초파리 멜라노가스터에서 스트레스 유발 우울과 유사 상태의 다중 행동 표현형 분석

요약

이 프로토콜은 Drosophila melanogaster에서 스트레스로 인한 행동 변화를 평가하는 틀을 제공합니다. 상호 보완적인 분석법을 결합하면 개별 파리의 활동, 탐구, 의사결정 능력을 정량화할 수 있습니다. 이 접근법은 유연하며 스트레스 생물학, 대사, 신경행동 기능을 조사하는 다양한 연구에 적용할 수 있습니다.

초록

대사, 신경퇴행, 스트레스 관련 장애는 종종 이동 변화, 의사결정 저하, 행동 유연성 저하를 동반합니다. 그러나 Drosophila melanogaster 에서 이러한 표현형을 정량화하기 위한 접근 가능한 다중 양식 행동 프레임워크는 제한적입니다. 여기서는 강제 수영 노출, Y자 미로 회전 행동 및 손, 광주성, FlyVac 시스템 내 활동 평가, 개방지 탐사, 그리고 초파리 활동 모니터를 이용한 장기 운동 모니터링을 통합한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 보완적 검사들은 운동 출력, 동기, 의사 구조, 행동 변동성 등 행동의 여러 차원을 신경 및 대사 상태의 기능적 판독으로 포착합니다. 이 파이프라인은 확장 가능하고 재현 가능하며 약리학적, 유전적, 환경적 조작에 적응할 수 있어, 초파리에서 스트레스, 대사, 신경퇴행 관련 행동 표현형을 탐지하는 데 다목적 틀을 제공합니다.

서론

이동, 의사결정, 탐색 활동 변화와 같은 행동 변화는 신경 및 생리적 상태를 나타내는 유기체 수준 지표로 널리 사용됩니다. 분류군 전반에 걸쳐 신경 기능 장애는 종종 움직임 구조 변화, 탐색적 동기 감소, 감각 유도 의사결정 행동 저하, 행동 예측 가능성 변화로 나타납니다. 이러한 유기체 수준의 출력은 신경, 대사, 생리적 상태를 통합하기 때문에 질병 관련 표현형 탐지에 있어 확장 가능한 판독값을 제공합니다. 그러나 분자 유전학과 신경과학에서 Drosophila melanogaster 의 광범위한 사용에도 불구하고, 운동 수행, 의사 구조, 행동 변이성을 동시에 포착하는 표준화된 다중 모달 행동 프레임워크는 여전히 제한적입니다.

모델 유기체는 스트레스 관련 및 신경정신과 표현형의 기전을 연구하는 데 필수적인데, 인간에서는 통제된 실험적 조작이 종종 불가능하기 때문입니다. 스트레스 관련 행동 증후군은 곤충을 포함한 많은 분류군에서 발생하며, 세로토닌과 도파민과 같은 보존된 신경조절 시스템과 대사 신호 전달 경로를 관여합니다. 따라서 초파리는 짧은 세대 시간, 유전적 접근성, 질병 관련 경로의 보존 덕분에 분자 기능 장애를 유기체 수준의 행동 결과와 연결하는 강력한 시스템으로 부상했다 ^1,2.

동시에, 초파리의 많은 행동 검사는 일반적으로 단독으로 적용되어 일반적인 질병 영향, 운동 장애, 동기 변화, 의사결정적 행동 변화 등을 구분하기 어렵습니다. 더불어, 평균 행동 지표만으로는 생물학적으로 의미 있는 표현형을 가릴 수 있는데, 신경조절 및 발달 교란이 평균 행동 출력보다는 행동 변이성을 변화시키는 경우가 많기 때문입니다. 따라서 강력한 유기체 수준의 표현형 시그니처를 생성하기 위해서는 운동, 탐색, 감각, 의사결정 분석을 결합한 다중 양식 행동 접근법이^{필요합니다.}

여기서는 강제 수영 노출 ^4,5, Y 미로 회전 행동 및 손주도 ^6,7,8,9, FlyVac 시스템^10,11을 이용한 광주성 및 활동 평가, 개방 필드 탐사¹², 그리고 초파리 활동 모니터 ^5,13을 이용한 장기 운동 모니터링을 통합한 다중 모드 행동 파이프라인을 제시합니다(그림 1). 이 틀 내의 각 분석은 스트레스 관련 표현형과 관련된 독특한 행동 차원을 포착합니다. 강제 수영 테스트는 수동적 대처 행동을 측정하는데, 이는 일찍 움직이지 않는 전환이 탈출 반응을 지속하려는 동기 감소를 반영하는 경우입니다. 오픈 필드 및 DAM 분석은 일반적인 운동 활동과 일주기 구조를 정량하여 운동 출력과 각성의 기초 측정값을 제공합니다. Y-미로 분석은 좌우 선택의 연속을 통해 의사결정 구조를 포착하여, 방향 편향(측면화)과 행동 변동성을 예측 가능성의 척도로 추정할 수 있게 합니다. 마지막으로, FlyVac 검사는 반복적인 광택 선택을 통해 감각 유도 의사결정과 접근-회피 행동을 평가합니다. 이 검사들은 활동, 동기, 의사결정 수준의 행동 변화를 구분하는 상호 보완적인 측정값을 제공합니다.

이 프로토콜은 운동 출력, 동기, 의사결정 구조, 행동 변동성의 상호 보완적 측면을 포착하여, D. melanogaster¹⁴에서 스트레스, 대사, 신경퇴행 관련 행동 표현형을 탐지할 수 있는 확장 가능한 틀을 제공합니다. 본 연구의 주요 목적은 스트레스로 인한 행동 변화의 여러 차원을 포착하기 위해 상보적 검사를 통합하는 다중 모달 행동 표현형 프레임워크를 확립하는 것입니다. 여기서 스트레스 패러다임은 프레임워크의 민감도와 적용 가능성을 보여주기 위한 표준화된 섭동으로 사용됩니다.

프로토콜

강제 수영 측정은 3R(대체, 환원, 정제) 원칙에 따라 수행되었습니다. 대체는 드 로소플라이 멜라노가스터 를 무척추동물 모델로 사용하여 윤리적 이유로 점점 제한되는 척추동물 강제 수영 패러다임을 피함으로써 이루어졌습니다. 이 검사의 고처리량 특성 덕분에 동물 사용을 최소화하면서 비교적 소규모 집단에서 강력한 행동 추론이 가능했습니다. 정교함은 수영 노출을 2분으로 제한하는 방식으로 해결되었으며, 이 기간은 피로나 익사를 방지하고 테스트 직후 정상적인 운동 행동을 완전히 회복할 수 있게 했습니다. 이러한 고려사항들은 측정이 의미 있는 행동 데이터를 제공하면서 잠재적 고통을 최소화하고 윤리적 수용성을 극대화하도록 보장합니다. 교육 환경에서도 마찬가지입니다.

1. 초파리 에서 침몰과 유사한 상태 유도 (진동 스트레스 프로토콜)

1. 경미한 CO₂ 마취 하에 폐화 후 24시간 이내에 수컷 D. melanogaster 를 채취하세요. 모든 세부 사항은 재료표에 명시되어 있습니다.
2. 플라이를 10마리씩 그룹으로 배치해 폴리프로필렌 또는 아크릴 바이알(길이 95mm× 내경 25mm)에 넣고 면마개로 밀봉합니다.
3. 파리를 진동 플랫폼을 이용해 기계적 진동(300Hz)에 노출시킵니다.
4. 표준 음식이 담긴 바이알에서 45분간 진동을 주고 15분간 회복하는 반복 사이클을 적용하세요.
5. 진동 주기를 하루 총 6시간씩 계속하세요.
6. 스트레스 프로토콜을 3일 연속으로 반복하세요.
7. 진동 노출 없이 동일한 하우징 조건에서 조종 플라이를 유지하세요.
   참고: 본 프로토콜에서는 생식 상태 및 호르몬 영향 등 성별 특이적 생리적·행동적 차이와 관련된 변이성을 줄이기 위해 수컷 파리만을 사용했습니다. 이 표준화는 통제된 환경에서 스트레스로 인한 행동 효과를 감지하는 데 도움을 줍니다. 하지만 이 프로토콜은 암컷 파리에 완전히 적용 가능하며, 성별 특이적 반응은 향후 연구의 중요한 영역입니다. 스트레스 관련 및 우울증 유사 표현형에 대한 민감도는 종별과 연령에 따라 다르며, 초 파리를 포함한 분류군에 따라 다르기 때문에, 이 틀을 다양한 인구통계학적 그룹으로 확장하면 추가적인 생물학적 통찰을 제공할 수 있습니다. 이 패러다임은 파리의 동기 부여와 활동 변화를 유발하는 기존 통제 불가능한 진동 스트레스 모델에서 적응한 것입니다.

2. 초파리 멜라노가스터에서의 강제 수영 검사

주의: 도데실 황산나트륨(SDS)은 자극물질입니다. SDS 용액을 준비하고 다룰 때는 적절한 개인 보호 장비(예: 장갑과 안구 보호구)를 착용하세요. 피부와 눈 맞춤을 피하세요. SDS 함유 폐기물은 기관 화학 안전 지침에 따라 처리해야 합니다.

1. 성충 파리는 폐화 후 24시간 이내에 채집하여 지속적인 빛과 통제된 환경 조건 아래 유지하세요.
2. 다중 웰 챔버 슬라이드를 준비하고 각 웰에 상온에서 0.08% SDS 용액 ~2mL를 채웁니다.
3. 녹음 직전에 각 우물에 플라이 한 개씩을 옮기세요. 마취는 필요 없습니다.
4. 2분간 오버헤드 카메라를 사용해 행동을 기록하여 첫 정지까지의 지연 시간을 측정하세요.
5. 첫 번째 움직임 정지까지의 지연 시간을 정량화하세요.
6. 기록 후 파리를 제거하여 흡수지에 올려 정상적인 이동 회복을 확인하세요.
   참고: 움직임 제한은 표면 위치를 유지하면서 적극적인 탈출 동작을 중단하는 상태를 의미합니다. 총 정지 기간과 정지 횟수 같은 추가 매개변수를 기록하기 위해서는 더 긴 기록 시간(예: 3분)이 필요합니다. 이 분석은 수동적 대처 행동을 반영합니다; 움직임 정지에 대한 잠복 감소는 탈출 반응을 유지하려는 동기 감소로 해석됩니다. 파리마다 움직임 없는 상태에 대한 지연 시간/완전한 움직임 정지 상태의 변동성. 이 분석은 일시적인 스트레스나 피로를 유발할 수 있습니다. 종방향 설계에 사용될 때는 다른 검사 전에 수행하고, 충분한 회수(예: ≥24시간)를 확보한 후 후속 시험을 진행하세요.

3. 초파리 활동 모니터(DAM)를 이용한 장기 운동 활동 모니터링

1. 초파리를 분류하기 위해 CO₂를 사용해 잠시 마취합니다(5초).
2. 개별 플라이를 음식과 면화가 들어있는 유리 DAM 튜브에 넣으세요¹⁷.
3. 초파리 활동 모니터 시스템에 튜브를 삽입하세요.
4. 통제된 온도와 빛과 어둠 조건 하에서 48시간 연속으로 운동 활동을 기록하세요.
5. 빔 브레이크 카운트를 획득 소프트웨어로 저장하세요.
6. 빈 활동 데이터를 정의된 시간 간격(예: 1–10분)으로 정리합니다.
7. 적응 후 죽거나 활동이 없는 파리는 제외하세요.
   참고: 48시간 동안 지속된 운동 모니터링만으로도 생체 활동 패턴을 포착하기에 충분합니다. DAM: 개인 간 총 거리, 속도, 경기 구조의 변동성.

4. 개방 운동 측정법

1. 잠시 동안(5초) CO₂로 초파리를 마취하세요.
2. 개별 플라이를 직사각형 25 x 75mm 아레나(각 아레나에 한 대)로 옮깁니다.
3. 플라이가 경기장 환경에 적응할 수 있도록 20분간 시간을 두고, 일정한 저강도 확산 백색광 아래에서 녹화하세요.
4. 자동 비디오 추적 시스템을 사용해 지속적인 조명 하에서 행동을 기록합니다.
5. 추적 소프트웨어를 사용해 경로를 분석하여 추출:
   총 이동 거리
   평균 운동 속도
   가속 및 회전 지표
   참고: 이 검사법은 스트레스 관련 행동 변화를 해석하는 기준선을 제공합니다. 적응 기간은 다루는 스트레스를 최소화하고 파리가 경기장에 익숙해져, 기록된 운동 활동이 기본 행동을 반영하도록 보장합니다. 지속적인 조명은 일주기 변동과 관련된 변동성을 줄이고 시험 간 일관된 행동 조건을 보장하기 위해 사용되었습니다. 궤적은 EthoVision XT(Noldus Information Technology)와 같은 자동 추적 소프트웨어나 Ctrax, idTracker, TrackMate(ImageJ/Fiji) 같은 오픈소스 대안을 통해 추출할 수 있으며, 가용성과 사용자 선호도에 따라 가능합니다. 개방형 분석 분석: 개인 간 총 거리, 속도, 그리고 경기 조직의 변동성. 질서 효과를 줄이기 위해 세션마다 적응과 조명 조건을 표준화하세요. 동일한 개체에 대해 여러 검사를 수행할 때는 경기장 노출 시간을 일정하게 유지하세요.

5. Y-미로 회전 행동 및 행동 변동성 분석

1. CO₂를 이용해 초파리를 잠시 마취(5초)하세요.
2. 개별 플라이를 Y-미로 챔버 ^8,9에 배치하세요. 미로는 레이저 조각기를 사용해 두께 1.6mm의 검은색 아크릴에 잘라냈습니다. 우리는 플라이를 95개의 개별 미로 배열에 배치했으며, 각 미로는 길이 12mm, 너비 3.3mm의 대칭적인 팔로 구성되어 있었습니다.
3. 파리가 20분 정도 자유롭게 탐색할 수 있도록 허용하세요.
4. 탐색적 이동(1시간) 중 왼쪽 또는 오른쪽으로 방향 전환 결정 기록하세요.
5. 개별 회전 편향을 우회전 비율로 계산하세요. 속도, 가속도, 움직임 없는 움직임, 시간 기반 활동 변동 등 관련 지표를 계산하세요^12,15.
6. 회전 편향의 절대 편차(MAD)를 이용해 파리 간 행동 변동성을 정량화합니다.
   참고: 이 검사는 전체 활동 수준과 무관하게 운동 손주와 행동 예측 가능성을 측정합니다. 선동 순서는 의사결정 구조를 포착합니다; 회전 편향은 측면화를 반영하며, 개인 간 변동성은 행동 예측 가능성을 반영합니다. 편향 = 플라이당 우회전 비율; 변동성 = 파리 간 편향의 분산(MADn). 반복 검사를 위해서는 개별 또는 코호트에 따라 분석 순서를 균형 맞추어 서열 효과를 조절하는 것을 고려하세요.

6. 광택 선택: 플라이백 장치 내 활동 모니터링

1. 개별 비행기를_CO2 마취 없이 FlyVac 챔버^{6, 11}로 적재합니다.
2. 시험을 시작하기 전에 적응(10분)을 허용하세요.
3. 각 파리에게 반복되는 이진 빛과 어둠 선택지를 제시하세요.
4. 자동 탐지를 사용하여 40개 시험의 선택지를 기록합니다.
5. 파리당 빛 선택 확률과 빛 선택 사이의 평균 시간을 활동 측정으로 계산합니다.
6. MAD를 사용하여 개인 간 행동 변동성을 정량화합니다.
   참고: FlyVac 시스템은 평균 의사결정 편향과 개인 간 변동성을 동시에 평가할 수 있게 합니다. 이 프로토콜에서 설명된 행동 분석은 모듈식이며, 실험 설계에 따라 다양한 순서로 수행할 수 있습니다. 그러나 잠재적 재현 효과를 최소화하기 위해 다른 검사 전에 강제 수영 검사를 수행하는 것이 권장됩니다. 질서 효과를 줄이기 위해 세션마다 적응과 조명 조건을 표준화하세요.

7. 데이터 분석

참고: 행동 분석은 별도의 언급이 없는 한 개별 파리를 추론 단위로 사용하여 수행되었습니다.

1. 강제 수영 테스트: 영상 녹화를 수동으로 분석하거나 행동 점수 소프트웨어를 사용하세요.
   참고: 움직임 없음은 파리가 떠 있는 동안 적극적인 탈출 동작이 없는 상태를 의미합니다. 각 파리마다 추출된 매개변수는 첫 번째 움직임 상실에 대한 잠시(latency)입니다. 행동 측정의 비정규 분포로 인해 그룹 비교는 비모수 통계 검정을 사용하여 수행되었습니다.
2. 장기 운동 활동(DAM): 초파리 활동 모니터가 기록한 빔 파괴 횟수 기록. 내보내고 10분 간격으로 버리세요.
   참고: 각 파리별로 총 활동 수와 일주기 활동 패턴이 계산되었습니다. 이 패턴들은 R, Python, 또는 Excel에서 계산할 수 있습니다—이용 가능한 언어 중 하나입니다. 사망률이나 기술적 인공물로 인한 비활동 파리는 분석 전에 제외되었습니다. 분석은 48시간 동안 진행되었습니다.
3. 오픈 필드 로코모터 분석: 자동 추적 소프트웨어를 사용해 비디오 추적 데이터를 처리합니다. 영상 파일을 EthoVision XT로 가져오세요. 조영 기반 임계값을 이용한 자동 검출을 이용해 추적을 수행합니다.
   참고: 궤적은 기본 필터링 알고리즘을 사용해 부드럽게 처리되었습니다. 비행 각 이동 운동 매개변수(거리, 속도, 가속도)는 CSV 파일로 내보내져 후속 분석을 수행했습니다. 비행 각 이동 경로 매개변수에는 총 이동 거리(mm), 가속도(mm/^{s 2})가 포함되었습니다. 요약 통계는 그룹 비교 전에 개인 수준에서 계산되었습니다. 이 검사 시간은 각 그룹별로 1시간이었습니다.
4. Y-미로 회전 행동: 기록된 궤적에서 회전 결정 데이터를 추출하여 좌우로 분류하고, 각 개인별로 좌우 이진 시퀀스로 내보냅니다.
   참고: 각 플라이에 대해 선회 편향은 기록된 모든 결정에서 우회전 비율로 계산되었습니다. 파리 간 행동 변동성은 회전 편향의 척도 중앙 절대 편차(MAD_n = 1.4826 × MAD)를 사용하여 정량화하였습니다. 이 검사 시간은 각 그룹별로 1시간이었습니다.
5. 플라이백 광학 선택: 이진 빛-어둠 선택지를 자동으로 기록합니다. 각 플라이에 대해 라이트 암이 선택된 시도 비율로 빛 선택 확률(LCP)을 계산합니다. 광택 편향을 이진 시험 결과의 평균으로 표현하라(밝은 색 = +1, 어두운 색 = −1).
   참고: 파리 간 변동성은 개별 광주성 지수의 MAD_n을 사용하여 정량화되었습니다.
6. 통계 분석: 10,000개의 라벨 무작위화를 사용한 순열 기반 검정을 사용하여 행동 측정 그룹의 차이를 평가합니다.
   참고: 변동성 비교를 위해 그룹 간 MAD_n 절대 차이에 대해 순열 검정을 수행하였습니다. 부트스트랩 재샘플링을 통해 MAD_n 추정치의 신뢰구간을 얻었습니다. 쌍 없는 쌍 t-검정을 사용하여 파리가 이동한 거리(mm)와 최대 가속도(mm/s²)를 비교했습니다. 데이터 시각화를 위해 바이올린 플롯(주로 밀도, 농도, 왜도) 표, 박스 플롯, 그리고 열형 차트가 사용되었습니다. 통계적 유의성은 α = 0.05로 평가되었습니다.

결과

진동 스트레스 프로토콜을 적용하면 D. melanogaster의 활동, 대처 행동, 의사결정을 포착하기 위해 설계된 여러 분석(그림 1)에서 측정 가능한 행동 변화가 발생했습니다.

우울증과 유사한 유도

반복적인 기계적 진동에 노출된 파리(그림 1A)는 스트레스가 없는 대조군에 비해 탐색 활동이 감소하고 행동 반응이 변화했습니다. 이러한 변화는 이후 행동 분석에서 안정적으로 나타났으며, 진동 패러다임이 지속성 우울과 유사한 상태를 효과적으로 유도했음을 시사합니다.

토론

본 프로토콜은 D. melanogaster에서 우울증과 유사한 행동 상태를 유도하고 정량화하는 다중 양식 접근법을 보여줍니다. 진동 기반 스트레스 패러다임과 보완적 행동 분석을 결합하여, 이 연구는 우울과 유사한 유도가 대처 행동, 운동 활동, 탐색 역학, 의사결정, 행동 변동성 등 여러 지표에서 감지될 수 있음을 보여준다^. 본 연구에서 사용된 스트레스 체계는 프로토콜의 주요 초점이 아니라 측정 가능한 행동 변화를 유도하고 다중 모달 프레임워크의 유용성을 입증하는 실용적인 도구로 작용합니다. 이 통합 프레임워크는 전통적인 활동 기반 측정과 행동 개별성 측정을 결합하는 가치를 강조합니다. 이 연구에서 얻은 강제 수영 테스트 결과는 이 검사법이 파리의 수동적 대처 행동 측정 지표로 검증된 이전 연구와 일치합니다. 이전 발견과 유사하게, 스트레스를 받은 파리는 움직임 제한이 증가하는 변화된 수영 행동을 보였으며, 이...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마취 장비: 예. 벤치탑 플로우버디, 완전 시스템 w/ 얼티밋 플라이패드	Genesis Scientific, El Cajon, CA, USA	59-122BCU
BioSan MSV-3500 멀티스피드 보텍스	Biosan SIA, Riga, Latvia	BS-010210-TAH	모든 플랫폼 포함
좁은 바이알용 면화 폐쇄물	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA	카탈로그 번호: 51-101
드로소필라 활동 모니터(DAM2)	TriKinetics Inc, Waltham, MA, USA	DAM2; RRID: 사용 불가능	32 튜브
드로소필라 멜라노가스터(오레곤-R-modENCODE)	드로소필라 멜라노가스터(오레곤-R-modENCODE)	BDSC:25211; RRID:BDSC_25211
GraphPad Prism	GraphPad Software, Boston, MA, USA;	카탈로그 이름: GraphPad Prism, RRID:SCR_002798	버전 11.0.1
로지텍 C920 HD 프로 웹캠, HD 1080p 렌즈 카탈로그 이름: HD 프로 웹캠 C920	Logitech Europe S.A., Lausanne, Switzerland	RRID: 사용 불가능	FST에 사용된 천장 녹화 카메라
좁은 플라이 바이알, 폴리프로필렌	Flystuff by Genesee Scientific, El Cajon, CA 92020 USA	카탈로그 번호: 32-120BF
Noldus EthoVision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands	RRID: SCR_000441	v. 15.0
나트륨 도데실 설페이트(SDS, ≥99%)	Merck KGaA (Sigma-Aldrich), Darmstadt, Germany	카탈로그 이름: 나트륨 도데실 설페이트(ACS 시약, ≥99% 순도); RRID: 사용 불가능
제이츠 스테미 508 스테레오 현미경	Carl Zeiss AG, Oberkochen, 바덴-뷔르템베르크, Germany	15634448