방법 논문

사회적으로 사는 쥐에서 인텔리케이지 테스트 시스템을 통한 자동 간헐적 음주

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DOI:

10.3791/71345

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2026년 6월 5일

 ,  ,  , 
1Section on Neurobiology of Compulsive Behaviors, National Institute on Mental Health, Intramural Research Program, National Institutes of Health

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 IntelliCage 테스트 시스템을 통해 사회적으로 수용된 쥐에서 알코올 음주 행동을 고처리량으로 자동화한 평가 방법을 제시합니다. 여기에는 조작적이고 간헐적인 음주 패러다임에 대한 상세한 방법론과 실험 파일 및 결과 데이터를 분석할 수 있는 코드가 제공됩니다.

초록

사회적 고립이 설치류 행동에 미치는 혼란이 알려져 있음에도 불구하고, 많은 연구자들은 알코올 사용 장애(AUD) 전임상 모델에서 알코올 선호를 평가하기 위해 단독 사육 쥐를 활용합니다. 이 프로토콜은 사회적 고립으로 인한 스트레스 혼란 없이 쥐의 음주 행동을 고처리량, 자동화된 평가로 제공하는 사회적 음주 과제를 설명합니다. IntelliCage 검사 시스템은 최대 16마리의 동성 마우스에서 동시에 음주 행동을 평가할 수 있게 하며, 각 쥐는 피하에 삽입된 무선 주파수 식별(RFID) 트랜스폰더로 고유하게 식별됩니다. 식당 보트병 접근은 소프트웨어로 제어되며 마우스별로 개별적으로 조정할 수 있습니다. 이 만성적이고 간헐적인 음주 패러다임에서 쥐들은 6주 연속 20% 알코올이 들어있는 주머니 병에 접근하기 위해 자발적으로 조작적인 코를 찌르는 행위를 합니다. 알코올 병은 하루 간격으로 24시간 동안 접근할 수 있으며, 처벌에 민감한 음주 여부를 평가하기 위해 퀴닌을 첨가해 선택적으로 첨가할 수 있습니다. 각 조작 코, 코 찌르기, 핥는 데이터 방문 기록이 각 마우스에 자동으로 기록됩니다. 상세한 실험 방법과 기록된 데이터를 분석하는 오픈소스 코드를 통해 연구자들은 AUD와 관련된 음주 행동을 점점 더 효율적이고 윤리학적으로 적합한 방식으로 평가할 수 있게 될 것입니다.

서론

전임상 모델 연구는 알코올 사용 장애(AUD) 유사 행동의 신경생물학적 메커니즘을 더 깊이 이해하는 데 매우 중요합니다. 그러나 설치류의 알코올 음주 측정 방법들, 예를 들어 두 병 선택 1,2,어둠 속에서 음주 3,4,5 테스트는 단일 서식하는 설치류의 액체 부피를 수동으로 측정해야 하는데, 이는 낮은 처리량과 오류가 잦은 방법입니다. 최근 커패시티브 6,7,8,9,10 또는 광전기11,12 기술을 사용하는 오픈 소스 리코미터 시스템의 채택은 알코올 음주 방법론의 처리량, 정확성, 기술적 민감도에서 상당한 진전을 의미합니다. 하지만 대부분의 가정용 케이지 리코미터 시스템은 설치류를 단독으로 보관해야 하므로 격리 스트레스가 발생한다13,14. 보고된 결과는 매우 다양하지만(15,16), 설치류는 일반적으로 단독 사육 시 알코올을 더 선호하는 경향이 있습니다(17,18,19,20). 그러나 사회적 고립이 음주에 미치는 영향은 동물의 나이, 성별, 주거 환경, 이전 스트레스 노출에 따라 다릅니다 20,21,22. 사회적 고립은 실험적 조작과 상호작용하여 평가된 AUD 유사 행동 결과의 타당성을 제한할 가능성이 있습니다.

IntelliCage 테스트 시스템(TSESystems 23, 24, 25)이나 오픈 소스 대안인 LIQ PARTI20, FARESHARE26과 같은 완전 자동화된 가정용 케이지 모니터링 시스템들은 여러 개의 집단 사육 동물에 대한 리코메트리와 무선 주파수 식별(RFID) 추적을 결합하여 이 문제를 해결합니다. 이러한 가정 감시 시스템은 사회적 고립으로 인한 스트레스 없이 음주 행동을 보다 효율적이고 재현 가능하게 합니다. 따라서 AUD와 유사한 행동에 대한 취약성에 영향을 미치는 실험적 조작에 대한 고처리량 검증 연구에 이상적입니다. 이 중 IntelliCage 테스트 시스템은 프로그래밍 가능한 조작 코너를 통합해 음료 병 접근을 차단하는 독특함으로, 약물 접근이 없을 때 탐색 행동을 평가하고 개별 동물의 조작 비율을 조절할 수 있게 합니다.

여기서 저자들은 사회적으로 입양된 쥐들을 대상으로 IntelliCage 테스트 시스템을 통해 진행된 간헐적 음주 패러다임을 제시한다27,28. 이 패러다임은 최대 16마리의 동성 쥐에서 장기간 자동 음주 평가를 가능하게 하며, 각 쥐는 피하에 삽입된 RFID 트랜스폰더로 고유하게 식별됩니다. 아래에서 설명하듯, 쥐들은 고정된 비율(FR)-3에서 코를 찔러 빨대기 병에 접근하도록 훈련됩니다. 짧은 교육 기간 후, 네 개의 작동 가능한 코너 중 두 곳에 있던 음료 병은 20% 알코올(수돗물에 95% 에탄올 [190 프루프], v/v)로 교체됩니다. 쥐는 물을 계속 마실 수 있지만, 24시간 동안 간헐적으로 술을 마실 수 있습니다(오후 12시 30분부터 12시 30분까지). 알코올 핥기는 6주에 걸쳐 정량화되며, 실험 중간에 2일간의 퀴닌 변조(0.5 mM, 1.0 mM) 검사를 통해 처벌에 민감한 음주 여부를 평가합니다. 각 마우스에 대해 방문, 코 찌르기, 핥기 데이터가 기록되어 TSE의 독점 소프트웨어를 사용해 추출한 후, 오픈 소스 파이프라인29를 통해 분석하여 AUD와 유사한 행동에 대한 통찰을 얻습니다.

이 프로토콜은 INTELLICAGE 테스트 시스템의 다른 발표된 활용법을 보완하여 AUD 유사 행동 30,31,32,33,34,35,36,37,38,39 및 기타 물질 사용 장애 유사 행동 40,41,42. 간헐적 접근 일정이 설치류의 자발적 음주 증가를 촉진한다는 보고와 일치하듯, 이 프로토콜은 대부분의 쥐에서 자발적 알코올 섭취량이 높게 나타납니다. 그럼에도 불구하고, 저자들이 프로토콜 전반에 걸쳐 지적하듯이, 실험 매개변수는 실험적 질문에 맞게 쉽게 수정될 수 있습니다. 전반적으로 이 방법론은 AUD의 기전을 연구하는 데 효율적이고 유연한 해결책을 제공합니다.

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그림 1: 고유 RFID 식별을 통한 쥐 방문, 코 찌르기, 핥기 등을 완전 자동화 추적. (A) 쥐 RFID 트랜스폰더 이식의 만화 다이어그램. RFID 트랜스폰더는 자동으로 홈케이지 모니터링 시스템에서 개인 추적을 가능하게 하기 위해 등경추 부위에 피하 이식됩니다. (B) 자동화된 간헐적 알코올 패러다임 동안의 데이터 수집 단계 개요. 동물 신원이 읽히고, 두 개의 RFID 링 안테나와 온도 센서 측정값을 통해 코너 방문을 기록하는데, 이 두 기기 모두 양성이어야 방문이 기록됩니다(왼쪽). 그 후 쥐들은 FR-3 스케줄에 맞춰 코를 찌르도록 훈련시켜 주머니 분주한 병(중간)에 접근합니다. 코를 성공적으로 찌르면 5초의 시퍼 병 접근이 가능하며, 이때 마우스의 핥기는 정전 용량 기반 리코미터(오른쪽)로 기록됩니다. 루시 앤더슨이 수정한 BioRender 템플릿을 기반으로 만든 만화로, CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy) 라이선스 하에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

프로토콜

모든 실험 절차는 NIH 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았으며, 실험동물의 인도적 돌봄과 사용에 관한 공중보건국 정책을 준수했습니다.

1. 장비 준비

참고: 각 IntelliCage 테스트 시스템은 최대 16마리의 동성 쥐가 거주할 수 있는 대형 플라스틱 가정용 케이지(39cm x 58 cm x 21cm)로 구성되어 있습니다. 이전 코호트들은 케이지당 8마리에서 16마리의 쥐 크기였습니다. 이 장치는 네 개의 조작식 모서리를 갖추고 있으며, 모두 상단 덮개에 있는 중앙 마이크로프로세서와 연결됩니다. 설치류 주우는 뚜껑 중앙에 설치된 대형 금속 호퍼에서 접근할 수 있습니다. 우리 안에서는 쥐들이 자유롭게 움직이는 구석과 중앙 생활 공간 사이를 돌아다닙니다. 중앙에는 침구와 풍부한 재료가 갖춰져 있습니다. 각 조작 코너에는 한 번에 한 마리의 마우스만 물리적으로 들어갈 수 있는 작은 원형 입구가 있습니다. 쥐의 신원은 이중 RFID 링 안테나와 온도 센서 측정값을 기반으로 읽고 기록되며, 두 가지 모두 양성이어야 방문이 기록됩니다. 각 조작 코너에는 두 개의 노즈포크 포트가 제공되며, 각 구멍은 두 개의 모터 문 중 하나를 제어합니다. 이 프로그래밍 가능한 모터 도어는 두 개의 빨대컵 병 중 하나를 사용할 수 있게 해줍니다. 연구자들은 시퍼 병 접근과 정전 용량 기반 리코미터의 민감도를 수동으로 프로그래밍합니다. 방문, 코 찌르기, 핥기 데이터는 각 마우스별로 개별적으로 기록되어 중앙 마이크로프로세서를 통해 TSE의 독점 소프트웨어 시스템이 탑재된 컴퓨터로 전송됩니다. 이 프로토콜에서는 다루지 않겠지만, 각 조작 챔버에는 혐오 조건화에 사용되는 프로그래밍 가능한 공기 퍼프 밸브도 포함되어 있습니다.

  1. 플라스틱 홈케이지에 압축된 면섬유 패드 5개(15.24 x 25.4 cm), 작은 면 사각형 2개(5.08 x 5.08 cm), 그리고 침구와 풍화 시설을 위한 4개의 플라스틱 굴 구조물을 장착하세요.
    참고: 압축된 면섬유 패드 사용은 두 가지 이유로 권장됩니다: (1) 일반적으로 사용되는 침구재의 먼지나 조각이 문 기계장치에 방해가 되는 것을 방지하기 위함, (2) 동물 간 싸움을 더 쉽게 식별할 수 있도록 하기 위함.
  2. 상단 뚜껑을 플라스틱 홈케이지에 넣으세요.
  3. 분리된 상태라면, 제공된 케이블을 사용해 모든 조작 코너를 중앙 마이크로프로세서에 연결한 후, 중앙 마이크로프로세서를 CAN 케이블을 이용해 TSE 소프트웨어가 미리 탑재된 컴퓨터에 연결하세요.
    1. 여러 장치를 사용할 경우, 모든 케이지를 같은 컴퓨터에 직렬적으로 연결하세요.
  4. 마이크로프로세서를 전원에 연결하고 각 모서리의 LED 조명이 켜지고, 여덟 개의 모터 문이 모두 움직이도록 하세요.
  5. 수돗물(또는 기타 액체)이 담긴 8개의 시퍼 병에 각각 250mL 정도 채우고, 뚜껑을 단단히 눌러 밀봉을 확인한 후, 리코미터 입구에 부드럽게 비틀어 리코미터와 단단히 연결되도록 하세요.
    참고: 방문, 코 찌르기, 핥기 센서 감도는 파일럿 실험을 통해 선택적으로 최적화할 수 있습니다. 각 모서리의 감도를 조정하려면 "컨트롤러" 프로그램의 "도움말" 파일에 설명된 제조사 지침을 따르세요. 모든 연구는 다음 설정을 사용했습니다: 방문 - 816 온/768 오프; 노즈포크 - 21회 켜짐/26회 꺼짐; 리코미터 - 69 켜짐/80 꺼짐/15 타임아웃.
  6. 먹이 호퍼에 설치류 먹이를 채우세요.
  7. 컴퓨터를 켜고, "컨트롤러" 애플리케이션을 열어 원하는 실험 파일을 불러오세요.

2. 동물 준비

참고: 동물은 행동 검사 시작 최소 일주일 전에 RFID 트랜스폰더를 이식하여 충분한 회복 시간을 확보해야 합니다. 최소 ~50일 이상 된 쥐를 사용하고, 체중이 15g 이상입니다. 작은 쥐를 이식하면 주사 중 쥐가 다칠 위험이 높아집니다. 마우스 계통에 따라 공격성이 특히 수컷 집 환경에서 문제가 될 수 있습니다. 사춘기 동안 모든 생쥐를 함께 키워 이 위험을 줄이세요. 저자들은 성체(~PND 80–150) 야생형 C57BL/6 마우스를 대상으로 한 연구에서 유의미한 공격성을 관찰하지 않았으나, 이것이 이 프로토콜이 다른 유전자형, 연령 또는 서식지에 일반화된다는 보장은 하지 않는다.

  1. 쥐를 피하에 삽입하여 등경추 부위에 RFID 트랜스폰더를 이식하여 고유 식별을 수행합니다.
    1. 모든 실험동물을 나열한 데이터 표를 출력하고, 각 동물 ID 옆에 빈칸을 두어 RFID 코드를 적은 바코드 스티커를 붙이세요.
    2. 모든 동물과 필요한 물품을 수집하세요: RFID 트랜스폰더, 재장전 가능한 RFID 트랜스폰더 인젝터, 그리고 아이소플루란 유도 장비.
    3. 첫 번째 쥐를 유도실에 넣고 증발된 이소플루란(산소 유량계: 분당 1.5mL, 이소플루란: 1.5–3.5%)으로 마취하여 쥐가 크게 딸꾹질하는 숨을 쉬고 발가락 꼬집음에도 반응하지 않을 때까지 마취합니다.
      1. 쥐가 마취될 때까지 기다리는 동안, 미리 장착된 바늘을 인젝터 베이스에 나사로 고정한 후 주사기를 천천히 배출하여 마이크로칩이 움직이는 것을 볼 때까지 RFID 트랜스폰더를 장전합니다.
      2. RFID 코드를 식별하는 바코드를 해당 동물 ID 옆에 인쇄된 데이터 테이블에 부착하세요.
    4. 마우스를 유도실에서 꺼내고, 미리 장전된 RFID 트랜스폰더를 등경추 부위에 피하 삽입합니다.
      1. 먼저 쥐가 발가락 꼬집기에 반응하지 않는다는 것을 확인한 후, 우세 손이 아닌 손의 엄지와 검지로 어깨뼈 바로 위에서 쥐의 목덜미를 꼬집습니다.
      2. 우세한 손을 사용해 주입 바늘을 쥐의 수피 끝에 삽입하며, 바늘을 척추 위와 평행하게 들어 올려 쥐를 다치게 하지 않도록 주의하세요.
      3. 주사기 끝을 쥐의 목덜미 안에 넣고 엄지와 검지 사이에 단단히 고정한 상태에서, 주도손을 조심스럽게 움직여 인젝터 플런저를 눌러야 합니다.
      4. RFID 트랜스폰더를 분리하고, 비우세 손의 손가락을 목덜미를 잡아 마이크로칩이 주사기 끝에서 빠져나간 후 만져보세요.
      5. 수염을 꼬집은 채로 인젝터를 천천히 제거하세요. 인젝터가 완전히 제거된 후에야 트랜스폰더가 빠지지 않도록 수염을 놓아주세요.
        참고: 선택적으로 마취 상태에서 피부를 닫기 위해 단일 봉합 매듭을 추가할 수 있습니다.
    5. 쥐를 다시 집으로 돌려놓고 마취 후 완전히 움직일 때까지 회복 상태를 관찰하세요.
    6. 부분 마비, 절뚝거리기, 원을 그리는 동작 등 신체적 손상 징후가 있는지 마우스를 관찰하여 주사가 빗나갔음을 나타내는 경우도 있습니다. 장애가 24시간 이상 지속되거나 동물 복지에 심각한 영향을 미친다면 인도적으로 안락사하십시오.
      1. RFID 트랜스폰더 리더기를 쥐의 등경추 부위 위에 대고 스캔하여 성공적인 위치 확인.
    7. 선택적으로 조직 샘플을 채취해 유전자형 분석도 가능합니다.
      1. 모든 실험용 마우스에 대해 반복합니다.
  2. RFID 트랜스폰더 이식 하루 후, RFID 트랜스폰더 리더기를 사용해 쥐가 RFID 트랜스폰더를 잃어버린 적이 없는지 확인하세요. 만약 트랜스폰더를 잃은 쥐가 있다면, 새 트랜스폰더로 같은 절차를 반복하고 기록을 업데이트하세요.
    참고: 보통 쥐가 RFID 트랜스폰더가 떨어질 경우, 이식 후 24시간 이내에 발생합니다. 이는 RFID 트랜스폰더 설치가 잘못되었거나, 주사 부위에서 쥐가 손질/긁히는 행위로 인해 발생할 수 있습니다. 이전 주사 상처에 재주입하는 것을 피하고, 세 번의 RFID 트랜스폰더 이식이 실패한 경우 쥐는 제외하세요.
  3. 쥐를 IntelliCage 장치에 재배치하기 전에 모든 RFID 트랜스폰더가 정상적으로 읽힐 수 있는지 확인하세요. 모든 쥐의 체중을 재고 기록하세요.

3. 실험 파일 준비

참고: IntelliCage 테스트 시스템은 TSE에서 제공하는 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 제어 및 운영됩니다. IntelliCage 실험을 실행하는 데 사용되는 애플리케이션은 세 가지가 있습니다: "디자이너", "컨트롤러", "분석기". 실험의 여러 단계는 "디자이너" 애플리케이션에서 설계되고 "컨트롤러" 애플리케이션에서 실행되는 서로 다른 실험 파일을 통해 수행됩니다. 실험 파일 설계 및 적응 방법에 대한 자세한 정보는 이전에48,49에 설명되었습니다. 연구에서 사용된 네 가지 실험 파일(Habituation.experiment, Water Training.experiment, Intermittent Alcohol.experiment, Open Bar.experiment)의 템플릿이 프로토콜 복제를 돕기 위해 제공되었습니다. 이 파일들에서는 12시 30분에 위상 변화가 일어납니다. 저자들은 동물들이 오전 6시부터 오후 6시까지 빛 주기를 따라 사육되었기 때문에 이 시기를 선택했습니다. 이로 인해 음주 행동을 측정할 수 있는 끊김 없는 암흑 단계가 열렸습니다. 하지만 조사관들은 이 시간을 '어둠 속에서 음주' 절차와 같은 다른 음주 방법론과 일관되게 변경하고 싶어 할 수있습니다.

  1. "디자이너" 애플리케이션에서 실험 파일을 설정하세요.
    참고: 템플릿 파일을 사용할 경우, 현재 코호트에 입력하기 전에 네 가지 예시 동물을 삭제하세요. 또한, 실험 설계에 맞춰 그룹 이름을 바꾸고 필요에 따라 그룹을 추가하세요. 새 그룹들이 템플릿에 있는 클러스터와 같은 클러스터에서 시작하는지 확인하세요.
    1. "Designer" 애플리케이션에서 Habituation.experiment 파일을 열고 각 마우스의 동물 ID, RFID 트랜스폰더 코드, 실험 그룹/유전자형을 조심스럽게 입력하세요. 템플릿 파일을 유지하기 위해 새 이름으로 저장하세요.
      참고: RFID 트랜스폰더 코드가 잘못 입력되면 데이터가 기록되지 않습니다. 동물을 관련 실험 그룹에 배정하면 행동을 모니터링하고 궁극적으로 데이터를 분석하는 데 도움이 됩니다.
    2. 동물 정보를 동물 파일 형식으로 내보내세요.
    3. 실험의 각 단계마다 해당 실험 파일을 열고 동물 파일을 불러오세요. 적절히 저장하고 이름을 바꾸세요.
    4. 별도의 컴퓨터에서 파일을 설계할 경우, 실험 파일을 휴대용 플래시 드라이브에 다운로드하여 행동실로 옮기세요.
  2. IntelliCage 장치에 연결된 컴퓨터에 모든 실험 파일을 다운로드한 후 "컨트롤러" 애플리케이션에서 첫 번째 파일을 엽니다. 모든 정보가 제대로 로드되는지 확인하세요.
  3. 종이든 전자적으로든, 실험의 각 단계를 시작/종료할 수 있는 날짜와 시간을 기록하는 실험 로그 파일을 만드세요. 이는 분석에 큰 도움이 될 텐데, 특정 약물 상태(예: 퀴닌 변조 알코올)는 인텔리케이지 아카이브 파일에 기록되어 있지 않기 때문입니다.

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그림 2: 조작적, 간헐적 음주 패러다임의 실험적 타임라인. (A) 네 모서리 중 두 곳에 알코올이 든 음료 병이 있는 인텔리케이지 장치의 도면. (B) 이전 출판물에서 사용된 모든 실험 단계의 일정을 나타내는 실험 타임라인23. 코호트 1은 간헐적 음주 종료 후 퀴닌 변조 알코올 검사를 실시했으며, 코호트 2와 3은 불순물 후 간헐적 음주로 복귀했습니다. (C) 모든 실험 단계의 소프트웨어 변경 사항을 상세히 보여주는 실험 달력: 습관화, 수중 훈련, 간헐적 음주, 퀴닌 첨가 알코올 검사, 그리고 "오픈 바"/무료 음주 사용. 케이지 교체는 "알코올 접근 ON" 모듈 완료 후 최소 주 1회 일정이 잡힙니다. 루시 앤더슨이 수정한 BioRender 템플릿을 기반으로 만든 만화로, CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy) 라이선스 하에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

4. 실험 실행

참고: 조작적이고 간헐적인 음주 패러다임은 다섯 단계로 구성됩니다: (1) 습관화, (2) 수중 훈련, (3) 간헐적 음주, (4) 퀴닌 첨가 알코올 검사, (5) "오픈 바"/자유 접근 음주 등. 실험의 각 단계는 간헐적 음주 음주와 퀴닌 변조 알코올 검사를 제외한 서로 다른 실험 파일에서 진행되며, 두 검사 모두 간헐적 알코올.experiment 파일에 명시된 매개변수를 사용합니다. 케이지 교체 외에도, 실험자들은 쥐를 주 3회 이상 점검하여 동물의 복지를 평가하고 소프트웨어가 제대로 작동하는지 확인해야 합니다. 부상이나 몸이 좋지 않은 쥐는 실험에서 제외해야 합니다. 예제 실험 일정은 그림 2를 참조하세요.

  1. 케이지 교체
    참고: 케이지 교체는 최소 주 1회 해야 합니다. 음주 중에는 "Water Access ONLY" 기간 중 오후 12시 30분 이후에만 이 변경을 하여 음주를 중단하지 않도록 하십시오. 이를 위해 Intermittent Alcohol.experiment 와 Open Bar.experiment 파일은 항상 "Water Access ONLY"로 시작합니다. 케이지의 크기 때문에 혼자서 사람이 있는 케이지를 다루기가 어렵습니다. 저자들은 케이지 교체를 위해 최소 한 명의 추가 연구자를 지원할 것을 권장합니다. 케이지 교체 후 24시간 동안 쥐를 점검하여 소프트웨어가 제대로 작동하는지, 그리고 케이지 교체로 인한 스트레스로 인한 공격성이나 싸움이 발생하지 않았는지 확인하세요.
    1. 새장 교체를 시작하기 전에 깨끗한 플라스틱 새장과 새 침구, 둥지 재료로 준비하세요. 8개의 흡입용 물병 각각에 ~250mL의 수돗물 또는 20% 알코올(수돗물에 95% 에탄올 [190도], v/v)을 채우세요.
      참고: 선택적으로 조사관은 새 깨끗한 우리에 오래된 침구 재료를 소량 추가할 수 있습니다. 이는 기존 집단 위계질서에 대한 혼란을 최소화하고 싸움 위험을 낮출 수 있습니다.
    2. "컨트롤러" 애플리케이션에서 실험을 중단하세요. 조작 코너에 쥐가 없는지 확인한 후, 금속 푸드 호퍼를 제거하세요. 한 사람이 금속 마이크로프로세서 장치를 충분히 높이 들어 올려서 두 번째 사람이 플라스틱 케이지를 그 아래에서 미끄러뜨릴 수 있게 하세요. 정확한 마우스 수를 확인하세요.
    3. 더러운 우리에서 쥐를 한 마리씩 꺼내고, RFID 트랜스폰더를 스캔한 뒤 체중을 기록하세요. 각 쥐의 부상이나 질병의 징후가 있는지 시각적으로 살펴보세요.
      참고: 저자들은 체중을 전자 스프레드시트(csv)에 기록하여 분석 파이프라인에 쉽게 읽을 수 있도록 권장합니다.
    4. 체중을 기록한 후 쥐를 잠시 깨끗한 보관용기에 넣어두세요.
    5. 소독제에 적신 젖은 수건으로 윗부분과 모서리를 깨끗이 닦으세요. 코너 플레이트의 표면과 하단 능선을 전자 부품에 액체가 새지 않도록 특별히 닦아주세요.
    6. 금속 마이크로프로세서 장치를 충분히 높이 들어 올려 새롭고 깨끗한 플라스틱 케이지를 제자리에 넣으세요.
    7. 새 흡입 병을 부드럽게 리코미터 구멍에 돌려 넣어 리코미터와 단단히 연결되도록 하세요.
    8. 쥐를 새롭고 깨끗한 장비로 옮기세요.
    9. 푸드 호퍼를 새롭고 깨끗한 푸드 호퍼와 신선한 설치류 먹이로 교체하세요.
    10. "컨트롤러" 애플리케이션에서 같은 실험을 다시 시작하거나 새 실험 파일을 불러와서 시작하세요.
    11. 프로그램이 제대로 작동하고 모든 쥐가 방문, 코 찌르기, 핥는 행동을 적절히 기록하는지 확인하세요.
      참고: "컨트롤러" 프로그램은 동물이 12시간 이내에 기록된 핥음이 없으면 자동으로 경고를 표시합니다.
    12. 더러운 장비를 청소하세요. 플라스틱 케이지, 시퍼 병, 플라스틱 굴착 구조물은 일반적으로 일반적인 케이지 세척 시스템으로 세척할 수 있습니다.
  2. 0일차: 습관
    참고: 습관 단계는 Habituation.experiment 파일을 사용하여 실행됩니다. 이 단계에서는 모든 시퍼 병에 수돗물을 포함합니다. 쥐들은 코를 찌르지 않고 모든 병에 자유롭게 접근할 수 있습니다. 쥐가 조작 구역에 들어오면 모터 도어가 열리며, 이때 흡입용 병 노즐에 접근할 수 있습니다.
    1. RFID 트랜스폰더 존재를 확인하고 마우스 체중을 기록한 후, 8개의 시퍼 병 모두에 ~250mL의 수돗물을 채우고 리코미터 입구에 부드럽게 돌려 넣습니다.
    2. 준비된 인텔리케이지 장치에 최대 16마리의 동성 쥐를 넣습니다.
    3. Habituation.experiment 파일을 "Controller" 애플리케이션에 로드하고 녹화를 시작하세요.
    4. 쥐가 조작 코너에 들어올 때 모든 모터 도어가 제대로 열리는지, 그리고 각 마우스의 방문, 코 찌르기, 핥는 행동이 모두 정상적으로 기록되고 있는지 확인하세요. 6시간 이내에 쥐의 방문, 코 찌르기, 핥음이 기록되지 않았다면, .animal 파일에서 오류를 확인해 주세요.
  3. 1-3일차: 수상 훈련
    참고: 수중 훈련 단계는 Water Training.experiment 파일을 사용하여 진행됩니다. 모든 시피 병에는 수돗물만 계속 담아야 합니다. 이 단계에서는 쥐들이 FR-1에서 코를 찌르도록 훈련하고, 이후 FR-3 스케줄로 시퍼 병 노즐에 접근하도록 훈련시킵니다. 코를 성공적으로 찌르면 모터 도어가 열리며 5초 동안 시퍼 물병을 사용할 수 있게 됩니다. 개별 쥐가 60% 이상의 성공률을 달성하면, 프로그램 기간 동안 FR-3 일정으로 이동됩니다. 보통 쥐는 24시간에서 72시간 이내에 FR-3 스케줄로 이동합니다. "컨트롤러"에서 동물들의 성능을 모니터링하세요. 동물이 72시간 이내에 FR-3 일정에 도달하지 못하면 추가 실험에서 제외하세요.
    1. 24시간 동안 습관화 후 모든 쥐가 수분을 충분히 섭취하고 다치지 않은 상태라면, Habitatuation.experiment 파일 실행을 멈추고 Water Training.experiment 파일을 실행하기 시작하세요.
    2. 각 마우스의 방문, 코 찌르기, 핥는 행동이 소프트웨어에서 정상적으로 기록되고 있는지, 모든 모터 도어가 제대로 열리고 있는지 확인하세요.
  4. 4일차+: 간헐적 음주
    참고: 간헐적 음주 단계는 Intermittent Alcohol.experiment 파일을 사용하여 실행됩니다. 이 단계에서는 네 개의 작동 가능한 코너 중 두 곳에 있던 흡입대 병이 20% 알코올로 교체됩니다. 물 대 알코올 코너는 실험 파일의 "클러스터" 기능을 통해 미리 지정되어 있습니다. 템플릿에서는 1번과 3번 코너('중성'으로 표시됨)에 물이 공급되고, 알코올은 2번과 4번 코너('틀림'으로 표시됨)에 배치됩니다. 쥐는 계속해서 물을 마실 수 있지만, 격일로 24시간 동안 간헐적으로 술을 마실 수 있습니다. FR-3는 모든 모서리에서 5초의 식음료 병 접근이 제공됩니다. 이 실험 단계에서는 음주를 방해하지 않도록 '물 접근 전용' 시간 동안 케이지 교체를 실시하세요. 연구자들은 실험 그룹이 수중 훈련 중 네 개의 코너 모두에 대해 대체로 동일한 선호도를 보이는지 확인한 후, 간헐적 음주를 위한 알코올 코너를 배정해야 합니다. 각 코호트에서 실험 그룹은 물 훈련 중 네 모서리 모두에서 거의 동등한 방문과 핥기를 보였다. 이 때문에 저자들은 코호트 간에 코너 과제를 고정했습니다. 실험자들은 "컨트롤러" 프로그램을 통해 코너를 가로지르는 핥기와 방문 비율을 쉽게 확인할 수 있습니다. 실험 기간 내내 정기적으로 데이터를 모니터링하고 핥아 장비 고장이나 쥐가 특정 모서리를 '독점'하는 문제가 발생하지 않도록 하세요.
    1. 모든 쥐가 FR-3 스케줄을 성공적으로 달성해 흡입식 병에 접근한 후, 20% 알코올(95% 에탄올 [190 도수], 수돗물에 v/v; ~250 mL/병)을 준비합니다.
    2. Water Training.experiment 파일 실행을 멈추세요.
    3. 조작 코너 2와 4(또는 실험 파일에 지정된 코너, 다를 경우 해당 코너)에 있는 음료 병을 제거하고, 각각 20% 알코올 ~250mL로 교체하세요.
    4. 새로 산 알코올 음료 병을 부드럽게 리코미터 구멍에 돌려 넣어 리코미터와 단단히 연결되도록 하세요.
    5. Intermittent Alcohol.experiment 파일을 불러오고 녹화를 시작하세요.
    6. 각 마우스의 방문, 코 찌르기, 핥는 행동이 소프트웨어에서 정상적으로 기록되고 있는지, 모든 모터 도어가 제대로 열리고 있는지 확인하세요.
    7. 다음 날 오후 12시 30분 이후에는 프로그램이 "Water Access ONLY"에서 "Alcohol Access ON" 모듈로 성공적으로 전환되었는지, 그리고 알코올이 포함된 리크가 녹음되었는지 확인하세요.
  5. 16일+: 퀴닌 변조 알코올 검사
    참고: 퀴닌 변조 알코올 검사 단계는 Intermittent Alcohol.experiment 파일을 사용하여 수행됩니다. 이 단계에서는 이전에 20% 알코올이 들어 있던 두 개의 조작 코너에 있던 술병을 0.5 mM으로 교체하고, 이후 1 mM 퀴닌 20% 알코올 혼합 알코올로 교체하여 처벌 무감각적 음주를 평가합니다. 이 퀴닌 농도는 각각 0.016%와 0.032% 퀴닌(w/v)에 해당하며, 이전에27, 28군 및 기타31군이 수행한 검사에서 혐오감을 유발하는 것으로 밝혀졌습니다. 쥐들은 24시간 동안 24시간 간격으로 퀴닌 첨가 알코올에 간헐적으로 접근하는 것으로 나타났습니다(예: 0.5 mM 퀴닌 하루, 물 전용 하루). 1.0 mM 퀴닌을 하루 복용). 모든 코너에 대해 FR-3 시간표에 따라 접근이 제공됩니다. 이 연구에서 쥐들은 16일 또는 24일 연속으로 간헐적 음주를 한 후 이 단계를 수행했습니다. 스트레스의 혼란 영향을 피하기 위해 불순물 검사 사이에 물인 날에는 케이지 교체를 하지 않았습니다. 이 실험 단계 이후에는 쥐들이 '오픈 바'/자유 접근 음주를 시작하거나 간헐적 음주로 돌아가 변조 후 반동 음주를 평가할 수 있습니다.
    1. 0.5 mM 및 1 mM 퀴닌 변조 알코올 20% 알코올(수돗물에 95% 에탄올 [190 프루프]), v/v; ~250 mL/병을 준비합니다.
    2. 케이지 교체를 시행하고 모든 흡입대 병을 제거하세요.
    3. 각 홀 병에 알코올 코너에 0.5 mM 퀴닌이 첨가된 20% 알코올 용액을 ~250 mL 채우세요.
    4. 새로 산 알코올 음료 병을 부드럽게 리코미터 구멍에 돌려 넣어 리코미터와 단단히 연결되도록 하세요.
    5. Intermittent Alcohol.experiment 파일을 불러오고 녹화를 시작하세요.
    6. 각 마우스의 방문, 코 찌르기, 핥는 행동이 소프트웨어에서 정상적으로 기록되고 있는지, 모든 모터 도어가 제대로 열리고 있는지 확인하세요.
    7. 오후 12시 30분 이후에는 프로그램이 "Water Access ONLY"에서 "Alcohol Access ON" 모듈로 성공적으로 전환되었는지, 그리고 알코올이 포함된 조작 코너에 리크가 녹음되었는지 확인하세요.
    8. 다음 주류 날 오후 12시 30분 이전에 알코올 코너에 있는 각 병을 1 mM 퀴닌 가순 20% 알코올 용액 ~250mL로 교체하세요. 병 교체를 위해 실험을 중단할 필요는 없습니다.
    9. 다음 주류 음료 날 오후 12시 30분 이전에는 변조된 알코올이 든 흡입 병을 제거하고, 각각 순수한 20% 알코올 ~250mL로 교체하세요.
  6. 20일차+: "오픈 바"/무료 음주 이용
    참고: 선택적으로 '오픈 바'/무료 음주를 하루는 비조작 대조군으로 사용할 수 있습니다. 이 단계는 Open Bar.experiment 파일을 사용하여 실행됩니다. 이 단계에서는 네 개의 조작 코너 중 두 곳에 있는 음료 병에 20% 알코올이 들어 있는데, 쥐들은 24시간 동안 (오후 12시 30분부터 12시 30분까지) 이 술에 접근할 수 있습니다. 코를 찔러보지 않고도 코를 방문하면 문을 열 수 있습니다. 이 연구에서 쥐들은 간헐적 음주 또는 퀴닌 변조 알코올 검사 단계 후에 이 단계를 수행했습니다.
    1. 필요 시 알코올 20%를 준비하세요(수돗물에 95% 에탄올 [190도], v/v; ~250mL/병).
    2. 다음 음주 날 오후 12시 30분 이전에는 현재 실험 파일 실행을 중단하세요.
    3. 필요하다면 알코올 코너에 있는 주머니 병을 제거하고 각각 20% 알코올 ~250mL로 교체하세요.
    4. 새로 산 알코올 음료 병을 부드럽게 리코미터 구멍에 돌려 넣어 리코미터와 단단히 연결되도록 하세요.
    5. Open Bar.experiment 파일을 불러오고 녹음을 시작하세요.
    6. 각 마우스의 방문, 코 찌르기, 핥는 행동이 소프트웨어에 제대로 기록되고 있는지, 모든 전동 문이 자유롭게 열려 있는지 확인하세요.
    7. 오후 12시 30분 이후에는 프로그램이 "Water Access ONLY"에서 "Alcohol Access ON" 모듈로 성공적으로 전환되었는지, 그리고 알코올이 포함된 조작 코너에 리크가 녹음되었는지 확인하세요.

5. 데이터 분석

참고: 각 실험의 데이터는 프로그램이 중단될 때까지 내부적으로 저장됩니다. 그때 압축된 데이터 아카이브 파일이 생성되어 로컬 하드 드라이브의 C:\Documents\NewBehavior\IntelliCage Plus\Archives에 저장됩니다. 파일 이름은 프로그램이 시작된 날짜와 시간으로 구성되며 끝나는 .zip입니다.  데이터 아카이브 파일에는 실험과 관련된 모든 관련 정보가 포함되어 있으며, 코 방문(시작 시간, 종료 시간, 지속 시간, 방문 순서), 코 찌르기(시작 시간, 종료 시간, 지속 시간), 빛과 어두운 시간, 온도 데이터 등이 포함됩니다. 이 데이터 아카이브는 "Analyzer" 프로그램으로 읽고 분석할 수 있습니다. IntelliCage 데이터 출력을 분석하는 다른 오픈 소스 패키지들도 존재하지만(Ruffini et al., 2021; Gastaldi 외, 2025), 저자들은 tidyverse에서 공개된 패키지를 사용하여 R에서 간헐적 음주 패러다임의 데이터를 분석하는 데이터 분석 파이프라인을 만들었습니다. 이 파이프라인에는 쥐당 코너 점유 분석 등 여러 품질 관리 단계가 포함되어 있습니다; 평균 방문, 코 찌르기, 그리고 일주기 리듬 전반에 걸친 핥기 빈도; 쥐 한 마리당 FR-3 핥는 습득률; 그리고 쥐 한 마리당 일일 핥는 횟수. 또한, 저자들은 음주 측정치에 대한 대본 기본 분석을 제공합니다. 이 도구는 쿼토 마크업 언어를 사용하는 R 노트북 템플릿 파일로, 데이터 파일을 처리하고 동물 집단별 변형에 맞게 조정할 수 있습니다. 분석은 무료 버전의 RStudio를 사용하여 수행됩니다. R용 프로젝트 템플릿 파일은 GitHub저장소 29에 있습니다.

  1. "컨트롤러" 애플리케이션에서 출력한 zip 파일과 마우스 체중 데이터가 담긴 CSV 파일을 포함한 모든 데이터를 컴파일하세요.
    참고: 체중 섭취량을 체중으로 정상화하기 위해 무게를 요구합니다. 이 작업 방식에서는 각 실험 파일에 추가하기보다는 무게 데이터를 별도의 파일에 수집하는 것이 더 합리적이었습니다. 첫 번째 열은 아카이브 파일의 동물 ID와 일치해야 합니다.
  2. GitHub 저장소에서 R 프로젝트 템플릿을 다운로드하세요.
    1. 실험에 맞게 프로젝트 이름을 바꿔보세요.
    2. 템플릿에는 분석이 어떻게 작동하는지 보여주는 샘플 데이터 파일이 data/C1 하위 폴더에 포함되어 있습니다. 아카이브 파일을 개인화된 데이터 아카이브로 대체하세요.
  3. RStudio를 실행하고 프로젝트를 열어보세요.
    1. RStudio 오른쪽 아래 창의 파일 섹션에서 qmd 폴더로 이동해 IC_template.qmd 파일을 엽니다.
    2. 템플릿 파일을 복제하고 실험에 맞게 이름을 바꾸세요.
    3. 중복된 파일의 YAML 헤더 부분과 초기 코드 청크의 메타데이터를 조정하세요.
    4. R 디렉터리의 IC_Commons.R 파일에서 실험 그룹과 일치하도록 그룹 이름을 조정하세요. (템플릿은 두 그룹을 사용합니다: 컨트롤과 LBN.)
  4. 노트북 파일을 실행하세요.
    참고: 더 자세한 설명은 GitHub 저장소의 README.md 파일과 함께 제공됩니다.

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그림 3: 훈련 및 간헐적 음주 단계 동안 모든 쥐의 조작 코너에 대한 비교 가능한 접근성. 코호트 1 쥐23 중에서, (A) 습화 및 수중 훈련 중 각 마우스가 각 모서리에서 하루에 보낸 총 시간과 (B) 첫 4일간의 간헐적 음주 기간(n = 15 F, 16 M)을 표시한 히트맵. 더 어두운 빨간색은 하루에 코너에 머무는 시간이 더 길다는 뜻입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 4: 생쥐는 생체 리듬에 따라 방문, 코 찌르기, 핥기를 하며, FR-3 일정에 따라 조작식 음료 병 접근을 성공적으로 획득한다. 코호트 1 쥐23명에서, 첫 8일간 세션 시간 동안 조작 가능한 코 방문 (A) 밀도, (B) 코 찌르기, (C) 핥는 밀도가 모두 측정되었습니다. (D) 각 쥐가 물 훈련 중 FR-3 비율을 성공적으로 핥을 때까지 시간. (E) 습관 및 수중 훈련 중 마우스의 방문 성공률(= 핥음 횟수/총 방문 비율)과 간헐적 음주 첫 4일(오른쪽). 원 기호는 여성을 나타내며(n = 15), 정사각형 기호는 남성을 나타냅니다 (n = 16). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 5: 쥐들은 훈련 및 간헐적 음주 기간 동안 일일 비슷한 핥음 속도를 보입니다. (A) 암컷(n = 15)과 (B) 수컷(n = 16) 코호트 중 한 쌍의 쥐23마리, 습화 및 수중 훈련(-4–0일) 동안 매일 물(파란색)과 알코올(빨간색) 핥는 횟수와 간헐적 음주(1–4일)를 비교했습니다. C는 통제-양육을 의미하며; L은 LBN 양육을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 6: 초기 생애 역경에 노출된 쥐들은 조작적, 간헐적 음주 패러다임에서 대조군보다 더 많은 알코올을 마셨다. (A) 8일간 간헐적으로 알코올 섭취를 한 대조군(회색; 왼쪽)과 LBN 키우기(분홍색; 오른쪽) 마우스 사이에서 체중에 따라 정상화된 일일 평균 알코올 섭취량(g; 주간 측정). (B) 키닌 변조 전, 중, 후에 체중에 따라 정상화된 일일 평균 알코올 섭취량(0.5 mM, 1 mM). (C) 단일 FR-0 "오픈 바" 주류 접근일 동안 체중에 따라 정규화된 평균 알코올 섭취량을 보여주는 밀도 그래프. 원 기호는 여성을 나타내며(n = 15), 정사각형 기호는 남성을 나타냅니다 (n = 16). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

결과

저자들은 IntelliCages를 통한 자동화된 홈케이지 테스트를 사용하여 초기 생애 역경(ELA)이 AUD와 유사한 행동에 대한 취약성에 어떤 영향을 미치는지 평가했다27. 역경을 유도하기 위해 그들은 제한된 침상 및 둥지 형성(LBN) 패러다임을 사용했는데, 이는 예측 불가능하고 단편화된 모성 간호를 유도하는 자원 부족 모델입니다 51,52,53,54,55,56. 이 연구는 사회적 고립으로 인한 스트레스 혼란 없이 사회적 거주 쥐의 알코올 음주 행동에 대한 ELA의 영향을 평가하는 데 새로웠습니다. 성인기의 사회적 고립이 ELA 노출 마우스에 차이가 있는 것으로 알려져 있다는 점을 고려하면 이는 중요하다22,57. 최대 처리량을 달성하기 위해 저자들은 성별별로 두 개씩 총 네 개의 IntelliCage 기기에서 동시에 음주 행동을 측정했다.

저자들은 원시 데이터에 대한 철저한 품질 관리를 통해 분석 파이프라인을 시작했습니다. 여기에 포함된 그래프는 출판된 연구23의 코호트 1(n = 15 여성, 16 M)의 대표 데이터를 보여줍니다. 모든 분석 및 플롯 작성용 스크립트는 GitHub저장소 29에 포함되어 있습니다. 실험 0일차는 케이지 변경으로 인해 데이터 수집이 중단되었습니다. 데이터 탐색과 품질 관리를 위한 고려사항 중 하나로, 연구자들은 모든 쥐가 훈련 단계(그림 3A)와 간헐적 음주 단계(그림 3B) 모두에서 모든 조작 영역에 대략 균등하게 접근할 수 있도록 했습니다. 이렇게 하면 쥐가 조작 코너를 '독차지'하여 다른 쥐가 음료 병에 접근하지 못하게 하는 심각한 영향을 배제합니다. 저자들은 다음으로 실험 기간 동안 쥐들이 예상되는 생체 리듬 내에서 방문, 코 찌르기, 핥기를 수행했으며(그림 4A–C), 모든 쥐가 모듈 시작 후 6시간 이내에 FR-3 비율로 첫 핥기를 성공적으로 수행했다는 것을 검증했습니다(그림 4D). 물 훈련 단계가 끝날 무렵, 모든 쥐는 비교적 높은 핥기 성공률(= 핥음 횟수 중 전체 방문 비율)을 기록했으며, 이는 물 훈련이 끝날 때 훈련이 성공적임을 확인시켜 주었습니다(그림 4E).

습관화, 물 훈련, 간헐적 음주 시작 기간 동안 쥐들은 일일 핥는 횟수를 대략 비슷하게 유지했습니다(그림 5A–B). 일부 쥐는 실험 3일째에 조작물 훈련 시작 시 일일 총 핥는 횟수가 감소했지만(예: P241260-1), 대부분의 쥐는 FR-1과 FR-3 코 찌르기 스케줄을 빠르게 습득하여 기본 舔음률을 유지했습니다. 따라서 쥐가 수중 훈련 중 과도한 탈수를 경험했을 가능성은 낮습니다. 모든 쥐는 FR-3 일정을 합리적인 속도로 학습했습니다. 실험 1일차부터 간헐적 음주가 시작되자, 거의 모든 쥐가 음주를 선택했으나, 비율은 다양했다. 일반적으로 쥐는 술을 마실 때 일일 총 핥는 횟수를 유의미하게 늘리지 않았습니다. 대신 쥐들은 알코올 섭취 증가에 맞춰 물을 핥는 횟수를 줄였습니다.

간헐적 음주일마다 1호트 쥐는 체중에 비해 일일 음주 횟수가 크게 달랐다(그림 6A). 저자들은 LBN 패러다임을 받은 쥐들이 교차 위탁 대조군보다 체중이 유의미하게 적다는 것을 발견했다23. 따라서 음주 그룹별 차이를 조사할 때, 그들은 체중 기준으로 일일 음주 섭취를 정상화하기로 선택했고, 연구자들은 우리 교체 시 체중을 매주 평가했습니다. LBN 키우는 쥐들은 간헐적 음주(그림 6A)와 퀴닌 변조(그림 6B) 모두에서 대조군보다 체중당 더 많은 알코올을 마셨습니다(그림 6B). 이 추세는 비조작적 오픈 액세스 하루에도 유지되었습니다(그림 6C). 1차 코호트의 이 결과는 발표된 결과와 일치하는데, 저자들은 ELA 노출 쥐가 간헐적 접근 기간 동안 교차 위탁 대조군보다 체중당 더 많은 알코올을 지속적으로 마셨으며, 특히 남성에서 이 효과가 두드러졌다고 보고했다23.

자동화된 가정 케이지 모니터링 시스템의 효율성 덕분에 발표된 연구는 사회적으로 수용된 ELA 노출 설치류에서 매우 강력한 표본 크기(n=54 대조군, 43 LBN)에서 알코올 음주 증가를 확인했습니다(n = 54 대조군, 43 LBN)23. 이 결과는 아동 경험력이 있는 AUD 환자에서 관찰되는 AUD 유사 행동 모델링에 있어 진전을 의미하며, ELA 이후 AUD 취약성 증가의 신경생물학적 원인을 규명하는 향후 기전적 연구의 문을 열어줍니다.

토론

저자들이 ELA27 에 노출된 쥐에서 AUD 유사 행동을 강력히 평가하기 위해 IntelliCages를 사용한 사례와 과거 형질전환 계통28 연구에서 볼 수 있듯, 자동화된 가정용 케이지 모니터링 시스템은 AUD의 전임상 모델 연구를 위한 효율적이고 유연한 해결책을 제공합니다. 최대 16마리의 동거 생쥐를 동시에 평가하면 사회적 고립으로 인한 스트레스의 혼란 영향을 피하면서 음주 방법론의 처리량을 크게 높였습니다. 조작적이고 간헐적인 음주 패러다임은 실험자들이 폭음, 시간이 지남에 따른 증가, 처벌에 대한 무감각한 음주 등 AUD와 유사한 행동의 여러 측면을 탐구할 수 있게 합니다. 이 패러다임은 AUD 유사 행동을 평가하는 한 가지 방법을 제공하지만, 설계는 간헐적 음주를 보다 만성적으로 측정하거나, 공기 흡입에 대한 처벌 무감각성 음주 검사, 가변 조작 비율 추가 등 다양한 가능성을 쉽게 적용할 수 있습니다. 전반적으로 자동화된 가정용 케이지 모니터링 시스템은 연구자들이 AUD 유사 행동을 평가할 수 있는 처리량과 특이성을 크게 높여 새로운 기저 회로와 치료 사례의 식별에 기여합니다.

모든 기술과 마찬가지로, 작가들도 때때로 기계적 및 기술적 결함을 경험합니다. 시스템이 감독 없이 운영되도록 허용하려는 유혹에도 불구하고, 조사관들은 장치의 적절한 작동을 보장하기 위해 정기적으로 모니터링하는 것이 매우 중요합니다. 자기 문이 가끔 기계적 고장으로 인해 쥐들이 시퍼 병에 접근할 수 없게 되었습니다. 적절한 청소와 유지보수가 이루어지면 드물게 발생했으며, 데이터 수집에 미치는 영향도 거의 없었습니다. 오류를 신속히 파악하기 위해서는 흡입대 병의 액체 감소 현상을 모니터링하고, 모든 동물의 모든 구석에서 핥는 동작이 기록되고 있는지 "컨트롤러" 애플리케이션을 정기적으로 확인하는 것이 중요합니다. 더 자세한 조언을 원한다면, 마스다와 동료들이 인텔리케이지48의 설치 및 유지보수 방법에 대한 훌륭한 설명을 제공합니다.

또한 싸움이나 다른 혼란스러운 행동을 모니터링하기 위해 동물 행동을 정기적으로 관찰하는 것도 필수적입니다. 저자들은 C57/BL6 마우스를 대상으로 이 패러다임을 적용할 때 큰 싸움 문제를 겪지 않았지만, 더 공격적인 유전자형 수컷을 함께 사육하는 것은 상당한 문제를 초래했습니다. 특히 우리 교체 후에는 마른 피, 절뚝거리는 동물, 기타 싸움 징후를 정기적으로 관찰하세요. 이러한 징후가 발견되면 즉시 문제를 일으키는 동물을 제거하고 추가 실험에서 제외하세요. 제공된 코드의 "개별 마우스 성능" 섹션을 사용하여 공격성이 개별 쥐의 음주 행동에 얼마나 오래 영향을 미쳤는지 평가하세요. 영향을 받은 모든 날짜는 분석에서 제외합니다. 앞서 언급했듯이, 저자들은 프로토콜이 다양한 유전자형이나 서거 배치에 대해 일반화될 수 있다고 보장할 수 없습니다.

관련하여, 저자들은 쥐가 조작 코너를 '독점'하는 문제를 가끔 겪었는데, 쥐가 몇 시간 동안 같은 코너에서 잠을 자거나 다른 방식으로 점유하는 경우도 있었습니다. 이 행동은 다른 쥐들이 그 구석에 있는 흡입대 병에 접근하는 것을 막습니다. 이러한 상황은 분석에서 제대로 고려되지 않으면 음주 결과를 혼란스럽게 만들 수 있습니다. 제공된 코드의 "코너 점유(방문 시간)"와 "개별 마우스 성능" 섹션을 사용하여 "독점"이 특정 실험일을 제외할 만큼 마우스 행동에 큰 영향을 미쳤는지 판단하세요. 일반적으로 실험 중 사회적 행동을 기록하거나 정량화할 수 없는 점은 이 자동 모니터링 시스템의 주요 한계입니다.

마지막으로, 점점 더 첨단 신경과학적 방법들이 그렇듯이, 자동화된 홈케이지 모니터링 시스템은 방대한 양의 데이터를 생성합니다. 여기서 제시된29와 같은 오픈 소스 코드와 다른 이들이 개발한63,64를 통해, 실험자들은 출력 데이터를 조직하고 분석할 수 있는 다양한 도구를 사용할 수 있습니다. 하지만 여기서 제시된 프로토콜의 수정은 코드의 적응이 필요합니다. 또한, 여기 제시되지 않은 방대한 출력 데이터에 대해 수많은 추가 분석이 수행될 수 있습니다.

예를 들어, 연구자들은 알코올 소비량(하루 쥐 무게당 g의 알코올)를 정량화하는 데 관심이 있을 수 있습니다. 저자들은 이 부분에 대해 간략히 논의하고, GitHub저장소 29에서 분석을 수행할 수 있는 예비 코드를 제공합니다. 여기서 저자들은 Kasia Radwanska와 동료들의 계산과 일치하는 1.94 μL/lick의 리크-부피 변환 계수를 사용한다30,37. 이 릭 변환 계수는 현장 다른 사람들의 알코올 소비량을 추정하는 데 사용되었지만,30, 37, 38, 39 정도는 물 소비량을 측정하여 계산한 것입니다. 따라서 물과 알코올 간 표면장력 차이로 인해 알코올 섭취량 20%를 정확히 측정할 수 없을 수 있습니다. 다른 연구자들은 3 μL/lick31, 34, 36, 38의 리크 변환 계수를 사용해 이 측정값의 해상도를 강조했습니다. 쥐가 크기가 다른 핥기를 할 가능성도 배제할 수 없으며, 이는 이 계산을 더욱 복잡하게 만듭니다. 연구자들이 알코올 섭취량(g/kg/day)의 정확한 측정에 관심이 있다면, 저자들은 실험 설계와 일치하는 'lick-to-volume 변환 계수'를 계산할 것을 권장합니다.

결론적으로, 자동화된 가정용 케이지 모니터링 시스템의 발전과 접근성 향상은 AUD 연구자들에게 전임상 음주 평가에 새롭고 향상된 도구를 제공합니다. 이러한 간헐적 음주 방식은 실험자들이 AUD 유사 행동의 여러 측면을 전통적인 방법론보다 훨씬 높은 처리량과 더 큰 동물행동학적 관련성으로 동시에 평가할 수 있게 합니다. IntelliCage 검사 시스템과 오픈 소스 대안20,26을 통해 연구자들은 AUD와 일치하는 음주 행동을 보다 효율적이고 유연하게 조사하여 효과적인 개입 사례 식별을 가속화할 수 있습니다.

공개 사항

저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

이 연구는 국립보건원(NIH) 산하 NIH 내부 연구 프로그램(V.A.A., ZIA AA000421; 지아 MH002987). 이 프로토콜 개발에 도움 주신 미리엄 보카슬리, 아누 마스케리, 에린 머레이에게 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
에탄올, 190 프로프디콘 연구소2801G
인텔리케이지 테스트 시스템TSE 시스템즈https://www.tse-systems.com/products/intellicage/2000P 정적 케이지 1개 포함 (Tecniplast, 2000P001) 및 nbsp; 마우스 하우스 4개(테크니플라스트, ACRE011), 그리고 8개의 시퍼 병(테크니플라스트, ACBT0252)과 캡(테크니플라스트, ACCP3521)
인텔리케이지 소프트웨어 ("디자이너", "컨트롤러", "분석기")TSE 시스템즈https://www.tse-systems.com/products/intellicage/버전 3.6.9.0
아이소 패드, 6" x 10"브레인트리 사이언티픽 주식회사ISO 6105압축 면 섬유 패드 (15.24 x 25.4 cm)
이소플루란백스터10019-360-40
이소플루란 VXP&트레이드; 웰필 베이퍼라이저의학과91305535
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