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연구 논문

Piezo1은 기계적 긴장-유도 섬유아세포 분화를 통해 경막 ECM 재형성을 촉진합니다

160 조회수

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DOI:

10.3791/71340

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2026년 8월 11일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Science, Eye and ENT Hospital, Shanghai Medical College, Fudan University, 2NHC Key Laboratory of Myopia, Chinese Academy of Medical Sciences, and Shanghai Key Laboratory of Visual Impairment and Restoration, Fudan University, 3Department of Ophthalmology, Children's Hospital of Fudan University, National Children's Medical Center, 4Department of Ophthalmology, Shanghai Eye Diseases Prevention and Treatment Center, Shanghai Eye Hospital, Tongji University School of Medicine, 5Jinfeng Laboratory, 6Department of Cell Biology, Zunyi Medical University, 7Shanghai Nineth People's Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 8State Key Laboratory of Medical Neurobiology and MOE Frontiers Center for Brain Science, Institutes of Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구는 쥐 안구 고혈압 모델과 인체 내 기계적 변형, 작용제/억제제, 그리고 인간 공막섬유아세포에서의 siRNA 실험을 결합하여, 경수막 세포외기질 재형성 과정에서 피에조1 발현이 상승하며, 근섬유아세포 분화에 기능적으로 관여함을 보여줍니다.

초록

기계적 긴장에 의한 근섬유아세포 분화는 녹내장에서 공막세포외기질(ECM) 재형성의 핵심 메커니즘입니다. 그러나 경막 섬유아세포 내에서 기계적 변형이 생화학적 신호로 변환되는 과정은 아직 충분히 명확하지 않았습니다. 이 연구는 경막 ECM 재형성 중 기계적 변형에 의한 근섬유아세포 분화 맥락에서 Piezo1이 세포 증식과 분화에서 어떤 역할을 하는지 조사하고자 했습니다. 연구 설계는 1주간 쥐 안구 고혈압 모델에서 관찰된 생체 내 발현 관찰과, 주기적 기계적 신장(0.5 Hz에서 최대 24시간간 10% 증가) 및 원발성 인간 공막섬유아세포(HSF 세포)에서 Piezo1(작용제 요다1, 억제제 GsMTx4, siRNA 넉다운)의 약리학적 조절을 이용한 시험관 내 메커니즘 분석을 결합합니다. 우리의 연구 결과는 피에조1이 경막 조직과 HSF 세포에서 발현됨을 보여줍니다. 생체 내 군에서는 안구 고혈압 쥐의 공막에서 1주일 후 Piezo1 단백질 수치가 유의하게 증가하는 것이 관찰되었으며, 이는 제1형 콜라겐(COL1)과 α-평활근 액틴(α-SMA) 발현 증가와 일치하였다. 시험관 내 실험에서는 기계적 늘리기(8–24시간)가 HSF 세포 내 피에조1 발현을 상향 조절하였습니다. 더불어, Yoda1과 Piezo1의 활성화(24시간)는 HSF 세포 증식을 촉진하고 α-SMA와 COL1의 발현을 증진시켰습니다. 반대로 Piezo1의 넉다운 또는 억제는 COL1 발현을 억제하고 기계적 변형 하에서 근섬유아세포 분화를 방해했습니다. 또한, Piezo1 활성화는 Yes-associated protein(YAP) 발현의 상향 조절을 촉진한 반면, 기계적 변형 유도 YAP 발현은 Piezo1 knockdown 또는 억제 시 감소했습니다. 요약하자면, 우리의 연구 결과는 피에조1이 녹내장 맥락에서 공막에서 주요 ECM 구성 요소의 기계적 변형 유발 발현에 역할을 하며, 추가 생체 내 검증이 필요한 잠재적 치료 표적일 수 있음을 시사합니다.

서론

녹내장은 망막 신경절 세포(RGC)와 시신경두(ONH) 축삭의 점진적 퇴행을 특징으로 하는 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인으로, 2020년 전 세계 7,600만 명에게 영향을 미쳤습니다. 높은 안압(IOP)은 녹내장의 가장 큰 위험 요인이며, 현재 녹내장 발생과 진행을 지연시키는 유일한 방법은 IOP 감소입니다. RGC 축삭이 눈을 빠져나가는 ONH는 녹내장에서 손상의 주요 부위입니다. IOP 상승은 ONH에 기계적 긴장과 변위를 유발하여 층상 주추(LC) 내 RGC 축삭의 퇴화를 초래하고, 결국 녹내장성 시신경병증 5,6으로 이어집니다.

유두주위 공막(PPS)은 ONH의 주요 하중 지지 조직이며, PPS의 기계적 특성이 IOP 유도 기계적 변형에 대한 ONH 반응을 결정합니다 7,8. 유한 요소 모델링 및 체외 연구를 통해 LC 생체역학적 변형률은 공막 강성에 의존하며, 향상된 PPS 강성은 LC 9,10의 변형률 감소에 기여함을 확인했습니다. 그 후 PPS의 강성변화 11,12와 두께13은 ONH의 IOP 관련 생체역학적 특성을 변화시켜 녹내장 시신경 손상에 대한 감수성을 더욱 변화시킬 수 있습니다14,15. 생체역학 연구에서 녹내장 공막의 안구 강직성이 사후 인간 눈에서 정상 공막보다 더 컸으며(16,17), 유두주위 공화의 경직이 인간 녹내장과 실험 동물 모델 모두에서 일관되게 관찰되었다(18,19,20). 이 데이터는 녹내장 중 IOP에 의한 ONH 변형 감소를 통한 보호적 반응일 수 있음을 시사합니다.

공막 조직의 생체역학적 특성은 섬유아세포에 의해 합성된 세포외기질 구성에 의해 결정됩니다21. 최근 증거는 IOP 증가로 인한 기계적 스트레스가 공막 내에 존재하는 공막 섬유아세포를활성화하고, 근섬유아세포 분화를촉진하며, ECM 재형성을 초래할 수 있음을 시사합니다. 24,25. 기계적 긴장에 의해 유도된 근섬유아세포 변형은 녹내장에서 공막 ECM 재형성 과정에서 핵심 과정이지만, 기계적 긴장이 어떻게 장막 섬유아세포에서 생화학적 신호와 세포 반응으로 전환되는지는 명확하지 않습니다.

피에조1은 심장 및 폐 피부를 포함한 여러 장기의 섬유화에 관여하는 새로운 비선택적 양이온성 기계민감성 채널 가족의 일원 중 하나입니다26,27. 기계적 변형은 세포 내 Piezo1 채널을 활성화시켜 Ca2+ 유입을 증가시키고, 이를 통해 섬유아세포의 증식, 운동성, 분화 등 다양한 세포 활동을 조절하는 칼슘 의존적 신호를 촉진할 수 있다29,30. 최근 연구에 따르면 기계적 변형 하에서 피에조1은 섬유아세포 증식, 운동성 및 분화를 자극하여 피부 섬유화 과정을 촉진합니다31. 이 연구는 두 가지 보완 요소를 포함합니다: 쥐 안구 고혈압 모델에서 Piezo1 발현의 생체 내 기술적 연구와 주기적 기계적 변형 하에서 일차 인간 공막 섬유아세포를 이용한 기전적 시험관 연구입니다. 기계적 변형이 Piezo1을 활성화하여, YAP 신호를 통해 공막섬유아세포의 근섬유아세포 분화와 ECM 구성 요소 발현을 촉진한다고 가설을 세웠습니다.

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프로토콜

수컷 스프래그-도울리 쥐(8주 생후)는 푸단대학교 어린이병원 실험동물센터에서 채취되었습니다. 모든 쥐는 자유롭게 사육되었으며, SPF 조건인 22±1°C와 12시간 주야간 주기를 유지했습니다. 모든 동물 실험은 안과 및 시각 연구에서 동물 사용을 위한 ARVO 선언을 준수했으며, 복단대학교 아동병원 기관심사위원회 및 윤리위원회(2022JS-EKYY-019)의 승인을 받았습니다. 1차 인간 경광섬유아세포를 유도하는 데 사용된 인간 경막 조직은 기관 지침에 따라 기증자 공막에서 채취되었으며, 관련 모든 절차는 복단대학교 기관심의위원회(2024-YS-187)의 승인을 받았습니다.

실험 설계

본 연구는 기계적 변형으로 개념적으로 연결된 생체 내 및 시험관 내 접근법을 모두 사용하여 피에조1이 공막 ECM 재형성에 기여하는 바를 조사하였다. 생체 내에서 우리는 쥐 안구 고혈압 모델을 사용하여 높은 안압 하에서의 피에조1 발현을 조사하였습니다. 시험관 내에서 우리는 1차 인간 공막섬유아세포를 주기적으로 기계적 신장에 노출시켜 녹내장에서 공막이 겪는 기계적 스트레스를 모델링했으며, 약리학적 작용제(Yoda1), 억제제(GsMTx4), siRNA 넉다운을 이용해 Piezo1 활성을 조작했습니다.

실험적 만성 안구 고혈압(OHT) 모델

총 18마리의 수컷 SD 쥐가 사용되었습니다. 각 쥐에서 오른쪽 눈은 카보머 주사를 맞아 안구 고혈압(OHT)을 유도했으며, 반대쪽 왼쪽 눈이 대조군(NT) 역할을 했습니다. 전체 실험의 독립적인 생물학적 복제 세 개가 수행되어 그룹당 총 18개의 눈이 나타났다. 실험 단위는 개별 눈이었다. IOP 측정과 웨스턴 블롯 분석을 수행한 연구자들은 그룹 배정에 대해 눈 보호를 받았습니다.

앞서 설명한 만성 OHT 실험 모델이 쥐를 대상으로 생성되었습니다25. 잠시 쥐는 10% 클로랄 하이드레이트로 마취되었고, 트로피카마이드로 동공을 확장한 후 카보머 용액(0.3%, 20 μL)을 전방 안구 챔버에 주입했다. 감염 예방을 위해 클로르테트라사이클린 염산염이 적용되었다. 3일과 7일 후 반동 타노미터를 사용하여 IOP 측정을 수행하였습니다. 모델이 확립된 것으로 간주된 지 일주일 후에 공막에서 조직을 채취했습니다.

공막 조직은 앞서 자세히 설명한 대로 분리되었다. 마취 후, 쥐들은 경심 관류로 4% 포름알데히드 PBS를 투여하였다. 불필요한 안과 조직을 구체에서 해부하고, 전방 분절 구조(각막, 홍채, 수정체)와 유리체를 조심스럽게 제거하였다. 망막과 맥락막은 안막벽에서 부드럽게 긁어냈습니다. 후방 공막 조직은 병리적 H&E 염색으로 채취 및 확인되었습니다.

세포 배양

일차 인간 강막섬유아세포(HSF 세포)는 이전에 인간 공공에서 유래한 세포주였다. 각 실험에는 세 개의 독립적인 생물학적 복제체(세 명의 서로 다른 기증자의 세포)가 사용되었습니다. HSF 세포는 표준 배양 조건(37°C, 5% CO2, 습윤 대기)에서 15% 태아 소 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충한 DMEM에서 유지되었습니다. 배양은 4일마다 분할되었으며, 모든 실험에서 5번과 9번 사이의 HSF 세포를 사용했습니다. HSF 세포는 콜라겐 타입 I과 α평활근 액틴 세포 표지를 이용한 면역형광법으로 확인되었습니다.

기계적 자극의 적용

순환 기계적 신장 시스템은 기계적 순환 신장 효과를 내는 데 사용되었습니다. 콜라겐 코팅된 유연한 바닥이 있는 6웰 플레이트에 부착된 HSF 세포에는 2×105 cells/mL의 시딩 밀도가 사용되었습니다. 스트레칭 그룹 세포는 이전 연구에서 설명한 대로 10% 진폭과 0.5 Hz의 순환 신장에 노출되었습니다32. 스트레치 플레이트에서 배양하되 정지 세포를 남겨두는 것이 대조군 역할을 했습니다. 피에조1 siRNA 녹다운 실험: 세포는 기계적 신장 전에 48시간 동안 피에조1 siRNA 또는 음성 대조 siRNA의 형질전환을 받았습니다. 형질전환 후 세포들은 24시간 동안 주기적으로 기계적 신장을 겪었습니다. 네 그룹이 포함되었습니다: (A) 스트레칭 없이 siRNA 형질전환 세포를 대조군; (B) 스트레치로 siRNA 트랜스펙션 세포를 조절; (C) 신장 없는 피에조1 siRNA 형질전환 세포; (D) 스트레칭을 이용한 피에조1 siRNA 형질전환 세포. 피에조1 억제제(GsMTx4) 실험: 세포는 기계적 신장 전과 중에 5 μM GsMTx4로 처리되었습니다. 네 그룹이 포함되었습니다: (A) 신장 없는 치료되지 않은 세포; (B) 치료되지 않은 신장 세포; (C) 신장 없는 GsMTx4 처리 세포; (D) GsMTx4 처리 세포와 신축 (전반적으로 GsMTx4가 존재함). 압전 작용제(Yoda1) 실험: 세포를 5 μM Yoda1 존재 상태에서 24시간 배양했습니다. 두 그룹이 포함되었습니다: (A) 치료되지 않은 (차량) 대조군; (B) 요다 1 처리 세포.

서부 블롯팅

단백질 수치는 일상 절차 후 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다. 간단히 말해, 우리는 RIPA 완충액에서 공막 또는 배양된 섬유아세포 샘플을 용해했습니다. 단백질(20 μg)은 SDS-PAGE로 분리된 후 니트로셀룰로오스 막에 블롯되었습니다. 그 후 5% BSA로 상온에서 1시간 동안 차단한 후, 적절한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양했습니다. 사용된 항체에는 피에조1, 콜라겐 1형, α평활근 액틴, YAP, GAPDH가 포함되었습니다. Piezo1 항체는 제조사에 의해 쥐 및 인간 조직에서 웨스턴 블롯과 면역형광에 대해 검증되었으며, 제품 시트에 녹아웃/녹다운 데이터가 제공됩니다. TBST로 세 차례 세척한 후, 적절한 HRP 접합 2차 항체(항토끼 또는 항생쥐)와 함께 실온에서 1시간 동안 막을 배양했습니다. 이후 영상 분석 소프트웨어를 사용해 대역 강도를 측정했고, 각 대상 대역의 신호를 동일한 레인의 GAPDH 신호와 정규화했습니다. 결과 데이터는 제어 조건에 대해 폴드 변화(fold-change)로 제시됩니다.

세포 증식

세포 증식은 제공된 프로토콜에 따라 색도 생존 측정법으로 평가하였다. 각 웰에 테트라졸륨 화합물(10 μL/mL)을 추가하고 표준 배양 조건(37 °C, 5% CO2)에서 2시간 배양했습니다. 흡수도는 450nm에서 측정되었습니다.

소량 간섭 RNA 형질염

피에조1 siRNA 형질전환은 앞서 설명한 대로 수행되었습니다. 서열은 다음과 같다: Piezo1-siRNA, 5'-AGAAGAAGAUCGUCAAGUATT-3'(의미), 5'-UACUUGAGAGAUCUCUCUCUCUTT-3'(안티센스), 음성 대조(NC) siRNA, 5'-GUGAGCUCUAUACAUCCAUCT-3'(의미), 5'-AUGGUAUAGAUGAGCUCACTT-3'(안티센스).

면역형광

면역형광을 위해 배양된 세포는 4% 파라포름알데히드(20분, 상온)로 고정하고, 0.1% Triton X-100(40분)으로 투과시킨 후 10% BSA로 차단하였다. 조직 절편은 4% 파라포름알데히드에 실온에서 하룻밤 고정한 후 투과화 및 차단을 거쳤습니다. 피에조1과 α-SMA에 대한 1차 항체와 함께 샘플을 배양하였습니다. 그 후, 형광 염료 결합 2차 항체인 녹색 표지 항생쥐제(α-SMA용)와 적색 표지 항토끼제(Piezo1용)를 각각 1:500 희석 비율로 도포하였습니다. 핵은 DAPI로 염색되었고, 형광 현미경으로 이미지를 촬영했습니다.

작용제 및 억제제 치료

HSF 세포는 이전 연구를 기반으로 5 μM GsMTx4와 5 μM 압전 작용제 Yoda1로 처리되었습니다33.

통계 분석

각 실험은 세 번씩 수행되었다. 결과는 표준편차(SD)± 평균 단위로 제시됩니다. 두 그룹 간 비교를 위해 양측 Student's t-검정을 적용했습니다. 다중 그룹 비교를 일원 ANOVA 후 Tukey의 사후 검사로 수행하였습니다. 데이터의 정규성은 샤피로-윌크 검정으로 확인되었고, 분산의 동질성은 레벤 검정으로 평가되었다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 정의되었습니다. 모든 통계 분석은 전용 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.

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결과

Piezo1은 쥐 공막 조직과 HSF 세포에서 발현됩니다

먼저, 쥐 공막 조직(생체 내)과 배양된 인간 공막섬유아세포(시험관 내)에서 Piezo1 발현을 조사했습니다. 조직 특이적 발현 Piezo1을 조사하기 위해 BioGPS 유전자 주석 데이터베이스를 사용했습니다. BioGPS 분석 결과, 피에조1은 망막 색소 상피, 홍채, 각막, 안컵 등 다양한 안구 조직에서 고도로 발현되어 있음을 밝혀냈습니다(그림 1A). 생체 내에서 면역형광 검사로 SD 쥐의 공막 조직에서 Piezo1 발현이 확인되었습니다(그림 1B). 쥐 공막 조직과 시험관 내 HSF 세포에서 Piezo1과 α-SMA의 공동 위치가 관찰되었으며, 이는 공막 섬유아세포에서 Piezo...

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토론

높은 안압(IOP)은 시신경두와 층열에 기계적 부담을 유발하여 망막 신경절 세포 퇴행에 기여합니다38,39. 유두주근 공막(PPS)은 ONH 생체역학에 영향을 미치는 주요 하중 지지 조직입니다. 이전 연구들은 기계적 긴장이 공막 섬유아세포에서 근섬유아세포로 분화하고 세포외기질(ECM) 재형성을 유도하여 공막 강성을 유발한다는 것을 보여주었다41. IOP 관련 기계적 힘에 의해 유도된 ECM 재형성은 녹내장 치료에 유망한 표적이 될 수 있으나, 기계적 힘에 의한 ECM 재형성의 근본 분자 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았습니다. IOP는 안벽 내에서 정수압과 벽 장력(신장)을 모두 생성합니다. 본 연구에서는 Flexcell 시스템을 사용하여 순환 기계적 신장 방식을 적용하기로 했는데,...

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공개 사항

저자들은 서로 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가자연과학기금(보조금 번호 82401257)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.3% carbomer solution (Carbomer 940 polymer)Solarbio, Shanghai, China—20 μL
10% chloral hydrateMacklin, Shanghai, China—3 mL/kg
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse secondary antibodyThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA —
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit secondary antibodyThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA—
BioFlex six-well culture plates (coated with collagen I)Flexcell Int Corp, Hillsborough, NC, USA—
Chlortetracycline hydrochlorideZhenhua Pharmaceutical, Yunnan, China—
COL1 primary antibodyNovus Biologicals, CO, USA—
DMEMGibco, Grand Island, NY, USA—
FBSGibco Life Technologies, Australia—
GAPDH primary antibodyBioworld, MN, USA—
GraphPad Prism version 8.4Inc., San Diego, CA, USA—
Nikon Eclipse E800 microscopeNikon, Melville, NY, USA—
Nitrocellulose membranesPierce, Rockford, IL, USA—
Penicillin-streptomycinHyclone, South Logan, UT, USA—
Piezo1 primary antibodyNovus Biologicals, CO, USA—
Rebound tonometer (TonoLab)Icare, Espoo, Finland—
RIPA bufferThermo Fisher Scientific, Shanghai, China—
The Flexcell FX-5000 Tension SystemFlexcell International Corporation—Used to apply mechanical cyclic stretch to HSF cells.
TropicamideBausch Lomb Freda, Shandong, China—
YAP primary antibodyCell Signaling Technology, Danvers, USA—
α-SMA primary antibodyAbcam, Cambridge, UK—

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