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방법 논문

공명 라만 분광법을 이용한 미토콘드리아 기능의 실시간 비침습적 평가

96 조회수

⸱

DOI:

10.3791/71290

⸱

2026년 8월 7일

 ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospital for Children, 3Pendar Technologies

이 논문에서

요약

우리는 공명 라만 분광법(RRS)을 이용한 비침습적이고 실시간 미토콘드리아 건강을 모니터링하는 방법을 제시합니다. 우리는 RRS를 사용해 미토콘드리아 산화환원 상태를 정량화하고, 미토콘드리아 건강을 측정하는 지표인 공명 라만 축소 미토콘드리아 비율(3RMR)을 개발했는데, 이는 전통적인 혈액-가스 분석제보다 산소 변화에 더 빠른 반응을 보입니다.

초록

미토콘드리아는 병인과 질병 진행의 중심이지만, 미토콘드리아 건강 역학에 대한 기전적 통찰은 여전히 비용이 많이 들고 접근하기 어렵습니다. 이 격차를 해소하기 위해 본 연구는 휴대용 시스템을 사용하여 미토콘드리아 기능을 평가하기 위해 공명 라만 분광법(RRS)을 사용하여, 쥐 간 내 미토콘드리아 사이토크롬 산화환원 상태를 실시간으로 비침습적이고 정량적으로 측정하는 휴대용 시스템을 사용합니다. 이 프로토콜에서는 설정, 데이터 수집, 데이터 처리 등 이 기술의 활용을 시연합니다. 이 연구는 RRS가 미토콘드리아 산화환원 상태의 실시간 변화, 그리고 확장해서 미토콘드리아 기능의 변화를 측정할 수 있음을 강조하는 개념 증명 실험을 제시합니다. 간단히 말해, RRS 장치는 레이저 펌프와 데이터 수집 컴퓨터에 연결되어 쥐 간에서 1cm 떨어진 곳에 놓였다.  획득 매개변수는 쥐 간 프로토콜에 따라 선택되었으며; 산화환원 상태는 산소 스트레스 테스트를 이용해 산소 및 허혈 상태에서 측정되었습니다. 미토콘드리아 산화환원 상태 변화는 산소 스트레스 검사 전반에 걸쳐 추적되었습니다.

서론

미토콘드리아는 세포 기능과 항상성에 중요한 역할을 합니다. 미토콘드리아는 세포 대사의 주요 동인으로, 산화적 인산화를 통해 ATP 생성을 조절합니다. 또한 세포 세포 세포의 운명을 조절하는 신호 소기관 역할도 하며, ROS 및 Ca+2 신호 전달1도 담당합니다. 따라서 미토콘드리아 기능 장애는 다양한 신경퇴행성, 근육 및 심혈관 질환을 유발할 수 있습니다 2,3. 미토콘드리아가 질병 진행에 중요한 역할을 함에도 불구하고, 미토콘드리아 기능 평가는 침습적이고 비용이 많이 들며 제한적일 수 있습니다.

산소 소비율, 산화적 인산화, 전자전달사슬(ETC) 내 다양한 복합체의 활성과 같은 미토콘드리아 기능의 주요 지표들은 호흡계를 통해 측정됩니다. ETC는 내부 미토콘드리아 막(IMM)에 내장된 네 개의 복합체(I–IV)로 구성되어 있습니다. 이 복합물들은 다른 보조효소의 도움으로 NADH와 FADH2와 같은 환원 기질에서 최종 전자 수용체인 O2로 전자를 전달하고,O2는 다시 물로 환원됩니다. 대부분의 현대 호흡 측정법, 예를 들어 해마 및 오로브로스 O2k 검사는 조직 처리가 필요하므로 중개 연구 적용이 제한됩니다 4,5. 미토콘드리아 막 전위(MMP) 측정은 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 또 다른 방법으로, JC-1과 같은 양이온 지친성 형광체와 현미경 영상을 활용하여 결합(건강한 미토콘드리아)과 비결합(손상된) 미토콘드리아가 서로 다른 파장으로 형광을 발합니다6. 하지만 이러한 분석법은 감도가 낮을 수있습니다. 염료 자체도 고농도에서 높은 세포독성을 가질 수있습니다. 5. 마지막으로, 호흡계 측정과 마찬가지로 이 기법도 조직 처리를 필요로 합니다. 최근에는 분광학 기반 기법이 미토콘드리아 건강을 평가하는 비침습적 방법으로 사용되고 있습니다. 예를 들어, 인 함유 대사산물의 농도를 측정하여 세포 대사를 평가하는 인자기공명 분광법(P-MRS)은 분화 과정을 겪는 인공 지방생성 조직을 특성화하는 데 사용되었습니다7. 하지만 이 기술에는 전문 장비와 훈련도 필요합니다.

우리 연구팀은 최근 공명 라만 분광법(RRS)을 이용해 장기 생존 지표로서 미토콘드리아 산화환원 상태를 실시간으로 비침습적이며 매우 특이적으로 측정하는 기법을 시연했습니다. RRS는 미토콘드리아 사이토크롬의 산화환원 상태를 정량하기 위해 광자의 비탄성 산란을 사용합니다. 미토콘드리아 사이토크롬, 헤모글로빈, 마이오글로빈과 같은 분자의 헴 모에에트 내 포르피린 고리는 441nm 파장 레이저로 여기될 때 산화 상태에 따라 특징적인 라만 스펙트럼을 생성합니다. RRS 시스템은 441 nm 파장을 사용하지만, 420 nm 및 405 nm 파장의 레이저도 사용할 수 있으며, 각각 서로 다른 사이토크롬 복합체를 우선적으로 증강합니다. 관심 있는 미확인 샘플에서 얻은 스펙트럼은 완전히 산화되거나 환원된 미토콘드리아의 사전 녹화된 라이브러리와 교차 참조하여, 환원 미토콘드리아와 전체 미토콘드리아의 비율 또는 현장 내 ETC 사이토크롬의 평균 산화환원 상태를 산출합니다. 이 비율은 공명 라만 축소 미토콘드리아 비율(3RMR)으로 정의됩니다.

3RMR에는 세 가지 뚜렷한 계산 유형이 있습니다: 미토콘드리아 3RMR(미토-3RMR), 복합체 III 3RMR(cIII-3RMR), 복합체 IV 3RMR(cIV-3RMR). 이 각 지수는 주어진 성분의 총 개수로의 비율을 계산합니다. 예를 들어, cIII의 3RMR은 조직 내 cIII 총 수와 환소된 cIII의 비율(cIII-R/(cIII-O+CIII-R)이다. 같은 패턴이 cIV에도 적용됩니다. 따라서 3RMR-cIII는 감소한 cIII와 총 cIII의 비율을, 3RMR-cIV는 감소한 cIV와 총 cIV의 비율을 의미합니다. 회귀분석을 통해 미토콘드리아 산화환원 상태(미토-3RMR)는 온전한 미토콘드리아의 스펙트럼 라이브러리를 이용해 계산되거나, 개별 복합 산화환원 상태(cIII-3RMR 및 cIV-3RMR)는 cIII 및 cIV 스펙트럼 라이브러리를 이용해 계산됩니다. 최근 논문(9 )은 미토-3RMR이 cIII 및 cIV 산화환원 상태(또는 cIII-3RMR과 cIV-3RMR)의 가중 평균을 대표한다는 것을 보여주었습니다. cI와 cII는 441 nm 파장을 통해 라만 활성화나 공명 증강이 아니라는 점을 유의해야 합니다. 따라서 미토-3RMR 계산 시 계산되지 않습니다.

이러한 3RMR 유형을 활용하여 3RMR의 최적 범위를 정의해 왔습니다. "건강한" 기관에서는 미토콘드리아가 온전하고 충분한 산소 공급을 제공합니다. 반면, 손상된 장기는 산소 전달이나 이용이 부족해 ETC 복합체에 전자가 축적될 수 있습니다. 전자 축적은 '환원 스트레스'를 일으켜 미토콘드리아를 산화 상태에서 환원 상태로 이동시키고 3RMR 값을 증가시킵니다. 설치류와 돼지 모델을 대상으로 심장과 간을 대상으로 한 여러 연구(8,9,10,11,12)는 3RMR의 최적 "건강" 범위인 10에서 30 사이를 밝히기 시작했습니다. 예를 들어, Perry 등은 포유류 심장에 저산소증을 노출시켰으며, 3RMR 30%가 저산소 조직을 감지하는 데 최적의 감도와 특이성 균형을 이루는 것으로 나타났습니다. 이 경향은 심장 조직11, 12, 간 이식10 연구에서도 더욱 확인되었습니다. 또한 Nyugen 등은 대사가 멈춘 조직에서 3RMR 값이 매우 낮은(산화된) 값으로 떨어지며, 3시간 동안 정상 관류 후 이식 불가능한 온허혈성 간에서 3RMR 수준(7.667 ±± 4.926)을 기록한 반면, 신선하고 이식 가능한 온방허혈 간에서는 3RMR 값이 10(~12–15)을 초과하는 반면9.

3RMR이 조직 생존력을 측정하는 이러한 시연을 넘어, RRS의 민감도, 특이성, 사용 편의성 덕분에 세포 대사와 미토콘드리아 기능에 영향을 미치는 다양한 연구에 매우 적합합니다. 이전 연구에서는 RRS가 시신경두13의 망막신경절 세포의 비수초 축삭의 대사 활성을 평가하여 쥐에서 황반변성 및 녹내장을 검출하는 데 활용되었습니다. 또한, 신생아 심장 선별검사에서 자주 놓치는 대동맥 경합(CoA) 모델에서 대동맥 경합(CoA)을 검출하는 데 사용되었습니다. 이 기술은 장기 이식 분야에서 장기 기능과 생존성을 이해하는 데 활용되었으며, 여기에는 체외 기계 관류에 따른 장기 생존 평가 연구(10,11), 정적 냉장 보관 후 재산소 공급 평가(14), 열허혈성 간의 재관류 손상 완화 연구(9)가 포함됩니다.

이 논문은 RRS를 미토콘드리아 건강 평가를 위한 실시간 민감한 도구로 확립하고자 합니다. 쥐 모델의 전체 간 샘플을 통해 다양한 수준의 허혈과 산소 재관류를 통해 미토콘드리아 반응을 평가하였습니다. 이 산소 스트레스 검사에서는 신선한 간에 초기 관류 흐름 5분, 허혈 5분, 재관류 5분을 받습니다. 스트레스 시험 전반에 걸쳐 3RMR과 젖산, K+, 산소 분압(pO2) 측정이 이루어졌습니다. 3RMR은 전통적인 혈액 가스 분석제에 비해 산소 변화에 더 빠른 반응을 보였습니다. 이러한 실험에서 RRS의 사용은 단순히 기전적 연구뿐만 아니라 진단 방법이자 치료적 시험대로도 강조됩니다. 따라서 이 공유 프로토콜은 미토콘드리아 연구를 하는 다양한 연구자들에게 유용할 수 있습니다. 전반적으로 RRS는 비침습적이고 실시간으로 매우 특이적인 특성 덕분에 세포 대사에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.

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프로토콜

실험에 참여하는 모든 동물은 미국 매사추세츠 종합병원(보스턴, MA)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. RRS 설정 및 활용

  1. 장치 설명:
    참고: 휴대용 RRS 시스템(Pendar Technologies; 연구용으로만 제공됨)은 441nm 레이저를 사용하는데, 이는 이 파장의 미토콘드리아 사이토크롬의 라만 스펙트럼을 공명 증강하기 때문입니다. 레이저는 4 mW에서 8 mW 사이로 작동합니다.
    1. 레이저 여기 소스를 광섬유 케이블을 통해 맞춤 제작된 프로브에 연결합니다. 프로브는 조직에 직경 2mm 레이저 스팟을 비추고, 방출된 스펙트럼을 수집합니다. 스펙트럼은 밴드패스 필터를 통과한 후 전하 결합 소자(CCD) 배열에 의해 수집됩니다. 스펙트럼은 180초 동안 매초 수집되어 평균화되어 분석용 원시 노이즈 스펙트럼을 만듭니다.
    2. 소프트웨어는 회귀분석을 통해 얻은 스펙트럼을 사전 측정된 스펙트럼 라이브러리와 비교합니다.
  2. 사전 녹음 라이브러리 절차
    참고: 본 논문에서 제시된 실험을 위해 미토콘드리아, 복합체 III 및 복합체 IV의 환원 및 산화 형태, 헤모글로빈, 마이오글로빈 라이브러리를 생성하고 활용하였습니다. 모든 라이브러리의 RRS 신호는 실온(21°C)에서 블랙박스에 담겨 촬영되었습니다. 이 라이브러리 파일들은 분석 소프트웨어와 별도로 제공됩니다. 그러나 관심 조직과 다른 라만 활성 분자의 존재에 따라, 다음 프로토콜을 적절히 변형하여 다른 라이브러리도 만들 수 있습니다. 헤모글로빈, 마이오글로빈, 산화/환원 III/IV 복합체 라이브러리의 원시 RRS 스펙트럼이 제공됩니다. 보조 그림 1.
    1. 헤모글로빈 라이브러리 (보조 그림 1C):
      1. 동물의 출혈을 통해 신선한 설치류 혈액을 채취하세요. 채취된 혈액을 100% 산소로 산소 공급하거나, 100% 질소를 사용해 탈산소화한 유리 쿠벳에 디티오네이트를 첨가합니다.
      2. 유리 쿠벳 벽을 통해 각 상태의 RRS를 10분간 측정하고, RRS 프로브는 유리 큐벳에서 9mm 떨어진 곳에 위치시킵니다.
      3. 1356 cm-1 의 스펙트럼 피크를 사용해 탈산소 상태를 확인하고, 1376 cm-1 의 피크를 사용해 산소 상태를 확인한다.
    2. 환원/산화된 미토콘드리아 라이브러리 (그림 1)
      1. 유리 큐벳에서 균질화 및 정제된 설치류 심장에서 미토콘드리아를 분리합니다. 라만 프로브를 유리 큐벳에서 9mm 떨어진 곳에 놓고 유리벽을 통해 이 미토콘드리아의 스펙트럼을 측정합니다.
      2. 미토콘드리아에 100% 산소 흐름을 제공함으로써 완전히 산화된 상태를 만듭니다. 1357 cm-1에서 환원된 RR 피크가 없을 때 산화 상태를 검증합니다.
      3. 미토콘드리아를 100% 질소에 노출시키고 소량의 황화수소를 포함해 완전히 환원된 조건을 만듭니다. 1371 cm-1에서 산화된 RR 마커 피크가 없을 때 조건 감소를 검증합니다.
    3. 산화/환원 복합체 III/IV (보충 그림 1A, B):
      1. 다른곳에서 설명된 3, IV 복합체 9, 15, 16, 17을 분리합니다. 간단히 말해, 분리된 미토콘드리아 샘플(시토크롬 a 200나몰에 해당)을 출발물질로 사용하세요.
      2. 미토콘드리아를 10 nmol 사이토크롬 A/mL로 희석하여 얼음 냉각 완충 C(50 mM Tris, 1 mM MgSO4, pH 8.45)에 넣습니다. 그 후 얼음 위에서 부드럽게 섞은 상태에서 10% w/v n-β-D-도데실-말토사이드(DM)를 한 방울씩 최종 농도가 1%로 만듭니다.
      3. 추출물을 40,000 g × 4°C에서 40분간 원심분리합니다. 상청액을 2.5cm × 20cm 유리 컬럼에 적용하는데, 이 컬럼에는 교환 레진이 5개의 버퍼 C(0.02% w/v DM 함유)로 평형을 맞춘 상태입니다.
      4. 버퍼 C 2개 컬럼으로 세척한 후, 같은 버퍼에 선형 0–400 mM NaCl 구배를 적용하여 미토콘드리아 복합체를 용출하고, 4 mL 분획으로 용출물을 수집합니다.
      5. 복합체 IV를 포함하는 녹색 분획은 구배 중간(~180 mL NaCl) 근처에서 용출되었고, 그 전에 복합체 III를 포함하는 붉은 분획이 나타났습니다. 각 복합체를 포함한 모은 분획을 20–30 nmole 사이토크롬 a/mL로 농축합니다.
      6. 개별 복합체가 분리되면 산화 및 환원 조건에 노출시키세요. Tris 완충액 내 복합체 III 11 mM 샘플을 2 mL의 아스코르베이트(1 M)로 환원하여 사이토크롬 c1을, 2 mL의 HS(황산수소)를 사용하여 사이토크롬 bL과 bH를 완전히 환원합니다.
      7. Tris 버퍼 내 18.67 mM 복합체 IV 샘플을 여러 단계로 환원하는데, 복합체 IV는 다단계 촉매 산화 과정을 거치기 때문입니다. 복합체 IV를 완전히 줄이기 위해서는 H2O2 2 2(10 mM) 2mL를 추가하고, 이어서 HS 2mL를 추가합니다.
      8. 각 추가 후 라이브러리 스펙트럼을 수집하여 사이클의 각 단계를 포착하세요. 최종 기준 라이브러리에 완전히 산화되고 환원된 스펙트럼을 추가하여 복합체 IV의 정상 상태를 나타냅니다.
      9. 모든 샘플을 1mL 유리 바이알에 담아 프로브 렌즈에서 9mm 떨어진 고정 위치에 보관한 뒤, 빛 오염을 방지하기 위해 블랙박스에 넣으세요. 각 복합체와 산화 상태별로 600초 동안 RRS 스펙트럼을 수집합니다.
      10. 앞서 설명한 분리된 cIII 및 cIV의 순도를 검증하고, 최근 논문9에서 설명된 전체 미토콘드리아 스펙트럼을 설명하는 데 있어 분리된 cIII 및 cIV 스펙트럼 라이브러리의 적절성을 검증합니다.
    4. 마이오글로빈 라이브러리 (보충 그림 1D):
      1. 유사한 산소와 질소(용해된 디티오나이트 포함) 흐름을 사용하여 심근 마이오글로빈 추출물의 옥시미오글로빈 포화도를 0%에서 100% 사이로 조절합니다. 1355 cm-1 과 1376 cm-1의 마커 피크를 통해 라만 스펙트럼을 검증하세요.

참고: 위에서 설명한 대부분의 스펙트럼 성분, 예를 들어 헤모글로빈이나 산화/환원 미토콘드리아는 헤메를 포함하는 분자이며 동일한 파장에 의해 여기됩니다. 이 RRS 시스템은 각 분자의 고유한 스펙트럼 신호를 기반으로 회귀 라이브러리를 생성하여 신호 중복을 방지합니다. 얻어진 산란 스펙트럼은 선택된 라이브러리에 대해 회귀 알고리즘을 거칩니다. 회귀 알고리즘은 각 라이브러리 스펙트럼에 대해 기록된 스펙트럼에서의 상대적 기여도, 즉 조직 내 상대적 농도에 대한 최적 적합 추정치를 제공하는 인자를 산출합니다. 알고리즘은 다양한 파수 범위에 걸쳐 최적의 적합도를 사용하기 때문에, 다양한 라이브러리 구성 요소의 스펙트럼 피크의 위치나 강도의 미세한 차이만으로도 회귀분석에서 밀접한 관련이 있는 크로모포어를 식별할 수 있습니다. 회귀 알고리즘과 스펙트럼 라이브러리를 통해 RRS 시스템은 전체 산란 신호를 고유한 스펙트럼 피크에 따라 다양한 성분으로 분해하여 헤메 함유 분자와의 신호 중복을 방지할 수 있습니다. 헤모글로빈과 미토콘드리아 간의 관계를 보여주기 위해 보충 그림 2가 포함되어 있는데, 이 그림 2는 간 관류에서 측정된 신호, 최적의 적합선, 개별 스펙트럼 피크 차이로 인한 설명되지 않은 잔여 스펙트럼의 이미지를 제공합니다. 패널 A에서는 환원 및 산화된 헤모글로빈과 환원 및 산화된 미토콘드리아 회귀 라이브러리를 선정하였습니다. 라이브러리와 회귀분석을 통해 선별된 최적 적합 선은 측정된 신호와 깔끔하게 겹치며, 설명되지 않은 잔여물도 거의 없습니다. 패널 B에서는 산화되고 환원된 미토콘드리아 라이브러리만 선택됩니다. 설명되지 않은 잔류 구조가 크기 때문에, 미토콘드리아 스펙트럼 피크는 회귀분석에 포함되지 않은 헤모글로빈에서 몇 파수 이동됩니다. 더욱이, Nguyen 등9의 보충 도표에서 저자들은 미토콘드리아와 개별 복합체(cIII 및 cIV) 간의 관계, 그리고 개별 복합체16 간의 관계를 설명하는데, 복합체 III는 더 날카롭고 낮은 주파수 피크를 보이는 반면, 복합체 IV는 더 넓고 위로 이동된 띠를 보인다. 더 나아가, 저자들은 환원된 Complex III와 Complex IV 라이브러리가 환원 전체 미토콘드리아의 측정된 스펙트럼을 완전히 설명하여 설명되지 않은 잔여가 최소화된다는 것을 보여준다.

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그림 1: 완전히 산화되고 환원된 미토콘드리아의 스펙트럼 라이브러리. RRS 라이브러리 스펙트럼은 분리된 미토콘드리아에 (A) 100% 산소 또는 100% 질소(B)를 제공하여 각각 산화 및 환원 상태에 도달한 후 얻어졌습니다. 이러한 상태는 RR (C) 산소화 및 감소(D) 마커 피크의 존재로 확인되었습니다. 이 피크들의 이동은 산소가 존재할 때 분자 진동 모드의 변화에 해당합니다. 각 피크의 세기는 1 임의 강도 단위(AU)로 정규화되며, 이 441 nm 여기 파장을 사용하면 환원 상태의 증강이 더 커집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

2. RRS를 이용한 데이터 수집

  1. 장치 설정:
    1. 분광기 유닛(컴팩트 박스 안에 보관됨)을 직류(DC) 전원 공급 장치와 공급 케이블을 통해 전원 어댑터에 연결합니다. 분광기 유닛은 정렬 홈이 있는 둥근 플러그 하나로 구성되어 있습니다.
    2. 원형 플러그의 홈을 전원 어댑터에 연결하는 케이블의 홈과 맞춰 보세요. 포트 연결 전에 청소할 필요는 없습니다(그림 2).
    3. 분석을 수행하는 컴퓨터를 분광기와 전원 공급 장치를 연결하는 동일한 전원 어댑터에 케이블로 연결하세요.
    4. 레이저 프로브를 프로브 홀더에 넣으세요. 실험 시작 시 이 프로브의 위치를 조정하세요.
    5. 분광기 제어 소프트웨어(셀룰러 에너지 소프트웨어)를 열어라.
  2. 소프트웨어 설정:
    참고: 시스템에 따라 다양한 유형의 조직에 대한 설정 파일 및 회귀 라이브러리가 제공됩니다. 이 파일에는 RRS 시스템이 회귀분석에 포함해야 할 라이브러리, 회귀 창에 포함된 스펙트럼 수, 레이저 파워와 같은 기타 매개변수에 관한 정보가 포함되어 있습니다. 기본 설정은 변경할 수 있고, 새로운 설정 파일을 저장해 향후 실험에서 사용할 수 있습니다. 아래에 설명된 소프트웨어의 스크린샷은 보충 그림 3에 제시되어 있습니다.
    1. 분광기 제어 소프트웨어를 열면 3RMR, 산소포화도(StO2), 마이오글로빈 포화도의 비율을 나타내는 그래프가 나타납니다. 이 화면에서 이 지표들이 선택될 경우, 측정 과정 내내 실시간으로 표시됩니다. 페이지 왼쪽 하단의 설정 탭을 클릭하세요.
    2. 정보 탭에서 세션 이름 아래에 세션 정보를 입력하고, 필요한 세부 사항은 세션 설명 탭에 입력하세요.
    3. 데이터 수집 방식은 두 가지가 있습니다. 스 팟 체크 모드를 사용해 지정된 품질 지표(예: 목표 시그마 또는 회귀 창/스펙트럼 개수)를 충족할 때까지 스펙트럼을 축적한 후 기록을 중단합니다. Continuous Mode 를 사용해 스펙트럼을 기록하고 스톱 버튼을 누르세요. 두 모드 모두에서 3RMR 결과와 개별 스펙트럼 등 모든 데이터가 자동으로 저장됩니다. 이 실험은 연속 모드를 사용합니다.
    4. 모든 세션 정보를 입력한 후에는 시스템 탭을 클릭하세요.
    5. 설정 파일에서 프로젝트에 맞는 프로토콜을 선택하세요(무세포 쥐 간 관류의 경우 쥐 간 무세포 프로토콜을 선택). 이 기능은 자동으로 측정 유형, 평균 측정 길이(회귀 창), 그리고 목표 시그마를 조정합니다.
      1. 새 설정 파일을 만들려면 위에 나열된 컴포넌트 중 하나를 조정한 후 저장 버튼을 클릭하세요. 이렇게 하면 이 매개변수들을 별도의 설정 파일로 저장해 시스템에 가져올 수 있습니다.
      2. 새 설정 파일을 가져오려면 Default(Mod) 옆의 드롭다운 메뉴를 클릭한 후 Import New Settings File을 선택하세요. 새 설정 파일을 클릭하면 가져올 수 있습니다.
    6. 회귀 라이브러리 항목에서 데이터 수집 및 분석에 사용할 라이브러리 조합을 선택하고 확인하세요. 환원 및 산화된 미토콘드리아 라이브러리(미토 단독)가 이 실험에 선택되었습니다. 다른 사용자는 고급 라이브러리에 포함된 헤모글로빈, 마이오글로빈 또는 기타 복합체를 포함하는 라이브러리를 선택할 수도 있습니다.
    7. 선호하는 윈도우 폭 모드를 선택하고 확인하세요.
      1. 적응형 폭 모드: 적응형 폭 모드를 사용하여 최대 시그마 목표에 도달할 때까지 개별 스펙트럼을 평균화된 스펙트럼에 추가합니다. 시그마 목표에 도달하지 못하면, 설정된 회귀 창의 상한선(즉, 기록하라고 지시받은 최대 스펙트럼 수)에 도달하면 기록이 중단됩니다. 최소 시그마 목표에 도달한 후 측정 결과가 화면에 표시됩니다.
      2. 고정 폭 모드: 고정 폭 모드를 사용하여 목표 스펙트럼 수가 포함될 때까지 개별 스펙트럼을 평균화된 스펙트럼에 추가합니다(평균 길이 아래에 설정).
    8. 시스템 설정이 완료되면 플롯 탭을 클릭하세요.
    9. 메인 시리즈 항목에서 측정 시 화면에 표시할 부품을 선택하세요.
    10. 선택된 모든 측정 성분이 관심 있는 프로토콜에 부합하는지 확인하세요.
  3. 데이터 수집:
    참고: 라만 측정은 어두운 공간에서 이루어져야 합니다. 데이터 수집을 시작하기 전에 작업 공간이 가능한 한 빛으로부터 차단되도록 하세요. 방이 완전히 빛을 차단할 수 없을 경우, RRS 시스템은 중앙에 직사각형 개구부가 있는 검은색 커버를 제공합니다(다음 사진에 표시됨) 그림 2) 이 구멍을 통해 레이저 프로브를 장착할 수 있습니다. 상자는 RRS 측정이 이루어지는 샘플이나 장기 부위를 덮을 수 있습니다. RRS 레이저 작업 시 직접 또는 장시간 눈 노출을 피하세요. 레이저를 눈이나 반사면에 직접 비추지 마세요. 레이저는 관심 있는 조직에 직접 위치했을 때만 작동하세요. RRS 레이저는 4 mW에서 사용할 때 클래스 3R 레이저이고, 10 mW에서 사용할 때는 클래스 3B 레이저입니다. 레이저는 조직 접촉에 안전합니다.
    1. 적절한, 미리 저장된 설정, 녹화 매개변수, 라이브러리 파일을 선택하세요.
    2. 레이저 프로브를 관심 있는 조직/장기 바로 위에 놓으세요. 프로브를 가능한 한 수직으로 조직에서 1cm 떨어진 곳에 위치시키세요. 자를 사용해 장기 표면에서 1cm 정도 정확히 측정하세요. 신호가 명확하지 않으면 프로브를 1cm 이내로 조정하세요. 하지만 프로브가 조직에 닿지 않도록 주의하세요.
      참고: 프로브는 손에 들 수도 있지만, 조절이 가능하고 안정적으로 유지되는 프로브 홀더/스탠드를 사용하는 것이 권장됩니다. 프로브를 가능한 한 수직으로 조직에서 1cm 떨어진 곳에 위치시키세요. 자를 사용해 오르간 표면에서 1cm 정도 정확히 측정할 수 있었습니다. 신호가 명확하지 않을 경우 프로브를 1cm 이내로 더 가깝게 위치시킬 수 있습니다. 하지만 프로브는 절대 조직에 닿아서는 안 됩니다.
    3. 레이저 스팟이 문맥 가까이, 왼쪽 측엽에 있는지 확인하세요.
    4. 선택된 모든 라이브러리, 회귀 설정, 타겟 시그마, 회귀 창, 획득 모드가 올바르고 원하는 대로 있는지 확인하세요.
      1. 방을 최대한 어둡게 하세요. 프로브에 창문에 오염, 특히 혈액이 묻어 있지 않은지 확인하세요. 오염 시 보풀 없는 비연마성 물티슈에 70% 이소프로필 알코올을 사용해 Quartz 창문을 청소한 후, 건조 티슈로 철저히 건조한 후 작업을 진행하세요.
      2. 오염이 심한 경우, 위에서 설명한 대로 프로브를 최대한 깨끗이 닦아야 합니다. 그 다음, 검은 테이프로 감싼 어두운 케이스에 레이저를 넣고 Take Dark 버튼을 눌러 기기를 보정하세요. 보정은 약 5분에서 10분 정도 소요됩니다. 오염 여부와 상관없이 한 달에 한 번 기기를 보정하면 자동으로 알림 메시지를 보냅니다.
        참고: 각 품질 관리 지표에 대한 설명, 이러한 QC 지표의 예시, 그리고 최적 및 비최적 기록에서 얻은 원시 스펙트럼 신호(보충 파일 1, 그림 3, 보충 그림 3)에 대한 설명입니다. 이 품질 관리 기준은 쥐 모델에서 온 간에 최적화되었습니다. 다른 장기/동물 모델을 사용하는 새로 개발된 프로토콜은 이 지표들을 적절히 다듬고 조정해야 합니다.
    5. 메인 페이지에서 시작 버튼을 클릭하여 데이터 수집을 시작하세요. 선택한 설정에 따라 소프트웨어는 목표 오차 값(시그마) 또는 180초에 도달할 때까지 녹화를 진행합니다. 데이터 수집이 완료되었습니다.
      1. 이 그래프와 값에서 RRS 신호의 품질을 추론하여 프로브 위치나 측정 조건을 조정할 수 있습니다(그림 3). 만약 얻어진 RRS 신호가 이러한 품질 관리 기준을 충족하지 못하면, 프로브를 가능한 한 수직으로 조정하고 표면에서 프로브 창문까지 약 9mm 거리로 조정하세요.
    6. 데이터 수집/실험 프로토콜이 완료되면 간과 조직 전체를 생물학적 위험 보관함에 버리세요. 장기나 조직과 접촉한 모든 시스템이나 표면은 70% 에탄올로 청소하세요.
      1. 관류 시스템을 사용할 경우, DI수를 효소 세정제(7.8mL를 1L 탈이온수에 희석한 상태)를 섞은 후 깨끗한 DI수를 사용하세요.
        참고: 각 녹화는 새로운 세션 파일 아래에 별도의 분석 파일로 저장됩니다. 3RMR과 미토콘드리아 신호 세기(r3RMR) 결과는 메인 창에 표시되어 있습니다. 원시 스펙트럼도 표시할 수 있습니다. 잔류 신호 세기와 총 신호 세기와 같은 다른 품질 검사 지표는 스펙트럼 탭 아래에 표시됩니다.
  4. 데이터 분석:
    1. 데이터 수집이 완료되면 화면 하단의 리뷰 폴더를 클릭하여 실험 파일을 열고 결과를 확인하세요.
    2. 또는 결과를 담은 텍스트 파일을 열어보세요. 관심 있는 세션 파일을 선택하세요. 모든 측정값이 포함된 분석 파일이 열립니다. 각 매개변수와 그 시그마 값은 별도의 열을 가집니다. 예를 들어, 매초 얻는 3RMR 값은 "3RMR" 열에, 그 시그마 값은 "sigma_3RMR" 항목에 표시됩니다.
    3. 각 열의 마지막 행에는 해당 세션 파일의 각 매개변수에 대한 최종 값이 포함됩니다. 이 값을 사용해 플롯을 작성하세요.
    4. 각 세션 파일/녹화마다 반복 단계를 반복하세요. 플롯은 원하는 값을 얻었습니다.

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그림 2: RRS 장치 설정. RRS 시스템 구성의 회로도입니다. 프로브는 광섬유 케이블을 통해 레이저 여기원과 분광기가 포함된 RRS 시스템에 연결됩니다. 이 구성은 분광기 제어 앱이 있는 노트북에 연결되어 데이터 수집 및 분석이 가능합니다. 컴퓨터와 분광기 모두 전원 콘센트에 연결되어 있습니다. RRS 측정은 어두운 환경에서 측정해야 합니다. 방이 완전히 빛을 차단할 수 없을 경우, RRS 시스템은 중앙에 직사각형 개구부가 있는 검은색 덮개를 갖추고 있어 레이저 프로브를 설치할 수 있습니다. 상자는 RRS 측정이 이루어지는 장기 샘플/부위를 덮고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 3: 최적 품질 및 최적 품질 추적의 예시 추적 및 품질 관리 지표. 잔류 신호(잡음)는 주황색 괄호로, 미토콘드리아 신호는 초록색 괄호로 표시됩니다. (A) 최적이 아닌 라만 신호에서 나온 트레이스 예시. 잔류 신호가 너무 커서 미토콘드리아 신호와 구분되지 않습니다. 스펙트럼 피크는 측정된 신호 전체에서 구별할 수 없습니다. (B) 최적 라만 신호에서의 트레이스 예시. 미토콘드리아 신호는 잔류 신호와 눈에 띄게 크고 구별됩니다. 측정값에서 스펙트럼 피크를 구분할 수 있습니다. (C) 각 신호로부터 얻은 QC 지표. 전반적으로, 최적이 아닌 판독값에서 얻어진 전체 신호는 최적 값보다 적습니다. 최적 기록에서는 비최적화 기록보다 더 많은 미토콘드리아 신호가 측정되며, 미토콘드리아 신호는 전체 신호의 17%와 14%를 차지합니다. 신호는 최적 오차가 4.3%로 측정되었으며, 이는 최적 이하 기준의 오차가 18.5%와 대조적이다. 마찬가지로, 설명되지 않은 잔류 신호는 비최적 기록에서 전체 신호의 11%를 차지하는 반면, 최적 기록에서는 3.6%를 차지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

3. RRS를 이용한 미토콘드리아 건강 평가

참고: 공명 라만 분광법(RRS) 기술을 사용하여 이식 장기의 생존 가능성을 나타내는 미토콘드리아 생존 지표(3RMR)를 개발했습니다. 본 연구는 산소 공급, 그리고 확장해서 세포 호흡의 변화가 락테이트와 K+ 같은 전통적인 손상 바이오마커와 비교해 3RMR 추세에 어떻게 반영되는지 보여주는 것을 목표로 합니다. 여기서 산소 스트레스 시험이 사용되며, 5분간 연속 관류 후 산소 관류 흐름을 5분간 멈췄다가 5분간 재개합니다. 스트레스 시험 내내 RRS 측정과 유입 및 유출 진류 샘플이 채취됩니다.

  1. 간 조달:
    1. 유도 챔버에서 3%–5% 이소플루란을 사용해 동물을 진정시킵니다. 과도한 증기는 활성탄으로 걸러내세요.
    2. 수컷 루이스 쥐에게 150g 전간절제술을 시행하세요. 문맥의 가지를 연결하세요. IVC를 통해 50 U의 나트륨 헤파린을 주입하세요. 수술 중 문맥에 16G 카테터를 삽입하고, 간은 50mL 식염수로 세척하세요.
    3. 구입한 간을 위스콘신 대학교(UW) 용액 30mL가 든 페트리 접시에 얼음 위에 올려 보관하세요.
  2. 서비모동 기계 관류(SNMP) 설정 및 공명 라만 측정:
    1. 앞서 설명한 대로 RRS 장치를 설정하세요. 분광기 제어 소프트웨어에서 무세포성 쥐간 프로토콜 을 설정하면 폭 모드를 자동으로 적응 폭, 평균 길이 180, 타겟 시그마를 1.5로 설정합니다. 또한 3RMR 과 형광 을 측정 매개변수로 선택하며, 회귀 라이브러리로는 미토만 을 선택합니다. 획득 모드를 연속 모드로 설정하세요.
    2. 다른곳에서 설명한 대로 SNMP 시스템을 설정하세요.
      1. 간단히 말해, 관류 장치가 관류 챔버, 연동 펌프, 멤브레인 산소 공급기, 그리고 버블 트랩으로 구성되어 있는지 확인하세요.
      2. 대기 중 산소 혼합물(산소 95%,CO2 5%)을 공급합니다; pO2는 400–500 mmHg 사이로 유지하세요. 간내 압력 센서로 혈압을 모니터링하고 3–5 mmHg 사이로 유지하세요. 샘플을 샘플링 포트를 통해 채취하세요.
    3. 소프트웨어와 관류 시스템이 설정되면, PV를 관통하는 캐뉼라를 관류 기계의 유입관에 연결합니다. 장기, 관류제, 관류 세팅은 물욕 없이 실온(21°C)에서 유지하세요.
    4. 연동 펌프를 이용해 PV의 캐뉼라를 통해 관류액을 장기에 전달합니다.
      1. 퍼퓨세이트를 준비하기 위해 페놀 레드 프리 윌리엄스 미디엄 500 mL에 소 혈청 알부민(BSA) 5g, 수용성 덱사메타손 12mg, 페니실린-스트렙토마이신 5 mL, L-글루타민 5 mL, 인슐린 2.5 μL, 그리고 1000 U 헤파린을 혼합합니다.
      2. 모든 성분을 교반판에서 약 20분 정도 또는 모든 성분이 녹을 때까지 저어줍니다. 관류 유량을 증가시켜 압력을 3–5 mmHg로 만듭니다.
    5. 그 후 RRS 레이저 광원을 프로브 홀더에 넣고, 간에서 가장 큰 엽 위 1cm 높이, PV에 최대한 가깝게 위치시킵니다. 5분(T5)에 관류 흐름을 멈추고 10분(T10)에 다시 시작하세요. 스트레스 테스트는 15분(T15)에 실시하세요.
    6. 스트레스 테스트 전반에 걸쳐 RRS 측정을 하세요; T0부터 시작하여 5분마다 유입 및 유출 측정을 수행합니다(그림 4). T0,T 5, T10, T15(n = 3)에 대한 3RMR 값과 유출 K+ 및 락테이트 수치를 그래프로 표시합니다(그림 5).
    7. 산소 흡입/유출 분압(pO2)에 혈장 내 산소 용해도 계수(0.00314)를 곱하여 T0, T5, T10, T15에서 산소 소비율(OCR)을 계산합니다. T0,T 5, T10, T15의 OCR을 그립니다(그림 5).
      참고: 한 간에서 관류(T5), 허혈(T10), 재관류 (T15) 상태에서의 예시적 공명 라만 스펙트럼 흔적이 나타났습니다(그림 6)

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그림 4: 실험 흐름을 나타내는 도표. 암컷 루이스 쥐에 대해 전면 간절제술이 시행되었습니다. 확보한 간은 뇌하 기계에 관류를 받고 첫 5분간 산소 관류액을 투여했습니다. 관류액은 문맥을 통해 간으로 흘러들어가 연동 펌프를 통해 재순환합니다(관류 흐름은 파란색 화살표로 표시됨). 산소 관류는 T5에서 5분간 중단되었다가 T10에서 다시 5분간 재시작되었습니다. 3RMR 측정값은 스트레스 테스트 전반에 걸쳐 측정되었으며(레이저로 표시됨). 투류수 샘플은 T0, T5, T10, T15에서 채취되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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결과

신선한 간은 산소 스트레스 검사를 이용해 허혈과 재관류 기간을 겪었습니다. 그 후 스트레스 시험 전반에 걸쳐 3RMR의 실시간 변화를 T0,T 5, T 10, T15에서 산소 소비율, 유출 젖산, 칼륨 분석으로 얻은 것과 비교하였다. 건강한 조건에서는 3RMR 값이 10%에서 30% 사이일 것으로 예상됩니다(그림 5A). 예상대로, T0과T 5에서의 3RMR 값은 이 범위 내에 속하는데, 이는 간이 이 시점 사이에 지속적으로 산소 공급을 받았기 때문입니다(그림 5A). 그러나 허혈기 말(T10) 시점의 3RMR 값은 최적 범위에서 벗어난 상태입니다(그림 5A). 이 증가는 산...

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토론

본 연구는 휴대용 공명 라만 분광법(Resonance Raman Spectroscopy) 시스템을 사용하여 비침습적이고 실시간으로 매우 민감한 미토콘드리아 건강 상태를 정량화하는 방법을 강조합니다. 이 시스템은 소형 프로브 내 레이저와 광섬유 케이블로 레이저 펌프에 연결된 구조입니다. 이 방법은 441nm 레이저를 사용해 미토콘드리아를 여기시켰으며, 미토콘드리아는 산화 상태에 따라 독특한 스펙트럼 신호를 생성합니다. 따라서 RRS는 미토콘드리아의 각 상태를 스펙트럼 서명을 통해 정량화하고, 회귀분석을 통해 방출된 스펙트럼을 사전에 측정된 스펙트럼 라이브러리와 비교할 수 있습니다. 이후 미토콘드리아 건강 지표가 축소된 미토콘드리아와 전체 미토콘드리아의 비율을 바탕으로 한 감소 공명 라만 미토콘드리아 비율(3RMR)이 만들어졌습니다.

본 논문은 샘플 처리 없이 천연 조직과의 산소 공급에 따른 3RMR의 실시간 변화를 입증하...

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공개 사항

저자들은 상충하는 이해관계를 선언한다. S.N.T.와 P.R.은 이 연구와 관련된 잠정 특허 출원을 보유하고 있습니다. P.R.은 Pendar Technologies의 직원이자 주주입니다. S.N.T는 MGH와 Partners HealthCare가 이해충돌 정책에 따라 관리합니다. J.N.K의 상충하는 이해관계는 BCH의 이해충돌 정책에 의해 관리된다. 이 연구에서 사용된 특허 기술은 다음과 같습니다: US2020/0281474A1 라만 분광법을 이용한 세포 에너지의 생체 내 모니터링 (응용). 공명 라만 분광법을 이용한 안과, 조직 생존 가능성, 화상 손상 평가 분야에 대한 추가 특허 출원도 제출되었으며, R.J.도 이 분야의 발명가입니다.

감사의 글

이 연구는 미국 국립보건원(R01DK134590)으로부터 S.N.T.에 대한 관대한 지원으로 지원받았습니다. 또한 미국 국립보건원(NIH)으로부터 S.N.T에 지원해 주신 것에 감사드립니다 (K99/R00 HL1431149; R01HL157803; R24OD034189), 국립과학재단(EEC 1941543), 폴스키 패밀리 재단, 그리고 슈라이너스 어린이 보스턴(보스턴 보조금#BOS-85115). 또한, 미국 간질환 연구 협회 재단의 보조금 #LIFER23-263034로 R.J. 에 대한 자금 지원을 인정합니다.저자들은 하버드 의과대학 병리학 핵심부의 조직학 연구를 위한 전문가들의 지원에 깊은 감사를 표합니다. NIH 국립심장폐혈액연구소의 로버트 발라반 박사와 아르멜 페므누 박사께 미토콘드리아 에너지 분야 전문성과 개별 미토콘드리아 복합체 RRS 라이브러리 개발에 중요한 도움을 주신 데 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
16 G Catheter BD Insyte Authoguard381454간문맥을 관통하는 데 사용됨
Activated CharcoralVet Equip Vapor Guard Activated Charcoal931401마취 중 과도한 증기를 필터링하는 데 사용됨
BSA Sigma-Aldrich A7906침윤액 조성
Bubble Trap Radnoti130149
DexamethasoneSigma-AldrichD2915침윤액 조성
Glutamax Thermo Fisher Scientific35050061침윤액 조성
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)Fisher Scientific 13-200-292간을 통해 침윤액을 흐르게 하는 데 사용됨
Masterflex peristaltic pumps Cole Parmer, Vernon Hill, IL7528-30 간을 통해 침윤액을 흐르게 하는 데 사용됨
Membrane Oxygenator Radnoti130144침윤액을 산소화하는 데 사용됨. 
Penicillin-streptomycinSigma-AldrichP4458침윤액 조성
RAPIDPoint 500 Blood Gas SystemSiemens Healthineers41115805혈액 가스 분석을 위해
Resonance Raman System  Pendar TechnologiesA4D441이 제품에 대한 문의는 Pendar Technologies에 문의

참고문헌

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