방법 논문

인간 유방암 오가노이드 구축 및 독소루비신 유발 DNA 손상의 혜성 분석 기반 정량

64 조회수

⸱

DOI:

10.3791/71299

⸱

2026년 7월 28일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Science, North China University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, 3School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 4Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People's Hospital of Suzhou City, 5Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 인간 유방암 오가노이드(BCO) 모델을 구축하고, 코멧 분석법을 이용해 독소루비신에 의한 DNA 손상을 정량적으로 평가합니다. 혜성 분석법을 BCO에 적용하는 것이 가능함을 입증했으며, BCO에서 DOX 유발 DNA 손상을 감지하기 위한 재현 가능하고 확장 가능하며 운영 가능한 워크플로우가 제공됩니다.

초록

유방암은 전 세계 여성들 사이에서 가장 흔한 악성 종양이며, 상당한 이질성을 보입니다. 독소루비신(DOX)은 유방암 치료에 널리 사용되며, 그 주요 작용 기전은 DNA 이중 가닥 절단을 유도하고 세포 사멸을 유발하는 것입니다. 이 프로토콜에서는 DOX로 인한 DNA 손상을 정량적으로 평가하기 위해 인간 BCO 모델이 구축되었습니다. 원발성 유방암 세포는 기계적 및 효소 해리를 통해 환자 유래 종양 조직에서 분리한 후 3차원 매트릭스에서 배양하여 BCOs를 생성했습니다. 오가노이드는 8 μM DOX로 2시간 처리되었으며, 2시간 후 DNA 손상을 평가하였다. 처리 후, 오가노이드는 단일 세포로 해리되어 저융점의 아가로스에 박혀 알칼리성 조건에서 전기영동을 시행했다. 전기영동 후, DNA 이동 패턴은 형광 현미경 아래에서 혜성 구조로 시각화되었고, OpenComet 소프트웨어를 사용해 꼬리 DNA 비율(% Tail DNA)의 비율을 정량적으로 분석했습니다. 혜성 분석법은 BCO에서 DNA 손상을 성공적으로 탐지했습니다. 대조군과 비교하면, 8 μM DOX에 2시간 동안 노출된 BCO는 오가노이드 해리 및 전기영동 후 길쭉한 혜성 꼬리를 보였습니다. 정량 분석 결과, 처리된 그룹에서 꼬리 DNA 비율이 유의미하게 높았으며, 이는 DNA 손상이 유도되었음을 시사합니다. 이 고민도의 방법은 DOX의 독성학 및 약리역학 연구를 지원하며, 환자 유래 BCO 시스템에서 DNA 손상을 평가할 수 있는 견고한 기술적 플랫폼을 제공합니다.

서론

유방암은 유전적 변화, 호르몬 조절 장애 및 기타 병원성 요인으로 인해 유방 상피 조직에서 발생하는 악성 종양입니다. 전 세계 여성 사이에서 가장 흔한 악성 종양이며, 독특한 역학적 양상과 상당한 종양 내 이질성을 보인다 1,2. 1차 화학요법제인 DOX는 DNA에 삽입되어 토포이소머라제 II 활성을 억제하고 DNA 가닥 절단을 유도하여 궁극적으로 종양 세포에서 세포자멸사를 유발합니다. 전통적인 2차원 세포 배양 시스템은 유방 종양의 복잡한 세포 조직과 이질성을 재현하는 데 한계가 있습니다. 반면, BCO는 환자 종양 조직에서 유래한 3차원 구조로, 원래 종양의 핵심 특성인 세포 구성, 조직 구조, 분자 표현형 등을 유지합니다. 특히 BCO 모델은 임상 약물 반응과 높은 일치성을 보이며; 특정 치료제에 대해 BCO와해당 환자 사이에서는 부정적 반응 일치율이 100%에 도달하고, 긍정적 반응 일치율은 98%에 도달합니다.

BCO는 원발성 종양의 주요 구조적·기능적 특징을 재현하는 고급 시험관 내 모델로서, 종양 발생, 질병 진행,치료 저항성 연구에 널리 적용되어 왔습니다. 유방암에서 종양 발생은 일반적으로 TP53, PTEN, RB1, NF1과 같은 여러 종양 억제 유전자의 협력적 비활성화에 의존하며, 단일 유전자 변형만으로는 정상 유선상피의 악성 변형을 촉진하기에 충분하지 않기 때문입니다. 이 과정에는 세포 극성 상실, 구조적 무질서, 통제되지 않은 증식이 동반된다 6,7,8.

혜성 분석법(단세포 겔 전기영동, SCGE라고도 함)은 단일 세포 수준에서 DNA 손상을 평가하는 고전적인 방법입니다. 이 기법은 1978년 Rydberg와 Johanson에 의해 처음 도입되었고, 이후 Ostling과 Johanson에 의해 개선되어 DNA 이중 가닥 절단을 감지하는 중성 혜성 분석법을 확립했습니다. 1988년, 싱과 동료들은 알칼리성 전기영동 조건을 도입하여 DNA 단일 가닥 절단, 비염기성 부위, 알칼리 불안정성 병변을 검출할 수 있게 하여 분석의적용 범위를 크게 확장했습니다. 혜성 분석법의 기본 원리는 DNA 전기영동 이동도가 DNA 무결성에 의존한다는 것입니다. 아가로스 임베딩과 세포막 및 단백질 제거 용해 후, 손상된 DNA 조각은 전기영동 중 양극 쪽으로 이동하여 '혜성 꼬리'를 형성하고, 온전한 DNA는 적재 부위 근처에 남아 '혜성 머리'를 형성합니다10. 꼬리 길이, 꼬리 DNA 비율(% tail DNA), 올리브 꼬리 모멘트와 같은 매개변수는 DNA 손상의 반정량적 또는 정량적 평가를 가능하게 하며, 시간 실험 설계를 통해 DNA 수리 능력을 평가할 수 있습니다. 높은 민감도, 낮은 샘플 입력 요구, 상대적으로 절차적 단순성 덕분에 혜성 분석법은 유전독성학, 암생물학, 약물 반응 연구에서 널리 활용되어 왔으며, 특히 화학요법 및 방사선 치료에 의해 유발된 DNA 손상, 종양 세포 내성 기전 평가에 활용되고 있습니다. 이 분석법은 실험 조건과 절차적 변동성에 매우 민감하며, 재현성과 실험실 간 비교 가능성은 표준화된 워크플로우와 자동 이미지 분석에 의존합니다11. 최근 몇 년간 고처리량 영상 소프트웨어, 오르가노이드 모델, 유전자 편집 시스템의 도입으로 혜성 분석법의 DNA 손상 및 수리 기전 조사, 종양 치료 반응 평가에 대한 활용도가 더욱 높아졌습니다.

γ-H2AX 면역형광 염색이나 유동세포분석과 같은 전통적인 DNA 손상 분석법과 비교할 때, 코멧 분석법은 단일 세포 수준에서 물리적 DNA 가닥 절단을 직접 정량화할 수 있는 수단을 제공합니다. 이 방법론은 특정 단백질 발현이나 항체 특이성과는 독립적으로 작동하기 때문에, 세포 주기 상태 변화나 DNA 손상 반응 경로의 이상에서 발생하는 거짓 음성 결과를 효과적으로 제거합니다12. 더불어, 기존의 2차원 단일층 배양과 달리, 본 연구에서 사용된 3차원 오가노이드 모델은 생체 내 종양의 복잡한 공간 구조, 세포외 기질 상호작용, 약물 투과 구배를 보다 충실히 재현합니다. 전통적인 세포주 모델이 인공 약물 과노출로 인한 유전독성을 과대평가하는 반면, 오가노이드 플랫폼은 임상 생리학적 조건과 매우 유사한 미세환경에서 DOX 유도 DNA 손상을 평가하여 이 스크리닝 패러다임의 신뢰성과 번역 가치를 크게 향상시킵니다13.

본 연구에서 DNA 손상 평가를 위해 확립된 오가노이드 통합 혜성 분석법의 상당한 장점에도 불구하고, 실제 구현은 샘플 입력과 관련된 여러 기술적 한계와 적용 매개변수를 신중히 고려해야 합니다. 이 프로토콜은 매우 생존 가능한 단일 세포 현탁을 얻기 위해 오가노이드의 철저하지만 부드러운 효소 해리를 요구합니다. 기저막 기질 100 μL당 15,000–20,000개의 원발성 유방암 세포(~200 세포/1 μL)의 씨앗 밀도는 견고한 구체 형성에 필요한 세포 간 파라크린 신호를 유지하면서 과밀도와 급격한 영양 고갈로 인한 중심 괴사를 방지합니다. 치료 창과 관련해서는, 이 검사는 과도한 세포 사멸(>20–30%)을 방지하기 위해 DOX 농도와 노출 시간을 신중하게 조정해야 합니다. 치명성 약물 노출은 진짜 DNA 손상 신호를 흐리게 하고 데이터 해석을 혼란스럽게 하는 '고슴도치' 혜성을 다수 생성한다. 분석의 한계와 관련해, 표준 알칼리성 혜성 분석법의 본질적으로 낮은 처리량 때문에 고처리량 약물 스크리닝에는 적합하지 않습니다. 더불어, 이 기술은 겔 부착 안정성, 알칼리 해제 지속 시간, 전기영동 균일성 등 실험 절차의 엄격한 표준화를 요구하며, 미세한 작동 편차조차도 상당한 전신 오류를 초래할 수 있습니다.

결론적으로, 이 프로토콜은 인간 BCO를 확립하고 혜성 분석법을 적용해 DOX 유도 DNA 손상을 정량화하는 것이 가능함을 입증합니다. 완전히 확립된 BCO에 대해 8 μM DOX 처리 후, 혜성 분석법을 이용해 DNA 손상을 평가하였습니다. 이 접근법은 DOX 유발 DNA 손상을 안정적이고 직접적으로 평가할 수 있게 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

이 연구는 쑤저우 무중인민병원 윤리위원회(승인 번호 20251w03)의 승인을 받았으며, 의학 윤리 기준에 따라 수행되었습니다. 본 연구의 모든 대상자는 서면 동의서를 제공하였습니다.

1. 인간 BCO 제작

  1. 유방암 조직의 운반 및 저장
    1. 즉시 신선하게 절제한 인간 유방암 조직을 미리 냉각된 조직 보존용액(4 °C)에 넣으세요.
      참고: 운송 시 조직이 완전히 잠긴 상태를 유지하세요.
  2. 유방암 조직의 기계적 해리
    1. 모든 절차를 생물안전 캐비닛에서 수행하세요. 유방암 조직을 6cm 배양 접시에 넣고 멸균 메스와 겸자로 보이는 지방 조직을 제거하세요.
    2. 6cm 배양 접시에 3mL의 PBS를 추가하고 조직을 세 번 세척합니다.
    3. 인산염 완충 생리식염수(PBS)를 흡입하여 버립니다.
    4. 1.2.2와 1.2.3 단계를 두 번 더 반복합니다.
    5. 멸균 수술용 가위를 사용해 유방암 조직을 1.5mL 마이크로 원심분리관에 옮기고, 약 2 x 5mm 크기의 작은 조각으로 절단합니다.
  3. 유방암 조직의 효소 소화
    1. 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 1mL의 오가노이드 해리 용액을 추가한 후 현탁액을 15 mL 원심분리관으로 옮깁니다.
    2. 15mL 원심분리관에 추가로 8mL의 오가노이드 해리 용액을 추가합니다.
    3. 15mL 원심분리관을 37°C에서 40분간 배양하세요.
    4. 소화 과정 동안 셰이커에 1분씩 관을 1분씩 흔들어 주세요.
    5. 40분 후에는 15mL 원심분리관에 6mL의 PBS를 추가하여 소화를 종료합니다.
      참고: 효소 작용을 멈추기 위해 소화 혼합물에 PBS를 직접 첨가하세요.
  4. 원발성 유방종양 세포 분리 및 오가노이드 매립
    1. 100 μm 세포 체를 50 mL 원심분리관 위에 올려놓습니다.
    2. 세포 체에 완전 배양 배지 1mL를 추가하세요.
      참고: 기저 배지 500 mL, 태아 소 혈청 50 mL, 페니실린-스트렙토마이신 5 mL를 사용하여 완전한 세포 배양 배지를 준비하세요.
    3. 15mL 원심분리관에서 소화된 조직 현탁액 1mL를 흡입하여 세포 체에 바릅니다.
    4. 1.4.3 단계를 반복하여 서스펜션 전체가 스트레너를 통과할 때까지 반복합니다.
    5. 세포 체를 추가로 1mL의 완전 배양 배양액으로 헹군습니다.
    6. 50 mL 원심분리관을 350 × g에서 4 °C에서 3분간 원심분리합니다.
    7. 흡인하고 상정액을 버리세요.
    8. 세포 펠릿을 1mL의 완전 세포 배양지에 재현탁한 후 1.5mL 미세원심분리관으로 옮깁니다.
    9. 370 × g에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
    10. 흡인하고 상정액을 버리세요.
    11. 1.5mL 마이크로 원심분리관에 기저막 매트릭스 100 μL을 추가하고 완전히 혼합합니다.
      참고: 기저막 기질 100 μL당 15,000–20,000개의 원발 유방암 세포를 시딩 밀도로 유지하세요(200 세포/1 μL). 이로 인해 세포 간 파라크린 신호 전달이 유지되어 견고한 구체 형성을 돕고 중추 괴사를 예방합니다.
    12. 24웰 플레이트의 각 웰에 25μL의 저저막 기질-세포 혼합물을 분사합니다.
    13. 24웰 플레이트를 뒤집어 37°C에서 10분간 배큐하여 저저막 매트릭스 중합을 허용합니다.
    14. 24웰 플레이트의 각 웰에 500 μL BCO 배양지를 추가합니다.
      참고: 독점 제형을 사용하는 상업용 즉시 사용 배양지를 사용하는 BCO는
    15. 플레이트를 37°C의 가습 인큐베이터에 5% CO₂와 함께 배양하세요.
      참고: 세포외 기질에 씨앗을 심은 후, BCO는 적절한 3D 구조 발달을 위해 7–10일간 배양되었습니다. 오가노이드는 밀도가 높고 구형인 3D 형태를 보였으며 평균 직경이 약 50–100 μm에 달하며 중심성 괴사 징후가 없을 때 완전히 확립되어 약물 치료 준비가 된 것으로 간주되었습니다. 이 평가 기준이 충족된 후, BCO들은 이후 DOX 치료를 받았습니다.

2. 혜성 분석법을 이용한 BCO에서 DOX 유발 DNA 손상 검출

실험 프로토콜은 확립된 지침을 바탕으로 조정되었으며, 특정 실험실 조건에 맞게 더욱 최적화되었습니다14.

주의: 모든 DOX 취급 절차—건조 분말 무게 측정, 재고 용액 준비, 작업 용액의 연속 희석—은 인증된 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛 또는 화학 연기 후드 내에서 수행되어야 합니다. 개방형 실험실 작업대에서는 어떤 조작도 엄격히 피하세요. 모든 시술 기간 동안 이중 니트릴 장갑을 착용하고 약물을 빛으로부터 보호하세요. 마지막으로, 모든 DOX 오염 소모품(예: 피펫 팁 및 미세원심분리관)을 '세포독성 폐기물'로 엄격히 분리하여 특수 폐기용으로 처리합니다; 이 물품들을 일상적인 생물학적 위험 폐기물과 절대 섞지 마세요.

  1. BCO의 DOX 치료
    1. 사용한 배양지를 흡입하고 버리세요.
    2. 각 웰에 500μL 신선한 BCO 배양액을 첨가합니다
    3. 각 웰에서 매질을 4μL씩 제거하여 버립니다
    4. 각 웰에 1 mM DOX 스톡 용액 4 μL을 추가합니다.
      참고: 최종 작업 농도인 8 μM을 설정하려면 표준 희석 방정식을 사용하여 필요한 재고 부피를 결정합니다: C1V1 = C2V2. 여기서 C1 은 초기 DOX 재고 농도(1 mM), C2 는 목표 농도(8 μM), V2 는 최종 웰 부피(500 μL)를 나타냅니다. V1 을 풀면 4 μL가 나옵니다. 따라서 프로토콜은 웰당 나머지 496 μL 배양지에 1 mM DOX 스톡 4 μL을 첨가한 후, 균질한 분포를 위해 철저히 혼합하는 것을 요구합니다.
    5. 플레이트를 5% CO₂를 넣은 37°C 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하세요.
  2. BCO의 해리
    1. 24웰 플레이트에서 BCO 배양 배지를 흡입하고 폐기합니다.
    2. 각 웰에 500 μL 오가노이드 해리 용액을 추가합니다.
    3. 피펫을 반복해서 위아래로 움직여 기저막 매트릭스와 오가노이드 구조를 완전히 파괴하세요.
    4. 플레이트를 37°C에서 5% CO₂와 함께 10분간 배양하세요.
    5. 각 웰에서 생성된 현탁액 500 μL를 15 mL 원심분리관에 옮깁니다.
    6. 350 × g에서 4°C에서 3분간 현상액을 원심분리합니다.
    7. 흡인하고 상정액을 버리세요.
    8. 15mL 원심분리관에 완전 배양지 1mL를 추가하여 세포 펠릿을 재현탁시키고, 그 결과 현탁액을 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
    9. 350 × g에서 4°C에서 3분간 현상액을 원심분리합니다.
    10. 흡인하고 상정액을 버리세요.
      참고: 원심분리 후 오가노이드 펠릿은 원심분리기 튜브 내에 남아 있습니다.
  3. 세포 재현탁 및 아가로스 임베딩
    1. 금속 가열 블록을 95 °C로 예열하세요.
    2. 저녹는점(LMP) 아가로스 1mL를 금속 가열 블록에 넣고 10분간 배양하여 완전히 녹이도록 합니다.
    3. 100 μL 용융된 0.5% 저녹점아가로스를 1.5mL 마이크로 원심분리관에 피펫 흡입하여 BCO를 포함합니다.
    4. 즉시 샘플을 37°C 수조에 옮기고 10분간 평형을 유지합니다.
    5. 충분히 혼합한 후 즉시 50 μL 세포-아가로스 현탁액을 현미경 슬라이드에 피펫팅합니다.
  4. 세포 용해와 DNA 해소
    1. 슬라이드를 냉용융액에 담그고 4°C에서 어두운 곳에서 12시간 배양합니다.
    2. 용액에서 슬라이드를 제거하고 즉시 알칼리성 이완용액에 담가세요.
      참고: 알칼리성 이완액을 준비하기 위해, 4.975 mL의 초순수수에 0.6 g의 NaOH를 용해한 후 200 mM EDTA 250 μL를 첨가합니다. 알칼리성 전기영동 완충제를 준비하기 위해, 12g의 NaOH를 995mL의 초순수수에 녹인 후, 5mL의 200 mM EDTA를 첨가합니다.
      주의: 혜성 분석 완충제 내 NaOH는 매우 부식성이 강한 강한 기반으로, 심각한 피부 및 안구 화상을 일으킬 수 있습니다. 용액 준비 중에는 고체 NaOH 펠릿을 천천히, 점진적으로, 그리고 연속적인 자기 교반 하에 물에 첨가합니다. 건조한 펠릿에 직접 물을 붓지 마세요. 격렬한 발열 반응으로 인해 부식성 액체가 끓어 튀게 됩니다. 또한, 모든 건조 분말은 화학 연기 후드에서만 처리하여 부식성 먼지 흡입을 방지하세요.
    3. 슬라이드를 용해액에 담근 후 4°C에서 어두운 환경에서 1시간 배양합니다.
  5. 전기영동
    1. 알칼리성 해제 용액에서 전기영동실로 슬라이드를 옮깁니다.
    2. 슬라이드가 완전히 잠기도록 전기영동 탱크에 알칼리성 전기영동 완충제 1L을 추가하세요.
    3. 25 V와 300 mA에서 30분 동안 전기영동을 수행하세요.
  6. 슬라이드 세척 및 고정
    1. 슬라이드를 70% 에탄올 5mL에 담근 후 실온에서 5분간 배양합니다.
      참고: 에탄올은 심각한 인화성 위험을 지닙니다. 대용량 제제나 조직 탈수를 수행할 때는 실험 환경에서 강한 환기를 유지하세요. 모든 점화원, 예를 들어 알코올 버너와 정전기 불꽃을 포함한 모든 점화원으로부터 작업 구역을 엄격히 격리하십시오. 사용 후에는 즉시 시약 용기를 밀봉하고 전용 방폭성 보관함에 안전하게 보관하세요.
    2. 슬라이드를 37°C 인큐베이터에 넣고 15분간 말리세요.
  7. DNA 염색 및 영상
    1. 10mL의 초순수수에 1μL 핵산 형광 염색액을 첨가합니다.
      주의: 이러한 핵산 삽입제는 잠재적인 돌연변이 유발 물질로 간주하고 엄격히 주의하여 다루십시오. 일상 작업 공간에서 교차 오염을 방지하기 위해 전용 피펫이 설치된 '핵산 염색 구역'을 설치하세요. 용융 아가로스에 염료를 보조할 경우, 유해하고 염료가 포함된 증기 흡입을 방지하기 위해 젤을 약 60°C까지 식혀 첨가하세요. 마지막으로, 사용한 염색액과 폐기물 젤은 지정된 핵산 위험 용기에만 엄격히 버리세요.
    2. 슬라이드를 2.7.1단계에서 준비한 염색액에 담근 후 실온에서 어두운 상태에서 30분간 배양합니다.
    3. 5mL 초순수수로 5분간 한 번 세척하세요.
    4. 슬라이드를 37°C 인큐베이터에서 15분간 자연 건조하세요.
    5. 녹색 여기 필터가 장착된 형광 현미경을 사용해 혜성 구조를 시각화하고 적색 형광을 감지합니다.

3. 데이터 처리

  1. 피지(공식 배포)에서 OpenComet 플러그인을 사용해 혜성 분석법 이미지를 자동 정량 분석하여 DNA 손상 관련 파라미터를 얻습니다.
    참고: 통계 분석과 관련해, 이 작업은 형태가 온전하고 겹치지 않는 고해상도, 명확하게 촬영된 혜성만을 엄격히 포함했습니다. 반대로, 선별 프로토콜은 머리가 축소되고 꼬리가 넓어 심각한 세포자사멸사나 괴사를 나타내는 '고슴도치' 또는 '유령' 혜성뿐만 아니라 가장자리가 흐릿해지거나 세포 군집, 배경 인공물이 있는 이미지도 제외했습니다.
    1. 피지 소프트웨어를 열어 보세요(보조 그림 1A).
    2. 메뉴 바에서 플러그인을 클릭하세요(보조 그림 1A).
    3. OpenComet을 선택하세요 (보조 그림 1B).
    4. 입력 파일 아래에서 탐색을 클릭하고 분석을 위해 혜성 분석 이미지를 선택하세요(보조 그림 1C).
    5. 출력 디렉터리 아래에서 탐색을 클릭하고 출력 파일의 목적지 폴더를 정의하세요 (보조 그림 1C).
    6. 자동 분석을 시작하려면 실행을 클릭하세요(보조 그림 1C). 이 단계는 데이터 처리 및 분석 워크플로우를 마무리합니다.
      참고: 각 실험군에 대해 본 연구는 최소 50개 이상의 무작위 세포에서 꼬리 DNA(꼬리 DNA)의 비율을 정량화하였습니다. 이후 통계 분석에서는 일방향 분산분석(ANOVA)을 사용해 그룹 평균을 비교했으며, p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

BCO의 설립

이 연구는 1차 종양 조직 표본에서 유방암 오가노이드를 성공적으로 확립하였습니다. 배양 초기 단계에서는 다수의 단일 세포 또는 작은 세포 군집이 명확히 관찰되었으며, 세포들은 비교적 분산되어 있고 명확한 3차원 구형 조직이 없었다. 일부 세포는 둥글거나 거의 둥근 형태를 보였는데, 이는 종양 유래 세포가 생존하고 세포외 기질에 적응했지만 아직 안정적인 오가노이드 구조를 확립하지 않았음을 나타냅니다(그림 1A–C).

24일간의 배양 기간 동안 BCO 내에 세포 밀도가 증가하는 영역이 나타나 뚜렷한 세포 성장 상태가 공존함을 나타냈다(그림 1D).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

혜성 검사는 유전독성 평가 방법의 중요한 진보를 나타냅니다. 단일 세포 해상도와 전기영동 이동에 기반한 DNA 손상 패턴의 직접적인 시각화 덕분에, 이 기술은 기존 유전독성 검사에 비해 명확한 장점을 제공합니다15.

실험 절차 중 여러 중요한 단계가 재현성과 데이터 해석에 영향을 미칩니다. 첫째, 분해 조건과 용해 기간은 배치 간 변동성을 최소화하기 위해 일관성을 유지해야 합니다. 원발성 유방암 세포를 다룰 때는 추가 DNA 손상을 막기 위해 빛 노출을 피해야 합니다. 아가로스 젤은 슬라이드 부위를 완전히 덮고 수평을 유지하여 젤 박리를 방지해야 합니다. 저빙 아가로스는 조기 굳음을 피하기 위해 얼음에서 다루는 것이 좋습니다. 오가노이드 크기와 세포 해리 효율의 변동성은 전기영동 이동과 신호 해석에 영향을 미칠 수 있습니다; 샘플 준비 중에는 엄격한 통제가 필요합니다.

...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 장쑤성 분자 표적 치료 및 종양학 동반 진단 공학연구센터 프로젝트(SGK2202319), 장쑤 고등교육기관 과학기술 혁신연구팀(2021), 장쑤 직업대학 공학기술연구센터 프로그램(2023), 중국 장쑤 고등교육기관 자연과학 핵심재단(보조금 번호 24KJA310008)의 지원을 받았습니다. 쑤저우 직업보건대학(szwzy202406) 주요 프로그램, 수저우대학교 국가 방사선 의학 및 보호 중점연구소 프로젝트(번호: GZK1202506), 동우 건강 인재 프로그램(DWWS2024002, DWWS2025009, DWWS2025013)입니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100 μm cell strainerBIOLOGIX15-1100
15 mL 원심분리기 튜브BIOFILNone15 mL 원심분리기 튜브
1 mL 피펫 팁Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808633
200 μL 피펫 팁Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808214
24웰 플레이트Corning Incorporated3524
50 mL 원심분리기 튜브BIOFILNone50 mL 원심분리기 튜브
Breast Cancer Organoid Kit PlusMogenel Biotechnology MA-0807T011LPBCO 배양 배지
Comet SlideR&D SYSTEMS4250-050-03
건식 온도 조절기Hangzhou Ruiyi Science and Technology Trading Co., Ltd.DH100-2가열 블록
Dulbecco’s Modified Eagle MediumgibcoC11995500BT완전한 세포 배양 배지
EDTATREVIGEN4250-050-04
전기 일정 온도 수조Shanghai Mulang Instrument Manufacturing Co., Ltd.MSY-24수조
전기영동 장치BIO-RAD1645052
태아 우 혈청EallBio03.U16001DC
형광 현미경WEIDAIM-300LD4
포스셉BeyotimeFS019
GelRedBeyotimeD0140
GraphPad Prism 8.0GraphPad Software통계 분석 소프트웨어
ImageJNational Institutes of Health, NIH1.54p이미지 처리 소프트웨어 / 이미지
LMA garoseR&D SYSTEMS4250-050-02저용점 아가로스 
저온 고속 원심분리기Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTDKDC-40원심분리기
용해 용액TREVIGEN4250-050-01용해 용액
MatrigelMogenel Biotechnology82755기저막 기질
NaOHDAMAO1588
OpenComet 소프트웨어Open-source ImageJ 플러그인, 싱가포르 국립 대학교, 싱가포르v1.3.1
Organoid 분리 용액Mogenel BiotechnologyMB-0818L01L
페니실린 – 스트렙토마이신BeyotimeCO22
인산 완충액(1x PBS)Fdbio Science Biotech Co.,LtdFD7032PBS
피펫RaininPipet-Lite XLS
가위BeyotimeFS001
조직 소화 용액Mogenel BiotechnologyMB-0818L06L/MB-0818L06S오가노이드 분리 용액
```

참고문헌

  1. Xiong X, Zheng LW, Ding Y, Chen YF, Cai YW, Wang LP, et al. Breast cancer: pathogenesis and treatments. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):49.
  2. Giaquinto AN, Sung H, Newman LA, Freedman RA, Smith RA, Star J, et al. Breast cancer statistics 2024. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2024;74(6):477-95.
  3. Kciuk M, Gielecińska A, Mujwar S, Kołat D, Kałuzińska-Kołat Ż, Celik I, et al. Doxorubicin—An Agent with Multiple Mechanisms of Anticancer Activity. Cells. 2023;12(4):659.
  4. Glibetic N, Bowman S, Skaggs T, Weichhaus M. The Use of Patient-Derived Organoids in the Study of Molecular Metabolic Adaptation in Breast Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 2024;25(19):10503.
  5. Leung D, Kaur J, Richardson G, Jardé T. Breast cancer organoids: Advancements and applications in precision medicine. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2025;214:104914.
  6. Nik-Zainal S, Davies H, Staaf J, Ramakrishna M, Glodzik D, Zou X, et al. Landscape of somatic mutations in 560 breast cancer whole-genome sequences. Nature. 2016;534(7605):47-54.
  7. Hua Z, White J, Zhou J. Cancer stem cells in TNBC. Semin Cancer Biol. 2022;82:26-34.
  8. Neal JT, Li X, Zhu J, Giangarra V, Grzeskowiak CL, Ju J, et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 2018;175(7):1972-88.e16.
  9. He X, Chen F, Zhou L, Sun Y, Liu Q, Chen W, et al. The comet assay: A contemporary approach for detecting genomic instability. DNA Repair (Amst). 2025;154:103899.
  10. Ladeira C, Moller P, Giovannelli L, Gajski G, Haveric A, Bankoglu EE, et al. The Comet Assay as a Tool in Human Biomonitoring Studies of Environmental and Occupational Exposure to Chemicals-A Systematic Scoping Review. Toxics. 2024;12(4):270.
  11. Moller P, Gajski G, Geric M, Giovannelli L, Azqueta A, Haveric A, et al. The comet assay as a tool in human biomonitoring studies: Effects of confounding factors. Mutat Res Rev Mutat Res. 2025;796:108566.
  12. Collins A, Moller P, Gajski G, Vodenkova S, Abdulwahed A, Anderson D, et al. Measuring DNA modifications with the comet assay: a compendium of protocols. Nat Protoc. 2023;18(3):929-89.
  13. Caipa Garcia AL, Phillips DH. Organoids for Genotoxicity Assessment. Methods Mol Biol. 2026;2986:491-510.
  14. Cardoso R, Dusinska M, Collins A, et al. In vivo mammalian alkaline comet assay: method adapted for genotoxicity assessment of nanomaterials. Front Toxicol. 2022;4:903896.
  15. Kyrylenko S, Chorna I, Klishchova Z, Yanko I, Roshchupkin A, Deineka V, et al. Elucidation of Potential Genotoxicity of MXenes Using a DNA Comet Assay. ACS Applied Bio Materials. 2024;7(12):8351-66.
  16. Rodrigues D, Coyle L, Fuzi B, Ferreira S, Jo H, Herpers B, et al. Unravelling Mechanisms of Doxorubicin-Induced Toxicity in 3D Human Intestinal Organoids. Int J Mol Sci. 2022;23(3):1286.
  17. Bankoglu EE, Schuele C, Stopper H. Cell survival after DNA damage in the comet assay. Arch Toxicol. 2021;95(12):3803-13.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

233233

관련 논문