연구 논문

당뇨병성 신병증에서 단지 강탕 캡슐의 네트워크 약리학, 머신러닝 및 생체 내 검증

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DOI:

10.3791/71328

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2026년 7월 28일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University of Chinese Medicine

이 논문에서

요약

단지 강탕 캡슐(DJC)은 화학물질 신호 전달과 열융증 표지자의 변화로 입증되어, 생물정보학과 생체 내 검증에 의해 입증된 것처럼 당뇨병성 신병증(DN)을 완화시킬 수 있습니다.

초록

단지 강탕 캡슐(DJC)은 당뇨병 치료에 임상적으로 사용되는 전통 한약 제제이지만, 당뇨병성 신병증(DN) 시 신장을 어떻게 보호하는지는 아직 완전히 명확히 밝혀지지 않았습니다. 이 연구는 DJC가 DN에 미치는 잠재적 메커니즘을 탐구하기 위해 설계되었으며, 특히 NLR 계열인 피린 도메인 포함 3(NLRP3)/카스파제-1/가스데민 D(GSDMD)의 피롭토시스 관련 신호 전달 연쇄 반응에 초점을 맞추었습니다.

네트워크 약리학과 머신러닝을 결합한 통합 전략이 적용되었습니다. 전통 중의학 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼(TCMSP)과 전통 중의학 분자 기전을 위한 생물정보학 분석 도구(BATMAN-TCM)를 사용하여 DJC의 생체 활성 성분과 해당 단백질 표적을 선별하였습니다. DN 관련 유전자는 Gene Expression Omnibus(GEO), GeneCards, 그리고 온라인 멘델리안 유전(OMIM)에서 검색되었습니다. 주요 후보 대상은 여러 기계 학습 알고리즘을 사용해 선별되고 순위가 매겨졌습니다. DJC의 활성 성분과 핵심 표적 간의 결합 친화성은 분자 도킹을 통해 평가되었습니다. 마지막으로, 치료 효능과 예측된 기전을 db/db 당뇨병 마우스에서 평가하였다.

네트워크 약리학 분석에서 599개의 DJC 표적과 DN과 공유되는 68개의 중복 유전자가 확인되었습니다. 머신러닝 알고리즘을 사용하여 C-C 모티프 케모킨 리간드 2(CCL2)와 CASP1이 우선순위 후보 표적으로 확인되었습니다. 분자 도킹은 DJC 활성 성분과 이 핵심 단백질 간의 강한 결합 친화성을 예측했습니다. 기능적 풍부 분석(GO/KEGG)은 DJC 조절이 염증 반응 및 MAPK 경로와 관련이 있음을 시사했습니다. 생체 내 검증 결과, DJC 치료가 신손상과 섬유증 표지자를 완화하는 것으로 나타났습니다. 이 발견들은 DJC가 CCL2/C-C 모티프 케모카인 수용체 2(CCR2) 관련 열융증 신호 변화를 통해 DN을 부분적으로 감쇠시킬 수 있음을 시사합니다.

서론

당뇨병(DM)의 전 세계적 부담은 계속해서 증가하고 있으며, 이는 막대한 공중보건 도전 과제를 제시하고 있습니다. 매년 약 520만 명의 사망자가 DM과 관련 합병증으로 인해발생합니다. 1. DN은 심각한 미세혈관 합병증으로 간주되며, 말기 신장 질환(ESRD) 발병에 주요 원인으로 작용하며, 당뇨병 환자의 약 30-40%에게 영향을 미칩니다 2,3. 대사 기능 장애, 혈역학적 재형성, 지속적인 염증 반응 등 여러 얽힌 요인들이 DN 병리학적 진행에 기여합니다. 고혈당과 고지혈증을 포함한 병리학적 손상은 NLRP3/카스파제-1/GSDMD 매개 열감소증 경로를 활성화하여 신장 간엽 및 관 상피세포에서 염증성 프로그램적 사멸을 유도하고, 이어서 진행성 세뇨관 간질성 병변을 유발합니다. 피로토시스는 원형질막 파열이 특징이며, 이는 IL-1β와 IL-18의 방출을 촉진합니다. 이러한 염증 유발 인자는 C-C 모티프 케모카인 리간드 2(CCL2) 전사를 증가시키고, 대식세포 침윤을 촉진하며, 열파성 활성화를 더욱 강화하여 신손상을 점차 악화시킵니다. 임상 실무에서 이 상태는 진행성 알부민뇨와 사구체 여과율의 점진적 감소로 나타나며, 이는 결국 돌이킬 수 없는 신장 손상과 환자의 삶의 질의 현저한 악화로 이어질 수 있습니다 7,8. 의료 기술의 발전에도 불구하고, 엄격한 혈당 및 혈압 조절에 중점을 둔 현재의 치료 전략은 질병 진행을 완전히 멈추는 데 실패하는 경우가 많습니다. SGLT2 차단제, GLP-1 작용제, 미네랄로코르티코이드 수용체 차단제 등 신흥 약물치료법과 줄기세포 치료, 식이 중재가 상당한 관심을받고 실제로 보편화되고 있지만, DN의 잔존 위험은 여전히 높습니다. 따라서 혁신적인 치료 물질 개발은 특히 여러 병리학적 경로를 동시에 표적으로 할 수 있는 전통 의학 물질 개발이 시급한 연구 우선순위로 남아 있습니다.

단지 강탕 캡슐(DJC)은 안후이 중의대 제1부속병원에서 개발된 병원 내 전용 제형(안후이성 의과대학 제제 승인 번호 Z20090006; 특허 번호. ZL200310112845.1; 배치 번호20220427)는 유망한 치료제 후보입니다. 밀봉되어 건조하고 환기가 잘 되는 환경에 보관되어야 하며, 빛으로부터 보호되어야 합니다. 이 조제법은 여섯 가지 전통 중국 약초로 구성되어 있습니다: Pseudostellaria heterophylla(Radix Pseudostellariae), Whitmania pigra(Hirudo), Alisma orientale(Alismatis Rhizoma), Cuscuta chinensis(Cuscutae 정액), Paeonia suffruticosa(무탄 피질), 그리고 Rehmannia glutinosa(Rehmanniae Radix Praeparata) (5:4:4:3:2:5)10. 임상 실무에서 DJC는 당뇨병 환자에서 저혈당 효능과 신손상 지표 감소 능력을 입증했습니다11. 이전 연구들은 DJC가 혈당 수치와 지질 대사를 조절함으로써 신경계 보호 효과를 발휘할 수 있음을 시사합니다 12,13,14. 이전 DJC 연구들은 주로 비체계적 표적 선택을 통한 단일 경로 검증에 초점을 맞추었습니다. 따라서 우리는 네트워크 약리학과 머신러닝을 통합하여 활성 성분을 선별하고 핵심 허브 유전자를 식별한 뒤, 예비 생체 내 검증을 통해 분석을 강화하였습니다.

네트워크 약리학은 복잡한 한방 처방을 해부하는 효과적인 전략을 제공합니다. 이 프레임워크는 생물정보학 및 체계적 생물학적 접근법, 계산화학, 약리학을 통합하여 약물 작용의 "다성분, 다중 표적, 다중 경로" 메커니즘을 해독합니다15, 16, 17. 이러한 전체론적 접근법은 한약 화합물과 질병 특이적 네트워크 간의 복잡한 상호작용을 구조적으로 검토할 수 있게 하며, TCM18에 내재된 시너지 효과를 밝혀냅니다. 하지만 전통적인 네트워크 약리학은 때때로 데이터에 과도한 잡음을 생성할 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 머신러닝 알고리즘을 통합하면 대규모 데이터셋에서 핵심 특성 유전자를 정밀하게 선별할 수 있습니다. 더 나아가, 분자 도킹은 약물-생체분자 결합 친화도를 예측하는 직관적이고 역동적인 관점을 제공합니다.

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프로토콜

생리활성 화합물과 DJC의 잠재적 표적의 스크리닝

DJC에 속하는 여섯 가지 허브인 Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae), Paeonia suffruticosa (Moutan Cortex), Cuscuta chinensis(Cuscutae 정액), Alisma orientale (Alismatis Rhizoma), Rehmannia glutinosa(Rehmanniae Radix Praeparata), Whitmania pigra (Hirudo)의 생리활성 화합물이 TCMSP 데이터베이스에서 검색되었습니다. 선별검사는 약물동학적 매개변수를 기준으로 수행되었으며, 경구 생체이용률(OB) ≥ 30%, 약물 유사성(DL) 0.18≥. TCMSP에 데이터가 없는 휘트마니아 피그라의 경우, 활성 화합물과 표적은 BATMAN-TCM에서 획득했으며, 선정 기준으로 점수 20≥< P-값 받았습니다. UniProt은 수집된 모든 표적을 표준 유전자 명명법으로 통합하기 위해 적용되었습니다.

DN 관련 유전자의 획득

DN 관련 유전자는 세 곳에서 수집되었습니다. 먼저, GeneCards와 OMIM을 "당뇨병성 신병증"이라는 검색어로 검색하였습니다. 관련성 점수가 1인 GeneCard의 유전자는 > 유지되었습니다. 둘째, GEO 저장소에서 세 가지 마이크로어레이 프로필(GSE30529, GSE104948, GSE96804)을 얻었습니다. GSE30529 샘플은 신관에서 유래한 반면, GSE104948와 GSE96804 샘플은 신장구체에서 유래했습니다. 모든 데이터베이스 검색은 2024년 12월 15일에 수행되었습니다. GSE30529 데이터셋에서 DN 환자와 건강한 대조군 간의 차등 발현 유전자(DEGs)를 R 소프트웨어의 limma 패키지를 사용하여 확인하였습니다. 선별 기준은 조정된 p-값 0.05와 |log2(폴드 변화)| <로 설정되었습니다. > 0.5. 화산 그래프와 히트맵은 차별화된 유전자를 표시했다.

DN에 대한 DJC의 추정 치료 표적 식별

벤 다이어그램 분석을 통해 DJC 표적 풀과 GeneCards, OMIM, GSE30529 DEGs의 DN 관련 유전자 간에 공유 유전자좌가 확인되었습니다. 이 공유 유전자좌들은 모든 후속 연구 절차의 후보 치료 유전자 역할을 했습니다.

단백질 상호작용(PPI) 네트워크의 구축 및 프로파일링

치료적 유전자좌를 STRING에 업로드하여 상호작용 컷오프가 0.4 신뢰 이상으로 설정된 단백질-단백질 상호작용 네트워크를 구축했습니다. Cytoscape는 시각적으로 표현하기 위해 네트워크 데이터셋을 처리했습니다. Degree와 같은 위상 지수는 CytoNCA 플러그인을 통해 네트워크 전반의 핵심 노드를 식별하기 위해 계산되었습니다.

농축 분석

후보 표적과 연결된 생물학적 역할과 신호 전달 연쇄 반응을 구분하기 위해, r에서 clusterProfiler 패키지를 사용하여 org. 주석 작성은 Hs.eg.db, 시각화는 ggplot2입니다. 유전자 온톨로지(GO) 용어는 생물학적 과정(BP), 세포 구성 요소(CC), 분자 기능(MF) 범주에 걸쳐 평가되었습니다. 교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG) 경로는 풍부 p-값이 < 0.05일 때 유지되었습니다.

CytoHubba 알고리즘의 적용

Cytoscape의 CytoHubba 플러그인을 사용해 각 네트워크 노드에 대해 네 개의 토폴로지 중심성 지수를 계산했습니다. 직접 연결된 이웃의 수를 나타내는 도수는 각 단백질의 상호작용 범위를 반영합니다. 최대 이웃 구성 요소(MNC)는 노드의 이웃 하위 그래프에서 가장 큰 연결 구성 요소의 크기를 정량화하는 지표로, 국소적 조절 영향력을 측정합니다. 엣지 퍼콜레이트 컴포넌트(EPC)는 시뮬레이션된 무작위 엣지 제거와 평균 연결 컴포넌트 크기의 정량화를 통해 전역 구조적 중요성을 평가합니다. 각 지수에서 상위 20위 안에 드는 유전자들을 교차시켜 최종 허브 유전자를 얻었습니다.

머신러닝 기반 핵심 유전자 스크리닝

GSE30529 데이터셋의 발현 프로필에 세 가지 머신러닝 접근법이 적용되어 후보 대상 중 신뢰할 수 있는 허브 유전자를 식별하였습니다.

(1) LASSO(최소 절대 축소 및 선택 연산자): 정규화 매개변수 λ는 5중 교차 검증을 통해 조정되었으며, 최적 값은 폴드 간 평균 성능에 의해 결정되었습니다. 입력된 유전자 발현 특징들은 발현 크기의 영향을 제거하기 위해 자동으로 Z-점수 표준화를 거쳤습니다. 순수 LASSO 정규화에 대해 페널티 α매개변수가 1로 고정된 상태에서, 선별을 위해 미리 정의된 100 λ 값의 패널이 사용되었습니다. L1 페널티는 저관련성 특징의 계수를 0으로 줄여 동시 특징 선택과 복잡도 제어를 가능하게 했으며, 교차 검증 조정된 정규화 강도는 과적합 위험을 완화했습니다.

(2) SVM-RFE(지원 벡터 기계-재귀 기능 제거): 견고한 특징 스크리닝을 보장하기 위해 2층 5중 교차 검증 프레임워크가 사용되었습니다. 전체 데이터셋을 확률적으로 나누어 5개의 겹치지 않는 부분집합이 생성되었으며, 4개는 훈련에, 1개는 5번의 반복에 걸쳐 테스트에 사용되었습니다; 접힘별 평균화는 단일 표본 분할로 인한 편향을 완화했습니다. 재귀적 특징 제거법이 적용되어 특징 차원을 줄이고 모델 복잡도를 제한하여 과적합을 완화했습니다. 분류 오류율과 정확도는 최적의 특징 수를 결정하는 성능 지표로 사용되었습니다.

(3) 랜덤 포레스트(RF): 최적 트리 수는 최소한의 아웃 오브 백 분류 오류율로 결정되어 최종 모델을 재학습하는 최적 트리 수가 결정된 초기 500개의 랜덤 포레스트를 구성했습니다. 각 노드 분할에서의 임의 특징 하위 집합 크기를 포함한 모든 나머지 하이퍼파라미터는 기본 패키지 설정으로 유지되었습니다. 최종 모델의 유전자 중요성 점수는 내림차순으로 순위를 매겨 질병 시그니처 유전자 세트를 생성했습니다. 최종 핵심 유전자 집합은 이 세 알고리즘의 결과를 교차시켜 결정되었습니다.

허브 유전자 발현의 독립적인 데이터셋 기반 검증

허브 유전자의 전사체 수준을 검증하기 위해 두 개의 독립적인 외부 데이터셋인 GSE104948와 GSE96804가 사용되었습니다. 유전자 발현 데이터셋은 정규화를 거쳤으며; DN 환자와 건강한 대상자 간의 발현 차이는 R의 ggplot2와 ggsignif 툴킷을 사용해 그래프로 표시하였습니다.

분자 도킹

허브 표적 단백질(CASP1, PDB ID: 3E4C; CCL2, PDB ID: 7S00)는 단백질 데이터베이스에서 얻었습니다. 생리활성 화합물 3D 구조는 PubChem을 통해 수집되었습니다. 우르솔산, 3β-하이드록시우르-12-엔-28-오익산, 그리고 케르세틴이 결합 대상으로 선정되었는데, 이는 네트워크 약리학이 이들 활성 화합물과 핵심 표적 CCL2 또는 CASP1 간의 상호작용을 예측했기 때문입니다. 단백질 구조는 천연 리간드와 물 분자를 제거하고 극성 수소를 도입하여 전처리한 후, AutoDock Vina를 이용한 분자 도킹을 거쳤습니다. 결합 친화도는 도킹 점수(kcal/mol)로 나타내며, 상호작용의 강도를 평가하는 데 사용되었습니다. 안정적인 분자 간 상호작용을 정의하기 위해 결합 에너지 임계값이 −5.0 kcal/mol로 설정되었습니다. 도킹된 구조는 PyMOL을 사용해 시각화되었습니다.

동물과 실험 설계

본 연구는 특정 병원체가 없는(SPF) 등급의 8주 된 수컷 db/db 마우스 30마리와 연령에 맞는 수컷 SPF db/m 마우스 10마리를 사용했습니다. 모든 실험용 쥐는 SPF 등급 시설에서 12시간의 밝고 어두운 광주기 하에 사육되었으며, 안정적인 조건(22 ± 2°C, 상대습도 50–70%), 그리고 규칙적인 식과 식수 자유 이용 환경에서 유지되었습니다. 모든 생체 내 실험 프로토콜에 대한 윤리적 승인은 안후이 중의학대학교 동물윤리위원회(승인 번호)로부터 승인되었습니다. AHUCM-마우스-2023059).

설치류는 7일간의 적응 단계를 거친 후 무작위 그룹(각 6마리)과 8주간의 일일 개입을 거쳤습니다. 모든 실험동물에서 공복 혈당이 측정되었으며; 동물들은 무작위 번호표를 사용하여 배정되었고, 조직학, IHC, 서부 블롯 정량은 블라인드 평가 하에 수행되었습니다.

정상 대조군( CTL) 그룹: 경구 관식으로 식염수를 투여받는 마우스.

모델(M) 그룹: 경구 관식식염수 투여 중인 db/db 마우스.

DJC-중간 용량(DJC-M) 그룹: 0.78 g/kg(성인 임상 일일 용량과 동등)로 DJC를 투여하는 db/db 마우스.

DJC-고용량(DJC-H) 그룹: djc/db 마우스가 1.56 g/kg(성인 임상 일일 용량의 두 배)으로 DJC를 투여받는 경우.

투여 준비

인간에서 쥐 간 용량 조정은 약리학적 실험 방법론에 명시된 체표면적 정규화 접근법을 사용하여 변환 계수는 9.1로 도출되었습니다. DJC의 임상 일일 용량은 70kg 성인의 경우 6g(0.0857 g/kg)으로, 마우스 등가량은 0.78 g/kg(임상 용량 1배)과 1.56 g/kg(임상 용량 2배)입니다. 모든 마우스는 10 mL/kg의 일정 용량으로 위내 투여를 받았습니다. DJC 분말은 0.5% CMC-Na 용액에 정확히 무게를 측정하고 현탁하여 78 mg/mL(중간 용량)와 156 mg/mL(고용량)에서 균일한 현탁액을 형성하였습니다.

8주간 매일 투여 후, 모든 실험 마우스에서 1% 펜토바르비탈나트륨을 사용해 마취를 유도하였다. 복부 대동맥을 통해 혈액 샘플을 채취하여 키트 기반 생화학적 분석에 위해 상청액을 분리하기 위해 원심분리했습니다. 대사 케이지가 사용되어 쥐 소변 샘플을 채취했습니다. 부분 신장 조직은 헤마톡실린-에오신(HE) 및 마손 염색을 위해 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 액체 질소에 급동한 후, 잔류 신장 조직은 −80 °C에서 보존되어 후속 분석 분석에 사용되었습니다.

조직학적 분석

4% 파라포름알데히드에 고정된 후, 신장 조직은 점진적인 에탄올 탈수, 투명화, 파라핀 삽입, 그리고 이후 HE 및 매슨 삼색 염색을 위한 4μm 연속 절절을 거쳤다. HE 염색은 신장 조직병리학적 변화를 관찰하기 위해 표준 절차(탈파라핀, 재수화, 헤마톡실린 핵 염색, 산성화된 에탄올 분화 및 청색, 이오신 역염색, 탈수, 투명화, 중성 발삼 마운팅)에 따라 수행되었습니다. 절편들은 헤마톡실린 염색에 3분간 담근 후 15초간 에오신 대염색을 했습니다. Masson의 삼색 염색에서는 절편을 탈파라핀화, 재수화, 순차적 염색, 분화, 아세트산 색 분리를 거쳤으며, 이후 탈수, 투명화 및 마운팅을 거쳐 신장 콜라겐 축적과 섬유화 변화를 평가하였습니다. 밝방야 현미경을 사용해 200× 배율로 모든 염색된 조직 단면을 검사하고 촬영하였습니다. HE 염색된 절편은 사구체 경화증 지수(GSI)를 사용하여 채점하였습니다. Masson의 트리크롬 염색에서는 Masson Trichrome 프리셋을 적용하여 블루 콜라겐 채널을 분리하고, 콜라겐 면적과 붉은 염색 조직 면적의 비율을 계산했습니다.

면역조직화학(IHC)

4% 파라포름알데히드로 24시간 고정한 후, 조직 표본은 연속 에탄올 구배로 탈수한 후 파라핀을 박더해 순차적으로 5 μm 절면으로 절단했습니다. 탈파라핀화 후, 절편은 항원 회출과 내인성 과산화효소 차단을 거쳤습니다. 차단 후, 희석된 1차 항체와 함께 습한 방에서 4°C에서 하룻밤 동안 조직 슬라이드를 배양하였습니다. 슬라이드는 PBS 세척 후 상온에서 2차 항체 배양을 받고, 최적 염색 강도가 달성될 때까지 DAB 염색 반응을 거쳤습니다. 그 후 절편들은 순차적인 헤마톡실린 카운터 스테인, 분화, 블루잉, 탈수, 투명화, 커버슬립 마운팅, 그리고 밝시야 현미경 영상 촬영을 거쳤습니다. 항원 회재는 10분간 오토클레이빙을 통해 수행한 후 자연 냉각을 실온으로 유지했습니다. 5% 염소 혈청으로 상온에서 60분간 차단한 후, 절편은 1차 항체(1:200 희석)와 HRP 결합 염소 항토끼 항구 2차 항체(1:300 희석)로 각각 60분간 실온에서 배양했습니다. DAB 염색 반응은 상온에서 3–5분간 진행되었으며, 현미경으로 모니터링된 후 증류수로 세척하여 종료되었습니다. 이미지는 ×200 배율로 촬영되었으며, 양성 염색 면적의 비율은 ImageJ를 사용해 정량화되었습니다.

ELISA 검출

분석 단계는 키트 공급업체가 제공하는 공식 프로토콜을 준수했습니다. 세척 완충제와 직렬 희석 표준은 사전에 준비되었습니다. 빈 웰, 표준웰, 샘플 웰에 시약을 채우고 어둠 속에서 배양했습니다. 배양 후 플레이트는 충분히 세척된 후, 효소 조합과 함께 어둠 속에서 배양했습니다. 세척 후에는 빛 보호 색상 반응을 위해 색채 기질을 추가했고, 표준 웰에서 뚜렷한 청색 구배가 나타나면 스톱 버퍼로 종료되었습니다. 각 웰의 흡광도(OD)는 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 목표 파장에서 측정되었습니다. 혈청 IL-1β와 IL-18 농도는 표준 농도의 OD 값(희석되지 않은 혈청 샘플; 450 nm에서 흡광도 측정; 샘플당 8개의 기술 복제 웰)에서 생성된 보정 곡선을 사용하여 정량화되었습니다. 24시간 대사 케이지(546 nm 흡수 측정; 표본당 8회 기술 복제)를 사용해 희석되지 않은 소변 샘플에서 요로 크레아티닌과 24시간 소변 단백질을 측정하였다.

실시간 정량 PCR(RT-qPCR)

총 RNA는 신장 조직에서 분리되었고, 그 순도와 농도는 분광광도계로 측정되었습니다. 정제된 RNA를 역전사하여 cDNA 주형을 생성했습니다. RT-qPCR은 실시간 PCR 기기에서 다음과 같은 열 사이클링 프로그램을 통해 수행되었습니다: 5분간 사전 변성(95 °C), 이어서 40회 증폭 라운드: 95 °C에서 15초, 60 °C에서 1분. RT-qPCR은 10 μL 반응에서 수행되었으며, 5 μL SYBR 그린 마스터 믹스, 0.2 μL 전방 프라이머, 0.2 μL 역방향 프라이머가 포함되어 있습니다. cDNA 주형물 1 μL, RNase 없는 물 3.6 μL. cDNA 합성을 위한 역전사는 총 반응 부피 20 μL로 수행되었으며, 증폭 특이성을 확인하기 위해 용융곡선 분석이 수행되었고, 각 샘플은 세 차례의 기술 복제로 분석되었습니다. 전사체 수준은 표 1에 모든 프라이머 서열을 포함하여 2⁻ΔΔCq 정규화를 통해 β-액틴으로 평가하였습니다.

서부 블롯 분석

각 마우스 코호트에서 약 40mg의 신장 조직 샘플을 채취하여 얼음 위에 다진 후 단백질 용해 완충제에서 완전히 균질화했습니다. 12,000rpm, 4°C에서 15분간 회전시킨 후, 조직 균질체에서 단백질 함유 상청액을 모두 수집하여 분리하여 −80°C에서 냉동보존하였습니다. 단백질 상정액은 로딩 버퍼와 혼합되어 물욕에서 끓여 변성시켰습니다. 각 레인당 약 10 μL의 정규화된 단백질 샘플을 적재하고 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 분리하였습니다. 표적 단백질은 습식 전기블롯을 통해 니트로셀룰로오스 필터로 전달되었습니다. 전송은 400 mA의 고정 전류로 얼음 욕조에서 30분에서 45분간 수행되었습니다. 이식 후에는 차가운 무지방 우유에 2시간 배양한 후, 1:1,000 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양했습니다. 세척된 블롯은 4°C에서 2시간 동안 동일한 2차 항체(1:10,000)로 덮었고, ImageJ 소프트웨어를 사용해 블롯 사진에서 발광 밴드 신호를 기록하고 정량화하였습니다. GSDMD-N의 경우, 튜불린은 예상 분자량(~35 kDa)과 GAPDH(~36 kDa)와 겹치기 때문에 부하 조절 변수로 사용되었습니다. 모든 웨스턴 블롯 실험은 세 개의 독립적인 생물학적 복제체로 수행되었습니다.

통계 분석

정량적 데이터는 표준편차(SD)± 평균으로 제시됩니다. 두 그룹 간 차이는 쌍이 없는 학생 t-검정으로 분석되었고, 다그룹 간 비교는 일방향 분산분석(ANOVA)과 투키의 사후 검정으로 평가되었습니다. p 값 0.05< 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

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결과

DJC 생체활성 성분 및 표적 식별

DJC를 구성하는 6가지 허브에서 선별 기준을 충족하는 생리활성 화합물(OB ≥ 30%, DL ≥ 0.18)이 총 66종이 확인되었습니다. 여기에는 Pseudostellaria heterophylla에서 26개, Paeonia suffruticosa에서 6개, Cuscuta chinensis에서 8개, Alisma orientale에서 6개, Rehmannia glutinosa에서 10개, Whitmania pigra에서 10개가 포함되었습니다. 표적 표지의 표준화와 중복 제거를 통해 DJC와 관련된 599개의 뚜렷한 후보 단백질 표적이 발견되었습니다. 우리는 이러한 상호 연결을 보여주기 위해 화합물-표적 상호작용 지도를 구축했습니다(

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토론

DN은 복잡하고 다인자에 걸친 발병 기전을 특징으로 하여 아직 완전히 이해되지 않은 ESRD의 주요 원인으로 남아 있습니다20,21. DJC는 DN 완화에 있어 임상적으로 유망한 효능을 보여주었지만, 근본적인 분자 기전은 여전히 대부분 밝혀지지 않았습니다22. 본 연구에서는 네트워크 약리학, 머신러닝 도구, 결합 시뮬레이션 분석법, 생체 내 검증을 통합한 다중 오믹스 분석 기법을 사용하여 DJC의 약리학적 작용을 탐구하였습니다. 이 다각적 접근법은 잠재적 목표를 선별하고, 핵심 경로를 계산적으로 우선순위 정하며, 주요 발견을 실험적으로 평가하여 탐색적 결론의 기초를 강화할 수 있게 했습니다.

1차 네트워크 약리학 분석에서 DN에서 DJC 효과와 관련된 68개...

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공개 사항

저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 안후이성 대학의 주요 연구 프로젝트(보조금 번호 2024AH050968)의 지원을 받았습니다.

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재료

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참고문헌

  1. Demir S, Nawroth PP, Herzig S, Ekim Üstünel B. Emerging targets in type 2 diabetes and diabetic complications. Adv Sci (Weinh). 2021;8(18):e2100275.
  2. Zimmet PZ, Magliano DJ, Herman WH, Shaw JE. Diabetes: a 21st century challenge. Lancet Diabetes Endocrinol. 2014;2(1):56-64.
  3. Liu M, et al. Loss of glomerular aldolase B in diabetic nephropathy promotes renal fibrosis via activating Akt/GSK-3β/β-catenin axis. J Adv Res. 2025;76:207-18.
  4. Wang L, et al. Puerarin reduces diabetic nephropathy-induced podocyte pyroptosis by modulating the SIRT1/NLRP3/caspase-1 pathway. Mol Cell Endocrinol. 2025;595:112409.
  5. Wang Y, et al. C-reactive protein promotes diabetic kidney disease via Smad3-mediated NLRP3 inflammasome activation. Mol Ther. 2025;33(1):263-78.
  6. Liu Y, et al. Role of MCP-1 as an inflammatory biomarker in nephropathy. Front Immunol. 2024;14:1303076.
  7. Bai Z, Huang X, Nie S. Kidney function-related protection of polysaccharides from red kidney bean and small black soybean via urine metabolomics in type 2 diabetic rats. Carbohydr Polym. 2025;355:123311.
  8. Xuan C, et al. Isoquercitrin alleviates diabetic nephropathy by inhibiting STAT3 phosphorylation and dimerization. Adv Sci (Weinh). 2025;12(25):e2414587.
  9. Hu Q, et al. Diabetic nephropathy: focusing on pathological signals, clinical treatment, and dietary regulation. Biomed Pharmacother. 2023;159:114252.
  10. Wu YJ, et al. Danzhi Jiangtang Capsule mediates NIT-1 insulinoma cell proliferation and apoptosis by GLP-1/Akt signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2019;2019:5356825.
  11. Sun M, et al. Danzhi Jiangtang Capsule ameliorates kidney injury via inhibition of the JAK-STAT signaling pathway and increased antioxidant capacity in STZ-induced diabetic nephropathy rats. Biosci Trends. 2018;12(6):595-604.
  12. Fang Z, et al. Radix pseudostellariae of Danzhi Jiangtang capsule relieves oxidative stress of vascular endothelium in diabetic macroangiopathy. Saudi Pharm J. 2020;28(6):683-91.
  13. Xie J, et al. Danzhi Jiangtang capsule reduces renal injury in rats with diabetes induced by high fat diet and streptozotocin via downregulating toll-like receptor 4-nuclear factor-κB pathway and apoptosis. J Tradit Chin Med. 2023;43(2):312-21.
  14. Fang Z, et al. The effects of Danzhi Jiangtang capsule on clinical indices and vascular endothelial function in patients with impaired glucose tolerance of Qi-Yin deficiency type. Ann Med. 2023;55(2):2291185.
  15. Li X, et al. Network pharmacology prediction and molecular docking-based strategy to explore the potential mechanism of Huanglian Jiedu Decoction against sepsis. Comput Biol Med. 2022;144:105389.
  16. Zhao L, et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  17. Li X, et al. Network pharmacology approaches for research of traditional Chinese medicines. Chin J Nat Med. 2023;21(5):323-32.
  18. Zhao N, et al. Integrated chemical composition, transcriptomics, and network pharmacology to reveal the mechanism of Jia-Wei-Si-Miao-Yong-An Decoction in ACS model rats. Phytomedicine. 2025;145:157027.
  19. Wu J, et al. Use of molecular dynamics simulations to study how plant biomolecules help improve environmental health. Sci Total Environ. 2023;869:161871.
  20. Abhirami BL, Krishna AA, Kumaran A, Chiu CH. Targeting NF-κB in diabetic nephropathy: exploring the therapeutic potential of phytoconstituents. Arch Pharm Res. 2025;48(7-8):577-637.
  21. Joumaa JP, et al. Mechanisms, biomarkers, and treatment approaches for diabetic kidney disease: current insights and future perspectives. J Clin Med. 2025;14(3):727.
  22. Shi H, et al. In vivo and in vitro studies of Danzhi Jiangtang capsules against diabetic cardiomyopathy via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Saudi Pharm J. 2021;29(12):1432-40.
  23. Deng Y, et al. Mechanism exploration of Wenshen Jianpi Decoction on renoprotection in diabetic nephropathy via transcriptomics and metabolomics. Phytomedicine. 2025;139:156446.
  24. Li J, et al. Mechanistic investigation of astragalus root in the management of T2DM-NAFLD comorbidity: an integrated network pharmacology, molecular docking, molecular dynamics simulation, and in vitro study. Pharmaceuticals (Basel). 2026;19(2):289.
  25. Li X, et al. Integrating network pharmacology, bioinformatics, and experimental validation to unveil the molecular targets and mechanisms of galangin for treating hepatocellular carcinoma. BMC Complement Med Ther. 2024;24(1):208.
  26. Zhao L, et al. Inflammation in diabetes complications: molecular mechanisms and therapeutic interventions. MedComm (2020). 2024;5(4):e516.
  27. Shen J, et al. Different types of cell death in diabetic endothelial dysfunction. Biomed Pharmacother. 2023;168:115802.
  28. Li J, et al. Investigating the effects and potential mechanisms of astragalus root against diabetic nephropathy based on bioinformatics analysis and in vitro validation. Int J Mol Sci. 2026;27(10):4641.
  29. Tang L, et al. ATP6AP1 drives pyroptosis-mediated immune evasion in hepatocellular carcinoma: a machine learning-guided therapeutic target. Discov Oncol. 2025;16(1):616.
  30. Wu Y, Ma Y. CCL2-CCR2 signaling axis in obesity and metabolic diseases. J Cell Physiol. 2024;239:e31192.
  31. Song Z, et al. The novel potential therapeutic target PSMP/MSMP promotes acute kidney injury via CCR2. Mol Ther. 2024;32(7):2248-63.
  32. Yang Y, et al. CCL2-CCR2 axis in cardiovascular disease: research advances and challenges. Sci Bull (Beijing). 2025;70(6):820-4.
  33. Pozzi S, Satchi-Fainaro R. The role of CCL2/CCR2 axis in cancer and inflammation: the next frontier in nanomedicine. Adv Drug Deliv Rev. 2024;209:115318.
  34. Torices S, et al. Targeting the CCL2/CCR2 axis in HIV-1 infection and ischemic stroke. Stroke. 2026;57(2):538-48.
  35. Scurt FG, et al. Monocyte chemoattractant protein-1 predicts the development of diabetic nephropathy. Diabetes Metab Res Rev. 2022;38(2):e3497.
  36. Xu J, et al. (5R)-5-hydroxytriptolide ameliorates diabetic kidney damage by inhibiting macrophage infiltration and its cross-talk with renal resident cells. Int Immunopharmacol. 2024;126:111253.
  37. Wang X, et al. Discovery of the pharmacodynamic material basis of Danggui Buxue Decoction in the treatment of diabetic kidney disease based on lipidomics regulation. Phytomedicine. 2025;141:156643.
  38. Fu J, Wu H. Structural mechanisms of NLRP3 inflammasome assembly and activation. Annu Rev Immunol. 2023;41:301-16.
  39. Makoni NJ, Nichols MR. The intricate biophysical puzzle of caspase-1 activation. Arch Biochem Biophys. 2021;699:108753.
  40. Shi Y, et al. Inhibition of caspase-1 suppresses GSDMD-mediated peritoneal mesothelial cell pyroptosis and inflammation in peritoneal fibrosis. Small. 2025;21:e2409362.
  41. Broz P. Pyroptosis: molecular mechanisms and roles in disease. Cell Res. 2025;35(5):334-44.
  42. Zhang G, et al. Emodin influences pyroptosis-related caspase 1-GSDMD axis alleviated cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Sci Rep. 2025;15(1):19397.
  43. Ouyang PW, et al. Procyanidin B2 attenuates microvascular dysfunction in diabetic retinopathy via inhibition of caspase-1/GSDMD-mediated pyroptosis. J Ethnopharmacol. 2025;344:119528.
  44. Chen J, et al. Chlorogenic acid attenuates deoxynivalenol-induced apoptosis and pyroptosis in human keratinocytes via activating Nrf2/HO-1 and inhibiting NLRP3/GSDMD pathway. Food Chem Toxicol. 2024;186:113578.

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