 코호트에 해당하는 환자 수준 데이터를 제공합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

프로토콜의 핵심 단계에는 DNA 단편화, 어댑터 연결, PCR 증폭, 그리고 단가닥 DNA(ssDNA) 순환화가 포함됩니다. 이 단계에서는 오염 위험을 최소화하기 위해 세심한 작업이 필수적입니다. 비드 기반 정제 시 정확한 에탄올 세척과 적절한 자기 스탠드 배양 시간이 필수이며, 편차는 제품 수율 감소나 변이 발견 놓치는 결과를 초래할 수 있습니다. 통합 라이브러리 준비 시 환자당 93.75 ng의 정확한 계산과 신중한 부피 조정이 필요합니다.

프로토콜 최적화 및 문제 해결을 위해, 특히 0.8–2 ng/μL 임계값 이하의 ssDNA 농도가 낮은 형광 정량 측정은 변이 호출 민감도를 높이기 위해 시퀀싱 깊이를 늘리거나 구슬 건조 시간을 단축해야 할 수 있습니다. 의심되는 모자이크 변이의 경우, 장기 독기 시퀀싱 기술의 통합이 검출 정확도를 높일 수 있습니다. 또한, 효소 소화 후 샘플을 얼음 위로 빠르게 옮기는 것은 제품 안정성 유지에 매우 중요합니다^12,13. DNB 준비 과정에서 느리고 부드러운 피펫팅과 정지 버퍼의 신중한 첨가가 나노볼 무결성을 유지합니다. 이는 SAVI ^6,11과 같은 조기 발병 간섭병증에서 유전자형-표현형 상관관계를 확립하는 데 특히 중요합니다.

이 WES 기반 유전 분석은 자가염증 특징과 혈관염이 있는 소아 환자에서 간호병증 관련 변이를 평가하는 틀을 제공합니다. DNASE1, ADAR, STING1, RNASEH2A/B/C, TREX1, SAMHD1, COPA와 같은 주요 유전자의 변이를 확인함으로써, 이 연구는 인터페론 주도 혈관염 표현형의 유전적 이질성을 강조합니다. 이 코호트에서 핵산 대사 및 감지 유전자, 특히 DNASE1과 ADAR의 변이가 빈도가 나타나는 것은 소아 혈관염 및 자가염증 질환의 발병 기전에서 조절 이상인 제1형 인터페론 신호전달의 중심적 역할과 일치합니다. 이 발견들은 이 유전자들이 간섭병증 및 혈관염 증상과 연관된 이전 보고서들과 일치합니다 ^4,5,7.

SAVI에서 관찰되는 피부 및 간질성 폐 침범과 같은 단일유성 자가염증 증후군의 혈관염 유사 증상을 밝혀내는 이 접근법은 조기 진단을 촉진하고 항인터페론 표적 치료법 ^4,5,7을 안내하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 단일유전자 간간엽병증은 ANCA 관련 혈관염 및 기타 소아 혈관염과 임상적으로 유사할 수 있어, 비정형적이거나 치료 저항성 사례에서 유전자 검사의 중요성을 강조합니다 ^9,10,11. 조기 유전적 진단은 또한 STING1 및 기타 인터페론 관련 돌연변이 환자에서 임상적 이점을 보인 JAK 억제제와 같은 표적 치료의 시기적절한 시작을 가능하게 할 수 있습니다 ^7,13,14.

이 연구는 또한 복잡한 자가염증성 혈관염을 가진 소아 환자 중 상당수가 간간증 관련 유전자에서 희귀하거나 새로운 변이를 가지고 있음을 확인시켜 줍니다. 이 대규모 코호트에서 79개의 새로운 변이가 확인되어 알려진 유전 스펙트럼이 확장되었으며, 소아 혈관염에서 유전자형-표현형 상관관계 개선에 기여할 수 있습니다.

이 탐색적 워크플로우에서 운영상의 고려사항은 임계 한계를 평가하는 것으로, 탐색적 SNR 매개변수의 편차가 필터링 출력에 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, DFT 기반 뉴클레오타이드 분포 필터링은 잡음 제거에 도움을 주지만, 돌연변이 신호를 과도하게 부드럽게 만드는 것을 방지하기 위해 보정이 필요합니다; 문제 해결에는 이진 매핑 매개변수(퓨린은 0, 피리미딘은 1)를 반복적으로 조정하여 특징 추출을 최적화하는 것이^{포함됩니다.} 생물물리학 모델링에서는 ODE의 초기 조건을 정의하는 것이 필수적인데, 증폭률의 작은 교란이 임계값 거동을 변화시켜 지속적인 인터페론 신호를 과소평가할 수 있기 때문입니다. 향상된 JAK-STAT 세부 사항에는 IFN-α 신호전달에서 TYK2의 역할을 모델링하는 것이 포함되며, 이득 오브 기능 변이체가 STAT2 활성화를 증폭시켜 간핵병증 표현형²⁰을 유도합니다.

방법의 수정에는 노이즈가 많은 셀룰러 환경에 대한 확률적 요소를 적분하는 것이 포함될 수 있으며, 예를 들어 ODE에 랑주뱅 잡음 항을 추가하는 것이 있습니다:

dX = f(X)dt + g(X)dW

여기서 dW는 위너 과정 노이즈를 나타내며, JAK-STAT 변동성²¹의 현실성을 시뮬레이션할 때 더 실감을 높입니다. 길레스피 알고리즘을 이용한 인터페론 경로의 확률적 시뮬레이션은 세포 간 전사 인자 수준 차이가 ISG 활성화의 이중분포를 이중분포하는 음성 피드백 루프로 인한 IFN-β 발현의 이질성을 포착합니다^22,23. 경로 모델 문제 해결은 실험적 IFN-β 데이터를 검증하는 것을 포함하며; 증폭이 차이를 이루면, 인산효소 활성화율과 같은 음성 대조군을 재조정하거나 분산 지연을 전사에 적용할 수 있습니다:

지연 과정에는 감마 커널을 사용합니다.

전체 유전체 시퀀싱(WGS)과 비교할 때, 이 WES 중심 접근법은 비용 효율적일 수 있으나 비외분자 영역에 대해서는 덜 포괄적입니다 ^24,25. 이 예비 프레임워크의 범위는 누적 효과가 임계값을 초과해 혈관 손상을 초래하는 임계값 모델에서 볼 수 있듯이, 수학적 변동이 추정된 인터페론 신호 행동과 어떻게 상관관계하는지 평가하는 지지 생화학적 시뮬레이션 모델을 제공하는 데 제한됩니다. 이 방법의 한계는 저수준 모자이크 변이를 간과할 수 있는 가능성과 새로운 발견에 대한 기능적 검증 필요성^입니다.

이 기술은 면역학 및 혈관 의학 분야에서 잠재적 응용을 지니고 있으며, 변이가 경로에 미치는 영향을 시뮬레이션하여 항인터페론 치료제를 안내하고 희귀질환 진단용 데이터베이스를 풍부하게 하는 데 활용됩니다¹⁹. 확률적 확장은 간에로병증에서 이질적 반응을 예측할 수 있게 하여 개인 맞춤형 의학을 지원할 수 있습니다.

본 연구에서는 소아 혈관염에서의 유전적 평가를 조직병리학 및 영상 기법과 같은 기존 진단 도구와 함께 강조합니다. 전반적으로 이 연구는 소아 혈관염에서 유전적 평가의 중요성을 강조하며, 의심되는 자가염증 질환에 대한 유전적 분석을 받는 환자들 사이에서 간과병증 관련 변이의 빈도를 강조합니다. 이러한 변이체가 인터페론 신호전달 경로에 미치는 영향을 평가하고 소아 혈관염에서 조기 진단의 중요성을 강조함으로써, 이 연구는 혈관염 및 자가염증 질환과 관련된 희귀질환 데이터베이스의 풍부함에 기여하고, 변이 병원성 및 집단별 다형성을 조사하는 향후 연구에 통찰을 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
조절 가능한 피펫 (P2, P10, P20, P200, P1000)	모든 공급업체		정확한 액체 취급을 위해
벤치톱 원심분리기	모든 공급업체		PCR 튜브의 간단한 원심분리
이퀴녹스 라이브러리 앰프 믹스	MGI Tech/ NEB	7K0014-096 (또는 동등)	PCR 증폭 마스터 믹스
에탄올 (분자 생물학 등급)	모든 공급업체		80% 에탄올 워시 용액 준비에 사용
IVT 프라이머 1 & IVT 프라이머 2	MGI Tech	키트에 포함되거나 별도	라이브러리 증폭 프라이머
저 결합 PCR 튜브 (0.2 mL)	모든 공급업체		멸균 PCR 튜브
자기 스탠드 / 자기 랙	모든 공급업체		자기 비드 분리용
MGI DNBSEQ-G400	MGI Tech Co., Ltd.	900-000641-00	DNBSEQ 기술 (DNA 나노볼 시퀀싱)을 사용하는 벤치톱 차세대 시퀀서; 다양한 읽기 길이 (예: SE50부터 PE300까지) 지원; 최대 1440 Gb의 높은 처리량 출력; WES, WGS 및 표적 시퀀싱 애플리케이션에 이상적.
MGIEasy 원형화 키트	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (이중 바코드, 16 RXN) 또는 1000005260 (V2.0)	단일 가닥 원형 DNA (ssCirDNA)를 생성하기 위한 원형화 키트; 이중 바코드 버전은 인덱스 홉핑을 줄임; MGI 시퀀싱 워크플로우에서 DNB 형성을 위한 필수 라이브러리 준비 후 단계.
MGIEasy DNA 클린 비드	MGI Tech Co., Ltd.	1000005279	DNA 정제용 자기 비드
MGIEasy DNB 프레 키트/ DNB 메이크 키트	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570 (이중 바코드 원형화 통합) 또는 관련 DNB 메이크 (예: 940-000036-00 Onestep DNB)	DNA 나노볼 (DNB) 준비 모듈; 플로우 셀 로딩을 위한 원형화 및 나노볼 생성 포함; DNBSEQ 시퀀서용 라이브러리 처리의 최종 단계 (종종 원형화 키트와 결합).
MGIEasy 엑솜 캡처 액세서리 키트	MGI Tech Co., Ltd.	1000009657 (또는 동등)	차단 용액, MGI 유니버설 차단기, 엔한서, 결합 완충액, 세척 완충액 1 & 2, 스트렙타비딘 비드 포함
MGIEasy 엑솜 캡처 V4 프로브 (또는 Twist CES 프로브, MGI/DNBSEQ와 호환 가능)	MGI Tech Co., Ltd. (MGIEasy용) 또는 Twist Bioscience (Twist용)	1000007745 (V4 프로브 세트, 16 RXN) 또는 1000007740 (프로브); Twist: 사용자 정의 / 패널 특정 (주문 기반, 표준 번호 없음)	하이브리드화 기반 전체 엑솜 캡처 프로브; ~59 Mb 코딩 영역 (CCDS, RefSeq, GENCODE, miRBase) 타겟; DNBSEQ 플랫폼에서 WES 워크플로우의 고효율 농축을 위해 설계됨; MGIEasy 액세서리 키트와 함께 하이브리드화 (65°C 사전 잠복, 65°C에서 16시간 야간), 차단기 추가, 스트렙타비딘 비드 캡처 (결합 완충액, 세척 완충액 1/2 48°C), 용출 및 포스트 캡처 PCR 증폭 (이퀴녹스 믹스와 호환)에 사용.
MGIEasy 빠른 하이브리드화 및 세척 키트	MGI Tech Co., Ltd.	940-001974-00 (16 RXN)	하이브리드화 및 세척 시약
MGIEasy FS DNA 라이브러리 준비 키트	MGI Tech Co., Ltd.	1000006987 (16 RXN 세트) 또는 1000005256 (96 RXN 코어 키트)	빠른 단편화 기반 DNA 라이브러리 준비 키트; 5–400 ng gDNA 입력으로 효소 단편화; DNBSEQ 플랫폼과 호환되어 효율적인 WGS/WES 라이브러