방법 논문

조직에서 형태계측으로: 성체 마우스의 신경 및 수지상 척추 분석을 위한 단계별 골지-콕스 워크플로우

DOI:

10.3791/71384

⸱

2026년 6월 5일

 ,  , 
1Department of Developmental Neurobiology and Neurophysiology, Institute of Neurobiology - UNAM

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 글에서는 성체 마우스에서 골지-콕스 염색을 단계별로 설명하며, 용액 제조, 조직 함유, 냉동 보호, 절절, 현상, 마운팅 과정을 설명합니다. 이 방법은 조직 보존과 균질하고 저배경 염색을 강조하여 신경 형태를 명확하게 시각화할 수 있게 합니다. 이 방법은 수상돌기 아버를 명명하고 수상돌기 가시의 정량적 형태계측 분석을 지원합니다.

초록

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건강과 질병에서의 신경 형태 분석은 뇌 기능을 이해하고 실험적 개입의 효과를 평가하는 데 기본적입니다. 골지-콕스 염색은 여전히 고전적이면서도 매우 중요한 기법으로, 완전한 신경 아버와 수지돌기 가시를 시각화하는 데 있습니다. 그러나 발표된 프로토콜은 중요한 절차 단계에서 자주 다르고 필수적인 방법론적 세부사항이 부족하여 염색 품질에 상당한 변동이 발생하고 실험실 표준화가 시간과 도전을 초래합니다. 여기서는 성체 마우스를 위한 포괄적이고 단계별 골지-콕스 프로토콜을 제시하며, 생체 내 취급과 조직 처리부터 영상화 및 형태측정 데이터 추출까지 전 과정을 아우릅니다. 이 보고서는 침투 효율, 절획 무결성, 신호 대 잡음비에 영향을 미치는 실용적인 고려사항과 흔한 함정을 상세히 설명하며, 재현성을 향상시키기 위한 방법론적 지침을 제공합니다. 전반적으로 이 프로토콜은 전체 뉴런, 수지돌기 분절, 수지상가시의 신뢰성 있는 시각화와 정량적 분석을 가능하게 합니다. 이 자료는 골지-콕스 염색법을 더 일관성, 투명성, 기술적 엄밀함으로 구현하는 데 도움을 주며, 다양한 실험실 환경에 적용할 수 있는 명확한 틀을 제공할 것으로 기대됩니다.

서론

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골지-콕스 염색법의 궁극적인 목표는 고정된 뇌 조직 1,2,3,4에서 수지돌기 아버와 수지돌기 가시를 포함한 전체 신경 형태를 고해상도로 시각화하는 것입니다. 이 기법은 복잡한 신경 회로 내 개별 뉴런의 상세한 구조 분석을 가능하게 하여, 시냅스 가소성, 신경발달, 신경퇴행, 경험 의존적 구조 재형성 연구에 특히 가치가 있습니다 5,6.

골지체 기반 방법의 개발과 지속적인 사용의 근거는 드문드문하고 완전한 신경 침착을 생성할 수 있는 독특한 능력에 있습니다 1,2. 이 방법은 1873년 카밀로 골지(Camillo Golgi)에 의해 처음 기술되었고 1891년 콕스 7,8에 의해 정교화되었으며, 제한된 뉴런 부분 내에 은 크롬산염을 침전시키는 데 의존하여 중복 표지 없이 완전한 형태학적 재구성을 가능하게한다. 골지-콕스 변형은 원래 골지법에서 사용된 질산은 대신 염수은으로 대체하여 조직 침투성과 염색2의 일관성을 개선합니다. 형광 단백질 발현, 바이러스 추적, 염료 충전 방법과 같은 대체 신경 표지 기법과 비교할 때, 골지-콕스 염색은 여러 가지 장점을 제공합니다. 유전적 조작, 입체 주입, 특수 현미경 장비가 필요하지 않으며, 밝은 시야 현미경 1,2 아래에서 높은 대비로 수지돌기 가시를 시각화할 수 있습니다. 현대 형광 기반 방법이 세포 유형 특이성을 제공하지만, 골지-콕스 염색은 편향 없는 형태학적 샘플링과 형질전환 도구가 없는 종 또는 실험 조건에서 특히 유리하다.

더 넓은 문헌 내에서 골지체 기반 방법은 학습 및 기억5, 스트레스 및 정신 질환11, 노화12, 알츠하이머병12, 13, 14와 같은 신경퇴행성 질환 연구에서 수지돌리 척추 밀도와 형태를 정량화하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 수십 년에 걸친 지속적인 사용은 구조 신경해부학 2에 대한 신뢰성을 강조합니다. 이 방법은 전체 세포 시각화가 필요한 뇌 조직의 수지상 구조와 척추 형태를 분석하는 연구자에게 특히 적합합니다. 실험 그룹 간 비교 형태학 연구에 적합합니다. 그러나 세포 유형 특이성, 라이브 이미징 또는 분자 공위치화가 필요한 연구자들은 형광 또는 유전적으로 암호화된 표지 접근법이 더 큰 혜택을 받을 수 있습니다 9,10.

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프로토콜

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이 연구에서는 성체 야생형 B6129SF2/J 마우스(n = 3)를 사용했습니다. 하지만 성체 단계에서 남녀 모두를 이용해 유사한 염색을 할 수 있습니다. 모든 실험 절차는 이전에 생명윤리 위원회의 승인을 받았습니다. (#117.A, 신경생물학 연구소(INb), 멕시코 국립 자치 대학교)

1. 해의 준비

주의: 염수은 매우 독성이 강하고 부식성이 강합니다. 장갑, 실험복, 안경 보호구를 착용한 채 화학 연기 후드 안에서 손잡이를 취하세요. 폐기물은 라벨이 붙은 유해 폐기물 용기에 폐기하세요. 이크롬산칼륨과 크롬산칼륨은 독성이 있고 발암성 산화제입니다. 화학 훈기 후드 안에서 다루고 피부 접촉이나 흡입을 피하세요.

  1. 재고 침투 솔루션 준비
    1. 칼륨 디크로메이트 15g의 무게입니다. 300mL의 이중 증류수에 녹여 5%(w/v) 용액을 얻습니다.
    2. 수은 염화물 15g의 무게입니다. 300mL의 이중 증류수에 녹여 5%(w/v) 용액을 얻습니다.
    3. 크로메이트 칼륨 15g의 무게를 주세요. 300mL의 이중 증류수에 녹여 5%(w/v) 용액을 얻습니다.
    4. 모든 용기를 알루미늄 호일로 감싸 실온에서 빛을 차단해 보관하세요.
  2. 골지-콕스 작업 해법 준비
    1. 50 mL 이크롬산칼륨 용액, 50 mL 염화 수은, 40 mL 크롬산칼륨 용액을 혼합합니다.
    2. 증류수 100mL를 넣고 충분히 섞으세요.
    3. 혼합물을 빛으로부터 보호한 실온에서 48시간 부화하세요.
    4. 침전물이 가라앉도록 두세요. 조직 침투에는 상정액만 사용하세요.
      참고: 골지-콕스 용액은 빛으로부터 보호받아 보관할 경우 최대 1개월간 보관할 수 있습니다. 시약 낭비를 줄이고 용액의 신선도를 보장하기 위해 실험에 필요한 재고 용액과 최종 골지-콕스 용액의 부피만 준비하십시오. 침전물 손실 후 사용 가능한 상정액 20mL를 얻기 위해 뇌당 최소 23mL를 준비하세요.
  3. 냉동 보호 용액 준비해
    1. 300g 자당을 무수 인산염 이염기성나트륨, 단수화형 인산염기성나트륨, 염화나트륨으로 조제한 0.1M 인산염 완충 생리식염수(PBS, pH 7.4)에 용해합니다.
    2. 최종 볼륨을 1L로 조정하세요.
    3. 최대 일주일간 4°C에서 보관하세요.

2. 조직 채취 및 임시 침투

  1. 심장 내 관류 시술
    1. 동물에게 펜토바르비탈 나트륨(252 mg/kg, 무효)으로 마취하세요. 진행 전에 페달 철수가 없어 마취 깊이가 충분한지 확인하세요.
    2. 약 30mL의 0.1 M PBS(pH 7.4)를 담은 심장 내 관류를 실시하여 배출물이 깨끗해질 때까지 실시하여 뇌 조직에서 혈액이 완전히 제거되도록 합니다. 고정제는 사용하지 않았으며; 골지-콕스 솔루션 자체가 이 작업 흐름에서 고정제 역할을 합니다.
    3. 뇌를 조심스럽게 추출해 증류수에 헹구세요. 뇌가 적절히 관류되고 잔여 혈액이 없는지 확인하세요(그림 1A).
  2. 임신 조직
    1. 뇌를 반구나 코로나 블록(~3mm 두께)으로 나누어 임신을 개선합니다. 작은 조직 블록은 더 균일한 함유를 촉진하고 변이성을 줄이지만, 더 큰 샘플은 더 긴 배양 시간이 필요하고 덜 균일한 염색을 보일 수 있습니다.
    2. 뇌를 10mL 골지-콕스 용액에 넣습니다. 빛으로부터 보호하세요.
      참고: 10mL의 골지-콕스 용액은 성체 쥐 뇌 전체에 충분합니다. 단일 반구나 더 작은 코로나 블록(~3 mm 두께)을 사용할 때, 조직이 완전히 침수되어 있어야 용액 부피를 비례적으로 줄일 수 있습니다. 전체 뇌를 사용할 경우, 관심 부위를 보존하면서 절절 절단하여 최적의 시약 침투와 균질한 침투를 보장하는 것이 권장됩니다.
    3. 상온에서 24시간 배양하세요.
    4. 신선한 골지-콕스 용액 10mL로 교체하세요. 어두운 환경에서 22–25°C에서 10-14일간 부화시킵니다.
      일시정지: 조직을 골지-콕스 용액에 최대 15일간 저장하면서 큰 생존력 손실 없이 보관합니다.
      참고: 골지-콕스 임신 후 뇌는 짙은 황금빛으로 변하고 매우 취약해집니다; 따라서 주의해서 다루어야 합니다(그림 1B). 강철 재료와의 화학 반응을 피하기 위해 플라스틱 핀셋을 사용하는 것이 권장됩니다.

3. 냉동 보호

  1. 조직을 10mL 냉동보호제 용액(30% 자당(w/v), 0.1 M PBS, pH 7.4, 1.3단계에서 준비됨)로 옮깁니다.
  2. 24시간(4 °C)을 배양합니다.
  3. 같은 온도(4 °C)에서 신선한 냉동 보호 용액으로 교체하고 최소 4–7일간 배양합니다.
    멈추는 지점: 절제 수술 전에 조직을 4°C에서 최대 3주간 냉동 보호 용액에 보관하세요.

4. 임베딩 및 단면 분할

  1. 조직 박동
    1. 뜨거운 증류수에 8% 아가로스(w/v) 아가로스를 준비하세요. 약 40°C까지 식히세요.
    2. 조직을 임베딩 몰드에 넣고 적절한 방향으로 맞추세요.
    3. 아가로스를 조직 위에 부어 실온에서 1시간 또는 4 °C에서 30분간 굳히도록 합니다(그림 1C).
    4. 블록에서 과잉 아가로스를 다듬으세요(그림 1D).
  2. 절개 조직
    1. 접착제로 아가로스 블록을 진동 단계에 고정하세요. (그림 1E)
    2. 절단실에 냉동 보호 용액을 채우세요.
    3. 100–200 μm 두께의 조직 절개. 수상돌기 척추 분석에는 영상 해상도를 높이기 위해 더 얇은 절면(예: 100–120 μm)이 권장되며, 전체 신경 재건에는 두꺼운 단면(예: 150–200 μm)이 사용될 수 있습니다. 이 연구에서는 120 μm 두께로 절단이 이루어졌습니다(그림 1F).
    4. 부드러운 붓으로 단면을 모으세요.
      참고: 비브라토움 설정 은 재료표에 기록하세요. 섹션을 장착한 후에는 어떤 경우에도 슬라이드를 헹구지 마세요. 자당은 발달 단계까지 조직을 보호합니다.

5. 장착

  1. 젤라틴 코팅 슬라이드의 준비
    1. 끓을 때까지 가열한 증류 100 mL(0.5% w/v)에 젤라틴 0.5g을 녹여 코팅 용액을 준비합니다.
    2. 젤라틴이 완전히 녹을 때까지 저어주고 용액을 실온까지 식히세요.
    3. 황산칼륨 0.05g(0.05% w/v)을 넣고 완전히 녹을 때까지 섞습니다. 필요하다면 잔여 폼을 제거하세요.
    4. 젤라틴 용액을 필터 페이퍼로 여과하여 녹지 않은 입자와 잔여 폼을 제거하여 슬라이드의 균일한 코팅을 보장합니다.
    5. 유리 슬라이드는 중성 세제와 물로 세척하고, 꼼꼼히 헹궈낸 후 증류수로 헹구세요.
    6. 슬라이드를 96% 에탄올에 담가서 눈에 띄는 방울이 남지 않을 때까지 사용하세요.
    7. 오븐에서 50–60 °C에서 30분 또는 완전히 마를 때까지 건조하세요.
    8. 딥은 젤라틴 용액에 미끄러져 들어가 남은 용액이 배수되도록 합니다.
    9. 슬라이드를 50–60 °C에서 오븐에 30분 또는 완전히 마를 때까지 넣으세요.
    10. 적절한 접착을 위해 코팅과 건조 과정을 최소 다섯 번 반복하세요.
    11. 최종 건조 단계가 끝난 후, 슬라이드를 먼지 없는 환경(예: 화학 연기 후드 내부)에서 실온까지 식히고, 깨끗하고 밀폐된 용기에 보관하여 사용하세요.
      참고: 코팅할 슬라이드 수에 필요한 젤라틴 용액 양만 준비하세요. 약물 양은 지정된 농도(w/v)를 유지하면서 비례적으로 스케일링할 수 있습니다.
  2. 부드러운 붓을 사용해 젤라틴 코팅 현미경 슬라이드에 절편을 배치합니다
    참고: 현미경 슬라이드에는 최소 5층 이상의 0.5% 젤라틴이 코팅되어 있습니다. 슬라이드는 신선하게 준비하여 조직의 완전성을 확보하세요. 이 프로토콜에서는 전하 슬라이드가 시험되지 않았습니다.
  3. 흡혈지에 냉동 보호 용액을 적셔서 단지 위에 덮으세요.
  4. 손바닥으로 부드럽게 눌러 기포를 제거하고 조직 절편과 젤라틴 코팅 슬라이드 간의 균일한 접촉을 보장하여 이후 처리 시 안정적인 접착을 촉진합니다.
    참고: 부드러운 압력은 절편과 젤라틴층 간 접촉을 극대화하여 접착력을 높여 수용성 현상 중 박리 위험을 줄여줍니다.
  5. 종이를 조심스럽게 떼어내고 실온에서 2–3일 동안 어두운 곳에서 말리세요.
    참고: 저습도 환경에서 건조하는 것은 안정적인 접착력에 매우 중요합니다. 빛으로부터 보호함으로써 크롬산염의 존재로 인해 빛에 민감한 골지-콕스 함침 조직의 광화학적 변화를 최소화합니다. 또한, 잔류 아가로스는 발달 과정을 크게 방해하지 않으며, 발달 절편에서 조직 주변에서 관찰할 수 있습니다(그림 2A). 아가로스의 존재는 골지-콕스 함침 조직이 매우 약하기 때문에 마운팅 시 조직의 안전한 취급을 용이하게 합니다. 원한다면, 슬라이드에 단면을 장착한 후 과도한 아가로스를 조심스럽게 수동으로 제거할 수 있습니다.
    멈춤 지점: 슬라이드를 빛으로부터 보호하세요.

6. 개발

주의: 자일렌은 흡입 시 가연성 및 독성이 있습니다. 화학 훈기 후드에서 다루고 불꽃은 피하세요. 암모니아는 부식성이 강하며 자극적인 증기를 발생시킵니다. 배기구 처리에 핸들이 있어.

  1. 재수화물 섹션
    1. 슬라이드를 증류수에 5분간 담가보세요.
    2. 신선한 증류수에 5분간 옮깁니다.
    3. 50% 에탄올에 5분간 담그세요.
      참고: 50% 에탄올 단계는 수성 상태에서 탈수로 점진적으로 전환하여 시약 침투를 용이하게 하고 현상 단계 전 조직의 무결성을 유지하는 데 도움을 줍니다.
  2. 착색 현상
    1. 25% 암모니아 2부피와 증류수 1부피(2:1, v/v)를 혼합하여 8분간 수성 암모니아 용액에 슬라이드를 인큐베이트
    2. 증류수에 5분간 씻으세요.
    3. 다시 증류수로 5분간 세척하세요.
    4. 5% (w/v) 티오설페이트 나트륨을 증류수에 담아 어두운 곳에서 10분간 배양하세요.
    5. 증류수에 1분간 씻으세요.
    6. 다시 증류수로 1분간 세척하세요.
      참고: 개발 과정을 시작하면 중단 없이 완료하세요.
  3. 탈수와 투명
    1. 슬라이드를 70% 에탄올에 5분간 담가.
    2. 슬라이드를 96% 에탄올에 5분간 담그세요.
    3. 슬라이드를 100% 에탄올에 5분간 담그세요.
    4. 슬라이드를 자일렌에 최소 6분간 옮기세요.

7. 영구 장착

  1. 각 섹션에 Permount® 장착 매체(굴절률 ~1.52)를 적용하세요.
    참고: 최적의 이미지 품질을 보장하기 위해 장착 매체의 굴절률은 오일 침지 대물렌즈와 호환되어야 합니다.
  2. 공기 방울을 피하려면 커버슬립을 조심스럽게 깔아야 합니다.
  3. 가장자리는 투명 매니큐어로 밀봉하세요.
  4. 슬라이드는 실온에서 어두운 곳에서 48시간 말리세요.

8. 영상

참고: 영상 방식과 획득 구성은 현미경 브랜드에 따라 다릅니다; 각 시스템에 대해 최적의 설정을 정해야 합니다.

  1. 현미경을 켜.
  2. 현미경 소프트웨어를 열어
  3. 현미경 스테이지에 슬라이드를 올려놓으세요.
  4. 1X/0.04 N.A. 또는 4x/0.10과 같은 저배율 대물렌즈를 사용하여 뇌 단면의 2D 광시각 이미지를 촬영하세요(그림 2A, B).

9. 전체 뉴런 영상 촬영

  1. 관심 뉴런이 포함된 영역의 고해상도 이미지 스택을 10x/0.25 N.A. 또는 20x/0.40 N.A. 대물렌즈를 사용해 캡처합니다(그림 2C).
    참고: 분석 대상 신경세포는 완전하고 균일한 골지-콕스 침투를 보여야 하며, 명확하게 정의된 수지상 골치기와 최소한의 배경 염색을 보여야 합니다. 절단된 돌기, 불완전한 임복, 겹치는 구조, 높은 배경 신호를 가진 세포는 정확한 형태계측 분석을 위해 제외해야 합니다.
  2. 이미지를 포커스하고 카메라 설정을 조정하세요. 노출과 화이트 밸런스도 포함해서요.
  3. 이미지 스택의 상하 경계를 설정하세요.
  4. 이미지 획득 창 내에서 스텝 거리를 0.5 μm로 설정하세요.
  5. 스택 획득을 위한 소프트웨어 명령어를 사용하여 이미지 스택을 캡처합니다.
  6. 위의 단계를 반복하여 관심 있는 모든 영역을 포착하세요.
  7. 데이터 파일을 저장하고 모든 이미지 파일을 저장하세요. 외부 처리를 위한 TIFF 형식.

10. 수상돌기 가시 영상

  1. 관심 뉴런이 포함된 영역의 고해상도 이미지 스택을 적절한 밝시야 현미경에서 63x/1.4 N.A. 오일 침지 대물렌즈를 사용해 캡처합니다(그림 2D).
    참고: 본 원고에서는 그림 2D에 나타난 수지상 가시의 고해상도 이미지가 공초점 현미경인 자이스 모델 LSM 780의 밝시장 모드를 사용해 얻었습니다. 하지만 다른 밝시야 현미경들은 63배의 고품질 z-스택 이미지를 얻을 수 있으며, 각 실험실에서 그 매개변수를 표준화해야 합니다.
  2. 슬라이드에 침수 오일 1–2방울을 바르고 대물렌즈를 슬라이드 위에 올려놓아 대물렌즈와 오일이 닿도록 하세요.
  3. 이미지를 포커스하고 카메라 설정을 조정하세요. 노출과 화이트 밸런스도 포함해서요.
  4. 이미지 스택의 상하 경계를 설정하세요.
  5. 이미지 획득 창 내에서 스텝 거리를 0.3 μm로 설정하세요.
  6. 스택 획득을 위한 소프트웨어 명령어를 사용하여 이미지 스택을 캡처합니다.
  7. 위 단계를 반복하여 관심 있는 모든 영역을 포착하세요
  8. 외부 처리를 위해 데이터 파일을 저장하고 모든 이미지 파일을 TIFF 형식으로 저장하세요.
    참고: 9단계와 10단계에 대해서요. 현미경에 Z-스택 획득을 위한 모터 구동 스테이지가 장착되어 있지 않은 경우, 마이크로미터 초점을 조정하여 수동으로 이미지를 수집할 수 있습니다. 하지만 광학 단면 간 간격은 덜 정밀할 수 있습니다. 이 경우, 획득된 이미지 시퀀스로부터 이미지 처리 소프트웨어(예: ImageJ)에서 Z-스택을 재구성할 수 있습니다.

11. 형태계측학적 분석

참고: 이를 위해 다양한 접근법과 전문 소프트웨어 프로그램을 사용할 수 있습니다. 수지상기 척추 분석을 위한 무료 접근 도구로는 ImageJ 또는 본 연구와 같이 PyReconstruct15가 있습니다. PyReconstruct와 그 신경 재구성 및 형태측정 분석에 대한 더 자세한 설명은 참고 출처를 참조하세요.

  1. 수지상 척추 형태측정 분석 절차
    1. ImageJ에서 파일을 열면, RGB 색상 > 이미지 유형을 선택하여 RGB로 변경>
    2. ImageJ에서 Z-스택을 이미지 시퀀스로 변환하세요: 파일 > 이미지 시퀀스로 저장 > 클릭하세요. 각 이미지 시퀀스를 별도의 폴더에 저장하여 후속 분석을 하세요. PyReconstruct에서 이미지 시퀀스를 불러와서 파일 > 이미지에서 새 >을 클릭하세요.
    3. 대화 창이 나타나 파일에 이름을 할당하도록 안내합니다(예: WTVR1N1 – 야생형 차량 쥐 1 뉴런 1).
    4. 그 후 세 개의 연속된 대화 창이 나타납니다. 첫 번째 창에서 보정 값(μm/px)을 입력하세요. 이 정보는 Z-스택 메타데이터에서 확인할 수 있으며 ImageJ에서 접근할 수 있습니다.
    5. 두 번째 창에서는 각 연속 광학 단면의 두께(μm)를 입력합니다. 마지막으로 이미지 시리즈가 자동으로 로딩되기 시작합니다(보조 그림 1A).
    6. 관심 세그먼트가 확인되면, 조사자가 정의한 포함 기준에 따라 추적을 진행하여 정량적 데이터를 얻으세요.
    7. 각 트레이스 유형별로 고유한 이름과 도메인을 할당하세요. 도메인은 하단 패널에 위치하며, 다양한 색상의 기하학적 도형으로 표현되어 있습니다(보조 그림 1B).
    8. 연필 도구를 사용해 원하는 샘플 길이에 맞는 선을 그립니다. 그 후 Z 도구를 사용해 수지돌기 구간을 따라 Z-스택을 따라 두 번째 트레이스를 생성합니다.
    9. 초기 트레이스를 사용하여 적절한 구간 길이를 결정하고 Z-트레이스 리스트 > 리스트(보조 그림 1B)에서 검증하세요.
    10. Z-스택을 탐색하며 최적의 초점으로 수지상상 척추 머리를 식별하세요. 연필 도구를 사용해 각 척추 머리의 가장 넓은 원위 부위를 따라 그립니다. 그 후 Z 도구를 사용해 Z-스택 전체를 따라 척추 목을 따라 그립니다(보조 그림 1C, D).이 과정을 반복하여 선택한 수지상기 마디 내 모든 척추 머리와 목을 추적할 때까지 반복합니다.
  2. 척추 머리 수출 측정
    1. 척추 머리 너비와 길이 측정 목록을 열어보세요. 각각 Lists > Trace List(너비)와 Z-트레이스 리스트> Lists(길이)에서 접근하세요.
    2. 데이터를 컴퓨터에서 원하는 위치로 내보내세요. 두 개의 별도 엑셀 파일이 생성되며, 각각 해당 측정 데이터가 담겨 있습니다.
  3. 척추 형태를 분류하고 밀도를 계산하세요
    1. 이전에 생성된 엑셀 파일에서 척추 머리와 목의 너비와 길이 측정값을 추출하세요.
    2. 데이터는 다음 기준16에 따라 형태학적 분류를 위해 폭과 길이로 분류되는 해당 열로 정리되어야 합니다: 섬유족(>2 μm), 얇은 (< 2 μm), 짧음(길이 대 머리 너비 비율≤1), 버섯(머리 폭 >0.6 μm). (보충 그림 1E). 분석된 수상돌기 구간에서는 섬유지형이 거의 관찰되지 않아 분석에 포함되지 않았다.
    3. 이 단계에서 분석된 수상돌리 마절당 가시의 총 수와 가시 밀도(선형 μm당 가시), 그리고 각 가시 아형의 유형과 수가 결정됩니다. 이 분석에 사용된 엑셀 템플릿16 은 참고 소스에서 확인할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 12개월 된 암컷 쥐에서 해마의 CA1 부위의 기저 수지상성 가시 밀도를 정량화하였습니다.
    4. 데이터 분석, 도서화 및 통계에 최적화된 전문 과학 소프트웨어 애플리케이션으로 정량화된 데이터를 내보내고 그래프를 생성할 수 있습니다. 여기서 그림 3 의 그래프는 GraphPad 프리즘 소프트웨어로 제작되었습니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

조직 함유 및 절절 절단
여기서 설명한 골지-콕스 프로토콜은 성체 쥐 뇌 조직에서 신뢰할 수 있고 균일한 신경 세포 염색을 생성했습니다. 골지-콕스 용액에 수혈된 후, 뇌는 특징적인 짙은 황금색을 띠었으며, 이는 염색액이 조직 전체에 성공적으로 확산되었음을 나타낸다. 진동 절단은 신경세포 소마타와 수지돌기 돌기의 구조적 완전성을 보존했습니다.

신경 시각화
밝은 필드 영상은 명확하게 정의된 신경세포체와 수상돌기 붕대를 배경 염색이 최소화한 상태로 확인했습니다. 개별 뉴런은 2차 및 3차 수지상돌기 가지를 포함해 전체적으로 시각화할 수 있었습니다. 더 높은 배율에서는 수상돌기 마디가 잘 분명히 드러나 형태 측정 분석이 가능했습니다.

수상돌기 가시의 정량적 분석
이 프로...

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토론

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골지-콕스 염색법은 고정된 뇌 조직에서 신경 형태와 수지돌기 가시를 시각화하는 데 가장 널리 사용되는 기법 중 하나로 남아 있습니다 3,4. 이 방법은 소수의 무작위 뉴런 하위 집합을 임신시켜 배경 염색을 최소화한 완전한 수지상 나무를 시각화할 수 있게 합니다. 본 프로토콜에서는 해마 피라미드 뉴런과 그 수지상 가시를 명확히 시각화할 수 있게 하여, 밝시야 현미경과 Z-스택 이미징을 이용한 신뢰할 수 있는 형태계측 분석을 가능하게 했습니다. 이 프로토콜로 얻은 염색 품질과 신경 형태의 대표적인 예는 그림 1과 3에 나타나며, 신경 구조는 전체 조직 절면부터 개별 수지돌기 가시까지 다양합니다.

여러 실용적인 수정과 문제 해결 전략이 얼...

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공개 사항

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저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 과학, 인문학, 기술 및 혁신 비서국(SECIHTI)(CBF-2025-G-35), 개인 학술 총국(DGAPA), 그리고 신경생물학 프로그램(신경생물학), UNAM, 멕시코 대학교(UNAM)의 지원을 받았습니다. 움베르토 마르티네스는 SECIHTI(No. 2330239)에서 박사후 연구원 과정을 받았다. 페드로 F. 루비오는 SECIHTI(국가 기부)로부터 재정 지원을 받았습니다. 비바리움 지원을 제공해 주신 A. R. 아길라르 바스케스와 신경생물학연구소(INb) 기술진, A. 카스티야 레온, M. 가르시아 세르빈, M. A. 카르바호 마타에게 감사드립니다; 현미경 지원을 위해 E. 데 로스 리오스 아렐라노와 E. N. 에르난데스 리오스; 화상회의 지원을 위해 M. 멘도사 발타사르와 M. E. 로사스 알라토레, 과학 홍보를 위해 B. A. 가르시아 프리아스가 참여했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아가로스라이프 테크놀로지15510-027CAS 9012-56-6
암모니아 용액 25%머크208380CAS 1336-21-6. 위험하다.
무수 인산나트륨 이염기성시그마-올드리치S3264CAS 7558-79-4
밝야 현미경니콘이클립스 시
황산칼륨 크롬시그마-올드리치243361
공초점 현미경자이스LSM 780
디지털 잔액아큐리스 인스트루먼트W3200-1200
몰드 삽입머크E6032크기: 22x22 mm
에탄올마이어394
실험 동물잭슨 연구소2124-01B6129SF2/J 마우스 품종
젤라틴 가루시그마-올드리치G2500
그래프패드 프리즘 소프트웨어그래프패드 소프트웨어 주식회사버전 8.0.2
이미지 J 피지 소프트웨어미국 국립보건원(NIH)버전 1.54p, https://imagej.net/software/fiji/downloads
수은 염화물J.T. 베이커2594-01CAS 7487-94-7. 위험하다.
현미경 카메라니콘DS-Vi1
현미경 대물렌즈 (10배)니콘93183플랜 10x/0.25 N.A.
현미경 대물렌즈 (1개)니콘93180계획 UW 1x/0.04 N.A. 
현미경 대물렌즈 (20배)니콘93184플랜 20x/0.40 N.A. 
현미경 대물렌즈 (4배)니콘93182플랜 4x/0.10 N.A. 
현미경 대물렌즈 (63배)자이스420782-9900-799플랜 APO 63x/1.4 N.A. 오일 DIC
현미경 슬라이드시그마-올드리치S8902
단수화형 인산나트륨 단염성J.T. 베이커3818-05CAS 10049-21-5
매니큐어죄악 있는 색깔대담한 색상투명
퍼마운트 마운팅 매체피셔 사이언티브SP15-500
크롬산칼륨프로덕토스 퀴아큐테; 미코스 몬테레이2784CAS 7789-00-6. 위험하다.
이크로메이트 칼륨시그마-올드리치207802CAS 7778-50-9. 위험하다.
파이리컨스트트럭트 소프트웨어텍사스 대학교 오스틴 캠퍼스버전 1.19.0, https://github.com/SynapseWeb/PyReconstruct
염화나트륨페르몽24912CAS 7647-14-5
티오설페이트 나트륨프로덕토스 퀴아큐테; 미코스 몬테레이7291CAS 7772-98-7. 위험하다.
자당J.T. 베이커 (아반토르)4072-0566.55° 비각 회전, ACS 시약
비브라토움라이카 바이오시스템VT1200S속도 20 mm/s, AMPL 및 대시; 0.60 mm
자일렌CTR 사이언티브CTR05128CAS 1330-20-7. 위험하다.

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