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방법 논문

사용된 인간 배아 배양지의 핵자기공명대사체분석: 방법론 검증 및 기술적 고려사항

98 조회수

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DOI:

10.3791/71285

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2026년 7월 31일

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1Department of Reproductive Medicine and Gynaecological Endocrinology, University Medical Centre Maribor, 2Faculty of Medicine, University of Ljubljana, 3National Institute of Chemistry, 4EN-FIST Centre of Excellence, 5Faculty of Chemistry and Chemical Technology, University of Ljubljana, 6Department of Reproductive Science, Manipal Academy of Higher Education

이 논문에서

요약

여기서는 핵자기공명(NMR) 분광법을 이용해 사용된 인간 배아 배양지를 수집, 준비 및 분석하는 프로토콜을 제시하여, 일상적인 임상 배양 조건에서 마이크로리터 크기의 샘플에서 저분자량 대사산물을 재현 가능하게 검출할 수 있게 합니다.

초록

사용된 인간 배아 배양 배지는 저분자량 대사산물을 포함하고 있어 착상 전 배아 생리학을 비침습적으로 확인할 수 있습니다. 그러나 핵자기공명(NMR) 기반 대사체 분석은 일상적인 배아 배양 조건이 마이크로리터 용량, 단백질 보충, 그리고 배경 신호를 생성하고 스펙트럼 품질을 저하시키는 파라핀 오일 오버레이를 포함하기 때문에 기술적으로 어렵습니다. 여기서는 오일 오염을 최소화하기 위해 통제된 방울 수집을 포함한 폐용 배아 배양 배지에 최적화된 NMR 대사체학 워크플로우, 마이크로리터 부피를 수용하면서 외부 기준점(TMSP)으로부터 시료를 화학적으로 분리하는 플루오린화 에틸렌프로필렌(FEP) 튜브 라이너, 그리고 고분자 배경 신호를 억제하는 Carr-Purcell-Meiboom-Gill 펄스 서열을 이용한 획득 방식을 제시합니다. 이 프로토콜은 개별 배양된 인간 배아에서 저분자량 대사산물의 일관된 검출과 정량을 가능하게 하며, 일상적인 실험실 조건에서 재현 가능한 분석을 지원합니다. 수많은 기술적 도전 과제로 인해, 이 방법은 연구나 임상 목적으로 사용하기 전에 반드시 검증되어야 합니다.

서론

시험관 착상 전 발달 동안 배아는 저분자량 대사산물을 지속적으로 섭취하고 주변 배지에 방출합니다. 따라서 사용한 배아 배양 배양지(SECM)의 구성은 배아의 대사 활동을 반영하며, 배아 생리학과 발달 능력에 대한 비침습적 기능적 판독을 제공합니다 1,2. 이 대사 발자국 분석은 기존 평가 방법을 보완하고 보조생식 기술에서 배아 선택 전략을 개선할 수 있습니다 3,4. 특히, 아미노산과 탄수화물 회전의 변화가 배아 발달 잠재력과 생존력과 연관되어 있습니다 5,6,7.

핵자기공명(NMR) 분광법은 사용한 배아 배양 배지 8,9,10을 포함한 다양한 생물학적 샘플의 비표적 대사물 프로파일링에 널리 사용됩니다. 그러나 이 샘플들의 분석은 여전히 분석적으로 어려운과제입니다. 일상적인 임상 실무에서는 배아가 생리학적 조건을 모방하도록 설계된 정의된 미세 환경에서 배양됩니다. 배양 배지는 삼투압을 안정화하고 독성 화합물을 결합하며 지질과 성장 인자를 운반하는 분자를 제공하여 삼투압을 안정시키고, 독성 화합물을 결합하며, 정상 발달을 지원하기 위해 단백질, 주로 알부민으로 보조됩니다. 증발을 방지하고 용질 농도를 일정하게 유지하기 위해 배양 방울에 멸균 파라핀 오일13을 덮습니다.

오버레이 오일과 단백질 성분에서 유래한 지질은 포도당, 피루빈산, 아미노산과 같은 저분자량 대사산물의 좁은 공명을 가리는 광범위한 배경 신호를 생성합니다. 더불어, 표준 5mm NMR 튜브에서 마이크로리터 샘플 부피를 분석하려면 RF 코일의 활성 부피에 도달하기 위해 상당한 희석이 필요합니다. 이 분석 물질 농도의 감소는 신호 대 잡음비(S/N)를 심각하게 감소시켜 저함량 대사산물을 가리고 재현 가능한 정량화를 방해합니다. 수많은 연구가 NMR 기반 대사체학을 사용한 인간 배아 배양 배지에 적용했으나, 표준화되고 재현 가능한 채집 및 준비 프로토콜의 부재로 인해 재현성과 연구 간 비교 가능성이 제한되었습니다 8,9,11.

여기서는 인간 배아 배양 배지 샘플링 및 분석과 관련된 기술적 도전을 극복하기 위해 설계된 NMR 기반 대사체 워크플로우(그림 1)를 제시합니다. 이 접근법은 오일 운반을 줄이기 위한 통제된 방울 수집, 희석 인공을 피하기 위해 플루오린화된 에틸렌프로필렌(FEP) 라이너를 이용한 마이크로리터 부피 획득, 그리고 Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG) 펄스 서열을 이용한 고분자 신호 감쇠를 결합한 것입니다.

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프로토콜

이 연구는 2023년 1월부터 4월까지 슬로베니아 마리보르 대학 의학센터 생식의학 및 부인내분비학과에서 수행되었습니다. NMR 분석은 슬로베니아 류블랴나에 위치한 국립화학연구소에서 수행되었습니다. 모든 참가자로부터 서면 동의를 받았습니다. 기관 윤리 위원회(번호: UKC-MB-KME-1/21)와 국가 의학 윤리 위원회(번호: 0120-37/2021/15) 모두로부터 승인을 받았습니다.

1. 연구 설계

참고: 이 연구는 NMR 기반 대사체학을 사용하여 인간 사용 배아 배양 배지를 분석하였습니다.

  1. 장기간 배아 배아 배양 후 세포질 내 정자 주입(ICSI) 후 샘플을 채취합니다. 사용되지 않은 인큐베이트 대조군 샘플을 같은 수의 채취합니다.

2. 샘플 채취

  1. 배아 배양 후 사용한 배아 배양 배지(SECM) 샘플을 채취하라( 그림 2에 나타난 것처럼).
  2. 배양액에서 배아를 제거한 후, 배양 배지 표면에서 과도한 오버레이 오일을 조심스럽게 흡인하여 배지를 방해하지 않습니다(그림 2, 1단계).
  3. 멸균 피펫을 사용해 원래 방울에서 약 35 μL의 배양지를 흡입하고, 잔류 표면 기름을 빨아들이지 않도록 약 5 μL만 남겨둡니다. 이 부피를 멸균 페트리 접시로 옮겨 새로운 방울을 만듭니다(그림 2, 2단계).
  4. 입체현미경으로 새로 형성된 방울을 육안으로 관찰하세요. 이 방울에서 약 30 μL를 조심스럽게 흡입하고, 오일 운반을 최소화하기 위해 약 5 μL를 남겨두세요. 이 부피를 두 번째 무균 위치로 옮겨 더 깨끗한 방울을 만듭니다(그림 2, 단계 3).
  5. 두 번째 방울을 확대하여 육안으로 살펴보세요. 기름방울이 가장 두드러지지 않는 지역을 식별하세요. 피펫 팁을 이 영역에 삽입하고 약 25 μL의 매질을 흡입하여 오일 운반을 최소화하기 위해 약 5 μL를 남겨둡니다(그림 2, 4단계).
  6. 즉시 수집된 25 μL을 멸균 RNase 없는 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 샘플을 분사할 때 튜브 내부 벽을 만지지 않도록 오염과 샘플 손실을 방지하세요. 즉시 모든 샘플을 액체 질소에 급동하여 -80 °C에서 NMR 분석할 때까지 보관합니다(그림 2, 단계 5).
  7. 동일한 배양 조건에서 동일한 배양 접시, 오버레이 오일, 배양 기간, 인큐베이터 환경, 취급 절차를 사용하여 동일한 배양 조건에서 준비, 배아 없이 배아 없이 배아 배양 및 처리한 매칭된 미배양 대조군 드롭을 수집하여 환경 변동성과 체계적 편향을 최소화합니다.
    참고: 순차적인 방울 전달과 육안 검사를 엄격히 준수하면 오일 오염이 크게 줄어듭니다. 이 단계에서 실험은 일시 중지되었다가 NMR 채취를 위한 추가 샘플 처리를 위해 재개될 수 있습니다.

3. NMR 분석을 위한 샘플 준비

  1. 샘플을 실온에서 ~10분 동안 해동하세요.
  2. NMR 혼합물 준비:
    1. 25 μL SECM을 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 옮깁니다. D₂O를 200 μL에 넣습니다. 10초간 소용돌이로 돌리고, 실온에서 1000 × g 에서 10초간 원심분리합니다.
  3. 로드 인서트: 혼합물 225 μL를 FEP 라이너에 옮깁니다.
  4. 외부 참조관을 준비하세요.
    1. 5mm NMR 튜브에 150 μL D₂O가 들어 있으며, 1 mM 3-(트리메틸실릴)프로피오닉-2,2,3,3-d4 산성 나트륨염(TMSP-d4)을 함유합니다.
  5. 샘플 조립: FEP 인서트를 NMR 튜브에 삽입하고 파라필름으로 밀봉합니다.

4. NMR 획득 및 스펙트럼 처리

  1. Bruker cpmgpr1d 펄스 시퀀스를 사용하여 64회 스캔과 함께 H-CPMG1회 획득; 65,536개의 데이터 포인트; 이완 지연: 8초; 스펙트럼 폭: 11.9 kHz; 에코 시간: 80 루프 × 400 μs (유효 T₂ 필터 32 ms); 총 획득 시간: ~15분.
    참고: 유효 CPMG T₂ 필터 지속 시간은 64 ms로, 단백질 함유 생물학적 샘플에 대한 확립된 대사체 프로토콜을 기반으로 선택되었으며, 이 값은 고분자 신호를 효율적으로 억제하면서 저분자량 대사물 공명을 보존합니다14.
  2. 스펙트럼 처리를 수행하세요:
    1. 푸리에 변환 스펙트럼을 얻으세요.
    2. 0.3Hz 지수 선로 확장을 적용하세요.
    3. 위상 및 기준선 보정을 수행하세요.
    4. 0 ppm의 TMSP-d4를 기준으로 스펙트럼을 참고하세요.
    5. 참조 화학적 신호는 0 ppm에서 외부 TMSP-d4 신호로 이동(δ)합니다.
      참고: FEP 라이너 내부의 샘플 혼합물(225 μL)과 외부 동축 갭에 있는 외부TMSP-d 4 기준 용액(150 μL)은 활성 NMR 코일 검출 창 내에서 서로 다른 물리적 기하학적 및 부피를 차지하기 때문에 절대 신호 강도는 1:1로 스케일링되지 않습니다. 외부 기준을 이용한 직접 절대 정량화는 시스템별 기하학적 보정 곡선이 필요합니다. 따라서 이 프로토콜의 엄격히 일정한 샘플 부피와 매우 재현 가능한 피펫 정밀도를 고려하여, 원시 버킷 적분을 직접 활용하여 샘플 간 상대적 대사 변동을 추적했으며, 외부 참조나 총 합 강도 정규화가 필요 없었습니다.
  3. 스펙트럼 비닝 수행:
    1. 비닝 전에 수분 공명 영역(예: 4.65–5.00 ppm)과 TMSP-d4 기준 영역(예: -0.05–+0.05 ppm)을 제외합니다.
    2. 스펙트럼을 가변 너비 버킷으로 나누어 피크가 분리되는 것을 피하세요.
    3. 외부 튜브 부피에 물리적으로 격리된 기준점이므로 외부 TMSP-d4 신호에 정규화하기보다는 원시 버킷 적분을 사용하여 통계 분석에 활용하세요. 이 방법은 인서트와 외부 튜브의 활성 부피 차이로 인한 정량화 오류를 피할 수 있습니다.
    4. 버킷 적분을 통계 분석을 위한 수치 데이터 행렬로 내보내세요.
      참고: 각 '버킷'(또는 빈)은 정의된 ppm 범위 내 모든 NMR 신호의 합산 적분을 나타냅니다. 이 적분들은 해당 범위에 존재하는 화학기의 상대적 농도를 반영하지만, 단일 버킷에는 여러 겹치는 대사산물의 신호가 담길 수도 있고, 특정 대사산물의 전체 신호의 일부만 포함될 수도 있습니다.

5. 통계 분석

  1. nmrglue15를 사용해 1개의H-CPMG 스펙트럼을 Python (v3.12)에 가져왔습니다.
  2. 물과 TMSP-d4 스펙트럼 영역을 제거하세요.
  3. 분석을 위해 버킷 적분을 내보내세요.
  4. SciPy (v1.14.1)를 이용한 통계 검정 수행:
    1. 샤피로-윌크 검정을 사용하여 각 스펙트럼 버킷의 정규성을 평가합니다.
    2. 정규 분포 데이터의 경우 일원 ANOVA 또는 비모수 데이터의 경우 Kruskal-Wallis를 적용하여 사용되지 않은 인큐베이트 대조군과 사용한 배지 간에 통계적으로 유의한 차이가 있는 버킷을 식별합니다.
    3. 유의미한 차이가 보이는 버킷의 경우, 1D 및 2D NMR 실험을 조합하여 구조 할당을 수행합니다: 1개의 H-13C HSQC, 1개의 H-13C HMBC, 1개의 H-1H COSY.
    4. 관찰된 2D 상관관계를 표준 데이터베이스(예: HMDB)와 비교하여 식별 버킷에 기여하는 대사산물의 정체성을 검증합니다.

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결과

사용한 배아 배양지의 비표적 NMR 대사체 프로파일링을 위한 분석 워크플로우는 그림 1에 요약되어 있습니다.

샘플링 중 오일 오염 제거
그림 2는 오버레이 오일 이리오버를 줄이기 위해 사용되는 순차적 방울 전달 절차를 보여줍니다. 신중한 피펫팅 없이 채취된 샘플은 스펙트럼의 지방산물 영역(δ 0.5–2.3 ppm)에 걸쳐 광범위한 탄화수소 공명을 보여 상당한 기준선 왜곡과 저분자량 대사물 신호를 가렸습니다(그림 3A, 녹색 추적). 반면, 최적화된 순차적 방울 전달 프로토콜을 사용한 샘플은 검출 가능한 파라핀 오일 오염이 거의 완전히 제거되어 기준선 안정성을 회복하고 관심 스펙트럼 영역 전역에서 잘 해명된 대사물 공명을 드러냈습니다(그림 3B...

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토론

본 연구에서는 비표적 NMR 대사체학을 사용하여 사용한 배아 배양 배지에서 저분자량 대사산물을 식별하고 정량하는 데 관련된 주요 분석 과제를 다루었습니다. 우리의 결과는 최적화된 워크플로우가 저분자량 대사산물의 신뢰성 있는 검출에 적합한 고품질의 정보가 풍부한 스펙트럼을 획득할 수 있음을 보여줍니다.

신중한 순차적 방울 전달은 석유 오염을 줄이는 데 필수적이었으며, 그렇지 않으면 광범위한 공명이 발생해 관심 있는 저분자량 대사물 신호를 가렸다. 최적화된 샘플링 절차 도입 전후로 획득한 스펙트럼 비교 결과, 검출 가능한 파라핀 오일 신호가 거의 완전히 제거되어 대사물 공명을 가리는 광범위한 탄화수소 배경을 효과적으로 제거했습니다. 주로 알부민 단백질에서 기래하는 고대분자 간섭은 신뢰할 수 있는 스펙트럼 해석을 더욱 제한했습니다. 문헌에서 검증된 유효 T₂ 필터 지속 시간 64ms를 사용하여 구현된 CPMG 펄스 시퀀스는 ...

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공개 사항

저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 슬로베니아 연구혁신청(ARIS) [프로젝트 번호 P3-0327]의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
5 mm FEP 튜브 라이너SP Wilmad-LabGlass4682701동축 NMR 내부 삽입물
5 mm NMR 튜브SP Wilmad-LabGlass535-PP-7-SB외부 튜브
6웰 배양 플레이트OosafeOOPW-SW02배아 배양 접시
극저온 액체 질소Messer제조업체에 문의샘플 급속 동결
중수산화물(D2O)EurisotopD214LNMR 용매
마이크로피펫(10–100 µL)Eppendorf4924000053조절 가능한 볼륨의 피펫
마이크로센트리퓨지 튜브, 1.5 mL, RNase 프리EppendorfN216966N샘플 수집 및 저장
미네랄 오일VitrolifeVTL-10029배양 액적 오버레이
NMR 분광계, 600 MHzBrukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html스펙트럼 획득
파스퇴르 피펫FalconFAL-357575액적 이동
단일 채널 기계식 피펫Sartorius728060샘플 처리
무균 피펫 팁Eppendorf22491148마이크로피펫과 호환
무균 필터 피펫 팁Sartorius790201F에어로졸 장벽
순차적 G-시리즈 배양 배지VitrolifeVTL-10143배아 배양 배지
TMSP-d4 (나트륨 3-트리메틸실릴프로피오네이트-d4)Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-48-1화학 시프트 참조
Safe-Lock 튜브Eppendorf0030121589저장 튜브

참고문헌

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