조현병에서 SUCNR1과 GPR37L1의 생물정보학 및 실시간 중합효소 연쇄반응 정량 분석

요약

본 연구는 GSE54913 데이터셋의 통합 생물정보학 분석, 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 검증, 그리고 독립적인 코호트에서의 언어 기억과의 상관관계를 통해 SUCNR1과 GPR37L1를 조현병 관련 분자 표지자로 평가합니다.

초록

조현병은 수많은 유전적 감수성 요소를 포함하는 심각하고 복잡하며 다요인적인 정신 질환으로, 상당한 장애, 이환율, 사망률을 초래합니다. 병태생리와 병인에 대한 이해가 크게 진전되었음에도 불구하고, 조현병의 구체적인 진단 바이오마커는 여전히 찾기 어렵습니다. 이 연구는 조현병과 관련된 후보 분자 표지를 규명하는 것을 목표로 했습니다. 공개된 마이크로어레이 데이터셋에 대한 통합 생물정보학 분석이 수행되었습니다GSE54913. 유전자 온톨로지(GO)와 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 경로 분석 결과, 가장 유의미하게 농축된 GO 용어는 수동 막관통 수송체 활성, 이온 채널 활성, 게이트 채널 활성, 기질 특이적 채널 활성 등 채널 활동과 관련되어 있음을 밝혀냈습니다. 상위 다섯 가지 KEGG 농축 경로는 인슐린 분비, cAMP 신호 전달 경로, 뉴클레오타이드 절제 수리, TNF 신호 전달 경로, 글루타티온 대사였습니다. 검증은 우한 롱쥔 유푸 병원의 독립 샘플 세트에서 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)을 사용하여 수행되었습니다. qRT-PCR 결과는 마이크로어레이 분석과 대체로 일치하였다(Pearson r = 0.89, 95% 신뢰구간: 0.66–0.97). 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 분석에서 두 개의 허브 유전자인 SUCNR1과 GPR37L1이 확인되었으며, 이들은 GO 용어 '이온 채널 활성'과 유의하게 연관되어 있고 KEGG 경로의 '인슐린 분비'에 풍부함을 보였습니다. 더불어, SUCNR1 발현은 언어 기억 점수와 음의 상관관계를 보였고(r = -0.54, P = 0.015), GPR37L1 발현은 양의 상관관계를 보였으며(r = 0.59, P = 0.0034). 이러한 발견은 SUCNR1과 GPR37L1 발현 변화가 조현병과 연관될 수 있음을 시사하며, 추가 연구를 위한 후보 분자 표지자가 될 수 있습니다.

서론

조현병은 원인이 밝혀지지 않은 만성적이고 복잡한 정신 질환으로, 심각한 뇌 기능 장애, 인지 장애, 심리^{사회적 결}손을 특징으로 합니다. 이는 전 세계적으로 2,100만 명 이상의 사람들에게 영향을 미치는 심각한 전 세계 보건 부담을 안겨줍니다². 진단 및 치료 접근법은 지난 50년간 크게 발전했지만, 핵심 병인 기전은 여전히 명확하지 않으며, 상당한 장애, 이환율, 사망률과 관련된 장기 결과도 눈에 띄^{게 개선되지} 않았습니다. 따라서 잠재적 핵심 유전자와 조절 표적을 식별하는 것이 필수적입니다.

조현병의 병태생리는 완전히 밝혀지지 않았으나, 유전적 다형성과 발현 변이에 널리 기인된다. 예를 들어, 에스트로겐 알파 유전자의 유전적 변이는 대체 유전자 조절과 전사^{체 처리를} 통해 조현병 감수성에 영향을 미칠 수 있습니다. 마찬가지로, NRG1의 기능적 프로모터 변이체가 조현병과 연관되어 있으며, III NRG1 아이소폼⁶의 발현 감소와 상관관계가 있습니다. 사후 연구에서는 조현병 뇌에서 PDE4B 아이소폼의 발현이 유의미하게 감소하여 예측 가능성을 시사합니다⁷. 기타 후보로는 도파민 수송체(DAT), 소포 모노아민 수송체(VMAT2), 모노아민 산화효소(MAO)가 있으며, 이들은 시냅스 도파민 수치를 조절하며 바이오마커 역할을 할 수 있습니다⁸. 또한, TCP1은 조현병에서 악틴 접힘 부정을 통해 세포골격 결손에 기여할 수^{있습니다.} 따라서 조현병 발병 기전에서 유전자 발현 프로필을 밝히는 것은 위험 예측, 기전 이해, 치료 평가에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

최근의 계산적 접근법은 통합 네트워크 분석과 머신러닝 방법을 통해 질병 관련 유전자 식별을 발전시켰습니다 10,11,12. 수많은 유전학 연구에도 불구하고, 신뢰할 수 있는 혈액 기반 진단 바이오마커가 조현병의 임상 실무에 적용된 것은 없습니다. 이 격차를 해소하기 위해 본 연구는 조현병 환자와 건강한 대조군의 혈액 유래 전사체 데이터를 포함하는 GSE54913 데이터셋을 통합적으로 생물정보학 접근법으로 재분석하였습니다. 이 데이터셋이 선정된 이유는 (1) 말초혈액 샘플이 최소 침습적이고 임상적으로 실용적이며, (2) 공개된 조현병 마이크로어레이 데이터셋 중 비교적 큰 표본 크기를 포함하고 있으며, (3) 원시 데이터가 재분석이 가능했기 때문입니다. 본 연구의 목적은 다음과 같았습니다: (1) GSE54913 데이터셋을 사용하여 조현병 환자와 건강한 대조군에서 차별화된 유전자를 식별하는 것; (2) 기능 풍부화 및 PPI 네트워크 분석을 수행하여 허브 유전자를 식별하는 것; (3) 독립적인 코호트에서 qRT-PCR로 후보 유전자의 발현을 검증하는 것; 그리고 (4) 허브 유전자 발현과 언어 기억 수행 간의 상관관계를 탐구합니다. 저자들이 아는 한, 이 연구는 SUCNR1과 GPR37L1를 조현병의 혈액 기반 분자 표지자로 처음으로 확인한 연구입니다.

프로토콜

이 연구는 우한 롱준 유푸 병원 윤리위원회(프로젝트 식별 코드, YF-IRB202310215)의 승인을 받았으며, 헬싱키 선언 원칙에 따라 수행되었습니다. 모든 참가자는 중국계 커뮤니티 거주자였으며, 서면 동의서를 제공했습니다.

연구 대상자 및 혈액 샘플링
정신분열증 진단을 받은 성인 10명과 3대에 걸쳐 정신질환 가족력이 없는 건강한 대조군 자원자 10명이 등록되었습니다. 조현병 환자 포함 기준: (1) DSM-5 기준에 따른 두 명의 독립적인 수석 정신과 의사가 확인한 정신분열증 진단; (2) 18세에서 65세 사이; (3) 혈액 채취 전 최소 4주 동안 항정신병 약물 변경이 없음; (4) 서면 동의서를 제공할 의사. 제외 기준: (1) 주요 질환을 동반하는 질환(예: 당뇨병, 심혈관 질환, 암); (2) 최근 6개월 이내의 약물 남용 또는 의존; (3) 지적 장애; (4) 임신 또는 수유. 건강한 대조군의 포함 기준: (1) 정신질환에 대한 개인 또는 가족력(3세대 이내)이 없음; (2) 현재 또는 과거에 항정신병 약물 사용 기록이 없음; (3) 조현병 그룹과 연령 및 성별 일치; (4) 주요 질병이 없음. 조현병 환자의 평균 질병 기간은 6.8년± 12.5년이었으며; 모든 환자는 안정적인 항정신병 약물을 복용 중이었으며(리스페리돈 6명, 올란자핀 4명), 평균 PANSS 총점은 76.4점± 12.3점이었습니다. 대조군은 연령(±5세)과 성별(그룹당 남성 5명, 여성 5명)으로 매칭되었습니다. 언어 기억은 홉킨스 언어학습 시험-개정판(HVLT-R)의 총 회상 점수를 사용하여 평가하였습니다. 모든 대상자는 2025년 1월 1일부터 7월 31일까지 우한 롱준 유푸 병원에서 모집되었습니다. 기본 인구통계는 표 1에 요약되어 있습니다.

표본 크기는 효과 크기 1.2, α = 0.05, 검정력 (1-β) = 0.80의 양측 독립 t-검정에 대해 표본 크기 계산 소프트웨어를 사용해 결정하였으며, 그룹당 최소 9명의 피험자를 산출했습니다.

정맥혈은 EDTA 항응고관으로 채취되어 지체 없이 처리되었습니다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 밀도 구배 배지를 이용한 밀도 구배 원심분리를 통해 샘플에서 분리되었습니다. 간단히 혈액을 인산염 완충 생리식염수(PBS, pH 7.4)로 1:1로 희석한 후 밀도 구배 배지 위에 층층이 쌓인 후, 브레이크를 해제한 상태로 400 × g 에서 30분간 20°C에서 원심분리했습니다. 원심분리 후, PBMC가 포함된 인터페이스는 신중하게 새로운 튜브로 옮겨졌습니다. 세포는 PBS로 두 번 세척되었고, 각 세척 후 4°C에서 300 × g 에서 10분간 원심분리한 후 최종 펠릿을 PBS에 부유했습니다. 생존 가능성은 트리판 블루 염료 배제법을 사용하여 평가되었으며, ≥95% 생존 세포를 가진 제제만 사용되었습니다. 분리된 PBMC는 분할 추출하여 최대 3개월간 −80 °C에서 저장한 후 RNA 추출을 시작했습니다.

마이크로어레이 데이터
연구의 작업 흐름은 그림 1에 나와 있습니다. 마이크로어레이 데이터셋은 GEO 데이터베이스에서 다운로드GSE54913 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/. 이 데이터셋이 선정된 이유는 (1) 말초혈액 샘플의 전사체 데이터를 포함하고 있기 때문이며, 이는 최소 침습이며 바이오마커 발견에 임상적으로 실용적이며; (2) 공개된 조현병 마이크로어레이 데이터셋 중 비교적 큰 표본 크기(18명의 환자, 12명의 대조군)를 포함한다; (3) 원시 데이터가 재분석을 위해 제공되었다. GEO 기록에 따르면, 샘플은 혈장이 아닌 말초 혈액 단핵세포(PBMC)에서 추출되었습니다. 이전 버전에서 '플라즈마 샘플'이라는 원래 설명은 오류였으며 수정되었습니다.

데이터 전처리 및 차별 발현 유전자(DEG) 스크리닝
원시 데이터 (. CEL 파일)은 마이크로어레이 전처리 소프트웨어를 사용해 전처리되었습니다. 배경 보정은 Robust Multichip Average(RMA) 방법을 사용하여 수행되었고, 이후 분위수 정규화와 log2 변환이 이루어졌습니다. 유전자 주석이 없는 프로브 세트는 필터링되었다. 샘플 전체에서 >20%의 누락이 있는 프로브는 제외되었고; 남은 탐침의 누락값은 누락값 보충 소프트웨어에서 구현된 k-최근접 이웃 알고리즘(k = 10)을 사용하여 보정되었습니다. GEO 기록에 따르면 모든 샘플이 한 번에 처리되어 배치 효과는 존재하지 않았습니다. 전처리 후 17,200개의 유전자 발현값을 얻어 후속 분석을 수행하였습니다. 조현병 환자와 건강한 대조군 간의 DEG는 차별 발현 분석 소프트웨어를 사용하여 확인되었습니다. 거짓 발견률(FDR)이 0.05, 절대 접힘 변화(FC)<> 1.2, P가 0.05< 유전자는 차별적으로 발현된 것으로 간주되었습니다. 조현병은 개별 유전자 발현 차이가 극적이기보다는 미묘한 복잡한 정신질환이기 때문에 비교적 낮은 FC 임계값(절대 FC > 1.2)이 선택되었습니다.

GO 및 경로 농축 분석
유전자 온톨로지(GO) 용어와 교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG) 경로에 대한 기능 풍부 분석은 기능 풍부화 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 배경 유전자 세트는 전처리를 통과한 모든 유전자(17,200개의 유전자)로 구성되어 있었습니다. 원시 P값 0.05< 풍부한 항과 경로가 보고되었습니다. GO와 KEGG 농축 출력에 원시 P-값이 사용되었기 때문에, 이 결과들은 탐색적 것으로 해석되어야 합니다.

PPI 네트워크 분석 및 허브 유전자 식별
단백질-단백질 상호작용 데이터베이스를 사용하여 PPI 네트워크를 구축했으며, 결합 상호작용 점수 > 0.9를 임계값으로 설정했습니다. 네트워크는 네트워크 시각화 소프트웨어를 사용해 시각화되었습니다. 허브 유전자는 Degree 알고리즘을 이용한 허브 유전자 식별 플러그인을 사용하여 확인되었습니다. 학위 점수가 가장 높은 상위 10개 노드가 허브 유전자로 선정되었습니다. 핵심 허브 유전자 서브네트워크는 기본 매개변수(degree 컷오프 = 2, 노드 점수 컷오프 = 0.2, K-코어 = 2, 최대 깊이 = 100)를 가진 서브네트워크 추출 플러그인을 사용해 추출되었습니다.

총 RNA 분리 및 qRT-PCR
β-액틴은 내부 참조(관리) 유전자로 사용되었습니다. 샘플 간 β-액틴 발현의 안정성은 조현병군과 대조군 간 Ct 값에 유의한 차이가 없음으로 확인되었습니다(P > 0.05). 상대 정량화는 2^−ΔΔCt 방법을 사용하여 수행되었습니다. 모든 반응은 3회 단위로 수행되었으며, 평균 Ct값을 계산에 사용했습니다( 표 2의 프라이머 서열 참조). 상위 10개의 DEG(접힘 변화로 인해 가장 유의미하게 상향 조절된 5가지와 가장 유의미하게 하향 조절된 5가지)가 초기 qRT-PCR 검증을 위해 선정되어 마이크로어레이 데이터의 전반적인 신뢰성을 확인하였습니다. 이후 SUCNR1 과 GPR37L1 는 세 가지 기준에 따라 집중 검증을 위해 선정되었습니다: (1) PPI 네트워크 분석에서 허브 유전자로 확인됨(차수 ≥ 7); (2) 이들은 상위 농축된 GO 용어인 '이온 채널 활성'과 KEGG 경로 '인슐린 분비'와 유의미하게 연관되어 있었으며; (3) 두 약물 모두 조현병에서 알려진 약물 표적인 GPCRs를 암호화합니다.

통계 분석
정상성은 샤피로-윌크 검정으로 평가되었다. 대략 정규 분포(P > 0.05)를 보이는 변수들은 2그룹 비교에 대해 학생 t-검정, 2개 이상의 그룹 비교에 대해서는 일방향 ANOVA를 포함한 모수적 방법으로 분석하였습니다. 정규성 가정이 충족되지 않을 경우, 적절히 Mann–Whitney U 또는 Kruskal–Wallis 검정이 사용되었습니다. 모든 통계 검정은 양측 검정이었습니다. 다중 비교(예: ANOVA 사후 검정)에서는 벤자미니-호흐버그 거짓 발견률(FDR) 방법을 적용했으며, FDR 임계값은 0.05였습니다. 상관관계 분석에서는 두 번의 상관관계만 수행되어 다중 비교 보정이 적용되지 않았다; 원시 P-값은 신중하게 보고됩니다.

결과

DEG의 식별과 계층적 군집화
GSE54913 데이터셋 분석에서 조현병 환자와 대조군 사이에서 473개의 차별발현 유전자(DEGs)가 확인되었으며, 이 중 357개는 상향 조절 유전자, 116개는 하향 조절 유전자였습니다(그림 2A,B). 이러한 DEGs의 계층적 군집화는 조현병 샘플과 대조군을 구분하는 데 기여했습니다(그림 2C).

DEGs의 기능 농축 분석
GO 농축 분석에서는 채널 활동과 관련된 용어가 확인되었으며, 여기에는 수동 막관통 수송체 활성, 이온 채널 활성, 게이트 채널 활성, 기질 특이적 채널 활성(원시 P < 0.05; 표 3). KEGG 경로 분석에서 인슐린 분비, cAMP 신호 전달 경로, 뉴클레오타이드 절제 수리, TNF 신호 전달 경로, 글루타치온 대사가 상위 농축 경로로 확인되었습니다(원시 P < 0.05; 그림 3C 및 표 4).

qRT-PCR을 이용한 상위 DEG 검증
상위 5개의 하향 조절 유전자(HCN3, OLFML2A, NOX1, MRGPRX1, BRIP1)와 상위 5개 상향 조절 유전자(CCL22, PNMA2, TBX20, ERAS, C12orf68)는 qRT-PCR로 검증되었습니다. 검증된 유전자와 해당 마이크로어레이 logFC 값은 표 5에 나열되어 있으며, qRT-PCR 검증은 그림 4에, 원시 Ct 값은 보충 표 S1에 제공된다. qRT-PCR 접힘 변화는 10개 유전자 모두에 대한 마이크로어레이 데이터와 방향적으로 일치했으며(Mann-Whitney U 검사에서 모두 P < 0.05였다). 마이크로어레이 logFC와 qRT-PCR logFC 간의 피어슨 상관관계는 r = 0.89(95% 신뢰구간: 0.66–0.97, P = 0.0004)로, 강한 일치를 나타냈다. SUCNR1 과 GPR37L1 발현 차이도 확인되었습니다(그림 5A, B).

PPI 네트워크 분석
PPI 네트워크는 모든 DEG로 구성되었습니다(상호작용 점수 > 0.9; 그림 6A). 연결성 정도에 따른 상위 10개 허브 단백질은 RTP5(도 = 14), CXCL1(도 = 8), CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4, SUCNR1(도 = 7), ATM(도 = 5)입니다(그림 6B 및 표 6). 기본 매개변수를 가진 서브네트워크 추출 플러그인을 사용해 핵심 허브 유전자 서브네트워크를 추출했습니다. 서브네트워크 추출 알고리즘은 RTP5, CXCL1, CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4, SUCNR1로 구성된 밀집 연결된 클러스터를 식별했으며, 클러스터 점수는 6.2였습니다. ATM은 코어 클러스터와의 연결성이 낮아 서브네트워크에 포함되지 않았습니다(그림 6C).

언어 기억과 SUCNR1/GPR37L1 간의 연관성
조현병 환자에서 건강한 대조군과 비교했을 때 SUCNR1 발현은 유의하게 높았으나 GPR37L1 발현은 감소했습니다(그림 5A, B). SUCNR1 발현은 언어 기억 점수와 음의 상관관계를 보였다(r = -0.54, 95% 신뢰구간: -0.79에서 -0.13, R² = 0.287, P = 0.015; 그림 5C), 반면 GPR37L1 표현은 언어 기억 점수와 양의 상관관계를 보였다(r = 0.59, 95% 신뢰구간: 0.20에서 0.82, R² = 0.349, P = 0.0034; 그림 5D). 상관분석 분석은 조현병 환자 10명과 건강한 대조군 10명을 포함한 20명 전원에 대해 수행되었습니다. 표본 크기가 20인 이 연구는 상관계수 |r| > 0.6 α = 0.05. 표본 크기가 적은 점을 고려할 때, 이러한 상관관계 결과는 예비적이며 더 큰 독립 코호트에서의 검증이 필요합니다.

데이터 가용성 명세서
이 연구에서 분석된 GSE54913 데이터셋은 유전자 발현 옴니버스에서 공개되어 있습니다. 원시 qRT-PCR Ct 값은 보충 표 S1에 제공되어 있습니다. 분석 스크립트, DEG 출력 파일, 농축 결과, PPI 네트워크 파일, 그리고 도표 소스 파일은 https://sandbox.zenodo 에서 이용할 수 있습니다.org/records/514960 또는 10.5072/zenodo.514960.

그림 1: 흐름도: 데이터 수집, 전처리, 분석 및 검증. GSE54913에서 얻은 PBMC mRNA 마이크로어레이 분석. DEG에 대해 GO 기능 및 경로 농축 분석이 수행되었습니다. 폴드 변화 기준으로 순위가 매겨진 상위 10개 유전자가 qRT-PCR을 이용한 마이크로어레이 데이터 검증을 위해 선정되었습니다. PPI 네트워크 분석에서 두 개의 허브 유전자가 확인되었습니다. 마지막으로, 두 허브 유전자 SUCNR1과 GPR37L1에 대한 체외 분석이 수행되었습니다. 약어: DEGs = 차등 발현 유전자; mRNA = 메신저 RNA; PBMC = 말초혈 단핵세포; qRT-PCR = 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응; PPI = 단백질-단백질 상호작용. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: DEG 선택 및 계층적 군집 분석. (A) DEGs의 화산 플롯. 가로축은 log₂(접힘 변화)를, 세로축은 –log₁₀(P 값)를 나타냅니다. 초록색과 빨간 점은 차별적으로 발현된 유전자를, 검은색 점은 비차등 발현 유전자를 나타냅니다. (B) 하향 및 상향 규제된 DEG의 수. (C) 차등 발현 유전자의 히트맵. 빨간색은 상향 규제를, 초록색은 하향 규제를 의미합니다. 약어: DEGs = 차별발현 유전자. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: DEG의 GO 및 KEGG 농축 분석. (A,B) GO 농축과 (C) KEGG 농축은 원시 P값을 기반으로 표시됩니다. 약어: DEGs = 차등 발현 유전자; GO = 유전자 존재론; KEGG = 교토 유전자 및 유전체 백과사전; BP = 생물학적 과정; CC = 세포 성분; MF = 분자 기능. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: qRT-PCR을 이용한 상위 10개 이상 조절 유전자에 대한 마이크로어레이 데이터 검증. (A) 상위 5개 DEG를 하향 조정. (B) 상위 5개 DEG를 상향 조정. 데이터는 평균± 표준오차입니다. P 값은 해당 패널에 표시됩니다. 약어: DEGs = 차등 발현 유전자; qRT-PCR = 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 조현병 환자 및 건강한 대조군에서의 SUCNR1 및 GPR37L1 발현. (A) QRT-PCR로 결정된 SUCNR1 및 (B) GPR37L1 발현. 언어 기억과 (C) SUCNR1 및 (D) GPR37L1 발현 간의 상관관계. 데이터는 해당되는 경우 평균의 표준오차 ± 평균으로 표시됩니다. 상관관계에 대한 P 값은 해당 패널에 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: 단백질-단백질 상호작용 네트워크 분석. (A) 단백질-단백질 상호작용 데이터베이스를 이용한 PPI 네트워크 분석. (B) PPI 네트워크 내 연관성에 따라 순위가 매겨진 단백질들. (C) 서브네트워크 추출 분석 후 네트워크 시각화 소프트웨어를 사용한 서브네트네트워크 시각화. 약어: PPI = 단백질-단백질 상호작용. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

가변	대조군 (n = 10)	조현병 환자 (n = 10)
나이 (연도)	36.5 ± 10.6	44.5 ± 9.5
여성, n(%)	5 (50)	5 (50)
일일 수면 시간 (h)	5.4 ± 3.1	7.5 ± 1.2
체질량지수(BMI; kg/m²)	25.2 ± 4.1	22.9 ± 2.3
언어 기억 점수	61 ± 18	30.2 ± 10.8
데이터는 평균 ± 표준편차 또는 숫자(%)로 제시됩니다.

표 1: 조현병 환자와 대조군의 기초 특성.

유전자 심볼	포워드 프라이머 시퀀스 (5'→3')	역프라이머 시퀀스 (5'→3')
HCN3	GTCCGCCGGGGGGCCTGGAT	CCTCCCACTGGTGTATGTAGC
OLFML2A	카그카아그카그카그	AATATTTGGGACTGGGTCA
NOX1	CACCCCAAGTCTGTAGTGGGAG	CCAGACTGGAATATCGGTGACA
MRGPRX1	CTAGGGTACCACGGAGGATT	TGGTTCTGGAGGAGGCCTTGC
브립1	카갓가그CG-타그트가	CGTCCTCCGGAGCTCTCTTAG
CCL22	TCCATCTCTTCTCTCTCTCTCTCTGA	CTGTGGGTCAGAGTCAGAAGAGAGA
PNMA2	GCGGGTCAATTCTCGGGACA	GTCCTGCCCCCGGTGTTTT
TBX20	가가아트가트가가카cc	아그그크트가카트가트그
시대	AGTCTATTATTTCGGGCACC	CCTTCGTGGTTCCCTGAGAC
C12orf68	TTCAACCCCTACACCGAGTT	CTTGAACGTGGACTGCAGC
GPR37L1	ATGTTTCTTGCCGAGCAGTG	CCACATGGAATCGGTCTAT
SUCNR1	아카아아카카가가트	GCACAGGAAGCAAAGTCAG
β-액틴	CTAAGGCCAACCGTGAAAG	GCATACAGGGACACACAG
qRT-PCR: 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응.

표 2: qRT-PCR용 PCR 프라이머.

고 ID	용어	원시 P-값	백작
가세요:0015267	채널 활동	0.000000056	13
출발:0022803	수동 막횡단 수송체 활성	5.78E-08	13
출발:0005216	이온 채널 활동	0.000000127	12
가세요:0022839	이온 개폐 채널 활동	0.000000131	11
가세요:0022836	게이트 채널 활동	0.000000136	11
가세요:0022838	기질 특이적 채널 활동	0.00000017	12
출발:0005261	양이온 채널 활동	0.00000668	9
시작:0015276	리간드 게이트 이온 채널 활동	0.000315	5
출발:0022834	리간드 게이트 채널 활동	0.000315	20
출발:0022890	무기 양이온 막관통 운반체 활성	0.000487	20
출발:0008324	양이온 막관통 수송체 활성	0.0009	18
출발:0099094	리간드 게이트 양이온 채널 활성	0.00128	16
출발:0005244	전압 개폐 이온 채널 활성도	0.001382	16
가세요:0022832	전압 개폐 채널 활동	0.001382	18
출발:0046873	금속 이온 관통막 수송체 활성	0.001836	21
출발:0022824	송신기 게이트 이온 채널 활동	0.002762	19
출발:0022835	송신기 게이트 채널 활동	0.002762	13
참고: P-값은 원시 값이며 조정되지 않은 상태입니다; 유의율은 원시 P < 0.05로 정의되었습니다.

표 3: 차별 발현 유전자의 유전자 온톨로지 분석(원시 P < 0.05).

신분증	설명	원시 P-값	백작
HSA04911	인슐린 분비	0.007066	6
HSA04024	cAMP 신호 전달 경로	0.010661	10
HSA03420	뉴클레오타이드 절제 수리	0.013724	4
HSA04668	TNF 신호 전달 경로	0.023694	6
HSA00480	글루타티온 대사	0.02466	4
HSA04740	후각 변환	0.032104	15
HSA05222	소세포폐암	0.03572	5
HSA00590	아라카돈산 대사	0.035991	4
HSA04080	신경활성 리간드-수용체 상호작용	0.037546	12
HSA05031	암페타민 중독	0.045653	4
HSA05203	바이러스 발암	0.046404	8
HSA04933	당뇨병 합병증에서의 연령-분노 신호 전달 경로	0.04831	5
참고: P-값은 원시 값이며 조정되지 않은 상태입니다; 유의율은 원시 P < 0.05로 정의되었습니다.

표 4: 교토 유전자 및 게놈 백과사전 유전자 풍부화 분석 (원료 P < 0.05).

유전자 심볼	공식 전체 이름	로그FC	원시 P-값
하향 조정
HCN3	과분극 활성화 고리 뉴클레오타이드 개폐 채널 3	-1.489	0.0001
OLFML2A	오르파토메딘 유사 단백질 2A	-1.521	0.0042
NOX1	NADPH 산화효소 1	-1.522	0.0022
MRGPRX1	Mas 관련 G-단백질 결합 수용체 X1	-1.526	0.0003
브립1	판코니 빈혈 그룹 J 단백질	-1.699	0.0018
상향 규제
CCL22	C-C 모티프 케모카인 22	2.517	0.0041
PNMA2	부종양 Ma 항원	2.159	0.0062
TBX20	T-박스 전사 인자 TBX20	1.866	0.0001
시대	GTPase 시대	1.846	0.0008
C12orf68	184를 포함하는 코일드 코일 도메인	1.839	0.0002
참고: logFC와 원시 P-값은 마이크로어레이 차별 표현 분석에서 나온 것입니다.

표 5: 상향 및 하향 조절 유전자의 폴드 변화 순위별 상위 10대 DEGs.

유전자 심볼	설명	공동유전자 (n)	P-값
RTP5	수용체 수송체 단백질 5	14	0.000276
CXCL1	성장 조절 알파 단백질 1	8	0.011423
CXCL10	C-X-C 모티프 케모카인 10	7	0.046144
GPR37L1	프로사포신 수용체 GPR37L1	7	0.003792
HCAR1	하이드록시카복실산 수용체 1	7	0.046572
OPRL1	노시셉틴 수용체 1	7	0.039753
P2RY4	P2Y 퓨리노셉터 4	7	0.001279
SSTR4	소마토스타틴 수용체 유형 4	7	0.006742
SUCNR1	광선 수용체 1	7	0.000105
ATM	세린 단백질 키나제 ATM	5	0.004961
PPI: 단백질-단백질 상호작용; DEGs: 차별적으로 발현된 유전자들.

표 6: DEGs의 PPI 네트워크에서 확인된 상위 10개의 허브 유전자.

보충 표 1: 연구의 원시 qRT-PCR Ct 값, 완전한 생물정보학 분석 워크플로우 및 처리 결과(DEG, GO/KEGG, PPI) 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

토론

조현병은 여러 유전적 감수성 인자가 관련된 중증 다인성 질환입니다^13,14. 병태생리에 대한 이해는 진전이 있었지만, 신뢰할 수 있는 진단 바이오마커는 여전히 부족합니다. 본 연구에서는 통합 생물정보학 접근법을 통해 조현병 환자의 혈액 샘플에서 473개의 DEG가 확인되었습니다. GO 및 KEGG 분석은 인슐린 분비, cAMP 신호 전달, 뉴클레오타이드 절제 수리, TNF 신호 전달, 글루타치온 대사 등 채널 활성 관련 용어와 경로에서의 농축을 강조하였습니다. PPI 네트워크 분석은 SUCNR1과 GPR37L1를 허브 유전자로 확인했으며, 이들의 발현이 언어 기억 수행과 연관되어 조현병 관련 분자 표지자로서 잠재적 관련성을 시사했습니다.

"채널 활동" GO 용어의 풍부화는 이전의 조현병 연구와 일치합니다. 전압 개폐 칼슘 채널(예: CACNA1C, CACNB2)과 칼륨 채널(예: Kv3, Kv2.1)은 조현병 감수성과 신경 흥분성에 관여하는 것으로 알려져 있습니다 15,16. 마찬가지로, 확인된 상위 KEGG 경로들은 기존 문헌과 일치합니다. 초기 조현병에서는 고인슐린혈증 및 인슐린 분비 이상이 보고^됩니다. cAMP 신호 전달 경로는 점점 더 질병 병태생리와 연관되어^{있습니다.} 히스톤 변종 H2AX 변형을 포함한 뉴클레오타이드 절제 수리 메커니즘도 19,20,21,22 역할을 할 수 있습니다. 더 나아가, TNF 신호전달과 글루타티온 대사는 정신분열증 발병 기전과 관련이 있습니다^23,24.

언어적 기억 장애는 조현병에서 핵심 인지 결손 중 하나로, 질병 발병 시 존재하고 기능적 결과와 연관되어 있습니다. 홉킨스 언어학습 테스트–개정판(HVLT-R)은 언어 학습과 기억을 잘 검증한 측정 도구입니다. 후보 표지 발현과 언어 기억 수행 간의 상관관계를 평가하는 것은 인지 장애가 조현병에서 장애의 주요 결정 요인이기 때문에 임상적 관련성을 확립하는 데 도움이 됩니다.

qRT-PCR로 검증된 상위 10개 DEG는 마이크로어레이 데이터와 일치했으나, 주요 GO/KEGG 결과와는 밀접하게 일치하지는 않았습니다. 반면, SUCNR1(상향 조절)과 GPR37L1(하향 조절)는 "이온 채널 활성"과 유의하게 연관되어 있고 "인슐린 분비"에 풍부함을 보였습니다. 두 유전자 모두 G 단백질 결합 수용체(GPCRs)를 암호화하는데, 이는 항정신병제의 중요한 표적이며 이온 채널 활성을 조절합니다^.

SUCNR1(GPR91)은 대사 스트레스와 인슐린 분비 및 저항성을 연관지어^26,27이며, 인슐린 저항성은 조현병의 알려진 위험 인자입니다²⁸. GPR37L1는 뇌에서 고발된 고아 수용체로, 소뇌 발달과 운동 기능에 관여하며(²⁹), 파킨슨병³⁰과 신장 나트륨 수송³¹에 연관되어 있습니다. 조현병에서 이 생물의 역할은 이온 채널 활동의 조절과 관련될 수 있습니다.

언어 기억 장애는 정신분열증의 핵심 특징으로, 유전적 위험성과 질병 중증도를 반영합니다^32,33. SUCNR1 발현과 GPR37L1 발현과 언어 기억 점수의 양의 상관관계는 조현병에서의 잠재적 관련성을 더욱 뒷받침합니다.

몇 가지 한계점을 인정해야 합니다. 첫째, 검증 코호트의 표본 크기(그룹당 n = 10명)가 작아 통계적 검정력과 일반화가 제한되었습니다. 둘째, 모든 조현병 환자가 항정신병 약물을 복용하고 있었기 때문에, 관찰된 발현 변화는 질병 병리보다는 약물 효과를 반영할 수 있습니다. 향후 연구에는 약물에 익숙하지 않은 첫 번째 에피소드 환자도 포함되어야 합니다. 셋째, 검증 코호트는 RNA-seq 확인이 없었으며; 더 큰 독립 코호트에서 전사체 전체 시퀀싱이 필요합니다. 넷째, 단면 설계는 바이오마커 수준과 질병 진행 간의 인과관계 평가를 배제합니다. 다섯째, 언어 기억과의 상관관계 분석은 탐색적이었으며 재현이 필요하다. 여섯째, GSE54913 데이터셋은 RNA-seq보다 감도가 낮은 마이크로어레이 플랫폼에서 생성되었습니다. 향후 방향으로는 질병과 치료 과정에서 SUCNR1 및 GPR37L1 수치를 추적하는 종단 연구, 조현병 병태생리에서 이 GPCRs의 기전적 역할을 규명하는 기능적 연구, 그리고 이들 바이오마커에 대한 임상적으로 검증된 분석 개발이 포함됩니다.

요약하자면, 이 통합 분석은 SUCNR1과 GPR37L1 발현 변화가 조현병과 언어 기억 수행과 관련이 있음을 시사합니다. 이 유전자들은 조현병 관련 분자 표지자 후보를 나타낼 수 있습니다. 하지만 제한점으로는 비교적 적은 표본 크기와 언어 기억을 통한 조현병 중증성 부분 평가가 있습니다. 이러한 발견을 검증하기 위한 추가 연구가 필요합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
affy	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/affy/	microarray preprocessing software. Description: R package for microarray preprocessing
clusterProfiler	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	functional enrichment analysis software. Description: R package for functional enrichment analysis
CytoHubba	National Institute of Bioinformatics	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba	hub gene identification plugin. Description: Cytoscape plugin for hub gene identification
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	network visualization software. Description: Software for network visualization and analysis
G*Power	Heinrich Heine University Düsseldorf	https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower	sample size calculation software. Description: Sample size calculation software
GraphPad Prism	GraphPad Software	https://www.graphpad.com/	statistical analysis and graphing software. Description: Statistical analysis and graphing software
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	density gradient medium. Description: Density gradient medium for PBMC isolation
impute	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/impute/	missing-value imputation software. Description: R package for missing-value imputation
Limma	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/limma/	differential expression analysis software. Description: R package for differential expression analysis
MCODE	Cytoscape app	https://apps.cytoscape.org/apps/mcode	subnetwork extraction plugin. Description: Cytoscape plugin for subnetwork extraction
R/Bioconductor	R Foundation	https://www.r-project.org/	statistical computing environment. Description: Statistical computing environment
STRING	EMBL	https://string-db.org/	protein-protein interaction database. Description: Protein-protein interaction database
SYBR Green	Takara	RR820A	fluorescent dye for qRT-PCR. Description: Fluorescent dye for qRT-PCR
TRIzol	Takara	9109	RNA extraction reagent. Description: Reagent for RNA extraction