애기장대 뿌리의 핵 형태와 염색질 역학의 정량적 생세포 영상화 및 발달 및 환경 스트레스 중

Summary

이 과정은 공초점 현미경과 형광 표지된 핵 및 염색질 마커 라인을 결합하여 애 기장대 뿌리의 핵과 염색질 역학을 동시에 기록하고, 발달 및 환경 신호에 반응하여 이러한 역학 변화를 조사 합니다.

Abstract

핵은 진핵생물의 특징적인 소기관입니다. 고전적인 교과서적 정적 핵 관점과 달리, 핵 형태는 살아있는 세포에서 역동적입니다. 변형되거나 변형된 핵 형태는 동물 세포의 암과 식물의 환경 스트레스의 특징입니다. 핵 외피 단백질은 유전자 발현을 조절하기 위해 크로마틴과 상호작용합니다. 안타깝게도 비생물적 스트레스가 핵 형태, 이동, 크로마틴 역학에 미치는 영향에 대해서는 거의 알려진 바가 없습니다. 이 문제에 대응하기 위해, 우리는 공초점 현미경과 입자 추적 소프트웨어를 이용해 통제 및 비생물적 스트레스 상태에서 애기장대 뿌리의 핵 및 염색질 역학을 정량화하는 파이프라인을 개발했습니다. 이 공초점 영상 기법은 핵 외피 단백질과 크로마틴이라는 이중 형광 표지 마커 라인을 사용하여 모델 식물 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 뿌리를 방제 및 염분 스트레스 조건에서 살아있는 세포 영상으로 수행합니다. 이 촬영된 영상들은 TrackMate 플러그인의 도움을 받아 오픈소스 이미지 처리 소프트웨어 Fiji/J를 사용해 핵 및 염색질 역학을 정량화하기 위해 분석됩니다. 이 방법을 검증하기 위해 우리는 대조군과 염분 스트레스 뿌리에서 크로마틴 이동을 영상화하고 정량화하여, 염분 스트레스 조건에서 크로마틴 속도가 감소함을 밝혔습니다. 이 방법은 식물 발달 및 환경 스트레스 중 뿌리 핵 형태와 크로마틴 역학을 정량적으로 생세포 영상으로 촬영할 수 있게 하여, 비생물적 스트레스 요인에 의해 발생하는 핵 및 크로마틴 역학 변화를 분석할 수 있게 합니다.

Introduction

핵 모양은 세포 유형에 따라 다르며, 발달 과정에서 애기장대(Arabidopsis thaliana ^roots)에서 달라집니다. 예를 들어, 핵 형태는 분열체를 적극적으로 나누는 영역에서 구형입니다. 분열조직 영역과 달리, 뿌리 전이 및 신장 영역의 핵은 덜 구형이다. 더 나아가, 뿌리털과 같은 분화된 세포 내 핵은 단단한 뿌리털 기저를 통과하여 길게 뻗은 핵 ^3,4,5로 활발히 변환됩니다. 핵 형태와 움직임의 동적 변화는 세포 ^6,7의 기능에 매우 중요합니다. 핵 형태의 결함은 핵 운동 감소와 같은 기능 장애를 초래합니다 ^1,3. 포유류 세포에서 세포 및 핵 형태 변화는 유전자 발현 및 단백질 합성 변화와 직접적으로 연관되어 있습니다⁸.

간기 동안 세포의 DNA는 염색질로 조직됩니다. 크로마틴 내 DNA는 히스톤 주위에 뭉치고 있어, 이로 인해 DNA가 조이거나 느슨해지면서 발현이 변할 수 있습니다. 마찬가지로, 염색질의 핵 외피 상대적 위치와 핵 말초와의 근접성도 유전자 발현⁹에 중요합니다. 삼투압 스트레스와 같은 환경 스트레스는 핵 형태를 변화시키고, 결과적으로 A. thaliana 뿌리¹⁰의 촉각 민감 유전자 발현을 변화시킵니다. 이와 관련해, 생세포 타임랩스 영상을 통해 핵 형태와 크로마틴 역학을 연구하는 것이 중요합니다. 핵 역학의 주요 측면 중 하나는 핵 이동 속도로, 세포 내 핵 위치가 유전자 발현을 결정하고, 핵 재배치는 핵 이동¹¹을 필요로 합니다. 핵 내 염색질 이동 속도도 중요하며, 유전자 발현 결정에 중요한 유전자 위치¹².

이전에는 핵 형태와 크로마틴 역학이 별도로 영상 촬영 및 정량화되었으며; 그 결과 핵 형태와 크로마틴 역학 간의 관계는 여전히 탐구되지 않았습니다. 핵과 염색질을 동시에 촬영하면 이들의 서로 상대적인 위치를 관찰할 수 있으며, 이는 입증하기 어렵거나 불가능한 핵 회전 및 핵 내 크로마틴 이동과 같은 움직임을 드러낼 수 있습니다. 이 방법에서는 형광 표지 외핵 외피 단백질 WPP 도메인 상호작용 단백질 1(WIP1)¹³ 과 중심 히스톤 H3(CENH3)¹⁴ 역학을 통한 크로마틴을 이용한 핵 형태를 시각화하고 정량화하는 라이브 세포 영상 기법을 제시하여, 비생물적 스트레스 요인에 의해 발생하는 핵 및 염색질 역학 변화를 분석하는 것을 목표로 합니다. 이 방법을 가능하게 하기 위해 A. thaliana의 WIP1-GFP/CENH3-mRFP 계통을 생성하였습니다. 또한, 오픈소스 ImageJ/Fiji 소프트웨어의 TrackMate 플러그인을 사용하여 크로마틴 역학을 정량적으로 연구했습니다. 우리는 여기서 제시된 이중 형광선과 크로마틴 역학 기법을 염분 스트레스 조건에서 시험했고, 응력 조건에 의해 중심체 초점의 형태와 역학에 변화가 있음을 발견하였습니다. 이 간단하고 재현 가능한 방법은 다양한 비생물적 스트레스 조건 하에서 애기장대 뿌리의 핵 및 크로마틴 역학을 고처리량으로 추적하는 데 이상적입니다.

Protocol

1. A. thaliana 묘목의 성장

1. 성장 배지 준비
   1. 1L 비커에 순수 800mL를 넣어 저어주는 접시 위에 올려놓으세요. 비커에 교반봉을 추가하세요.
   2. 600rpm에서 교반판을 켜세요.
   3. 비커에 자당 10g을 넣으세요.
   4. 비커에 무라시게와 스쿠그(MS) 성장 배지 2.16g을 추가하세요.
   5. 각 1L 매지 병 두 개에 5mg의 한천을 추가하세요.
   6. 한 병에는 "1/2 MS", 다른 병에는 "100 mM NaCl"이라고 라벨을 붙이세요.
   7. 병뚜껑 양쪽에 오토클레이브 테이프로 라벨을 붙이세요.
   8. "100 mM NaCl"이라고 적힌 병에 5.84g의 NaCl을 추가하세요.
   9. 비커에 순수한 물 1리터를 채우세요.
   10. 비커를 다시 교반판에 넣고 자당과 MS가 녹을 때까지 기다립니다.
   11. 비커 내용물을 1리터 눈금이 된 실린더에 부어주세요.
   12. 각 병에 눈금화된 실린더 내용물 500mL를 부어줍니다.
   13. 오토클레이브 성장 배지와 250mL 순수한 물, 121 °C에서 60분 액체 사이클을 사용했습니다.
       참고: 오토클레이빙 매체와 물을 사용할 때는 폭발 가능성을 방지하기 위해 뚜껑을 느슨하게 유지해야 합니다.
   14. 성장 매체 뚜껑을 다시 나사로 고정하세요.
   15. 한천이 완전히 분배되도록 성장 배지 병을 7번 뒤집어 사용하세요.
   16. 필요할 때까지 4°C 냉장고에 재배지를 보관한 후 전자레인지로 액체 상태로 만듭니다.
2. 성장판과 씨앗 설치
   1. 플로우 후드에서는 피펫 건을 사용해 10개의 플레이트 각각에 50mL의 성장 배지를 피펫팅합니다(그림 1A).
   2. 배지가 굳어지는 동안, 70% 에탄올 1mL를 마이크로 원심분리기 튜브에 10분간 붓고 씨앗을 세척하여 정화합니다(그림 1B).
      참고: 에탄올을 다룰 때는 주변에 열린 불꽃이 없는지 확인하세요.
   3. 10분 후 플로우 후드에서 에탄올을 제거하고 씨앗을 1mL의 오토클레이드 물로 두 번 헹군습니다(그림 1C).
   4. 배지가 굳으면 1000 μL 피펫을 사용해 세척된 씨앗을 성장판에 14개의 씨앗씩 두 줄로 배치합니다(그림 1D).
   5. 유동 후드를 떠나기 전에 영구 마커로 플레이트를 라벨링하고 마이크로포어 테이프로 밀봉하세요(그림 1E).
3. 발아 중인 묘목
   1. 성장판을 알루미늄 호일로 감싸고 최소 2일간 4°C 냉장고에서 냉층화하세요(그림 1F).
   2. 냉층화 후에는 냉장고에서 플레이트를 꺼내 성장 조명(~80 μmol/^{m 2}/s) 아래 수직으로 최소 4일간 두세요(그림 1G).
   3. 플레이트의 절반을 플로우 후드에서 100 mM NaCl 성장 배지로 옮긴 후 플레이트를 밀봉하고 라벨링합니다(그림 1H).
   4. 영상 촬영 전 2일간 성장 플레이트를 성장등에 두세요(그림 1I).

2. A. thaliana 뿌리 핵과 염색질의 생세포 영상

1. 슬라이드 준비
   1. 순수 60 μL의 피펫을 유리 슬라이드에 주입합니다(그림 2A).
   2. 6일 된 A. thaliana 묘목 뿌리 3개를 물에 눕히세요(그림 2B).
   3. 잎을 덮지 않고 뿌리 위에 22mm × #1.5 슬라이드 커버를 덮으세요(그림 2C).
2. 공초점 현미경 설정
   1. 레이저 노출 시간을 1000ms(1초)로 설정하세요.
   2. 레이저 결합기에서는 488nm 레이저를 녹색 형광 단백질(GFP)에 50%, 561nm 레이저를 50%로 적색 형광 단백질(RFP)으로 설정합니다(그림 2D). 광학 줌 없이 20× 대물렌즈로 촬영한 이미지. 10분 이상 녹화할 경우, 광표백을 줄이기 위해 강도를 낮추세요.
   3. Z-슬라이스 스텝 크기를 0.3 μm으로 설정하세요.
   4. 간격을 1분, 총 시간을 10분으로 설정하세요.
3. 영상
   1. 루트를 찾아 최대 20개의 z-슬라이스를 선택하여 16비트 이미지를 캡처할 수 있습니다.
   2. 타임랩스 시작.
   3. 타임랩스를 무손실 압축으로 TIFF 파일로 저장하세요.
   4. 분석을 위해 데이터를 컴퓨터로 옮기세요.

3. 데이터 추적 및 분석

참고: TrackMate가 미리 설치된 오픈소스 소프트웨어 ImageJ(버전 1.54 권장)의 피지 버전이 필요합니다.

1. 초기화
   1. 오픈 이미지J/피지.
   2. .vsi 파일을 클릭해 메인 ImageJ/Fiji 애플리케이션 창(그림 3A)으로 드래그하세요.
   3. '바이오 포맷 가져오기 옵션'이라는 제목의 프롬프트가 나타납니다; 오른쪽 하단(그림 3B)에서 '확인'을 클릭하세요.
   4. '바이오 포맷 시리즈 옵션'이라는 프롬프트가 나타납니다. 시리즈 1이 선택되었는지 확인하고 왼쪽 하단(그림 3C)에서 확인 버튼을 클릭하세요.
      참고: 파일이 여러 Z층이나 시간점이 많은 경우 로딩에 1분이 걸릴 수 있습니다.
   5. 이미지가 열리면(그림 3D), 메인 ImageJ 창에서 Image > 색상 > 채널 분할 로 이동하여 신호를 분할합니다(그림 3E). 이로 인해 GFP 표지된 핵과 RFP 표지된 크로마틴을 위한 각각 창이 생성됩니다(그림 3F).
2. 크로마틴 전처리
   1. 두 창 중 어느 쪽이 크로마틴에 해당하는지 결정하세요.
   2. 크로마틴 창(그림 3F)을 클릭한 후 메인 ImageJ 창에서 Z 프로젝트 > > 스택을 이미지로 표시하여 Z 프로젝트 연산을 적용하세요(그림 4A).
   3. 투영 유형을 최대 강도 로 바꾸고 모든 시간 프레임이 활성화되어 있는지 확인한 후 확인 (그림 4B)을 클릭하세요.
   4. Ctrl+Shift+C를 누르거나 메인 ImageJ 창에서 이미지를 > 밝기/명암 조정을 > 클릭하여 명암 메뉴를 열어보세요(그림 4C).
   5. 두 번째 막대( 최대 표시)를 왼쪽으로 밀어 크로마틴이 쉽게 보일 때까지 합니다(그림 4D).
3. 추적 크로마틴
   1. 플러그인으로 이동하세요(그림 5A).
   2. 플러그인 메뉴에서 아래 화살표를 클릭하면 트래킹 옵션(그림 5A)으로 스크롤됩니다.
   3. 트래킹을 클릭한 다음, TrackMate를 클릭하세요.
   4. 초기 설정이 나타납니다. 보정 설정이 정확한지 확인한 후 다음을 클릭하세요(그림 5B).
   5. 임계값 검출기를 선택하고 다음(그림 5C)을 클릭하세요.
   6. 이미지 창에서 타임랩스의 마지막 프레임으로 이동하세요(그림 5D).
   7. 강도 임계값 옆에서 Auto를 클릭한 다음 Preview를 클릭하세요.
   8. 강도 임계값을 조정하고 미리보기를 클릭하세요. 임계값을 반복해서 조정하고 미리보기하여 미리보기에 모든 염색질이 포함되고 노이즈가 최소화될 때까지 반복한 후 다음을 클릭하세요(그림 5D).
   9. 초기 임계값 감지가 이루어지며; 다음 (그림 5E)을 클릭하세요.
   10. 수동으로 임계값을 조정하여 크로마틴만 보이게 한 후 다음을 클릭하세요 (그림 5F).
   11. 이 페이지는 스팟 필터링을 지원합니다. 이 부분은 무시하고 다음 (그림 6A)을 클릭하세요.
   12. Simple LAP 트래커를 선택하고 다음(그림 6B)을 클릭하세요. LAP 트래커는 추적된 객체가 병합되거나 분할되지 않을 때 적용됩니다.
   13. 연결 최대 거리를 5마이크론, 간격 좁히는 최대 거리를 15마이크론, 간격 닫는 최대 프레임 간격을 1로 설정하세요. 다음(그림 6C)을 클릭하세요.
   14. 추적이 이루어질 것입니다. 트랙은 원본 이미지 창에 나타납니다. 다음 (그림 6D)을 클릭하세요.
   15. 이 페이지는 트랙 필터링을 지원합니다. 왼쪽 하단의 초록색 + 버튼을 눌러 필터를 만들고, 트랙 모드에서 스팟 수를 선택한 후 Auto 를 누르세요(그림 6E).
   16. 모드를 '위'로 설정해 두세요. 이렇게 하면 빠르게 나타났다가 사라지는 반점이 사라집니다.
   17. 다음(그림 6E)을 클릭하세요.
   18. 디스플레이 옵션 페이지에서 데이터를 csv 파일로 내보낼 수 있습니다. 페이지 하단에서 트랙 버튼을 클릭한 후 CSV로 내보내 기(그림 7A)를 선택하세요.
   19. 이 페이지는 내장된 플롯을 가능하게 하며; 무시하고 다음(Next)을 클릭하세요.
   20. 마지막 페이지에서 캡처 오버레이로 영상을 저장하고 실행 버튼을 누르세요. 클릭한 후 GIF로 저장> 파일로 이동> (그림 7B).
4. 기본 속도 분석
   1. 트랙 CSV를 스프레드시트 소프트웨어로 열어보세요.
   2. TRACK_ID, POSITION_X, POSITION_Y, POSITION_T, FRAME, RADIUS를 제외한 모든 열을 삭제하세요.
   3. 각 트랙의 순서가 뒤섞여 있습니다. 순서를 맞추려면, 먼저 상위 네 행을 정지한 후 TRACK_FRAME 이라는 새로운 열을 만들어 다음 열에 복사해 붙여넣습니다: =concatenate(A4, "_", if(E4>9, E4, concatenate("0", E4))).
   4. TRACK_FRAME 열을 선택하고 우클릭한 후 시트 정렬 A–Z를 클릭하세요. 각 트랙 내 자리는 이제 순서대로 정렬될 것입니다.
   5. 트랙 중간에 빠진 부분이 없는지 확인하려면 새 열을 만들고 다음 공식을 사용하세요: =if(E4>E3, E4-E3, "NA"). 각 트랙의 첫 번째 자리가 "NA"를 반환하고 나머지는 1.
   6. 속도(마이크론/프레임)를 위한 열을 만들고 다음 공식을 붙여넣습니다: =if(H4="NA", "NA", sqrt(((B4-B3)^2 + (C4-C3)^2)). 이 과정에서는 피타고라스 정리를 사용하여 두 점 사이의 거리를 계산합니다.
   7. 이를 속도(마이크로미터/초)로 변환하려면 새 열을 만들고 다음 공식을 붙여넣으세요: =IF(I5="NA", "NA", I5/(D5/E5)). 이렇게 하면 초/프레임을 찾아 그에 맞게 마이크론을 변환합니다.

Results

핵 외피와 크로마틴 역학의 라이브 셀 이미징
우리는 외부 핵 외피 단백질 WIP1-GFP와 중심 염색질 CENH3-mRFP를 포함하는 이중 형광 마커 라인을 생성했습니다(그림 8). 4일 된 묘목은 대조판 또는 100 mM NaCl 함유판으로 2일간 옮겨졌습니다. 2일간의 잠복 후,^{이전에 보고된} 바와 같이 소금 처리에 대해 뚜렷한 뿌리 성장 억제가 관찰되었습니다. 대조군과 염분 처리된 뿌리 모두 라이브 세포 영상 촬영과 5–10분 동안 타임랩스 영상을 촬영했으며, 획득 사이에 1분의 간격을 두었습니다(보완 영상 1 및 보조 영상 2). 대조군과 달리, 염분 처리된 뿌리 세포는 스트레스를 받는 것으로 나타나며, 중심질체 초점은 대조군보다 더 커 보인다(그림 8

Discussion

여기서 제시된 방법은 염색질 역학을 추적하는 데 이상적입니다. 과거 별도의 이미징을 사용한 생세포 이미징 방법과 비교할 때, 핵과 염색질의 동시 이미징은 핵과 염색질 역학 간의 관계를 탐구할 수 있게 합니다. 이는 핵 회전이나 핵 내 크로마틴 이동과 같은 운동을 드러낼 수 있으며, 이는 그렇지 않으면 입증하기 어려운 현상일 수 있습니다.

생세포 영상 방법으로서 전체 과정 동안 일정한 신호를 가진 형광선을 유지하는 것이 가장 중요합니다. 만약 시간 경과 과정에서 광표백이 신호를 방해한다면, 레이저 출력과 노출 시간을 줄여야 합니다. 특히 타임랩스 시간을 늘리기 위해 방법을 수정할 경우 더욱 중요합니다. 이미지 획득 측면에서 회전 디스크 공초점 현미경은 높은 프레임 속도와 낮은 광표백 현미경 덕분에 레이저 주사 공초점 현미경과 달리 생체 세포 영상에 이상적입니다. 이미지 처리 과정에서 크로마틴의 분할도 중요한

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
½ 무라시게와 스쿠그(MS) 미디어	바이오월드	30630058
3M 마이크로포어 테이프	아마존	A-1530-0
인콰지션 소프트웨어	올림푸스/이비자트	셀센스
아가르	바이오월드	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
커버 슬립	제네시	29-116
유리 슬라이드	제네시	29-101
이미지/피지	오픈 소스	https://imagej.net/software/fiji/downloads
현미경	올림푸스/이비자트	IX83
염화나트륨	피셔 사이언티브	BP358-212
회전 디스크	요코가와와	CSU-W1
정사각형 페트리 접시	수입	그리고 nbsp; 26-275
자당	바이오월드	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987