조직인자 양성 혈소판의 전혈류 세포계 정량: 다기관 협력 워크플로우

요약

여기서는 다센터 연구에서 조직 인자 양성 혈소판의 유동 세포 측정 정량을 위한 조화로운 워크플로우를 제시합니다. 프로토콜은 혈액 채취, 전혈 고정, 염색 및 기기 조화에 대한 표준화된 절차를 설명하여, 실험실 능력에 따라 국소 또는 중앙에서 분석을 수행할 수 있도록 합니다.

초록

조직 인자(TF)^pos-혈소판은 혈소판 집단의 일부를 나타냅니다. 최근에는 이 하위 집합이 관상동맥 질환 환자의 심혈관 사망률을 예측하는 것으로 밝혀져 혈전성 위험 층화에 유용한 바이오마커로 자리매김하고 있습니다. 유세포분석에 의한 TF^pos-혈소판의 정확한 정량화는 특히 기술적 변동이 측정에 영향을 줄 수 있는 다기관 연구에서 사전 분석 처리, 염색 절차, 기기 설정의 엄격한 표준화가 필요합니다. 이 프로토콜은 다양한 기술 인프라를 가진 실험실 간 재현성을 보장하기 위해 설계된 순환 TF^산소포 혈소판의 전혈 유량 세포검사 평가를 위한 조화로운 워크플로우를 설명합니다. 이 절차는 표준화된 혈액 수집과 전혈 고정을 포함하여 생체 내 혈소판 표현형을 보존합니다. 지역 실험실 역량에 따라 두 가지 다른 샘플 준비 방법이 제공됩니다: 유세포 측정 시설이 없는 센터에서는 고정 샘플을 코어 실험실로 보내 중앙 염색, 채취 및 분석하는 방법, 또는 유세포 측정 장비와 훈련된 인력을 갖춘 센터에서는 국소 염색 및 채취입니다. TF^포 혈소판 비율 평가는 항-TF 스타 플루어 488과 항-CD41 PerCP-Cy5.5 항체를 직접 표지하여 각각 표적 단백질과 혈소판 집단 마커를 식별함으로써 이루어집니다. 유세포계 조화는 동일한 세포계 모델에 대한 공유 획득 템플릿을 사용하거나, 서로 다른 플랫폼에 대해 비드 기반 정렬을 통해 달성됩니다. 워크플로우는 또한 표준화된 게이팅 접근법과 중앙집중식 데이터 분석을 통합하여 기관 간 TF^포스-혈소판 측정값을 신뢰성 있게 비교할 수 있도록 합니다. 대표적인 결과는 이 워크플로우가 검증된 다중기관 획득 환경에서 TF^포스 혈소판의 재현 가능한 정량화를 지원한다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 혈전성 위험 층화에서 TF^pos-혈소판 평가의 광범위한 적용을 촉진하고, 중개 및 임상 연구에서 혈소판 유동 세포검사의 표준화를 촉진할 수 있습니다.

서론

조직 인자(TF)는 혈액 응고의 주요 촉진자이자 트롬빈 생성의 핵심 결정 요인입니다. 내피하 세포와 백혈구에 의한 고전적 발현 외에도, TF는 순환하는 혈소판 1,2,3,4,5와도 관련이 있습니다. 혈전형성 과정에서 거핵세포는 TF를 혈소판⁶의 하위 집합으로 전달합니다. 생리학적 조건에서 순환 혈소판의 약 20–30%가 열린 관계 내에 TF를 저장하고 있으며, 이는 혈장 인자 VII⁷과 공간적으로 분리되어 있습니다. 이 구획화된 상태에서 TF는 순환하는 응고인자로부터 기능적으로 차단되어 비활성 상태를 유지합니다. 따라서 건강한 사람의 전혈을 플로우 사이토메트리로 분석했을 때 표면 TF를 감지하는 혈소판은 극히 일부에 불과하며, 이는 생리학적 항상성을 반영합니다 ^2,8. 혈소판 활성화와 혈전염증 불균형이 특징인 병리학적 상태는 이 균형을 깨뜨려 TF의 표면 노출을 증가시킬 수 있습니다. TF^양성(TF pos) 혈소판 비율이 9^{, 10, 11, 12, 13, 14, 15} 등 여러 혈전성 질환에서 증가한 결과가 보고되었습니다. 특히 관상동맥질환에서 TF^포 혈소판 수치가 4%를 초과하면 5년 추적 관찰 시 심혈관 사망률을 독립적으로 예측하여, TF^{포스 혈}소판 비율이 혈전위험의 임상적으로 관련 생체지표임을 확립했다¹⁶.

따라서 TF^포 혈소판의 정확하고 재현 가능한 정량화는 중개 연구 및 임상 연구 응용 모두에 필수적입니다. 이전에 발표된 TF^포스 혈소판 평가를 위한 혈소판 유량세포 검사 워크플로우는 단일^{센터 환경에서 이} 단백질 연구를 개선했으며, 선택된 사전 분석 또는 분석 단계 최적화에 대한 조언을 제공합니다. 그러나 이 접근법은 선적 절차, 표준화된 샘플 처리, 그리고 다양한 플로우 사이토미터 플랫폼 간 샘플 채취 조화의 필요성 등 다기관 연구의 추가적인 물류 및 분석 과제를 해결하기 위해 특별히 설계된 것은 아니었습니다. 또한 참여 센터의 다양한 인프라와 기술 전문성 수준도 고려해야 합니다.

이러한 맥락에서 본 프로토콜의 부가가치는 표준화된 혈액 채취와 전혈 고정, 유연한 샘플 처리 프로토콜, 크로스 플랫폼 채취 조화, 데이터 분석을 통한 직접 염색 및 중앙집중식 품질 관리를 결합한 상세한 워크플로우를 제공한다는 점에 있습니다.

따라서 본 연구의 목적은 유동세포분석을 이용한 전혈 TF^{포스 혈}소판 분석을 다기관에서 조화롭게 구현할 수 있는 운영 틀을 제공하는 것입니다. 이 통합 설계는 사전 분석, 분석 및 기기 간 변동성을 줄여 다중심 환경에서 TF^pos-혈소판의 일관된 평가를 위한 조건을 마련합니다.

프로토콜

모든 헌혈자는 기관 윤리 위원회(No.70/24, CE 18.06.24)에서 승인한 서면 동의서를 제공했습니다.

TF^포 혈소판의 전혈 유량 세포검사를 위한 다기관 워크플로우는 그림 1에 요약되어 있습니다. 아래에 설명된 프로토콜은 사용자가 다섯 가지 주요 단계를 거치도록 안내합니다.

그림 1: TF^포스 혈소판 분석을 위한 다센터 워크플로우. 전혈 유동 세포분석을 통한 순환 TF^포-혈소판 다센터 평가를 위한 분석 파이프라인의 개략적 표현. 피험자 등록 및 혈액 채취 후, 각 임상 병동에서 이용 가능한 기술 자원에 따라 샘플이 고정되고 처리됩니다. 유세포분석 시설이 없는 센터는 고정 샘플을 코어 실험실로 보내 염색, 채취 및 분석을 수행합니다. 플로우 사이토미터를 갖춘 센터는 표준화된 채집 템플릿을 사용하여 현장에서 염색 및 채취를 수행할 수 있습니다. 기기 조화는 공유 템플릿(동일 기기 모델), 코어 연구소에서 생성된 템플릿(정렬을 위한 다른 모델 제공), 또는 직접 템플릿 조화가 불가능할 경우 형광 구슬을 이용한 교정을 통해 이루어집니다. 데이터 분석은 표준화된 게이팅 워크플로우를 통해 중앙에서 수행됩니다. 이 다이어그램은 ChatGPT(OpenAI)를 사용해 작성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

1. 혈액 채취

참고: TF^{포스 혈}소판 평가는 최대 50 μL 전혈을 요구합니다.

1. 19게이지 버터플라이 바늘을 사용해 주정맥 전부에서 말초 정맥 혈액을 채취하세요. 정맥 천자 시에만 지혈대를 적용하고, 바늘 삽입 직후 즉시 해제하여 체외 혈소판 활성화를 최소화하세요.
2. 첫 번째 EDTA 튜브를 버리세요. 그 후 0.129M 시트레이트 나트륨 진공 추출기에 혈액을 채취하여 제조사 기준에 맞게 튜브를 채워 혈액과 항응고제 비율을 유지합니다.
3. 혈액과 항응고제를 충분히 섞기 위해 부드럽게 5번 뒤집어 주세요.
4. 관을 실온에서 똑바로 세워 두고, 교반, 냉장 보관, 공압 운반을 피하세요.
5. 샘플은 채취 후 3시간 이내에 처리하세요.

2. 샘플 준비

참고: 모든 항체는 코어 연구소에서 구매해야 하며, 모두 동일한 배치에서 나와야 합니다. 진행 중인 연구 중 배치 변경이 필요할 경우, 새로운 시약 배치는 동일한 분석 조건에서 병렬 시험을 통해 사용 중인 배치와 직접 연결되어야 하며, 유사한 성능이 확인될 때만 채택되어야 합니다. 일반적으로 사용되는 시약(예: PBS(인산염 완충 식염수)과 PFA(파라포름알데히드)는 각 참여 센터에서 구매할 수 있습니다; 하지만 제품 코드는 핵심 실험실에서 사용하는 것과 일치해야 하며, 연구 전반에 걸쳐 배치 일관성을 유지해야 합니다.

1. 샘플을 고쳐.
   참고: 혈액 처리를 시작하기 전에 실온에서 PBS로 4% PFA를 희석하여 1% PFA를 준비하세요.
   주의: PFA는 독성이 있으므로 적절한 개인 보호 장비(실험실 가운, 장갑, 안경 보호구)를 착용한 채 화학 후드 안에서 다루어야 합니다. 흡입과 피부 또는 눈과의 접촉을 피하세요. 폐기물 처리: 모든 PFA 함유 용액, 고정 샘플, 오염된 소비재를 기관 및 지역 규정에 따라 적절히 라벨링된 밀폐 유해 폐기물 용기에 수집하세요.
   1. 진공기를 부드럽게 5번 뒤집어 혈액과 항응고제를 섞으세요.
   2. 50 μL 혈액을 1% PFA 950 μL 함유 2 mL 튜브에 옮깁니다.
   3. 샘플을 부드럽게 섞어 실온에서 1시간 30분간 배양합니다.
   4. PBS 500 μL 추가.
   5. 1500 x g 원심분리기를 5분간 실온에서 가열합니다.
   6. 상정액을 제거하고 펠릿을 1mL의 PBS에 재현탁합니다.
      참고: 기술 체크포인트: 원심분리 후에는 상청액을 제거하기 전에 펠릿이 보이는지 확인하세요. 펠릿을 흔들지 않고 조심스럽게 상정액을 제거하세요. 재현탁 후에는 시료가 균질하고 눈에 띄는 덩어리나 응집체가 없는지 확인하세요.
   7. 고정 시료를 고정 후 24시간 이내에 2-8 °C로 유지되는 온도 제어 포장에 담겨 코어 연구소로 운송합니다. 얼지 마세요. 문서 수집 시간, 고정 시간, 배송 시간.
2. 유세포검사 분석을 위한 샘플 라벨링.
   참고: 항-TF 스타 플루어 488(클론 HTF1; 항-CD142)은 조직 인자에 작용하며, 항-CD41 PerCP-Cy5.5는 혈소판 인테그린 알파IIb를 인식합니다. 염색 절차를 시작하기 전에, 17000 x g 원심분리기 항체를 +4 °C에서 5분간 사용해 응집체를 제거^한다. 희석한 항-TF 스타 플루오 488 항체(1:100)와 PBS를 투여했습니다. Anti-CD41 PerCP-Cy5.5는 중간 희석이 필요 없으며 제조사가 권장하는 양으로 사용해야 합니다.
   1. 2mL 폴리프로필렌 튜브 4개를 준비하세요.
   2. 각 튜브에 80 μL의 고정 샘플을 분사합니다.
   3. 각 튜브에 표 1 (1일차)에 표시된 적절한 양의 PBS 및 항TF Star Fluor 488 항체를 추가합니다.
   4. 샘플을 부드럽게 섞으세요.
   5. O/N은 어두운 곳에서 4°C에서 부양하세요.
   6. 다음 날(2일차)에는 표 1에 표시된 대로 3번과 4번 튜브에 항CD41 PerCP-Cy5.5를 추가합니다.
   7. 샘플을 부드럽게 섞으세요.
   8. 어두운 곳에서 실온에서 15분간 부화하세요.
   9. 각 튜브마다 300 μL PBS를 희석하세요.
   10. 염색된 샘플은 유세포 검사 획득 전까지 어두운 곳에 보관합니다.
       참고: 샘플은 최대^3일간 4°C에서 보관할 수 있습니다. 더 긴 저장은 점진적인 신호 감쇠를 초래하므로 피해야 합니다.

		1일차		2일차
아니.	튜브 ID	1배 PBS (μL)	안티-TF 스타 플루어 488 (μL)	안티-CD41 PerCP-Cy5.5 (μL)
1	얼룩 없는	20	0	0
2	TF	12.5	7.5	0
3	CD41	15	0	5
4	TF/CD41	7.5	7.5	5

표 1: TF^{포스 혈}소판 평가를 위한 염색 프로토콜.

3. 유세포계 획득의 표준화

1. 획득 템플릿 설정 (코어 연구소 제공).
   1. 플로우 사이토미터 A 템플릿 설정.
      1. 소프트웨어 A v2.6을 열어보세요.
      2. 세포 집단을 시각화하기 위해 로그 축척으로 FSC-A/SSC-A 점 플롯 [모든 사건]을 생성하세요(그림 2A).
      3. [모든 사건]에 해당하는 CD41 도트 플롯을 로그 스케일로 작성하여 [혈소판] 게이트 내 혈소판을 식별합니다(그림 2B).
      4. PerCP-Cy5.5-A/Star Fluor 488-A 의사 색상 플롯 [모든 이벤트]를 작성하여 스필러브/보상을 확인한다(그림 2C).
      5. [혈소판] 게이트에서 FSC-A/FSC-H 점플롯을 만들고 싱글렛([Singlelet]; 그림 2D).
      6. CD41 PerCP-Cy5.5-A/TF 별 플루어 488-A 점표를 [싱글렛] 게이트에 생성하여 TF^포 혈소판을 식별합니다(그림 2E).
      7. SSC-H에서 임계값을 1000으로 설정하세요.
      8. 유량을 "느리게" 설정하세요.
      9. 긍정적 사건과 음적 사건 간의 최적의 구별을 위해 B525 게인을 315로 설정하세요; 필요한 경우 사용하는 기기에 따라 조정하세요.
      10. B690 게인은 일일 QC에 맞춰 설정하세요. 획득은 CD41^포스-혈소판 집단이 음성 배경에서 완전히 해소되어 채취 시 템플릿에 설정된 사전 정의된 기준 게이트 내에 머무를 때만 허용됩니다.
      11. "실험 내보내기 템플릿"을 사용해 템플릿을 내보내세요.
      12. 다운로드: 유동세포계 A에서 TF^포스 혈소판 분석을 위한 획득 템플릿은 보조 파일 1 과 보조 그림 1로 다운로드할 수 있습니다.
          참고: 이 다중 매개변수 분석에 필수는 아니지만 스필러/보상을 확인하는 플롯(그림 2C)이 포함되어 있습니다. 그럼에도 불구하고 이 프로토콜에서 제안된 것과는 다른 형광색소 조합을 사용할 것인지에 대해서는 고려해야 합니다.
   2. 유세포계 B 템플릿을 만드세요.
      1. 3.1.1에 설명된 전체 획득 설정을 포함하는 프로토콜 파일을 생성하세요.
      2. 소프트웨어 B v1.6의 "Export Protocol" 기능을 사용하여 템플릿을 내보내고, 프로토콜 파일을 생성합니다.
      3. 수신 기기에서 소프트웨어 내의 "Import Protocol" 기능을 사용하여 프로토콜 파일을 가져오세요.
   3. 플로우 사이토미터 C 템플릿 생성.
      1. 3.1.1에 설명된 전체 획득 설정을 포함하는 작업 공간을 생성하세요. 그리고 수출할 수 있습니다.
      2. 수신 기기에서는 C v3.1 소프트웨어의 "복사" 기능을 사용해 작업 공간을 가져오세요.
2. 보정 비드를 이용한 유세포계의 조화.
   참고: 6피크 레인보우 보정 비즈를 사용하세요.
   1. 목표 가치 정의.
      참고: B525 형광 채널의 첫 번째 피크의 중앙 형광 강도(MdFi)를 정의할 때 다음 공식을 사용하세요:
      MdFI_CU =
      여기서 CU는 임상 단위 기기, RI는 참조 기기입니다.
   2. 샘플 준비.
      1. 구슬 병을 보텍스.
      2. 샘플 튜브에 구슬 5방울을 넣으세요.
      3. PBS 1mL를 추가하세요.
      4. 5-10초 동안 소용돌이.
   3. 구슬 획득.
      1. 로그 스케일로 FSC-A/SSC-A 점 플롯을 생성하여 [모든 사건]을 표시하고, [Beads]라는 영역을 정의합니다(그림 3A).
      2. [비즈] 게이트에서 FSC-A/FSC-H 점 플롯을 만들고 싱글렛 [싱글렛]을 식별할 영역을 정의합니다(그림 3B).
      3. Star Fluor 488 형광 채널(B525)의 히스토그램 플롯을 작성합니다.
      4. 히스토그램에 [싱글렛] 만 표시하세요.
      5. 첫 번째 피크( 그림 3C의 영역 B) 전체 너비에 게이트를 그립니다.
      6. 통계 리본에서 X 중간값(X-Med) 값을 표시합니다.
      7. 기존의 보상은 모두 제거하세요.
      8. 유량을 "느리게" 설정하세요.
      9. "실행" 모드에서 획득을 시작하세요.
      10. "획득 설정"에서 B525 전압/이득을 조정하여 목표 값에 따라 계산된 X-Med 목표에 도달하게 합니다.
      11. [싱글렛] 게이트에 10,000개의 이벤트 데이터를 기록하는 것은 그 수용 기준에 도달한 후에야 합니다. 목표 범위에 도달하기 전까지는 연구 샘플을 채취하지 마십시오.

보조 파일 1: 플로우 사이토미터 A의 TF^포스 혈소판 분석 획득 템플릿을 다운로드 가능합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

보조 그림 1: 플로우 사이토미터 A에서 TF^pos-혈소판 분석을 위한 획득 템플릿 스크린샷. (A) FSC-A 대 SSC-A 점플롯은 전체 사건 분포를 시각적으로 나타냅니다. (B) 혈소판은 CD41 대 SSC-A 플롯에서 확인되어 [혈소판]으로 게이팅됩니다. (C) 잠재적 파급 효과를 평가하기 위해 PerCP-Cy5.5와 Star Fluor 488의 플롯을 포함합니다. (D) 이중항체는 FSC-A 대 FSC-H 플롯을 사용하여 [혈소판] 게이트 내에서 제외되며, 이는 [싱글렛] 집단을 정의합니다. (E) TF^{pos -} 혈소판은 PerCP-Cy5.5와 Star Fluor 488 형광을 기반으로 [싱글렛] 게이트 내에서 확인됩니다. (F-H) 템플릿에 구현된 샘플 유량(느림), 1차 임계값(SSC), 검출기 이득(B525 및 B690) 등 획득 설정이 표시되어 있습니다. 획득 설정과 워크플로우에 대한 자세한 내용은 3.1절에 제공되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: TF^부혈소판 식별을 위한 획득 템플릿 및 게이팅 전략. (A) FSC-A/SSC-A 점플롯(로그 스케일)으로 모든 감지된 사건을 보여줍니다. (B) 혈소판 집단을 식별하기 위해 사용한 CD41-A/SSC-A 점플롯. (C) PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 의사 색상 플롯은 스펙트럼 스필오버 및 보상 요구사항을 평가하는 데 사용됩니다. (D) [혈소판] 게이트의 FSC-A/FSC-H 플롯을 사용하여 이중항을 배제하고 단골을 정의합니다. (E) TF^포스 혈소판을 식별하는 데 사용되는 [싱글렛]의 PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 점 플롯. 괄호 안에 표시되는 통계 필드는 샘플 채취 시 템플릿을 적용할 때 자동으로 샘플별 값으로 채워집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 비드 기반 기기 교정 절차. (A) 비드 사건을 식별하는 데 사용되는 FSC-A/SSC-A 플롯. (B) 집합체를 배제하고 싱글렛을 정의하는 데 사용되는 비드 이벤트 내 FSC-A/FSC-H 플롯. (C) 스타 플루어 488의 히스토그램, 중앙값 형광 강도 결정을 위해 첫 번째 비드 피크에 게이팅이 적용된 비드 피크를 표시함. 시각화된 통계는 대표성으로 간주되어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

4. TF^소판 분석을 위한 유세포 샘플 채취

1. FCM 템플릿을 사용해 구매하세요.
   1. 소프트웨어 A 내의 "템플릿 가져오기" 기능을 사용하여 획득 템플릿을 가져오세요.
   2. 2단계에서 준비한 샘플을 확보하세요.
   3. 데이터 기록 전에 혈소판 게이트와 싱글렛 게이트가 기준 플롯 기하학과 일치하는지 확인하세요. 필요하면 게이트를 조정하세요.
   4. 5–10초 정도 안정적인 흐름이 유지된 후 기록을 시작하세요. [싱글렛] 게이트  내에서 20,000개의 이벤트 데이터 파일을 기록하세요( 그림 2D 참조). 보상받지 못한 .fcs 파일을 저장하여 코어 연구소로 전달하세요.
2. FCM 템플릿 없이 인수하는 경우.
   1. 3.1절에 보고된 획득 워크시트를 재구성하며, 다섯 개의 그래프와 게이트 계층 구조: TF/CD41 사분면> 혈소판 > 싱글렛 > 모든 사건을 포함합니다.
   2. SSC-H에서 임계값을 1000으로 설정하세요.
   3. 유량을 "느리게" 설정하세요.
   4. 3.2.3에서 정의된 대로 B525 전압/이득을 설정하세요.
   5. 2단계에서 준비한 샘플을 확보하세요. 5–10초 안정된 흐름 후에 기록을 시작하세요; [싱글릿] 게이트 내에서 20,000개의 이벤트를 획득하세요. 보상받지 못한 .fcs 파일을 저장하고 코어 연구소로 전달하세요.
      참고: 일일 QC 기기가 통과된 경우에만 획득이 허용됩니다. 20,000 CD41^poss 혈소판 목표에 도달하지 못하면 최소 10,000 CD41^소판 사건을 획득해야 합니다.

5. 데이터 분석

참고: 아래에 설명된 분석 워크플로우는 중앙 집중식 데이터 처리 및 품질 관리를 담당하는 핵심 연구소의 활동을 지원하기 위해 설계되었습니다.

1. 새 분석 워크시트를 열고 .fcs 파일을 불러오세요.
2. 각 샘플에 대해 그림 2에 나타난 분석 템플릿을 만듭니다. 동일하지 않은 플랫폼의 경우, 동일한 게이트 구조와 통계적 출력을 가진 동등한 플랫폼별 템플릿을 사용하세요.
3. 게이팅이 미리 정의된 산란 특성과 단일 유산 구별 전략에 따라 혈소판 집단을 올바르게 식별하는지 검증합니다(그림 4A, B, D).
4. 의사 컬러 플롯 [모든 사건](그림 4C)을 통해 스필러/보상을 점검합니다.
   참고: 플루오로크롬 스타 플루어 488은 520 nm 스펙트럼 방출을 가지는 반면, PerCP-Cy5.5는 676 nm 스펙트럼 방출을 가지고 있어 중복이 없고 보상이 필요 없는 이유를 설명합니다.
5. Star Fluor 488 점도 도면(그림 5)에 다음과 같은 게이팅 시퀀스를 적용하세요:
   1. 염색되지 않은 경우: 염색되지 않은 대조군을 사용하여 배경 TF^pos-이벤트가 혈소판 이벤트의 0.01% 이하로 유지되도록 사분면을 정의하며, 혈소판 자가형광은 제외합니다(그림 5A).
   2. TF: 염색되지 않은 샘플에서 정의된 사분면 좌표를 적용하여 단일 염색 샘플에서 TF^pos-신호를 식별합니다(그림 5B).
   3. CD41: 단일 염색된 CD41 샘플을 사용하여 혈소판의 배경 형광을 배제하는 사분면을 정의합니다(그림 5C).
   4. TF/CD41: 동일한 사분면 좌표를 적용하여 TF/CD41 염색 샘플에서 TF^위치 신호를 식별합니다(그림 5D).
      참고: 최종 TF^포스 혈소판 비율은 분석 소프트웨어에서 생성된 통계에서 얻어지며, 게이트 혈소판 집단의 TF^포스 사분면 내에 속하는 CD41^포스 이벤트 비율로 보고됩니다.
6. 파일 이름 식별, 시약 배치, 고정 시점부터 획득 간격, 운송 온도, 이벤트 수, 이상치 형광 분포에 대한 중앙집중식 품질 관리를 수행합니다. 국부 처리, 운송, 고정 타이밍 또는 획득 설정에서 문서화된 편차를 보여주는 파일은 플래그로 표시되어 중앙에서 검토되며, 연구별 편차 관리 계획에 따라 제외하거나 반복해야 합니다.

그림 4: TF^{포스 혈}소판 분석을 위한 순차적 게이팅 전략. 대표적 분석 워크플로우는 .fcs 파일을 로드한 후 혈소판 집단을 식별하는 과정을 보여줍니다. (A-B) 혈소판 개체군의 올바른 게이팅을 확인하는 점플롯. (C) PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 의사 색상 플롯을 사용하여 스펙트럼 스플러버를 평가합니다. (D) 이중항을 배제하고 싱글렛을 정의하는 데 사용되는 혈소판 게이트 내 FSC-A/FSC-H 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 데이터 분석을 위한 템플릿. (A) 염색되지 않은 대조군의 대표적인 점플롯을 사용하여 기준선 자가형광과 사분면 위치 정의를 사용했습니다. (B) TF 단일 염색 샘플; (C) 사분면 위치를 정의하는 데 사용되는 단일 염색 샘플 CD41. (D) TF/CD41 이중 염색 샘플, TF^포스 혈소판 분석에 사용됨. 숫자는 대표 샘플 내 TF^포 혈소판 비율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

결과

이 워크플로우는 이질적인 기술 인프라를 가진 센터들이 TF^포-혈소판의 정량화가 필요한 다기관 연구에 참여할 수 있도록 특별히 설계되었습니다. 그림 1 은 전혈 유동 세포분석을 통해 순환 TF^포 혈소판을 측정하는 다기관 연구를 지원하기 위해 설계된 조직 워크플로우 다면을 보여줍니다. 참여 센터의 기술 자원에 따라 다양한 샘플 준비 절차가 시행됩니다. 구체적으로, (i) 임상 유동에 유세포검사 시설이나 훈련된 인력이 부족한 경우, 전혈 샘플은 채취 직후 즉시 고정 검사를 거쳐 중앙집중식 염색, 채취 및 분석을 위해 코어 실험실로 운송됩니다. (ii) 또는 유세포검사 시설을 갖춘 센터가 국소에서 염색 및 채취를 수행할 수도 있습니다. 이러한 경우, 데이터 수집은 코어 연구소가 정의한 조화로운 워크플로우를 따릅니다. 기기 모델이 코어 연구소에서 사용하는 것과 일치하면, 수집은 코어 연구소에서 제공하는 표준화된 템플릿을 사용하여 수행됩니다. 서로 다른 기기 모델이 사용될 때, 조화는 템플릿 전송(코어 실험실에서 정렬 가능한 기기)이나 샘플 채취 전 비드 기반 교정 절차를 통해 이루어질 수 있습니다. 샘플은 표준화된 워크플로우에 따라 채취 및 분석될 수 있습니다.

다음 대표 결과들은 공식적인 다센터 분석법 검증을 제공하기보다는 워크플로우 타당성과 키 조화 단계를 보여주기 위한 것입니다. 신뢰할 수 있는 TF 검출을 위해 염색 전략은 먼저 스펙트럼 적합성과 신호 안정성을 평가했습니다. 혈소판은 항-CD41 PerCP-Cy5.5를 사용하여 확인되었으며, TF 검출은 Star Fluor 488에 결합된 항-TF 단클론 항체에 의존했습니다. 단일 염색 대조군을 사용하여 검출 채널 간 형광 스필오버가 없음을 검증하였습니다. 그림 6A에 나타난 바와 같이, CD41 PerCP-Cy5.5 단일 염색 샘플은 Star Fluor 488 채널에서 검출 신호를 내지 못했습니다. 일관되게, 이중 염색 샘플에서 측정된 TF^포스 혈소판 비율은 TF 단일 염색 샘플과 유사했습니다(그림 6B).

그림 6: 염색 특이성 검증. (A) 신호 특이성을 검증하기 위해 PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 점플롯에서 분석한 단일 염색 항CD41 PerCP-Cy5.5 샘플. (B) TF 단일 염색 샘플과 TF/CD41 이중 염색 샘플에서 측정된 TF^포스 혈소판의 백분율은 개별 쌍 측정(점)과 평균 ± SD(n = 18명의 독립 피험자)로 표시됩니다. 데이터는 Wilcoxon 매칭 쌍 부호 순위 검정으로 분석되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.제안된 분석의 분석 민감도는 n=200명의 건강한 피험자 샘플에서 평가되었습니다. 생물학적으로 빈 샘플을 사용했을 때, 계산된 빈 샘플 한계(LoB)는 0.39%, 검출 한계(LoD)는 0.77%, 정량 한계(LoQ)는 1.12%로, CV와 관련된 최저 수준≤ 20%로 정의되었습니다. 게이팅 전략의 운영자 간 재현성을 6명의 운영자가 사전 정의 분석 템플릿을 사용해 분석한 40개의 독립 샘플에서 평가되었으며, ICC는 0.985(95% 신뢰구간: 0.978-0.990)를 얻었습니다.

전혈 고정 후 TF 검출의 안정성은 고정 샘플을 종방향으로 염색하여 평가하였다. 고정일에 염색한 기준 샘플(D0)과 비교하면, TF^{포 혈}소판 수치는 고정 후 최대 4일간 안정적으로 유지되었으며(D3-D4), D3-D4 구간에서는 약 22%의 비유의한 감소(TF^포스 혈소판 내 상대 백분율 77.8% ± 7.2%)만 나타났습니다. D5-D6 염색 시 TF^{소판 검}출률은 53.8%± 20.7%로 유의하게 감소했습니다(TF^{소판 상대} 비율; p< 0.0001; 그림 7). 이 결과는 고정 샘플을 고정 후 4일 이내에 신호 손실 없이 신뢰성 있게 분석할 수 있음을 보여줍니다.

그림 7: 표본 고정 후 시간 경로 분석. 고정 후 서로 다른 시점에서 측정된 TF^포스 혈소판의 정량은 x축에 다음과 같이 표시되어 있습니다: D0 = 혈액 채취일; D1 = 1일차; D2 = 2일차; D3-4 = 3일 또는 4일차; D5-6 = 5일차 또는 6일차. 데이터는 D0와 비교한 SD 상대 비율의 평균 ± 표현됩니다(n = 7-10명의 건강한 피험자, 지정된 고정 후 시점 동안 평가). 데이터는 Anova 분석과 Dunnett의 다중 비교 검정을 사용했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

조화화된 획득 워크플로우의 성능은 이후 다양한 유동 세포 분석 플랫폼에서 평가되었습니다. 템플릿 기반 조화는 처음에 FACSLyric과 MACSQuant 기기를 기준 세포계로 평가하였습니다. 외부 시설에 위치한 동일한 모델의 추가 기기들이 시험 플랫폼으로 사용되었습니다. 안정 혈소판이 포함된 전혈 샘플은 표준화된 채집 템플릿을 사용하여 기준 및 검사 기기 모두에서 채취하였습니다. 그림 8A, B에 나타난 것처럼, 참조 세포계와 시험 세포계에서 유사한 TF^{포스 혈}소판 비율이 얻어져 공유 템플릿 접근법의 재현성을 확인하였습니다.

그림 8: 공유 획득 템플릿을 사용한 기기 간 재현성. 참조 및 FACSLyric (A) 또는 MACSQuant (B) 기기를 통해 검사 획득한 n=6명의 건강한 대상자에서 전혈 중 TF^{포 소}판 비율을 측정한 것. 데이터는 개별 결정(점)과 평균 ± SD로 표현되었으며, 데이터는 쌍 t-검정으로 분석되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

마지막으로, 서로 다른 구성의 악기들을 정렬하기 위해 비드 기반 조화가 평가되었습니다. 기준 기기는 세포계 A를, 시험 기기는 FACSymphony가 사용되었습니다. 정렬은 FACSymphony 488nm 검출기 전압을 조절하여 비드의 형광 세기가 미리 정해진 표적 범위 내에 들어갈 때까지 조정하여 6피크 레인보우 보정 비즈를 사용했습니다. 정렬 전후의 비드 피크 분포를 보여주는 히스토그램 프로파일은 그림 9A에 나와 있습니다. 그 후 교정 전후에 검사 기기로 전혈 샘플을 채취했습니다. 조화 이전에는 두 플랫폼 간에 TF^{포스 혈}소판 비율이 달랐습니다. 비드 기반 정렬 후 값은 참조 세포계(그림 9B)에서 얻은 값과 매우 일치하여 성공적인 크로스 플랫폼 조화와 재현 가능한 TF 정량화를 입증했습니다.

그림 9: 비드 기반 악기 조화. (A) 기기 정렬 전후(빨간 피크)와 후(녹색 피크) 획득한 6-피크 레인보우 보정 비즈의 대표적인 형광 히스토그램. (B) 조화 전후(Pre)와 후(Post) 조화 기기에서 n=6명의 건강한 대상자로부터 준비된 휴식 샘플에서 측정된 TF^포 혈소판 비율. 비교를 위해 기준 기기에서 얻은 측정값을 보여줍니다. 데이터는 쌍 t-검정으로 분석되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

이 프로토콜은 다센터 적용을 위해 설계된 전혈 유동 세포 정량을 위한 단계별 워크플로우를 제공합니다. 기존 혈소판 유동 세포분석 기반 워크플로우에 비해 가장 큰 방법론적 장점은 혈액 채취와 전혈 고정, 표지, 샘플 채취 전 기기 조화, 중앙집중식 분석 및 데이터 품질 관리에 이르기까지 전체 분석 과정을 표준화한다는 점입니다. 이로 인해 샘플 처리 능력이 없는 센터도 혈액 샘플을 제공할 수 있다면 다기관 연구에 참여할 수 있습니다. 본 작업 흐름은 생리^{학적 조건 7,8}에서 검출 가능한 표면 관련 TF를 보이는 소수의 혈소판만을 고려할 때, 가장 관련성 있는 중심 간 변이의 실질적 원인을 다룹니다. 이 출처에는 지역 샘플 취급의 차이, 유세포 측정 시설 접근, 기기 구성, 운영자별 데이터 분석 등이 포함됩니다.

이러한 문제를 극복하기 위해 채취 직후 전혈을 고정하여 생체 내 혈소판 표현형을 안정화하고 즉각적인 표지나 샘플 채취를 피합니다. 대표적인 결과는 고정 표본 접근법이 검증된 고정 후 구간 내에서 중앙집중식 처리를 지연시킬 수 있음을 보여줍니다. 이로 인해 현장 유세포검사 시설이 없는 센터에서도 연구 참여 가능성이 확대되면서도 일관된 사전 분석 워크플로우를 유지할 수 있습니다. 두 번째 장점은 간단한 2색 패널을 이용한 단순화된 직접 염색 전략을 사용하여 절차의 복잡성을 줄여준다는 점입니다.

패널에서는 잘 특성화된 항-TF 단클론 항체 클론 HTF1을 사용했는데, HTF1은 TF의 촉매 부위를 인식하고 인자 VII 결합과 경쟁하여 TF 검출에 가장 신뢰할 수 있는 시약 중 하나이며, 혈소판^{14, 16, 17}에서도 함께 사용되었습니다. 항체는 FITC와 스펙트럼이 유사하지만 신호 안정성이 향상된 밝고 광안정성 있는 플루오로크롬인 스타 플루어 488과 결합되었습니다. 중요한 점은, 488nm에서의 여기 덕분에 입문용 기기를 포함한 거의 모든 기존 유세포계에 적용된 청색 레이저 구성으로 샘플 검출이 가능하다는 것입니다. 이러한 에피토프 특이성과 단순한 플루오로크롬 검출의 조합은 여러 부위에 걸쳐 분석 감도와 확장성을 향상시킵니다. 이 검사에서는 저주파 집단에서 임계값 배치에 대해 등형 대조군보다 아이소타입 대조군보다 더 나은 선택으로 양성 임계치를 정의하였다¹⁸.

다양한 유세포계의 사용은 다기관 유세포검사 연구에서 변동성의 원인일 수 있습니다 19,20,21. 우리는 이전에 사전 분석 취급, 염색 설정 및 국소 기기 최적화에 관한 조언을 제공한 바^{있습니다.} 하지만 이러한 조치들은 서로 다른 플랫폼에서 일관된 형광 신호를 보장하지는 않습니다. 현재 워크플로우는 중앙집중식 분석과 향후 획득 조화를 결합하여 이 문제를 해결합니다. 동일한 세포계가 있을 때는 공유 획득 템플릿을 사용할 수 있으며, 서로 다른 플랫폼을 포함해야 할 때는 비드 기반 정렬을 적용할 수 있습니다. 이 이중 전략은 이질적인 국소 수집 후 중앙집중식 분석에만 의존하는 다센터 분석 모델에 비해 데이터 분석의 변동성을 처음부터 줄이고 사이트 간 게이트 적용을 더 재현 가능하게 지원함으로써 실질적인 이점을 제공합니다.

워크플로우의 일반화 가능성은 과장해서는 안 됩니다. 프로토콜은 지정된 전혈 고정 조건, anti-TF-Star Fluor 488 및 anti-CD41 PerCP-Cy5.5 시약 조합, 조화 절차, 제한된 유세포계 구성을 사용하여 검증되었습니다. 다른 항-TF 클론, 형광색소 조합, 고정 타이밍, 고정 농도, 또는 광학이 크게 다른 유동세포계를 사용하는 경우, 워크플로우의 분석 성능을 확인해야 합니다. 전반적으로 프로토콜 실패는 권장되는 사전 정의된 편차 규칙을 통해 관리되어야 합니다. 편차의 심각도에 따라 데이터는 연구별 편차 계획에 따라 플래그, 반복 또는 제외될 수 있습니다. 이러한 범위 내에서 본 프로토콜은 TF^포스-혈소판 분석의 다기관 구현을 위한 운영 프레임워크로 간주되어야 합니다. 국제 혈전증 및 지혈학회(International Society of Thrombosis and Hemostasis)의 전용 국제 표준화 연구에서 진행 중인 광범위한 실험실 간 성능 평가, 출하 검증, 분석 반복성 등 공식적인 분석 검증이 진행 중입니다. 정확한 TF^포 혈소판 정량화의 임상적 관련성은 관상동맥 질환에서 TF^포 혈소판 수치가 4%를 초과하면 5년^{추적 관찰 시} 장기 심혈관 사망을 독립적으로 예측하는 증거로 뒷받침됩니다. 따라서 신뢰할 수 있는 다기관 측정은 TF^포스 혈소판을 바이오마커로 검증하고 이를 임상 시험 및 실제 등록부에 적용하는 데 필수적입니다. 향후 자동화 정규화 알고리즘과 자동게이팅 전략의 구현은 운영자 편향을 더욱 줄이고 분산 분석을 지원하면서 사이트 간 비교 가능성을 유지할 수 있습니다 ^22,23.

결론적으로, 이 조화로운 워크플로우는 다센터 환경에서 전혈 유동 세포분석을 통해 TF^포 혈소판을 정량화하는 실용적이고 재현 가능한 접근법을 제공합니다. 표준화된 사전 분석 절차, 간소화된 샘플 처리, 기기 조화 전략을 결합함으로써, 이 프로토콜은 TF^pos-혈소판 측정값의 신뢰할 수 있는 교차 부위 비교를 가능하게 합니다. 여기서 설명한 원칙들은 혈소판 위험의 생체지표로서 TF^포 소판 평가를 지원하는 것 외에도, 번역 및 임상 연구 응용을 위한 혈소판 유동 세포검사법의 표준화 노력에 기여할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1X PBS w/o Calcium and Magnesium	Gibco	10010-015	항체 및 샘플 희석용
Anti-CD41 PerCP-Cy5.5  (clone HIP8)	BD	333148	혈소판 집단 마커로 사용되는 항 인간 CD41a 모노클로날 항체; 코어 실험실에서 제공해야 함
Anti-TF Star Fluor 488  (clone HTF1)	Cyanagen	CR304	항 인간 조직 인자(CD142) 모노클로날 항체; 코어 실험실에서 제공해야 함
BD FACSLyric Flow Cytometer	BD	non catalog item	본문에서, 흐름 세포계수기 B
BD FACSuite software v1.6	BD	non catalog item	본문에서, 소프트웨어 B
Butterfly Needle G19	PIKDARE	02044019030010	혈액 채취용
CytExpert Software	Beckman Coulter	non catalog item	본문에서, 소프트웨어 A
CytoFLEX S flow cytometer	Beckman Coulter	non catalog item	본문에서, 흐름 세포계수기 A
MACSQuant Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	non catalog item	본문에서, 흐름 세포계수기 C
MACSQuantify software v3.1	Miltenyi Biotec	non catalog item	본문에서, 소프트웨어 C
Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	120094	전혈 고정용
Paraformaldehyde	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	샘플 고정용
Pipet tips 10 µL	Gilson	F161630	혈액 샘플 이동용
Pipet tips 1000 µL	Gilson	F161670	혈액 샘플 이동용
Pipet tips 200 µL	Gilson	F161930	혈액 샘플 이동용
Polystyrene Round-Bottom Tube 5 mL	Corning	352052	흐름 세포계수기 획득에 필요
Rainbow calibration beads (6 peaks)	Spherotech (BD)	556286	흐름 세포계수기 조화에 용
Vacutainer EDTA	BD	368857	첫 번째 3ml의 혈액 수집용
Vacutainer multiple sample luer adapter	BD	367300	혈액 채취용
Vacutainer one use holder	BD	364815	혈액 채취용
Vacutainer with 0,129 M sodium citrate	BD	363079	혈액 수집용