공명 라만 분광법을 이용한 미토콘드리아 기능의 실시간 비침습적 평가

요약

우리는 공명 라만 분광법(RRS)을 이용한 비침습적이고 실시간 미토콘드리아 건강을 모니터링하는 방법을 제시합니다. 우리는 RRS를 사용해 미토콘드리아 산화환원 상태를 정량화하고, 미토콘드리아 건강을 측정하는 지표인 공명 라만 축소 미토콘드리아 비율(3RMR)을 개발했는데, 이는 전통적인 혈액-가스 분석제보다 산소 변화에 더 빠른 반응을 보입니다.

초록

미토콘드리아는 병인과 질병 진행의 중심이지만, 미토콘드리아 건강 역학에 대한 기전적 통찰은 여전히 비용이 많이 들고 접근하기 어렵습니다. 이 격차를 해소하기 위해 본 연구는 휴대용 시스템을 사용하여 미토콘드리아 기능을 평가하기 위해 공명 라만 분광법(RRS)을 사용하여, 쥐 간 내 미토콘드리아 사이토크롬 산화환원 상태를 실시간으로 비침습적이고 정량적으로 측정하는 휴대용 시스템을 사용합니다. 이 프로토콜에서는 설정, 데이터 수집, 데이터 처리 등 이 기술의 활용을 시연합니다. 이 연구는 RRS가 미토콘드리아 산화환원 상태의 실시간 변화, 그리고 확장해서 미토콘드리아 기능의 변화를 측정할 수 있음을 강조하는 개념 증명 실험을 제시합니다. 간단히 말해, RRS 장치는 레이저 펌프와 데이터 수집 컴퓨터에 연결되어 쥐 간에서 1cm 떨어진 곳에 놓였다.  획득 매개변수는 쥐 간 프로토콜에 따라 선택되었으며; 산화환원 상태는 산소 스트레스 테스트를 이용해 산소 및 허혈 상태에서 측정되었습니다. 미토콘드리아 산화환원 상태 변화는 산소 스트레스 검사 전반에 걸쳐 추적되었습니다.

서론

미토콘드리아는 세포 기능과 항상성에 중요한 역할을 합니다. 미토콘드리아는 세포 대사의 주요 동인으로, 산화적 인산화를 통해 ATP 생성을 조절합니다. 또한 세포 세포 세포의 운명을 조절하는 신호 소기관 역할도 하며, ROS 및 Ca⁺² 신호 전달¹도 담당합니다. 따라서 미토콘드리아 기능 장애는 다양한 신경퇴행성, 근육 및 심혈관 질환을 유발할 수 있습니다 ^2,3. 미토콘드리아가 질병 진행에 중요한 역할을 함에도 불구하고, 미토콘드리아 기능 평가는 침습적이고 비용이 많이 들며 제한적일 수 있습니다.

산소 소비율, 산화적 인산화, 전자전달사슬(ETC) 내 다양한 복합체의 활성과 같은 미토콘드리아 기능의 주요 지표들은 호흡계를 통해 측정됩니다. ETC는 내부 미토콘드리아 막(IMM)에 내장된 네 개의 복합체(I–IV)로 구성되어 있습니다. 이 복합물들은 다른 보조효소의 도움으로 NADH와 FADH2와 같은 환원 기질에서 최종 전자 수용체인 O2로 전자를 전달하고,_O2는 다시 물로 환원됩니다. 대부분의 현대 호흡 측정법, 예를 들어 해마 및 오로브로스 O2k 검사는 조직 처리가 필요하므로 중개 연구 적용이 제한됩니다 ^4,5. 미토콘드리아 막 전위(MMP) 측정은 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 또 다른 방법으로, JC-1과 같은 양이온 지친성 형광체와 현미경 영상을 활용하여 결합(건강한 미토콘드리아)과 비결합(손상된) 미토콘드리아가 서로 다른 파장으로 형광을 발합니다⁶. 하지만 이러한 분석법은 감도가 낮을 수^{있습니다.} 염료 자체도 고농도에서 높은 세포독성을 가질 수^{있습니다. 5}. 마지막으로, 호흡계 측정과 마찬가지로 이 기법도 조직 처리를 필요로 합니다. 최근에는 분광학 기반 기법이 미토콘드리아 건강을 평가하는 비침습적 방법으로 사용되고 있습니다. 예를 들어, 인 함유 대사산물의 농도를 측정하여 세포 대사를 평가하는 인자기공명 분광법(P-MRS)은 분화 과정을 겪는 인공 지방생성 조직을 특성화하는 데 사용되었습니다⁷. 하지만 이 기술에는 전문 장비와 훈련도 필요합니다.

우리 연구팀은 최근 공명 라만 분광법(RRS)을 이용해 장기 생존 지표로서 미토콘드리아 산화환원 상태를 실시간으로 비침습적이며 매우 특이적으로 측정하는 기법을 시연했습니다. RRS는 미토콘드리아 사이토크롬의 산화환원 상태를 정량하기 위해 광자의 비탄성 산란을 사용합니다. 미토콘드리아 사이토크롬, 헤모글로빈, 마이오글로빈과 같은 분자의 헴 모에에트 내 포르피린 고리는 441^{nm 파장} 레이저로 여기될 때 산화 상태에 따라 특징적인 라만 스펙트럼을 생성합니다. RRS 시스템은 441 nm 파장을 사용하지만, 420 nm 및 405 nm 파장의 레이저도 사용할 수 있으며, 각각 서로 다른 사이토크롬 복합체를 우선적으로 증강합니다. 관심 있는 미확인 샘플에서 얻은 스펙트럼은 완전히 산화되거나 환원된 미토콘드리아의 사전 녹화된 라이브러리와 교차 참조하여, 환원 미토콘드리아와 전체 미토콘드리아의 비율 또는 현장 내 ETC 사이토크롬의 평균 산화환원 상태를 산출합니다. 이 비율은 공명 라만 축소 미토콘드리아 비율(3RMR)으로 정의됩니다.

3RMR에는 세 가지 뚜렷한 계산 유형이 있습니다: 미토콘드리아 3RMR(미토-3RMR), 복합체 III 3RMR(cIII-3RMR), 복합체 IV 3RMR(cIV-3RMR). 이 각 지수는 주어진 성분의 총 개수로의 비율을 계산합니다. 예를 들어, cIII의 3RMR은 조직 내 cIII 총 수와 환소된 cIII의 비율(cIII-R/(cIII-O+CIII-R)이다. 같은 패턴이 cIV에도 적용됩니다. 따라서 3RMR-cIII는 감소한 cIII와 총 cIII의 비율을, 3RMR-cIV는 감소한 cIV와 총 cIV의 비율을 의미합니다. 회귀분석을 통해 미토콘드리아 산화환원 상태(미토-3RMR)는 온전한 미토콘드리아의 스펙트럼 라이브러리를 이용해 계산되거나, 개별 복합 산화환원 상태(cIII-3RMR 및 cIV-3RMR)는 cIII 및 cIV 스펙트럼 라이브러리를 이용해 계산됩니다. 최근 논문(⁹ )은 미토-3RMR이 cIII 및 cIV 산화환원 상태(또는 cIII-3RMR과 cIV-3RMR)의 가중 평균을 대표한다는 것을 보여주었습니다. cI와 cII는 441 nm 파장을 통해 라만 활성화나 공명 증강이 아니라는 점을 유의해야 합니다. 따라서 미토-3RMR 계산 시 계산되지 않습니다.

이러한 3RMR 유형을 활용하여 3RMR의 최적 범위를 정의해 왔습니다. "건강한" 기관에서는 미토콘드리아가 온전하고 충분한 산소 공급을 제공합니다. 반면, 손상된 장기는 산소 전달이나 이용이 부족해 ETC 복합체에 전자가 축적될 수 있습니다. 전자 축적은 '환원 스트레스'를 일으켜 미토콘드리아를 산화 상태에서 환원 상태로 이동시키고 3RMR 값을 증가시킵니다. 설치류와 돼지 모델을 대상으로 심장과 간을 대상으로 한 여러 연구(^8,9,10,11,12)는 3RMR의 최적 "건강" 범위인 10에서 30 사이를 밝히기 시작했습니다. 예를 들어, Perry 등은 포유류 심장에 저산소증을 노출시켰으며, 3RMR 30%가 저^{산소 조직을} 감지하는 데 최적의 감도와 특이성 균형을 이루는 것으로 나타났습니다. 이 경향은 심장 조직^{11, 12}, 간 이식¹⁰ 연구에서도 더욱 확인되었습니다. 또한 Nyugen 등은 대사가 멈춘 조직에서 3RMR 값이 매우 낮은(산화된) 값으로 떨어지며, 3시간 동안 정상 관류 후 이식 불가능한 온허혈성 간에서 3RMR 수준(7.667 ±± 4.926)을 기록한 반면, 신선하고 이식 가능한 온방허혈 간에서는 3RMR 값이 10(~12–15)을 초과하는 반면⁹.

3RMR이 조직 생존력을 측정하는 이러한 시연을 넘어, RRS의 민감도, 특이성, 사용 편의성 덕분에 세포 대사와 미토콘드리아 기능에 영향을 미치는 다양한 연구에 매우 적합합니다. 이전 연구에서는 RRS가 시신경두¹³의 망막신경절 세포의 비수초 축삭의 대사 활성을 평가하여 쥐에서 황반변성 및 녹내장을 검출하는 데 활용되었습니다. 또한, 신생아 심장 선별검사에서 자주 놓치는 대동맥 경합(CoA) 모델에서 대동맥 경합(CoA)을 검출하는 데 사용^{되었습니다.} 이 기술은 장기 이식 분야에서 장기 기능과 생존성을 이해하는 데 활용되었으며, 여기에는 체외 기계 관류에 따른 장기 생존 평가 연구(10,11^), 정적 냉장 보관 후 재산소 공급 평가(¹⁴), 열허혈성 간의 재관류 손상 완화 연구(^9)가 포함됩니다.

이 논문은 RRS를 미토콘드리아 건강 평가를 위한 실시간 민감한 도구로 확립하고자 합니다. 쥐 모델의 전체 간 샘플을 통해 다양한 수준의 허혈과 산소 재관류를 통해 미토콘드리아 반응을 평가하였습니다. 이 산소 스트레스 검사에서는 신선한 간에 초기 관류 흐름 5분, 허혈 5분, 재관류 5분을 받습니다. 스트레스 시험 전반에 걸쳐 3RMR과 젖산, K+, 산소 분압(pO2) 측정이 이루어졌습니다. 3RMR은 전통적인 혈액 가스 분석제에 비해 산소 변화에 더 빠른 반응을 보였습니다. 이러한 실험에서 RRS의 사용은 단순히 기전적 연구뿐만 아니라 진단 방법이자 치료적 시험대로도 강조됩니다. 따라서 이 공유 프로토콜은 미토콘드리아 연구를 하는 다양한 연구자들에게 유용할 수 있습니다. 전반적으로 RRS는 비침습적이고 실시간으로 매우 특이적인 특성 덕분에 세포 대사에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.

프로토콜

실험에 참여하는 모든 동물은 미국 매사추세츠 종합병원(보스턴, MA)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. RRS 설정 및 활용

1. 장치 설명:
   참고: 휴대용 RRS 시스템(Pendar Technologies; 연구용으로만 제공됨)은 441nm 레이저를 사용하는데, 이는 이 파장의 미토콘드리아 사이토크롬의 라만 스펙트럼을 공명 증강하기 때문입니다. 레이저는 4 mW에서 8 mW 사이로 작동합니다.
   1. 레이저 여기 소스를 광섬유 케이블을 통해 맞춤 제작된 프로브에 연결합니다. 프로브는 조직에 직경 2mm 레이저 스팟을 비추고, 방출된 스펙트럼을 수집합니다. 스펙트럼은 밴드패스 필터를 통과한 후 전하 결합 소자(CCD) 배열에 의해 수집됩니다. 스펙트럼은 180초 동안 매초 수집되어 평균화되어 분석용 원시 노이즈 스펙트럼을 만듭니다.
   2. 소프트웨어는 회귀분석을 통해 얻은 스펙트럼을 사전 측정된 스펙트럼 라이브러리와 비교합니다.
2. 사전 녹음 라이브러리 절차
   참고: 본 논문에서 제시된 실험을 위해 미토콘드리아, 복합체 III 및 복합체 IV의 환원 및 산화 형태, 헤모글로빈, 마이오글로빈 라이브러리를 생성하고 활용하였습니다. 모든 라이브러리의 RRS 신호는 실온(21°C)에서 블랙박스에 담겨 촬영되었습니다. 이 라이브러리 파일들은 분석 소프트웨어와 별도로 제공됩니다. 그러나 관심 조직과 다른 라만 활성 분자의 존재에 따라, 다음 프로토콜을 적절히 변형하여 다른 라이브러리도 만들 수 있습니다. 헤모글로빈, 마이오글로빈, 산화/환원 III/IV 복합체 라이브러리의 원시 RRS 스펙트럼이 제공됩니다. 보조 그림 1.
   1. 헤모글로빈 라이브러리 (보조 그림 1C):
      1. 동물의 출혈을 통해 신선한 설치류 혈액을 채취하세요. 채취된 혈액을 100% 산소로 산소 공급하거나, 100% 질소를 사용해 탈산소화한 유리 쿠벳에 디티오네이트를 첨가합니다.
      2. 유리 쿠벳 벽을 통해 각 상태의 RRS를 10분간 측정하고, RRS 프로브는 유리 큐벳에서 9mm 떨어진 곳에 위치시킵니다.
      3. 1356 ^cm-1 의 스펙트럼 피크를 사용해 탈산소 상태를 확인하고, 1376 ^cm-1 의 피크를 사용해 산소 상태를 확인한다.
   2. 환원/산화된 미토콘드리아 라이브러리 (그림 1)
      1. 유리 큐벳에서 균질화 및 정제된 설치류 심장에서 미토콘드리아를 분리합니다. 라만 프로브를 유리 큐벳에서 9mm 떨어진 곳에 놓고 유리벽을 통해 이 미토콘드리아의 스펙트럼을 측정합니다.
      2. 미토콘드리아에 100% 산소 흐름을 제공함으로써 완전히 산화된 상태를 만듭니다. 1357 ^cm-1에서 환원된 RR 피크가 없을 때 산화 상태를 검증합니다.
      3. 미토콘드리아를 100% 질소에 노출시키고 소량의 황화수소를 포함해 완전히 환원된 조건을 만듭니다. 1371 ^cm-1에서 산화된 RR 마커 피크가 없을 때 조건 감소를 검증합니다.
   3. 산화/환원 복합체 III/IV (보충 그림 1A, B):
      1. 다른^곳에서 설명된 3, IV 복합체 9^{, 15, 16, 17}을 분리합니다. 간단히 말해, 분리된 미토콘드리아 샘플(시토크롬 a 200나몰에 해당)을 출발물질로 사용하세요.
      2. 미토콘드리아를 10 nmol 사이토크롬 A/mL로 희석하여 얼음 냉각 완충 C(50 mM Tris, 1 mM MgSO_4, pH 8.45)에 넣습니다. 그 후 얼음 위에서 부드럽게 섞은 상태에서 10% w/v n-β-D-도데실-말토사이드(DM)를 한 방울씩 최종 농도가 1%로 만듭니다.
      3. 추출물을 40,000 g × 4°C에서 40분간 원심분리합니다. 상청액을 2.5cm × 20cm 유리 컬럼에 적용하는데, 이 컬럼에는 교환 레진이 5개의 버퍼 C(0.02% w/v DM 함유)로 평형을 맞춘 상태입니다.
      4. 버퍼 C 2개 컬럼으로 세척한 후, 같은 버퍼에 선형 0–400 mM NaCl 구배를 적용하여 미토콘드리아 복합체를 용출하고, 4 mL 분획으로 용출물을 수집합니다.
      5. 복합체 IV를 포함하는 녹색 분획은 구배 중간(~180 mL NaCl) 근처에서 용출되었고, 그 전에 복합체 III를 포함하는 붉은 분획이 나타났습니다. 각 복합체를 포함한 모은 분획을 20–30 nmole 사이토크롬 a/mL로 농축합니다.
      6. 개별 복합체가 분리되면 산화 및 환원 조건에 노출시키세요. Tris 완충액 내 복합체 III 11 mM 샘플을 2 mL의 아스코르베이트(1 M)로 환원하여 사이토크롬 c1을, 2 mL의 HS(황산수소)를 사용하여 사이토크롬 b_L과 b_H를 완전히 환원합니다.
      7. Tris 버퍼 내 18.67 mM 복합체 IV 샘플을 여러 단계로 환원하는데, 복합체 IV는 다단계 촉매 산화 과정을 거치기 때문입니다. 복합체 IV를 완전히 줄이기 위해서는 H₂O₂ 2 2(10 mM) 2mL를 추가하고, 이어서 HS 2mL를 추가합니다.
      8. 각 추가 후 라이브러리 스펙트럼을 수집하여 사이클의 각 단계를 포착하세요. 최종 기준 라이브러리에 완전히 산화되고 환원된 스펙트럼을 추가하여 복합체 IV의 정상 상태를 나타냅니다.
      9. 모든 샘플을 1mL 유리 바이알에 담아 프로브 렌즈에서 9mm 떨어진 고정 위치에 보관한 뒤, 빛 오염을 방지하기 위해 블랙박스에 넣으세요. 각 복합체와 산화 상태별로 600초 동안 RRS 스펙트럼을 수집합니다.
      10. ^앞서 설명한 분리된 cIII 및 cIV의 순도를 검증하고, 최근 논문⁹에서 설명된 전체 미토콘드리아 스펙트럼을 설명하는 데 있어 분리된 cIII 및 cIV 스펙트럼 라이브러리의 적절성을 검증합니다.
   4. 마이오글로빈 라이브러리 (보충 그림 1D):
      1. 유사한 산소와 질소(용해된 디티오나이트 포함) 흐름을 사용하여 심근 마이오글로빈 추출물의 옥시미오글로빈 포화도를 0%에서 100% 사이로 조절합니다. 1355 ^cm-1 과 1376 ^cm-1의 마커 피크를 통해 라만 스펙트럼을 검증하세요.

참고: 위에서 설명한 대부분의 스펙트럼 성분, 예를 들어 헤모글로빈이나 산화/환원 미토콘드리아는 헤메를 포함하는 분자이며 동일한 파장에 의해 여기됩니다. 이 RRS 시스템은 각 분자의 고유한 스펙트럼 신호를 기반으로 회귀 라이브러리를 생성하여 신호 중복을 방지합니다. 얻어진 산란 스펙트럼은 선택된 라이브러리에 대해 회귀 알고리즘을 거칩니다. 회귀 알고리즘은 각 라이브러리 스펙트럼에 대해 기록된 스펙트럼에서의 상대적 기여도, 즉 조직 내 상대적 농도에 대한 최적 적합 추정치를 제공하는 인자를 산출합니다. 알고리즘은 다양한 파수 범위에 걸쳐 최적의 적합도를 사용하기 때문에, 다양한 라이브러리 구성 요소의 스펙트럼 피크의 위치나 강도의 미세한 차이만으로도 회귀분석에서 밀접한 관련이 있는 크로모포어를 식별할 수 있습니다. 회귀 알고리즘과 스펙트럼 라이브러리를 통해 RRS 시스템은 전체 산란 신호를 고유한 스펙트럼 피크에 따라 다양한 성분으로 분해하여 헤메 함유 분자와의 신호 중복을 방지할 수 있습니다. 헤모글로빈과 미토콘드리아 간의 관계를 보여주기 위해 보충 그림 2가 포함되어 있는데, 이 그림 2는 간 관류에서 측정된 신호, 최적의 적합선, 개별 스펙트럼 피크 차이로 인한 설명되지 않은 잔여 스펙트럼의 이미지를 제공합니다. 패널 A에서는 환원 및 산화된 헤모글로빈과 환원 및 산화된 미토콘드리아 회귀 라이브러리를 선정하였습니다. 라이브러리와 회귀분석을 통해 선별된 최적 적합 선은 측정된 신호와 깔끔하게 겹치며, 설명되지 않은 잔여물도 거의 없습니다. 패널 B에서는 산화되고 환원된 미토콘드리아 라이브러리만 선택됩니다. 설명되지 않은 잔류 구조가 크기 때문에, 미토콘드리아 스펙트럼 피크는 회귀분석에 포함되지 않은 헤모글로빈에서 몇 파수 이동됩니다. 더욱이, Nguyen 등9의 보충 도표에서 저자들은 미토콘드리아와 개별 복합체(cIII 및 cIV) 간의 관계, 그리고 개별 복합체¹⁶ 간의 관계를 설명하는데, 복합체 III는 더 날카롭고 낮은 주파수 피크를 보이는 반면, 복합체 IV는 더 넓고 위로 이동된 띠를 보인다. 더 나아가, 저자들은 환원된 Complex III와 Complex IV 라이브러리가 환원 전체 미토콘드리아의 측정된 스펙트럼을 완전히 설명하여 설명되지 않은 잔여가 최소화된다는 것을 보여준다.

그림 1: 완전히 산화되고 환원된 미토콘드리아의 스펙트럼 라이브러리. RRS 라이브러리 스펙트럼은 분리된 미토콘드리아에 (A) 100% 산소 또는 100% 질소(B)를 제공하여 각각 산화 및 환원 상태에 도달한 후 얻어졌습니다. 이러한 상태는 RR (C) 산소화 및 감소(D) 마커 피크의 존재로 확인되었습니다. 이 피크들의 이동은 산소가 존재할 때 분자 진동 모드의 변화에 해당합니다. 각 피크의 세기는 1 임의 강도 단위(AU)로 정규화되며, 이 441 nm 여기 파장을 사용하면 환원 상태의 증강이 더 커집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

2. RRS를 이용한 데이터 수집

1. 장치 설정:
   1. 분광기 유닛(컴팩트 박스 안에 보관됨)을 직류(DC) 전원 공급 장치와 공급 케이블을 통해 전원 어댑터에 연결합니다. 분광기 유닛은 정렬 홈이 있는 둥근 플러그 하나로 구성되어 있습니다.
   2. 원형 플러그의 홈을 전원 어댑터에 연결하는 케이블의 홈과 맞춰 보세요. 포트 연결 전에 청소할 필요는 없습니다(그림 2).
   3. 분석을 수행하는 컴퓨터를 분광기와 전원 공급 장치를 연결하는 동일한 전원 어댑터에 케이블로 연결하세요.
   4. 레이저 프로브를 프로브 홀더에 넣으세요. 실험 시작 시 이 프로브의 위치를 조정하세요.
   5. 분광기 제어 소프트웨어(셀룰러 에너지 소프트웨어)를 열어라.
2. 소프트웨어 설정:
   참고: 시스템에 따라 다양한 유형의 조직에 대한 설정 파일 및 회귀 라이브러리가 제공됩니다. 이 파일에는 RRS 시스템이 회귀분석에 포함해야 할 라이브러리, 회귀 창에 포함된 스펙트럼 수, 레이저 파워와 같은 기타 매개변수에 관한 정보가 포함되어 있습니다. 기본 설정은 변경할 수 있고, 새로운 설정 파일을 저장해 향후 실험에서 사용할 수 있습니다. 아래에 설명된 소프트웨어의 스크린샷은 보충 그림 3에 제시되어 있습니다.
   1. 분광기 제어 소프트웨어를 열면 3RMR, 산소포화도(StO₂), 마이오글로빈 포화도의 비율을 나타내는 그래프가 나타납니다. 이 화면에서 이 지표들이 선택될 경우, 측정 과정 내내 실시간으로 표시됩니다. 페이지 왼쪽 하단의 설정 탭을 클릭하세요.
   2. 정보 탭에서 세션 이름 아래에 세션 정보를 입력하고, 필요한 세부 사항은 세션 설명 탭에 입력하세요.
   3. 데이터 수집 방식은 두 가지가 있습니다. 스 팟 체크 모드를 사용해 지정된 품질 지표(예: 목표 시그마 또는 회귀 창/스펙트럼 개수)를 충족할 때까지 스펙트럼을 축적한 후 기록을 중단합니다. Continuous Mode 를 사용해 스펙트럼을 기록하고 스톱 버튼을 누르세요. 두 모드 모두에서 3RMR 결과와 개별 스펙트럼 등 모든 데이터가 자동으로 저장됩니다. 이 실험은 연속 모드를 사용합니다.
   4. 모든 세션 정보를 입력한 후에는 시스템 탭을 클릭하세요.
   5. 설정 파일에서 프로젝트에 맞는 프로토콜을 선택하세요(무세포 쥐 간 관류의 경우 쥐 간 무세포 프로토콜을 선택). 이 기능은 자동으로 측정 유형, 평균 측정 길이(회귀 창), 그리고 목표 시그마를 조정합니다.
      1. 새 설정 파일을 만들려면 위에 나열된 컴포넌트 중 하나를 조정한 후 저장 버튼을 클릭하세요. 이렇게 하면 이 매개변수들을 별도의 설정 파일로 저장해 시스템에 가져올 수 있습니다.
      2. 새 설정 파일을 가져오려면 Default(Mod) 옆의 드롭다운 메뉴를 클릭한 후 Import New Settings File을 선택하세요. 새 설정 파일을 클릭하면 가져올 수 있습니다.
   6. 회귀 라이브러리 항목에서 데이터 수집 및 분석에 사용할 라이브러리 조합을 선택하고 확인하세요. 환원 및 산화된 미토콘드리아 라이브러리(미토 단독)가 이 실험에 선택되었습니다. 다른 사용자는 고급 라이브러리에 포함된 헤모글로빈, 마이오글로빈 또는 기타 복합체를 포함하는 라이브러리를 선택할 수도 있습니다.
   7. 선호하는 윈도우 폭 모드를 선택하고 확인하세요.
      1. 적응형 폭 모드: 적응형 폭 모드를 사용하여 최대 시그마 목표에 도달할 때까지 개별 스펙트럼을 평균화된 스펙트럼에 추가합니다. 시그마 목표에 도달하지 못하면, 설정된 회귀 창의 상한선(즉, 기록하라고 지시받은 최대 스펙트럼 수)에 도달하면 기록이 중단됩니다. 최소 시그마 목표에 도달한 후 측정 결과가 화면에 표시됩니다.
      2. 고정 폭 모드: 고정 폭 모드를 사용하여 목표 스펙트럼 수가 포함될 때까지 개별 스펙트럼을 평균화된 스펙트럼에 추가합니다(평균 길이 아래에 설정).
   8. 시스템 설정이 완료되면 플롯 탭을 클릭하세요.
   9. 메인 시리즈 항목에서 측정 시 화면에 표시할 부품을 선택하세요.
   10. 선택된 모든 측정 성분이 관심 있는 프로토콜에 부합하는지 확인하세요.
3. 데이터 수집:
   참고: 라만 측정은 어두운 공간에서 이루어져야 합니다. 데이터 수집을 시작하기 전에 작업 공간이 가능한 한 빛으로부터 차단되도록 하세요. 방이 완전히 빛을 차단할 수 없을 경우, RRS 시스템은 중앙에 직사각형 개구부가 있는 검은색 커버를 제공합니다(다음 사진에 표시됨) 그림 2) 이 구멍을 통해 레이저 프로브를 장착할 수 있습니다. 상자는 RRS 측정이 이루어지는 샘플이나 장기 부위를 덮을 수 있습니다. RRS 레이저 작업 시 직접 또는 장시간 눈 노출을 피하세요. 레이저를 눈이나 반사면에 직접 비추지 마세요. 레이저는 관심 있는 조직에 직접 위치했을 때만 작동하세요. RRS 레이저는 4 mW에서 사용할 때 클래스 3R 레이저이고, 10 mW에서 사용할 때는 클래스 3B 레이저입니다. 레이저는 조직 접촉에 안전합니다.
   1. 적절한, 미리 저장된 설정, 녹화 매개변수, 라이브러리 파일을 선택하세요.
   2. 레이저 프로브를 관심 있는 조직/장기 바로 위에 놓으세요. 프로브를 가능한 한 수직으로 조직에서 1cm 떨어진 곳에 위치시키세요. 자를 사용해 장기 표면에서 1cm 정도 정확히 측정하세요. 신호가 명확하지 않으면 프로브를 1cm 이내로 조정하세요. 하지만 프로브가 조직에 닿지 않도록 주의하세요.
      참고: 프로브는 손에 들 수도 있지만, 조절이 가능하고 안정적으로 유지되는 프로브 홀더/스탠드를 사용하는 것이 권장됩니다. 프로브를 가능한 한 수직으로 조직에서 1cm 떨어진 곳에 위치시키세요. 자를 사용해 오르간 표면에서 1cm 정도 정확히 측정할 수 있었습니다. 신호가 명확하지 않을 경우 프로브를 1cm 이내로 더 가깝게 위치시킬 수 있습니다. 하지만 프로브는 절대 조직에 닿아서는 안 됩니다.
   3. 레이저 스팟이 문맥 가까이, 왼쪽 측엽에 있는지 확인하세요.
   4. 선택된 모든 라이브러리, 회귀 설정, 타겟 시그마, 회귀 창, 획득 모드가 올바르고 원하는 대로 있는지 확인하세요.
      1. 방을 최대한 어둡게 하세요. 프로브에 창문에 오염, 특히 혈액이 묻어 있지 않은지 확인하세요. 오염 시 보풀 없는 비연마성 물티슈에 70% 이소프로필 알코올을 사용해 Quartz 창문을 청소한 후, 건조 티슈로 철저히 건조한 후 작업을 진행하세요.
      2. 오염이 심한 경우, 위에서 설명한 대로 프로브를 최대한 깨끗이 닦아야 합니다. 그 다음, 검은 테이프로 감싼 어두운 케이스에 레이저를 넣고 Take Dark 버튼을 눌러 기기를 보정하세요. 보정은 약 5분에서 10분 정도 소요됩니다. 오염 여부와 상관없이 한 달에 한 번 기기를 보정하면 자동으로 알림 메시지를 보냅니다.
         참고: 각 품질 관리 지표에 대한 설명, 이러한 QC 지표의 예시, 그리고 최적 및 비최적 기록에서 얻은 원시 스펙트럼 신호(보충 파일 1, 그림 3, 보충 그림 3)에 대한 설명입니다. 이 품질 관리 기준은 쥐 모델에서 온 간에 최적화되었습니다. 다른 장기/동물 모델을 사용하는 새로 개발된 프로토콜은 이 지표들을 적절히 다듬고 조정해야 합니다.
   5. 메인 페이지에서 시작 버튼을 클릭하여 데이터 수집을 시작하세요. 선택한 설정에 따라 소프트웨어는 목표 오차 값(시그마) 또는 180초에 도달할 때까지 녹화를 진행합니다. 데이터 수집이 완료되었습니다.
      1. 이 그래프와 값에서 RRS 신호의 품질을 추론하여 프로브 위치나 측정 조건을 조정할 수 있습니다(그림 3). 만약 얻어진 RRS 신호가 이러한 품질 관리 기준을 충족하지 못하면, 프로브를 가능한 한 수직으로 조정하고 표면에서 프로브 창문까지 약 9mm 거리로 조정하세요.
   6. 데이터 수집/실험 프로토콜이 완료되면 간과 조직 전체를 생물학적 위험 보관함에 버리세요. 장기나 조직과 접촉한 모든 시스템이나 표면은 70% 에탄올로 청소하세요.
      1. 관류 시스템을 사용할 경우, DI수를 효소 세정제(7.8mL를 1L 탈이온수에 희석한 상태)를 섞은 후 깨끗한 DI수를 사용하세요.
         참고: 각 녹화는 새로운 세션 파일 아래에 별도의 분석 파일로 저장됩니다. 3RMR과 미토콘드리아 신호 세기(r3RMR) 결과는 메인 창에 표시되어 있습니다. 원시 스펙트럼도 표시할 수 있습니다. 잔류 신호 세기와 총 신호 세기와 같은 다른 품질 검사 지표는 스펙트럼 탭 아래에 표시됩니다.
4. 데이터 분석:
   1. 데이터 수집이 완료되면 화면 하단의 리뷰 폴더를 클릭하여 실험 파일을 열고 결과를 확인하세요.
   2. 또는 결과를 담은 텍스트 파일을 열어보세요. 관심 있는 세션 파일을 선택하세요. 모든 측정값이 포함된 분석 파일이 열립니다. 각 매개변수와 그 시그마 값은 별도의 열을 가집니다. 예를 들어, 매초 얻는 3RMR 값은 "3RMR" 열에, 그 시그마 값은 "sigma_3RMR" 항목에 표시됩니다.
   3. 각 열의 마지막 행에는 해당 세션 파일의 각 매개변수에 대한 최종 값이 포함됩니다. 이 값을 사용해 플롯을 작성하세요.
   4. 각 세션 파일/녹화마다 반복 단계를 반복하세요. 플롯은 원하는 값을 얻었습니다.

그림 2: RRS 장치 설정. RRS 시스템 구성의 회로도입니다. 프로브는 광섬유 케이블을 통해 레이저 여기원과 분광기가 포함된 RRS 시스템에 연결됩니다. 이 구성은 분광기 제어 앱이 있는 노트북에 연결되어 데이터 수집 및 분석이 가능합니다. 컴퓨터와 분광기 모두 전원 콘센트에 연결되어 있습니다. RRS 측정은 어두운 환경에서 측정해야 합니다. 방이 완전히 빛을 차단할 수 없을 경우, RRS 시스템은 중앙에 직사각형 개구부가 있는 검은색 덮개를 갖추고 있어 레이저 프로브를 설치할 수 있습니다. 상자는 RRS 측정이 이루어지는 장기 샘플/부위를 덮고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 최적 품질 및 최적 품질 추적의 예시 추적 및 품질 관리 지표. 잔류 신호(잡음)는 주황색 괄호로, 미토콘드리아 신호는 초록색 괄호로 표시됩니다. (A) 최적이 아닌 라만 신호에서 나온 트레이스 예시. 잔류 신호가 너무 커서 미토콘드리아 신호와 구분되지 않습니다. 스펙트럼 피크는 측정된 신호 전체에서 구별할 수 없습니다. (B) 최적 라만 신호에서의 트레이스 예시. 미토콘드리아 신호는 잔류 신호와 눈에 띄게 크고 구별됩니다. 측정값에서 스펙트럼 피크를 구분할 수 있습니다. (C) 각 신호로부터 얻은 QC 지표. 전반적으로, 최적이 아닌 판독값에서 얻어진 전체 신호는 최적 값보다 적습니다. 최적 기록에서는 비최적화 기록보다 더 많은 미토콘드리아 신호가 측정되며, 미토콘드리아 신호는 전체 신호의 17%와 14%를 차지합니다. 신호는 최적 오차가 4.3%로 측정되었으며, 이는 최적 이하 기준의 오차가 18.5%와 대조적이다. 마찬가지로, 설명되지 않은 잔류 신호는 비최적 기록에서 전체 신호의 11%를 차지하는 반면, 최적 기록에서는 3.6%를 차지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

3. RRS를 이용한 미토콘드리아 건강 평가

참고: 공명 라만 분광법(RRS) 기술을 사용하여 이식 장기의 생존 가능성을 나타내는 미토콘드리아 생존 지표(3RMR)를 개발했습니다. 본 연구는 산소 공급, 그리고 확장해서 세포 호흡의 변화가 락테이트와 K⁺ 같은 전통적인 손상 바이오마커와 비교해 3RMR 추세에 어떻게 반영되는지 보여주는 것을 목표로 합니다. 여기서 산소 스트레스 시험이 사용되며, 5분간 연속 관류 후 산소 관류 흐름을 5분간 멈췄다가 5분간 재개합니다. 스트레스 시험 내내 RRS 측정과 유입 및 유출 진류 샘플이 채취됩니다.

1. 간 조달:
   1. 유도 챔버에서 3%–5% 이소플루란을 사용해 동물을 진정시킵니다. 과도한 증기는 활성탄으로 걸러내세요.
   2. 수컷 루이스 쥐에게 150g 전간절제술을 시행하세요. 문맥의 가지를 연결하세요. IVC를 통해 50 U의 나트륨 헤파린을 주입하세요. 수술 중 문맥에 16G 카테터를 삽입하고, 간은 50mL 식염수로 세척하세요.
   3. 구입한 간을 위스콘신 대학교(UW) 용액 30mL가 든 페트리 접시에 얼음 위에 올려 보관하세요.
2. 서비모동 기계 관류(SNMP) 설정 및 공명 라만 측정:
   1. 앞서 설명한 대로 RRS 장치를 설정하세요. 분광기 제어 소프트웨어에서 무세포성 쥐간 프로토콜 을 설정하면 폭 모드를 자동으로 적응 폭, 평균 길이 180, 타겟 시그마를 1.5로 설정합니다. 또한 3RMR 과 형광 을 측정 매개변수로 선택하며, 회귀 라이브러리로는 미토만 을 선택합니다. 획득 모드를 연속 모드로 설정하세요.
   2. 다른^곳에서 설명한 대로 SNMP 시스템을 설정하세요.
      1. 간단히 말해, 관류 장치가 관류 챔버, 연동 펌프, 멤브레인 산소 공급기, 그리고 버블 트랩으로 구성되어 있는지 확인하세요.
      2. 대기 중 산소 혼합물(산소 95%,_CO2 5%)을 공급합니다; pO₂는 400–500 mmHg 사이로 유지하세요. 간내 압력 센서로 혈압을 모니터링하고 3–5 mmHg 사이로 유지하세요. 샘플을 샘플링 포트를 통해 채취하세요.
   3. 소프트웨어와 관류 시스템이 설정되면, PV를 관통하는 캐뉼라를 관류 기계의 유입관에 연결합니다. 장기, 관류제, 관류 세팅은 물욕 없이 실온(21°C)에서 유지하세요.
   4. 연동 펌프를 이용해 PV의 캐뉼라를 통해 관류액을 장기에 전달합니다.
      1. 퍼퓨세이트를 준비하기 위해 페놀 레드 프리 윌리엄스 미디엄 500 mL에 소 혈청 알부민(BSA) 5g, 수용성 덱사메타손 12mg, 페니실린-스트렙토마이신 5 mL, L-글루타민 5 mL, 인슐린 2.5 μL, 그리고 1000 U 헤파린을 혼합합니다.
      2. 모든 성분을 교반판에서 약 20분 정도 또는 모든 성분이 녹을 때까지 저어줍니다. 관류 유량을 증가시켜 압력을 3–5 mmHg로 만듭니다.
   5. 그 후 RRS 레이저 광원을 프로브 홀더에 넣고, 간에서 가장 큰 엽 위 1cm 높이, PV에 최대한 가깝게 위치시킵니다. 5분(T₅)에 관류 흐름을 멈추고 10분(T₁₀)에 다시 시작하세요. 스트레스 테스트는 15분(T₁₅)에 실시하세요.
   6. 스트레스 테스트 전반에 걸쳐 RRS 측정을 하세요; T₀부터 시작하여 5분마다 유입 및 유출 측정을 수행합니다(그림 4). T₀,_{T 5}, T₁₀, T₁₅(n = 3)에 대한 3RMR 값과 유출 K⁺ 및 락테이트 수치를 그래프로 표시합니다(그림 5).
   7. 산소 흡입/유출 분압(pO₂)에 혈장 내 산소 용해도 계수(0.00314)를 곱하여 T₀, T₅, T₁₀, T₁₅에서 산소 소비율(OCR)을 계산합니다. T₀,_{T 5}, T₁₀, T₁₅의 OCR을 그립니다(그림 5).
      참고: 한 간에서 관류(T₅), 허혈(T₁₀), 재관류 (T₁₅) 상태에서의 예시적 공명 라만 스펙트럼 흔적이 나타났습니다(그림 6)

그림 4: 실험 흐름을 나타내는 도표. 암컷 루이스 쥐에 대해 전면 간절제술이 시행되었습니다. 확보한 간은 뇌하 기계에 관류를 받고 첫 5분간 산소 관류액을 투여했습니다. 관류액은 문맥을 통해 간으로 흘러들어가 연동 펌프를 통해 재순환합니다(관류 흐름은 파란색 화살표로 표시됨). 산소 관류는 T5에서 5분간 중단되었다가 T10에서 다시 5분간 재시작되었습니다. 3RMR 측정값은 스트레스 테스트 전반에 걸쳐 측정되었으며(레이저로 표시됨). 투류수 샘플은 T0, T5, T10, T15에서 채취되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

결과

신선한 간은 산소 스트레스 검사를 이용해 허혈과 재관류 기간을 겪었습니다. 그 후 스트레스 시험 전반에 걸쳐 3RMR의 실시간 변화를 T₀,_{T 5, T 10}, T₁₅에서 산소 소비율, 유출 젖산, 칼륨 분석으로 얻은 것과 비교하였다. 건강한 조건에서는 3RMR 값이 10%에서 30% 사이일 것으로 예상됩니다(그림 5A). 예상대로, T₀과_{T 5}에서의 3RMR 값은 이 범위 내에 속하는데, 이는 간이 이 시점 사이에 지속적으로 산소 공급을 받았기 때문입니다(그림 5A). 그러나 허혈기 말(T₁₀) 시점의 3RMR 값은 최적 범위에서 벗어난 상태입니다(그림 5A). 이 증가는 산소 탈로 인해 전자 수가 수송 사슬 전체에 쌓이면서 미토콘드리아가 축소된 상태로 이동하고 있음을 나타냅니다. T₁₀에서 산소 흐름이 재개되고; 재관류 기간이 시작됩니다. 재관류 주기(T₁₅)가 끝나면, 산소가 최종 전자 수용체로 재도입되어 ETC의 활성이 회복되면서 3RMR 값은 최적 수준으로 돌아갑니다(그림 5A). 이러한 산소 흐름 변화는 원시 스펙트럼에서도 관찰됩니다. T₀과_{T 15}의 원시 RRS 스펙트럼은 산화 미토콘드리아(그림 6A,C)와 유사한 스펙트럼 특성을 가지며, 예를 들어 1371 ^cm-1에서 스펙트럼 마커 피크가 나타납니다(그림 6D, F). 마찬가지로, T₁₀의 원시 라만 스펙트럼(그림 6B)에서는 1357 ^cm-1에서 스펙트럼 마커 피크가 감소한 RR 마커가 나타납니다(그림 6E). 결론적으로, RRS는 미토콘드리아 산화환원 상태의 변화를 실시간으로 식별하며, 이는 원시 스펙트럼 신호와 미토콘드리아 건강 지표(3RMR) 모두에서 입증됩니다.

RRS는 cIII와 cIV의 산화환원 상태를 기반으로 3RMR 값도 계산할 수 있습니다. 유사한 패턴이 cIII와 cIV 3RMR 값에서도 관찰되었습니다(그림 5B). T₀에서 cIV의 3RMR 값이 완전히 산화되었고, cIII의 최적 범위 내에 3RMR 값이 관찰되었습니다. 이 산화환원 균형은 복합체 간의 생리적 균형으로, 전자가 cIII에서 cIV로 빠르게 산화되기 때문입니다. 허혈이 시작되면 각 복합체별로 3RMR 수치가 증가하는 것이 관찰되었습니다. 허혈기 동안 ETC를 통한 전자의 축적은 cIII와 cIV에 대한 환원 스트레스를 증가시키고, 그 결과 cIII-3RMR과 cIV-3RMR이 증가합니다. 그러나 산소를 재도입하면 두 복합체의 3RMR 값은 다시 최적 수준으로 감소합니다: 완전히 산화된 cIV와 생리적으로 환원된 cIII입니다(그림 5B). 두 복합체의 3RMR 추세는 산소 중단이 전체 ETC에 영향을 미치며, 개별 복합체가 무혈류 허혈에 특히 취약하지 않음을 보여줍니다.

반면, 산소화 역학의 변화는 관류액 분석에서 얻은 손상 바이오마커와 혈액-가스 분석물에는 반영되지 않았습니다. 허혈이 시작되면 세포가 유산소 호흡에 의존하기 시작하면서 젖산과 K⁺ 가 증가할 것으로 예상되며, 세포 간 K⁺를 방출하기 위해 천천히 분해됩니다. 또한 세포가 세포 호흡을 계속할 만큼 충분한 에너지를 생성하지 못하기 때문에 OCR도 감소할 것으로 예상합니다. 혈류가 없는 허혈이 지속된 후에도 산소 소모량은 손상의 징후를 보이지 않았습니다. 산소 공급 변화에도 불구하고 유출 젖산과 K⁺ 수치는 스트레스 시험 전반에 걸쳐 비교적 일정하게 유지됩니다(그림 5D–E).

그림 5: 산소 스트레스 검사 전반에 걸친 3RMR 및 손상 바이오마커의 변화. 허혈 시작과 재관류 기간은 각각 5분과 10분에 점선으로 표시되어 있습니다. 또한, 산소 흐름 기간은 파란 선으로, 허혈 기간은 빨간 선으로 표현됩니다. (A) 미토콘드리아 분석에서 3RMR 값. 산소 유류가 중단되면 3RMR 값이 증가하고, 유속이 재시작되면 다시 최적 수준으로 감소합니다. (B) 복합체 III와 복합체 IV의 3RMR 값. 유동이 멈추면 두 복합체 모두 감소합니다. (C) 스트레스 시험 전반에 걸친 평균 유출 K⁺ 값. 산소 생성 역학이 변함에도 불구하고 K⁺ 값은 스트레스 시험 전반에 걸쳐 일관성을 유지합니다. (D) 스트레스 테스트 전반에 걸친 평균 유출 젖산 수치. 유산염 배출량은 스트레스 테스트 내내 일정하게 유지됩니다. (E) 산소 소비율은_{T 0},_{T 10}, T₁₅입니다. pO₂ 값은 유동 기반 측정이기 때문에, 무유류 허혈 기간에 대해서는 OUR를 계산할 수 없습니다. 유의미한 변화는 관찰되지 않았습니다(p값: 0.2500)(n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: 스트레스 테스트 전반에 걸쳐 신선한 쥐 간의 모범적인 원시 스펙트럼 흔적. (A) 산화 상태, (B) 허혈 상태, (C) 재관류 상태에서의 간의 전체 스펙트럼 프로필. 산소화된 RR 마커에서 감소된 RR 마커로의 이동은 미토콘드리아의 스펙트럼 피크를 확대할 때 볼 수 있으며, 각 스펙트럼 프로필에 빨간 상자가 표시되어 있습니다. (D–F) 산화된 RR 마커 피크(1371 ^cm-1)는 (D) 산화 상태와 (F) 재관류 상태에서 나타나며 빨간 점선으로 표시됩니다. 감소된 RR 마커 피크(1357 ^cm-1)는 (E) 허혈 상태에 나타나며 파란색 점선으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 1: 환원 및 산화된 복합체 III, 복합체 IV, 헤모글로빈, 마이오글로빈의 스펙트럼 흔적. (A) C옴플렉스 III, (B) 복합체 IV, (C) 헤모글로빈, (D) 마이오글로빈. 회귀분석 은 수집된 스펙트럼을 이 스펙트럼 라이브러리(선택 시)와 대조하여 각 라이브러리 스펙트럼에 대해 기록된 스펙트럼에서의 상대적 기여도와 조직 내 상대적 농도에 대한 최적의 적합 추정치를 산출합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: 회귀 라이브러리를 이용해 중첩된 헤메 함유 분자(헤모글로빈 및 산화/환원 미토콘드리아)를 분해한 예시. (A) 세포 관류액으로 관류된 간 조직에서 추출된 원시 스펙트럼 흔적을 선별했으며, 헤모글로빈, 산화 헤모글로빈, 환원 미토콘드리아, 산화 미토콘드리아 등 필요한 모든 회귀 라이브러리가 포함되었습니다. 라이브러리와 회귀분석에서 도출된 최적 적합선은 측정된 신호와 깔끔하게 겹치며, 설명되지 않은 잔여가 거의 없다는 것이 분명합니다. (B) 동일한 조직에서 원시 스펙트럼 흔적을 얻으나, 산화되고 환원된 미토콘드리아 라이브러리만 선택됨. 설명되지 않은 잔류 구조가 크기 때문에, 미토콘드리아 스펙트럼 피크가 회귀분석에 포함되지 않은 헤모글로빈에서 몇 파수 이동한 것이 분명합니다. 이 그림은 고해상도 분광기와 전체 스펙트럼에 대한 회귀 분석이 밀접한 관련 스펙트럼을 구별할 수 있음을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 3: 소프트웨어를 화면에 캡처한 모습. (A) 시간에 따른 측정값을 표시하는 메인 창. 3RMR, StO2 및 기타 선택된 계열은 측정 시 여기에 표시됩니다. 또한, 각 시리즈의 신호 세기는 그래프에 점선으로 표시되고, 화면 오른쪽 아래에 값이 표시됩니다. 예를 들어, 여기서 캡처된 실선은 조직의 3RMR, 점선은 r3RMR(3RMR의 신호 세기)을 나타냅니다. 녹화된 스펙트럼의 품질을 보고 싶으면 보라색으로 동그라미 친 'Show Spectrum 탭'을 클릭할 수 있었습니다. (B) 조직의 원시 스펙트럼을 보여주는 스크린. 이 탭은 측정된 스펙트럼의 세기와 잔류 잡음을 비교하여 신호의 품질을 평가할 수 있는 탭입니다. (C) 실험 전반에 걸친 연속 추세를 보여주는 탭. 예를 들어, 실험 전반에 걸쳐 여러 번의 3RMR 측정을 할 경우, 각 측정값은 이 탭에 시간에 따라 표시됩니다. 다른 시리즈의 트렌드도 선택될 경우 여기에 표시됩니다. 이 탭은 메인 화면의 트렌드 버튼( A에서 초록색으로 동그라미 쳐짐)을 클릭하면 접근할 수 있습니다. (D) 세션 이름과 설명 같은 실험 정보를 입력할 수 있는 정보 탭. (E) 시스템 탭, 미리 로드된 프로토콜을 업로드할 수 있는 탭. 예를 들어, LiverContAcell 프로토콜을 선택하면 이 프로토콜은 쥐 간의 무세포 관류 프로토콜에 따라 회귀 라이브러리, 목표 회귀 창, 시그마를 설정합니다. 프로토콜을 가져오려면 파일에서 설정(Import Settings from File )을 클릭하고 관심 있는 프로토콜을 가져올 수 있습니다. 자신만의 프로토콜을 만들고 싶다면, (F) 회 귀 라이브러리 드롭다운 메뉴에서 필요한 라이브러리를 선택하고, 목표 시그마와 회귀 창, 알람을 조정한 후 왼쪽 하단의 저장 (디스크로 표현됨)을 클릭할 수 있습니다. (F) 플롯 탭으로, 메인 창에 어떤 시리즈를 표시할지 선택할 수 있습니다. 스펙트럼을 재분석할 때 이전 측정값에 더 많은 계수를 추가하고 싶다면, Recal 섹션 아래에서 관심 있는 계열을 선택할 수 있습니다. 재보정(Recal) 과정에서 소프트웨어는 측정된 원시 스펙트럼을 재분석하고 새로 선택된 시리즈의 결과를 표시합니다. 이 탭에서 선택한 시리즈의 신호 세기를 표시할 수도 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

보조 파일 1: 각 품질 관리 지표에 대한 설명.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

본 연구는 휴대용 공명 라만 분광법(Resonance Raman Spectroscopy) 시스템을 사용하여 비침습적이고 실시간으로 매우 민감한 미토콘드리아 건강 상태를 정량화하는 방법을 강조합니다. 이 시스템은 소형 프로브 내 레이저와 광섬유 케이블로 레이저 펌프에 연결된 구조입니다. 이 방법은 441nm 레이저를 사용해 미토콘드리아를 여기시켰으며, 미토콘드리아는 산화 상태에 따라 독특한 스펙트럼 신호를 생성합니다. 따라서 RRS는 미토콘드리아의 각 상태를 스펙트럼 서명을 통해 정량화하고, 회귀분석을 통해 방출된 스펙트럼을 사전에 측정된 스펙트럼 라이브러리와 비교할 수 있습니다. 이후 미토콘드리아 건강 지표가 축소된 미토콘드리아와 전체 미토콘드리아의 비율을 바탕으로 한 감소 공명 라만 미토콘드리아 비율(3RMR)이 만들어졌습니다.

본 논문은 샘플 처리 없이 천연 조직과의 산소 공급에 따른 3RMR의 실시간 변화를 입증하는 데 중점을 둡니다. 이는 산소 스트레스 시험을 통해 달성되었습니다: 5분간 연속 산소 관류 후 관류 흐름을 5분간 멈췄다가 다시 5분간 재시작합니다. 3RMR 측정이 스트레스 테스트 전반에 걸쳐 이루어집니다. 허혈기와 산소 주기를 오가는 스트레스 테스트 모델은 미토콘드리아 산화환원 상태의 연속적인 변화, 그리고 확장해서 미토콘드리아 기능의 변화를 추적할 수 있게 해줍니다. 즉, 산소 스트레스 검사는 산소 함량에 따른 3RMR 추세를 추적할 수 있게 해줍니다. 우리 연구팀은 3RMR 값 증가의 원인을 허혈성 상태와 관류 흐름 교란 때문이라고 보고했으며,_{이는 최종 전자} 수용체로서 산소가 공급되지 않아 ETC를 통과하는 전자가 축적되는 원인입니다. 이 전자의 축적은 축소 상태를 초래하며, 이는 3RMR 값의 증가로 이어집니다. 그러나_O2를 재도입하면 건강한 미토콘드리아는 구조적·기능적 요소가 온전하므로 ETC 활동을 재개하고 생리적 산화환원 상태로 회복할 것으로 예상됩니다.

예상대로, 본 논문에서는 허혈기 내내 3RMR이 실시간으로 연속적으로 증가하는 것이 관찰되었다(그림 5A). 마찬가지로, 3RMR은 재관류 기간 동안 점차 최적 수준으로 돌아갑니다(그림 5A). 이 미토콘드리아 산화환원 상태의 실시간 변화는 스펙트럼 그래프에서도 확인할 수 있는데, 미토콘드리아 피크가 허혈기 동안 산화된 상태(1371 ^cm-1)에서 환원 상태(1357 ^cm-1)로 이동했다가 재관류 종료 시 다시 산화된 상태로 돌아오는 현상입니다(그림 6). 허혈기 동안에도 다른 감소된 RR 마커 피크가 나타납니다. 기존의 미토콘드리아 건강 검사와 달리, 공명 라만은 복합체 III와 복합체 IV의 산화환원 상태를 정량화할 만큼 민감하여, 허혈-재관류 손상이 ETC에 미치는 구체적 영향에 대한 기전적 통찰을 제공해왔다. 건강한 미토콘드리아에서는 전자가 ETC 내 여러 복합물을 통과하며, I에서 시작해 최종 전자 수용체 인_O2에 도달합니다. 산소 흐름이 멈추면 전자가 ETC를 따라 역류하면서 각 복합체가 축소된 상태로 전환될 수 있습니다. 예상대로 허혈 발병 시 cIII와 cIV의 3RMR 값이 실시간으로 증가하는 것이 관찰되었습니다. 이는_O2 부족이 특정 복합체가 아니라 전체 ETC에 영향을 미친다는 것을 나타냅니다(그림 5B). 아래에서 논의할 바와 같이, RRS의 민감성은 상세한 기전 연구를 가능하게 하고 IRI에 대한 표적 치료제 개발에 도움을 줍니다.

전통적으로는 산소가 없는 상태에서 혐기성 대사로 ATP를 생성하기 때문에 허혈성 장기에서 젖산 수치가 높아지는 것으로 기대됩니다. 마찬가지로, 세포막 무결성이 손상되어 세포 간 K⁺가 배출되기 때문에 손상된 장기에서는 K⁺ 수치가 증가할 것으로 예상되었습니다. 마지막으로, 심하게 손상된 세포는 허혈로 인한 대사 노폐물과 ROS에 의해 대사 경로가 영향을 받아 산소 소비가 감소하여 대사율이 낮아질 수 있습니다. 그러나 허혈기 중이나 이후 젖산, K⁺, 산소 소비량에 변화는 관찰되지 않습니다. 실제로 이 값들은 응력 시험 내내 비교적 일정하게 유지되므로 산소 흐름의 정지를 나타내지 않습니다(그림 5B–D). 본질적으로 산소 스트레스 검사를 사용하여 본 연구는 3RMR 값이 허혈-재관류 과정에서 미토콘드리아 산화환원 상태의 변화를 전통적인 손상 바이오마커보다 더 빠르고 실시간, 그리고 더 민감하게 반영함을 보여줍니다(그림 5). 본 연구는 3RMR 역학을 락테이트와 OCR 같은 미토콘드리아 건강의 간접 지표와 비교했으며, NAD+/NADH나 ATP와 같은 직접적인 하위 비교 대상과는 다릅니다. 이 연구는 3RMR 변화를 ATP/NADH 농도와 명시적으로 연관시키지는 않았으나, 이전 연구 ^9,14에서는 3RMR이 이러한 하류 바이오마커 변화를 예측하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, Nguyen 등^은 3시간 온허혈(WI) 간이 낮은 3RMR(<10%)을 가진 간이 1h WI 간(3RMR 값 ~15%)보다 ATP 농도와 NAD/NADH 비율이 유의하게 낮음을 입증했습니다. 또한, Jain 등은 3RMR에 유의한 차이가 없는 그룹에서 NAD+/NADH 비율 또는 EC에서 유의한 차이^{를 발견하지} 못했습니다. 또한 24시간 냉허혈(CI) 간 간 무세포 관류 시 NAD+/NADH 비율과 EC가 세포 관류와 유의하게 차이를 보였으며, 이들 역시 통계적으로 유의미한 3RMR 값을 보였습니다. 이 결과들을 종합해 보면, 미토콘드리아 및 기타 기능 측정의 보다 직접적인 지표 변화를 반영하는 3RMR 값을 나타냅니다.

이 논문은 15분 관류 동안 RRS를 사용하여 시스템의 성능을 입증하지만, 다른 연구들에서도 RRS가 종단적 연구에서 유용함을 입증했습니다. 더 구체적으로, 이전 연구에서 우리는 RRS가 긴 장기 관류에서 전통적인 바이오마커를 보완한다는 것을 입증했으며, 이는 전통적인 방법과 크게 다른 미토콘드리아 건강과 기능에 대한 통찰을 제공합니다. 예를 들어, 연구는 RRS를 활용해 이식 가능(24시간 SCS) 및 비이식(72시간 SCS) 냉허혈성 쥐 간의 생존 가능성을 저뇌 관류 기간 동안 평가^{했습니다.} 두 그룹 모두 초기 산소 반응은 유사했으나, 이식 불가능한 간은 관류로 인해 3RMR이 증가한 반면, 이식 가능한 간의 3RMR은 SNMP를 통해 일관되게 유지되었습니다. 마찬가지로, 72시간 CI 간 간의 칼륨 수치와 전체 체중 증가는 SNMP 전반에 걸쳐 24시간 CI 간보다 더 높았습니다. 이 연구는 RRS가 장기간 관류 기간 동안 전통적인 바이오마커를 보완하는 데 유용함을 입증했습니다. 또 다른 연구에서는 RRS를 이용해 냉허혈(CI) 쥐 간의 재산소화 역학과 대사 회복을 이해했다¹⁴. 우리는 최소 허혈(15분간 냉허혈) 및 24시간 냉허혈 간 관류를 무세포 또는 적혈구 가축 관류(pRBC)로 관류했습니다. 24시간 CI 간에 무세포 관류액을 투여했을 때, pRBC 관류 시에 비해 3RMR이 잠복 감소하는 것을 관찰했습니다. 연구는 3RMR의 지연된 증가를 냉허혈 시 미토콘드리아 사이토크롬에 전자가 축적되어 pRBC 기반 퍼퓨세이트의 풍부한 산소 분자로 빠르게 전달될 수 있기 때문이라고 밝혔습니다. 그러나 다른 손상 지표들과 결합하면, pRBC가 관류된 24시간 CI 간에서 간 손상이 더 심한 것으로 관찰됩니다. 연구는 RRS를 통해 실시간으로 미토콘드리아 산소 공급을 측정하는 것이 미토콘드리아 회복에 대한 통찰을 제공하며, 이는 장기 관류 전략 최적화에 유익할 수 있다고 결론지었습니다. 본질적으로, 이 연구 결과는 전통적인 바이오마커(예: 락테이트, OCR, ATP)와 RRS 기반 미토콘드리아 산화환원 상태 및 산소 생성 역학에 대한 통찰을 통합함으로써 미토콘드리아 회복에 대한 보다 포괄적인 평가를 제공함을 시사합니다.

다른 연구들은 RRS를 ETC⁹의 허혈-재관류 손상을 완화할 수 있는 치료제의 시험대로 사용했습니다. 장기간 허혈 상태에서는 전자가 ETC 내에 축적되어, 특히 재관류 시 다양한 복합물을 통해 전자가 빠져나갈 수 있는 능력이 생깁니다. 허혈-재관류의 함수로서 개별 복합체의 산화환원 상태를 이해하는 것은 손상 위치에 대한 더 깊은 이해를 제공하며, 보다 표적화된 개입의 잠재력을 제공합니다. 예를 들어, 우리 연구팀은 RRS를 활용해 온결허혈성 돼지 간에서 복합체-III 기능 장애에 대한 치료 중재를 개발했습니다. Nguyen 등(2026^)이 수행한 연구에서, 1시간 및 3시간 WI 간을 3시간 동안 SNMP에 투여했습니다. 앞서 언급했듯이, 3시간 WI 간은 ETC 손상으로 인해 과산화와 신진대사 저하를 겪는 것으로 알려져 있습니다. 신선 및 1시간 WI 간 3RMR 값은 관류 전반에 걸쳐 최적 범위 내에 있었으나, 3시간 WI 간 3RMR 값은 지속적으로 감소하여 3시간 시점에 최적 범위(10%) 이하로 떨어지는 것을 관찰했습니다. 또한, 두 그룹 간 cIV의 3RMR 값에 차이가 없으며, 각 그룹에서 cIV가 완전히 산화된 상태였습니다. cIII의 과산화와 cIV에서 관찰된 건강한 산화환원 상태는 복합체 III에서 재관류에 의한 과산화를 나타낸다. 이 지식을 바탕으로 Nyugen 등(2026)⁹은 cIII의 기능 장애를 극복할 수 있는 치료제인 메틸렌 블루(MB)를 선정할 수 있었는데, MB는 cI와 시토크롬 c 사이를 전자 셔틀처럼 작용하여 cIII를 우회하고 전자를 직접 cIV로 전달합니다. 3RMR 결과는 MB가 미토콘드리아에 미치는 치료 효과를 반영하는데, 3시간 WI 간 SNMP 중 3RMR 값이 증가하여 전자가 직접 cIV로 운반되고 간 대사가 재개됨을 반영하였다. MB의 완화 효과는 유출 젖산을 줄이고 산소 소비율을 개선함으로써 입증되었습니다. 본질적으로 RRS의 특이성 덕분에 온열 허혈 이후 미토콘드리아의 필요에 맞춘 치료 경로 개발이 가능했습니다.

이 논문 전반에 걸쳐 우리는 공명 라만 분광법을 미토콘드리아 건강 상태를 측정하는 비침습적이고 실시간 그리고 매우 특이적인 방법으로 제시합니다. 이 연구는 RRS가 조직을 교란하지 않고 미묘한 산화환원 상태를 측정할 수 있음을 보여주며, 이러한 생리적 변화가 후속 영향을 미치기 전에 이를 보여줍니다. 하지만 공명 라만 시스템의 여러 한계점도 주목할 필요가 있습니다. 첫째, RRS는 조직 내에서 공명 증강된 모든 분자를 식별하고 회귀분석에서 설명해야 하며, 각 분자는 상대적 신호 강도를 고려하기 위해 서로 다른 증강 인자를 가집니다. 주어진 파장과 조직에서 모든 구성 요소에 대해 스펙트럼 라이브러리를 만들었지만, 사용자는 관심 있는 각 조직과 파장별로 새로운 라이브러리를 생성하고 검증해야 할 수도 있습니다. 또한 일부 조직은 복잡한 스펙트럼 요소를 가질 수 있어, 낮은 농도의 미토콘드리아 사이토크롬을 측정하기 어려울 수 있습니다. 예를 들어, 돼지나 인간의 간에는 베타카로틴이 있고, 혈액에는 헤모글로빈이 포함되어 있는데, 이들 모두 강한 스펙트럼 신호를 가지고 있어 RRS가 회귀분석에서 고려해야 할 스펙트럼 신호 수를 늘립니다. 마지막으로, 이 측정에 사용되는 441 nm 레이저는 빔 직경 2mm, 관통 깊이가 1 mm 미만입니다. 이러한 국소적이고 표면적인 측정은 장기 내 다른 부위의 산화환원 상태 차이가 간과될 수 있어 샘플링 오차를 촉진할 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 장기 핵심부에서 채취한 생검을 통해 측정을 하거나, 다중 레이저 장비를 통해 더 넓은 표면적에 걸쳐 측정하여 전체 장기 건강에 대한 보다 완전한 이해를 제공할 수 있습니다.

결론적으로, 우리는 공명 라만 분광법이 혈액-가스 분석물에 비해 미토콘드리아 역학의 미묘한 변화에 민감함을 보여준다. 시스템 설정 및 운영에 대한 자세한 설명은 여기에서 제공됩니다. 우리는 RRS의 비침습적이고 매우 특이적이며 실시간 평가 특성을 강조하며, 이를 진단 및 기전적 접근법으로 어떻게 활용할 수 있는지 설명합니다. 또한 미토콘드리아 기능 장애에 대한 특정 치료 경로 개발에 사용됨을 강조합니다. 향후 연구는 RRS 시스템을 적응시켜 생검, 정밀 절단 조직 단편 또는 인간 조직을 포함한 기타 조직 유래 산물(중개 연구를 포함)에서 미토콘드리아 건강을 평가하는 데 집중할 수 있습니다. RRS의 도입은 대사 연구에 강력한 접근법을 제공하며, 전통적인 방법보다 세포 생체에너지 과정에 대한 이해를 더 쉽게 향상시킬 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16 G Catheter	BD Insyte Authoguard	381454	간문맥을 관통하는 데 사용됨
Activated Charcoral	Vet Equip Vapor Guard Activated Charcoal	931401	마취 중 과도한 증기를 필터링하는 데 사용됨
BSA	Sigma-Aldrich	A7906	침윤액 조성
Bubble Trap	Radnoti	130149
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	침윤액 조성
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	침윤액 조성
Masterflex L/S Precision Pump Tubing (24 G)	Fisher Scientific	13-200-292	간을 통해 침윤액을 흐르게 하는 데 사용됨
Masterflex peristaltic pumps	Cole Parmer, Vernon Hill, IL	7528-30	간을 통해 침윤액을 흐르게 하는 데 사용됨
Membrane Oxygenator	Radnoti	130144	침윤액을 산소화하는 데 사용됨.
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	침윤액 조성
RAPIDPoint 500 Blood Gas System	Siemens Healthineers	41115805	혈액 가스 분석을 위해
Resonance Raman System	Pendar Technologies	A4D441	이 제품에 대한 문의는 Pendar Technologies에 문의