줄기 라이디히 세포에 미치는 매트릭스 강성 효과를 연구하기 위한 조정 가능한 폴리아크릴아마이드 하이드로겔 제작

요약

이 프로토콜은 조절 가능한 강성을 가진 폴리아크릴아마이드 하이드로겔의 제조를 설명하며, 통제된 2차원 배양 시스템에서 행렬 역학이 줄기 라이디히 세포 거동에 미치는 영향을 연구합니다.

초록

세포외기질(ECM) 강성은 줄기세포의 행동을 결정적으로 조절합니다. 이전에 우리는 노화 과정에서 기질 강성의 병리적 증가가 줄기둥 라이디히 세포(SLC) 항상성을 방해하여 테스토스테론 감소를 초래한다는 것을 입증했습니다. 이 발견을 바탕으로, 본회의 실험실에서 개발된 상세한 프로토콜을 제시하는데, 이는 시험 관 내에서 고환 미세환경을 모델링하기 위해 강성을 조절하는 폴리아크릴아마이드(PA) 하이드로겔을 제조하는 방법입니다. 이 방법은 생리학적부터 병리적 조건까지 1–100 kPa의 강성 범위에서 겔을 재현 가능하게 주조할 수 있게 합니다. 주요 단계는 아크릴아마이드/비스-아크릴아마이드의 정밀 혼합, 젤 팽창 평형, 설포-SANPAH로 인한 표면 활성화, 그리고 SLC 접착 및 배양을 지원하는 콜라겐 코팅입니다. 우리는 표적 강성에 대한 최적화된 조형과 불완전 중합 및 세포 부착 불량 같은 일반적인 문제에 대한 문제 해결 지침을 제공합니다. 이 시스템은 기질 강성이 정의된 2D 조건에서 SLC 증식, 분화 및 스테로이도생성 기능을 어떻게 조절하는지 체계적으로 연구할 수 있게 합니다. 생식 생물학을 넘어, 다른 세포 유형의 기계생물학 연구와 뻣뻣함 관련 기능 장애를 표적으로 하는 치료제 선별에도 귀중한 플랫폼 역할을 합니다.

서론

세포외기질(ECM)의 기계적 특성은 줄기세포의 운명 조절에 중요한 역할을 하며, 증식, 분화, 기능 유지 1,2,3,4. 고환에서는 연령 관련 ECM 경직이 테스토스테론 생성 감소와 관련이 있습니다. 그러나 고환 생리적 강성 범위를 충실히 재현하는 표준화된 시험관 내 모델이 부족해 기저 기계생물학적 메커니즘은 아직 잘 이해되지 않았습니다. 어린 쥐 고환 조직의 생리적 강성은 약 1–15 kPa이며, 노화되거나 섬유화된 조직은 20–30 kPa 이상에 이를 수 있습니다.

폴리아크릴아마이드(PA) 하이드로겔은 아크릴아마이드와 비스-아크릴아마이드 ^5,6의 비율을 조절하여 강성을 정밀하게 조절할 수 있어 세포-기질 상호작용 연구를 위한 다목적 플랫폼으로 부상했습니다. 콜라겐 코팅 유리나 상업용 하이드로겔과 같은 다른 기판과 비교할 때, PA 겔은 강성과 생화학적 리간드 밀도를 독립적으로 조절하여 기계적 단서를 체계적으로 해부할 수 있게 합니다. PA 겔 제조를 위한 여러 프로토콜이 ^{존재하지만,} 특히 SLC와 같은 희귀 1차 세포의 경우 특정 세포 유형에 대한 상세한 최적화가 부족한 경우가 많습니다.

여기서는 마우스 SLC 배양에 맞춘 강성도(1–100 kPa)의 PA 하이드로겔을 제조하는 견고하고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법에는 젤 캐스팅, 팽창 평형, Sulfo-SANPAH를 이용한 표면 기능화, 세포 접착을 촉진하는 콜라겐 코팅에 대한 단계별 설명이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜을 따르면, 연구자들은 젊은(연약한) 고환과 노화된(딱딱한) 고환의 기계적 환경을 모방하는 조절 가능한 강성을 가진 기질을 생성할 수 있어, 강성 의존적 SLC 반응의 정량적 연구가 가능해집니다. 이 시스템은 다른 기계감응세포 유형에도 적응할 수 있으며, 강성 관련 병리를 표적으로 하는 약물 스크리닝의 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 쑨산대학교 기관동물 관리 및 이용 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호: SYSU-IACUC-2026-B1278)에서 기관 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 1차 마우스 SLC의 분리 및 배양

1. C57BL/6 마우스의 고환을 해부하고 조심스럽게 백부기(tunica albuginea)를 제거하세요.
2. 고환을 잘게 썰어.
3. 1 mg/mL 콜라게나제 IV형 DMEM/F12에서 37ºC에서 15분간 배양하여 미세뇨관에서 간질세포를 분리합니다.
4. 콜라겐제 활성을 멈추기 위해 10% 태아 소 혈청이 함유된 DMEM/F12를 추가하세요.
5. 1500 × g 에서 실온에서 3분간 원심분리기를 사용하세요.
6. 펠릿을 PBS에 재현탁하고 70 μm 필터를 통과시킵니다.
7. 유입 세포 분류기를 이용한 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 CD51⁺ 세포를 농축합니다.
8. 증축된 세포를 DMEM/F12로 구성된 SLC 배양 배양지에 씨앗을 뿌리고, 1 nM 덱사메타손, 1 ng/mL LIF, 5 μg/L 인슐린-트랜스페린-나트륨 셀레나이트, 5% 닭 배아 추출물, 0.1 mM β-머캅토에탄올, 1% 비필수 아미노산, 1% N2, 2% B27, 20 ng/mL 기본 섬유아세포 성장인자, 표피 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 온코스타틴 M을 보완하여 투여합니다.
9. 표준 조건(37 °C, 5% CO₂)에서 SLC를 하이드로겔에 씨앗할 수 있는 원하는 밀도에 도달할 때까지 배양합니다.

2. 젤 캐스팅 유리 용기 조립

1. 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE) 젤을 주조하는 데 사용되는 특수 유리판과 스페이서를 꼼꼼히 점검하고 청소하여 먼지, 손상, 잔여물이 없는지 확인하세요.
2. 제조사의 지침에 따라 유리판, 스페이서, 클램프를 올바르게 조립하여 젤 주조 시 누출을 방지할 수 있도록 조립체가 잘 밀봉되도록 하세요.
3. 조립된 유리 용기를 실험실 스탠드 위에 안전하게 올려놓고 주조 준비를 하세요.
   참고: 주조 장치는 표준 웨스턴 블롯(도데실 황산나트륨 [SDS]-PAGE) 유리판을 사용하며, 두께 1.0mm의 고정 스페이서를 사용하여 재현 가능한 겔 두께와 세포 배양에 평평한 표면을 보장합니다.

3. PAGE 젤 혼합액 준비

1. 실험 설계에 따라 다음 시약을 15 mL 또는 50 mL 무균 원심분리기 튜브에 정확히 측정하십시오: 40% 아크릴아마이드 스톡 용액, 2% 비스-아크릴아마이드 스톡 용액, 1M HEPES 버퍼(pH 8.5), 무균 ddH₂O.
   주의: 아크릴아마이드와 비스-아크릴아마이드는 신경독소입니다. 건조 분말을 무게 재 시에는 피부 접촉과 공기 중 입자 흡입을 방지하기 위해 항상 장갑과 방진 마스크를 착용하세요. 시술은 연기함 내에서 이루어져야 합니다.

4. 시작자와 촉매를 추가하고 젤을 주조합니다

1. 혼합액에 다음 성분을 순차적으로 첨가합니다: 10% 과황산암모륨(APS): 중합 반응을 시작하는 촉진자 역할을 합니다. N,N,N',N'-테트라메틸렌디아민(TEMED): 중합 반응을 가속시키는 촉매 역할을 합니다. 총 젤 부피 6mL 를 위해 10% APS 60 μL와 TEMED 6 μL를 추가합니다(스케일링은 표 1 참조).
   참고: 중합 반응은 TEMED를 첨가한 직후에 시작됩니다; 따라서 이후 단계들은 신속히 수행되어야 합니다.

5. 혼합된 용액을 부어

1. 즉시 혼합액을 유리 용기 한쪽 가장자리를 따라 피펫으로 부어 기포가 생기지 않도록 하세요.

6. 겔이 중합되도록 허용하기

1. 캐스트 젤 용기는 실온에서 방해받지 않고 두세요.
   참고: 중합은 보통 상온(20–25 °C)에서 15–30분이 소요됩니다.
2. 비중합 젤 혼합물과 중합 젤 사이에 명확한 경계가 보이고 젤이 완전히 고체가 되면 다음 단계로 넘어가세요(용기를 기울일 때 젤이 흐르지 않습니다).
3. 주조 직후, 겔 혼합물 위에 절대 에탄올(또는 수분 포화 에탄올)을 얇게 덮어 대기 중 산소가 라디컬 중합을 억제하는 것을 차단합니다. 에탄올은 평평한 윗면을 형성하는 데도 도움을 줍니다.
4. 중합 후에는 판을 분해하기 전에 에탄올을 제거하세요.

7. 용기 분해 및 젤 수확

1. 클램프를 조심스럽게 분해하고 플라스틱 쐐기나 주걱으로 유리판을 부드럽게 떼어내어 중합된 PAGE 젤이 한 판에 그대로 남도록 하세요.
2. 충분한 양의 멸균 PBS가 포함된 배양 접시를 준비하세요.
3. 주걱이나 장갑 낀 손으로 젤을 유리판에서 조심스럽게 떼어내고, 부드럽게 PBS에 녹여 넣으세요.
4. 젤이 들어있는 접시를 PBS에 밀봉하고 4°C에서 하룻밤 배양하세요.
   참고: 이 단계는 매우 중요합니다. 새로 준비된 젤은 탈수 상태이며, PBS에서 물을 완전히 흡수하여 최종 크기로 팽창해야 합니다. 이 단계를 건너뛰고 젤을 직접 절단하면, 이후 배양 배지에서 계속 팽창하여 배양 영역을 초과하여 사용할 수 없게 됩니다. 부기 후 젤 두께는 1mm입니다. 이는 겔 두께가 100 μm 이하로 떨어지면 세포가 기저의 강성 배양판의 강성을 감지할 수 있어 의도한 기계생물학적 측정에 방해가 될 수 있기 때문에 매우 중요합니다.

8. 겔을 절단하여 배양 플레이트에 옮기기

1. 다음 날, 4°C에서 젤을 채취하세요. 멸균 생검 펀치나 블레이드 커터(배양판 크기와 일치하는 직경, 예: 6웰 플레이트)를 사용하여 멸균 조건에서 젤을 절단합니다.
2. 생물안전 캐비닛 내에서 멸균 겸자를 사용해 잘린 젤 디스크를 부드럽게 집어 빈 멸균 배양 웰 중앙에 놓으세요.

9. 초기 세척 및 자외선 조사

1. 겔이 담긴 우물에 충분한 멸균 PBS를 첨가하여 젤이 완전히 잠기도록 합니다.
2. 배양판을 부드럽게 흔들어 젤 표면을 씻어내세요.
3. 피펫으로 PBS를 흡인하세요.
4. 이 세척 과정을 한 번 더 반복하여 총 두 번, 각각 3분간 세척합니다.
5. 세척 후에는 젤을 다시 덮을 만큼 충분한 멸균 PBS를 추가하세요. 뚜껑을 약간 열어둔 채 전체 배양 플레이트를 UV 램프 아래에 놓고(생물안전 캐비닛 또는 전용 UV 가교 결합기 안에서) 기본 멸균을 위해 1시간 방사선을 조사하세요.

10. 설포-산파 가교 결합기 활성화

1. 생물안전 캐비닛 내부에서 우물에서 PBS를 조심스럽게 흡입하세요.
2. 흡입 전에 액체 표면 장력으로 젤이 손상되지 않도록 피펫 팁을 사용해 젤을 웰 벽과 바닥에서 부드럽게 분리합니다.
3. 젤을 멸균 겸자를 사용해 같은 배양판의 다른 깨끗한 웰로 옮깁니다.
   참고: 젤을 옮길 때는 먼저 깨끗한 웰에 소량의 PBS를 첨가하면 웰 바닥과 젤 사이에 갇힌 기포를 배출하는 데 도움이 되며, 추가 세척 효과도 있습니다.
4. 가교 결합 작업 용액 준비: 멸균수나 권장 완충제(예: PBS)를 사용해 순정 용액을 희석하여 0.2 mg/mL Sulfo-SANPAH 작업 용액을 신선하게 준비합니다(표 1 참조).
   참고: 용액을 빛으로부터 보호하세요.
5. 젤을 덮을 만큼 충분한 Sulfo-SANPAH 작업 용액을 첨가합니다(예: 12웰 플레이트는 250 μL, 6웰 플레이트는 500 μL 등). 이 방법은 젤이 완전히 덮이도록 합니다.
6. 플레이트를 365 nm 파장 /120 mJ/^{cm 2} 자외선 빛 아래에 놓고 1시간 동안 조사합니다.
   참고: 이 단계는 설포-산파를 활성화하여 겔 표면의 관료기와 결합할 수 있게 합니다.

11. 가교 결합체 활성화 및 최종 세척

1. 조사 후에는 생물안전 캐비닛 내부의 우물에서 Sulfo-SANPAH 용액을 흡입합니다.
2. 충분한 멸균 PBS를 웰에 넣고, 젤 표면을 부드럽게 세척한 후 PBS를 흡입하세요.
3. 이 세척 과정을 한 번 더 반복하여 총 두 번, 각각 3분씩 세척하여 미응반응 설포-SANPAH를 완전히 제거합니다.

12. 쥐꼬리 1형 콜라겐 작업 용액 준비

1. 0.02M 아세트산 용액을 용매로 사용해 쥐 꼬리 타입 I 콜라겐 스톡 용액을 희석하세요.
2. 최종 작업 용액 농도를 60–100 μg/mL로 조절합니다. 예를 들어, 콜라겐 스톡 농도가 4 mg/mL라면, 15–25 μL 스톡을 0.02 M 아세트산 985–975 μL에 첨가하여 1 mL의 작동 용액을 얻습니다.

13. 콜라겐 코팅 및 배양

1. 활성화된 젤이 포함된 각 웰에 적절한 양의 콜라겐 작업 용액을 추가하세요: 6웰 플레이트는 2mL, 12웰 플레이트는 1mL입니다.
2. 배양판을 부드럽게 돌려 콜라겐 용액이 젤과 웰 바닥을 고르게 덮도록 하세요.
3. 플레이트를 덮고 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 배양하여 콜라겐이 Sulfo-SANPAH 가교작용을 통해 겔 표면에 고정되도록 하세요.

14. 2차 자외선 조사 및 고정

1. 다음 날, 플레이트를 제거하고 약 120 mJ/cm² 자외선에 1시간 동안 다시 조사합니다.

15. 결합되지 않은 콜라겐과 씨앗 세포를 제거합니다

1. 생물안전 캐비닛 내부에서 우물에서 쥐꼬리 1형 콜라겐 작업 용액을 조심스럽게 흡입하세요.
2. 우물에 멸균 PBS를 넣고, 젤 표면을 부드럽게 흔들어 세척한 후 PBS를 흡입하세요.
3. 한 번 더 세탁을 반복하면 총 두 번, 각각 3분씩 세척합니다.
4. 세척 후 젤 매트릭스가 준비됩니다. 준비된 줄기 라이디히 세포를 전체 SLC 배양 배양지(1단계에 상세 조성)에 재현탁합니다.
5. 세포 현탁액을 젤 표면에 직접 씨앗 뿌리세요. 권장 시딩 밀도는 2 ×^{10 4} 셀/^{cm 2} (예: 표준 6웰 플레이트의 경우 약 2 ×^{10 5} 셀)입니다.
6. 배양판을 37°C에서 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 배양하세요.
7. 최적의 세포 생존력과 스테로이도생 기능을 유지하려면 배양지를 48시간마다 교체하세요.

결과

이 프로토콜의 성공적인 실행은 1에서 100 kPa까지 강성이 정의된 폴리아크릴아마이드 하이드로겔을 얻으며, 이들은 배양판에 단단히 부착되어 강력한 SLC 부착 및 확산을 지원합니다. 그림 1 은 겔 캐스팅부터 세포 시딩까지 전체 워크플로우의 도식을 제공하여 사용자가 프로토콜의 주요 단계를 시각화할 수 있도록 합니다.

폴리아크릴아마이드 하이드로겔(목표 강성도: 1, 5, 15, 30, 50, 100 kPa)의 기계적 검증은 진동 리오메트리(평행판 형하학, 37 °C)를 사용하여 수행되었습니다. 측정된 영스 모듈리는 1.1 ± 0.2 kPa, 5.1 ± 0.6 kPa, 15.2 ± 2.1 kPa, 29 ± 3 kPa, 51.7 ± 3.7 kPa, 96 ± 6 kPa로, 설명된 공식들이 의도된 생리적·병리학적 강성 범위를 포함함을 확인시켜 주었습니다. 4°C에서 PBS에...

토론

세포외 기질의 기계적 특성은 줄기세포 행동 조절에 근본적인 역할을 하지만, 생식 세포에서 이러한 효과를 체계적으로 연구할 도구는 여전히 제한적입니다. 이전 연구들은 노화 중 병리학적 기질 경화가 Piezo1/ROS/Gli1 축을 통한 줄기 라이디히 세포(SLC)의 항상성을 방해하여 테스토스테론 감소를 초래한다는 것을 입증했습니다¹⁰. 이 발견을 바탕으로, 우리는 기판 강성이 SLC 기능을 직접 조절하는 방식을 연구할 표준화되고 재현 가능한 플랫폼을 제공하기 위해 폴리아크릴아마이드 하이드로겔 프로토콜을 개발했습니다. 생리적 강성도부터 병리적 강성 범위(1–100 kPa)에 걸친 하이드로겔을 제조할 수 있는 능력은 연구자들이 시험관 내에서 젊은 고환과 노령 고환의 기계적 미세환경을 재현할 수 있게 합니다.

폴리아크릴아마이드 하이드로겔의 취급은 간단합니다. 또한, 프로토콜은 UV 가...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세트산	시그마-올드리치	카테고리#A6283	쥐 꼬리 콜라겐용 희석제 (0.02 M)
아크리아아미드  그리고 nbsp; 그리고 nbsp;	상곤 바이오텍	Cat#A100341-0500	폴리아크릴아마이드 겔 제제용 단량체
과황산암모늄(APS)과 nbsp;	상곤 바이오텍	카테고리#A100486-0100	겔 중합의 개시 기관
B27 보충제	인비트로젠	캣#A1486701	항산화제와 호르몬이 강화된 보충제를 정의합니다; 신경 및 줄기세포 생존율 지원 (2% v/v)
기본 섬유아세포 성장인자(bFGF)	인비트로젠	캣#13256029	유사성 성장 인자; SLC 증식 및 줄기 촉진 (20 ng/mL)
비스-아크릴아마이드	상하이 위안예 바이오테크놀로지	Cat#S14002	폴리아크릴아마이드 겔용 가교제(Crosslinker)
닭 배아 추출물	미국 생물학	카테고리#C3999	성장 인자와 영양소의 풍부한 공급원; SLC 성장 및 생존 가능성 지원 (5% v/v)
쥐꼬리에서 추출한 콜라겐, I형	예센	Cat#40125ES50	설포-SANPAH 활성화 폴리아크릴아마이드 하이드로겔 표면을 코팅하여 SLC 접착과 배양을 촉진합니다.
콜라게나제 IV형	깁코	카탈로그 번호#17104-019	고환 조직 소화를 위해 DMEM/F12에 1 mg/mL 투여
CYP11A1 항체	제네텍스	고양이#GTX56293	서부 블롯팅을 위해
덱사메타손	시그마-올드리치	Cat#D1756	글루코코르티코이드 수용체 작용제; SLC 증식 및 줄기 유지 지원 (1 nM)
DMEM/F12 중간 크기	깁코	고양이#11320033	소화, 세척, SLC 배양을 위한 기저 배지
표피 성장인자(EGF)	페프로텍	Cat#AF-100-15	SLC 증식을 촉진하고 미분화 상태를 유지합니다(20 ng/mL)
태아 소 혈청 (FBS)	비스테크	Cat#SE100-011	콜라겐제 활동을 멈추기 위해 10% 용량으로 사용함
피지	해당 없음	https://imagej.net/Fiji	이미지 분석 소프트웨어
GADPH 항체	단백질 기술	카테고리#60004-1-Ig	서부 블롯팅을 위해
젤 소화 효소와 nbsp;	정확한 생명공학	캣#GXDLFA	고환 조직 소화 및 SLC 분리를 위한 효소 혼합물
HEPES	시티바	Cat#SH30237.01	pH 7.0&ndash를 유지하기 위한 버퍼; 7.4
HSD3&베타; 항체	산타크루즈	Cat#sc-515120	서부 블롯팅을 위해
유입 셀 분류기	BD	https://www.bdbiosciences.com/content/dam/bdb/marketing-documents/BD_Influx_tech_specs.pdf
인슐린-트랜스페린-셀레나이트 나트륨 (ITS)	시그마-올드리치	고양이#11074547001	세포 생존, 포도당 흡수, 항산화 방어 촉진(5 & mu; g/L)
녹아웃 혈청 대체 (KSR)	깁코	카탈로그 #10828-028	SLC 배양 배양지의 혈청 대체품
LIF(백혈병 억제 인자)	밀리포어	고양이#LIF1010	줄기세포 다능성과 자가 갱신을 유지하는 사이토카인 (1 ng/mL)
쥐 고환	이 종이	해당 없음	C57BL/6 마우스에서 분리
마우스 테스토스테론 ELISA 키트	파인 바이오텍	Cat#40203ES80	배양 상청액에서 테스토스테론 정량을 위해
마우스: C57BL/6	선전 탑바이오텍	해당 없음	고환 채취에 사용되는 마우스 계통
마우스: 고환줄기라이디히 세포(SLC)와 nbsp;	이 종이	해당 없음	쥐 고환에서 분리된 1차 세포
N2 보충제	인비트로젠	고양이#17502001	신경 및 줄기세포 배양을 지원하는 정의된 혈청 무첨가 보충제 (1% v/v)
비필수 아미노산	하이클론	Cat#SH30050.03	단백질 합성과 세포 대사를 위한 질소 공급원을 제공합니다 (1% v/v)
온코스타틴 M (OSM)	페프로텍	Cat#300-10T	SLC 분화 조절과 Leydig 세포 성숙에 관여하는 사이토카인 (20 ng/mL)
인산염 완충 식염수(PBS)	깁코	고양이#10010023	세척 및 부유 버퍼
혈소판 유래 성장인자(PDGF)	페프로텍	Cat#100-14B	세포 증식, 이동 및 생존 지원 (20 ng/mL)
프리즘 9.0	그래프패드	https://www.graphpad.com/	통계 분석 및 그래프 작성용 소프트웨어
StAR 항체	단백질 기술	캣#67130-1-Ig	서부 블롯팅을 위해
설포-산파와 nbsp;	맥클린	카탈로그#102568-43-4	겔 표면 활성화를 위한 이종기능성 가교체
TEMED	피진	고양이#PH0341	중합의 촉매
β-머캅토에탄올	인비트로젠	고양이#21985023	산화 스트레스를 줄이고 배양 내 세포 성장을 지원합니다(0.1 mM)