CaMPARI를 이용한 초파리 유충 중추신경계에서 개별 시냅스 전후 파트너의 기능적 특성 분석

Summary

이 프로토콜은 유전적으로 인코딩된 도구를 사용하여 Drosophila melanogaster 유충의 중추신경계에서 정의된 신경 파트너 간의 기능적 시냅스 활동을 생체 내에서 평가합니다. CsChrimson 매개 광유전학적 자극은 시냅스 전 감각 신경세포 cIVda 신경세포를 유발하여 시냅스 후 분지 4 중간뉴런에서 CaMPARI의 칼슘 의존적 광변환을 유도합니다.

Abstract

커넥토옴 연구는 다양한 종의 신경계에서 시냅스 연결성에 대한 이해를 크게 확장시켰습니다. 전자현미경(EM)을 이용한 시냅스 파트너의 특성 분석은 상세한 해부학적 정보를 제공하지만, 신경망의 기능적 측면은 상호 보완적인 접근이 필요합니다. 최근 초파리 연구는 유충의 완전한 연결체뿐만 아니라 수컷과 암컷 성체 중추신경계뿐만 아니라, 유충의 통각수용망과 같은 특정 행동을 조절하는 신경망의 세포 구성 요소도 밝혀냈습니다. 3령 유충 단계에 이르면, 클래스 IV 수지돌기 신경형성(cIVda) 다수지상 감각 신경세포(통각수용체)가 Basin-4 중간뉴런과의 대부분의 시냅스 접촉을 형성합니다. 이러한 해부학적 연결의 기능적 관련성을 평가하기 위해, 유전적으로 암호화된 칼슘 지표인 CaMPARI(Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator)를 살아있는 미해부 3기 유충에서 활동 의존적 보고자로 사용하여 cIVda 뉴런과 Basin-4 중간뉴런 간의 시냅스 연결성을 평가하였습니다. CaMPARI는 세포 내 칼슘 수치 상승에 따라 방출 스펙트럼이 변화하는 비율 형광 지표입니다. 기저 조건에서 CaMPARI는 녹색 형광을 발하며; 칼슘 농도가 높고 광변환광(~400 nm)에 노출되면 돌이킬 수 없이 적색 형광으로 전환됩니다. 시냅스 후 뉴런으로의 칼슘 유입이 시냅스 활성화의 특징이기 때문에, CaMPARI 광변환은 기능적 시냅스 신호 전달을 읽어줍니다. 적색편이 채널로돕신 CsChrimson을 이용해 현미경 슬라이드에서 3령 유충을 고정시켜 cIVda 통각수용체의 광유전학적 활성화를 진행하는 단계별 방법이 제시되었으며, 이는 분지 4 뉴런에서 동시 CaMPARI 광전환을 결합한 것입니다. 내부 움직임과 초점면 변화에도 불구하고 Basin-4 뉴런에서 칼슘 의존성 광변환은 이 세포들 간의 시냅스 연결성에 대한 기능적 증거를 제공합니다. 이는 CaMPARI를 시냅스 전 광유전학 자극과 결합하여 온전하고 해부되지 않은 초파리 유충에 대한 원리 증명 역할을 합니다.

Introduction

중추신경계(CNS)에서 정확한 시냅스 파트너를 식별하면 신경계 발달 중 시냅스 연결의 형성과 정교화를 추적할 수 있습니다. 이에 따라 Caenorhabditis elegans ^1,2와 Drosophila melanogaster ^3,4,5와 같은 강력한 유전 모델 생물의 완전한 연결체뿐만 아니라, 쥐의 주요 시각 피질⁶과 인간 측두피질⁷을 포함한 복잡한 포유류 뇌의 밀리미터 규모 EM 부피도 복원하기 위해 체적 전자현미경(EM)을 사용하는 노력에 집중되었습니다 . 이 연구들은 해부학적 수준에서 시냅스 연결성의 조직 원리에 대한 독특한 통찰을 제공합니다. 그러나 시냅스 파트너의 기능적 특성화는 신경 연결성에 대한 상호 보완적 통찰을 제공하며, 해부학적 발견을 검증하는 데 필수적입니다.

초파리는 유충³, 암컷⁴,^{수컷 5} 성인 중추신경계에 완전한 커넥토미터가 존재한다는 등 신경 연결성 연구에 많은 이점을 제공합니다. 또한 예측 가능한 행동을 조절하는 잘 특성화된 신경 회로도 포함됩니다 ^8,9,10. 유충 통각수용망은 정밀한 시냅스 연결성을 연구하는 데 매우 적합한 회로 중 하나이다¹¹. 이 네트워크의 EM 재구성은 통각수용 자극 처리에 필요한 상세한 시냅스 파트너십을 밝혀내어 노시펜시브 롤링(nocifensive rolling)으로 알려진 특징적인 탈출 행동을 이끌어냈다^12,13.

이 네트워크 내에서 클래스 IV 수지돌기 아보리화(cIVda) 뉴런¹⁴는 통증 감지를 담당하는 주요 감각 통각수용체 역할을 합니다 11,12,13,15,16. 이들의 세포체와 수상돌기는 체벽 주변부에 위치하며, 축삭은 유생 복측 신경줄(VNC)로 투사됩니다¹⁵. 중추신경계 내에서 cIVda 뉴런은 축삭 말단을 고정된 패턴으로 삼으며, 주로 4번 분지 중간뉴런^{11, 12, 13, 17}과의 시냅스 접촉을 형성합니다. 이 정의된 시냅스 관계는 cIVda 뉴런과 Basin-4 중간뉴런을 생체 내 시냅스 연결성의 기능적 평가에 이상적인 쌍으로 확립합니다. 개별적으로 식별된 시냅스 파트너 간의 기능적 연결 분석 방법 개발은 특히 고정관념화된 신경 회로를 가진 유전적으로 다루기 쉬운 시스템에서 시냅스 발달과 정제의 기전 조사를 촉진할 것입니다.

CaMPARI(칼슘 조절 광활성화 비율 적분기)¹⁸은 유전적으로 암호화된 비율 형광 지표로, 세포 내 칼슘 수치 상승에 따라 방출 스펙트럼이 변화합니다. 기저 조건에서 CaMPARI는 녹색 형광을 발하며; 높은 칼슘 농도가 존재하고 광변환광(~400나노미터(nm))에 노출되면 돌이킬 수 없이 적색 형광으로 변환^됩니다. 시냅스 후 뉴런으로의 칼슘 유입은 시냅스 활성화의 특징이기 때문에, CaMPARI 광변환은 기능적 시냅스 신호^{전달 19,20}을 읽어냅니다.

CaMPARI 외에도, 신경 활동은 GCaMP 또는 RCAMP²¹과 같은 유전자 암호화 칼슘 지표(GECI)와 Arclight²³, Ace2N-mNeon²⁴, VARNAM²⁵와 같은 유전적 인코딩 전압 지표(GEVI)²²와 같은 가역 센서를 통해 시각화할 수 있습니다. 이 빠르고 가역적인 센서들은 과도한 활동을 실시간으로 모니터링하는 데 적합하지만, 생체 내 영상 촬영 중 움직임 인공에 취약합니다. 반면, CaMPARI의 통합적이고 비가역적인 광변환 특성은 정해진 시간 창 내에서 활동을 포착할 수 있게 하여, 영상²⁰ 중 초점면이 이동해도 신경 활성화를 감지할 수 있게 합니다. 또한 CaMPARI 광변환은 보라색 빛의 세기를 조절하여 시냅스 강도 감소나 임계값 이하 입력을 감지할 수^{있습니다.} 이러한 특성들은 마우스 피질(²⁷), 제브라피시 뇌(Zebrafish brain²⁸), C. elegans²⁹, 성체 초파리²⁰ 연구를 포함하여 머리 고정이나 묶음 없이 자유롭게 움직이는 동물의 활동 지도 작성을 가능하게 했습니다.

CaMPARI 광변환과 공초점 현미경을 이용한 시냅스 전 광유전학적 자극을 결합해 온전한 해부되지 않은 초파리 유충에서 기능적 시냅스 파트너를 시각화하는 프로토콜이 설명되었습니다. 이 접근법에서 CaMPARI는 살아있는 3령 유충에서 cIVda 뉴런이 광유전학적 활성화된 후 분지-4 중간뉴런에서 시냅스 후 칼슘 유입을 감지하는 데 사용됩니다. cIVda 뉴런은 적색광 활성화 채널로돕신 CsChrimson^30,31을 발현하며, Basin-4 중간뉴런은 CaMPARI를 발현합니다. 적색광에 노출되면 통각수용기를 선택적으로 활성화하여 통각수용 자극을 시간 조절 방식으로 모방합니다^16,30. 이 전략은 시냅스 전 활성화가 시냅스 후 뉴런에서 칼슘 의존성 CaMPARI 광전환을 유도하는지 평가하여 시냅스 연결성의 기능적 증거를 제공합니다.

여러 기술적 이점이 CsChrimson과 결합하여 cIVda–Basin-4 연결성 분석을 수행하는 데 적합합니다. 첫째, cIVda수상돌기는 유충^체벽의 완전하고 겹치지 않는 타일링을 형성하여, 해부로 인한 손상으로 인한 교란 효과 없이 온전한 감각 신경세포를 광유전학적 활성화할 수 있게 한다¹⁶. 둘째, 유충은 현미경 슬라이드에서 물리적으로 고정되어 있지만, 내부 움직임은 영상 촬영 중 중추신경계 위치와 초점면을 자주 변화시킵니다; CaMPARI 광변환은 이러한 움직임 인공에 덜 민감하며, 신경 활동의 안정적이고 시간 통합 판독을 제공합니다. 셋째, CaMPARI의 통합적이고 조절 가능한 특성은 초기 발달 단계와 같이 시냅스 강도나 접촉 수가 감소하더라도 시냅스 활동을 감지할 수 있게 하여, 향후 시냅스 형성 및 정제에 대한 연구를 지원한다.

Protocol

모든 초 파리 멜라노가스터 실험 절차는 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 유전자형 w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4(RRID:^{BDSC_54899 12} 와 RRID:BDSC_32079¹⁶을 재조합하여 얻은 물질 유전학 및 CaMPARI 발현을 유도하는 데 사용되었습니다(w^-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo는 각각 시냅스 전 및 시냅스 후 파트너에서 RRID:BDSC_81085와 제2염색체 마커를 재조합하여 얻어졌습니다. 이 프로토콜에서 사용되는 연구 도구들은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 유충 준비

1. 처녀 암컷 UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI 간의 유전적 교배를 구축합니다; 예를 들어, 관심 있는 시냅스 전 뉴런이 GAL4 발현을, 관심 후 시냅스 뉴런이 LexA^33,34를 구동하는 두 이진 계통을 포함하는 파리 계통의 수컷 (RRID:BDSC_81085).
2. 표준 옥수수 가루 한천 배지 35,36,37,38에 0.5 mM 전트랜스 레티날(ATR)을 보충하여 CsChrimson 활성화를 위해 유전자 교배를 설정^{했습니다.} ATR이 없는 병렬 바이알을 ATR 없는 조종관으로 준비하세요.
   참고: 옥수수 가루 한천 배지를 끓이지 않고 녹여. 굳지 않고 식히도록 하세요. 제조사 지침에 따라 95% 에탄올에 희석한 40 mM ATR 스톡 용액을 준비한 후 배지에서 0.5 mM까지 희석한 후 충분히 섞습니다.
3. 빛 노출을 막기 위해 바이알을 알루미늄 호일로 완전히 덮으세요.
   참고: ATR의 빛에 민감하기 때문에 지속적인 어둠 속에서 키우는 환경을 유지하고, 의도치 않은 신경 활성화를 방지해야 합니다. CsChrimson은 적색광(590–680 nm)에 가장 민감하지만, 다른 가시광선^{파장 31,39}에도 활성화될 수 있습니다.
4. 25°C에서 바이알을 배양하고 유충을 3령 단계까지 키웁니다.

2. 유충 고정

1. 붓으로 3령 유충을 채집하세요. 유충을 0.1 M PBS가 포함된 3웰 마이크로 스팟 플레이트에 세척하여 먹이를 제거합니다.
   참고: 과도한 PBS를 제거하지 마세요; 수분 유지에 도움이 됩니다.
2. 깨끗한 커버슬립(18 × 18 mm)의 각 모서리에 소량의 모델링 점토를 뿌리세요. 유충을 커버슬립에 PBS 한 방울에 넣고 배가 아래로 향하도록 두세요.
   참고: 복측 신경줄(VNC) 영상 촬영을 위해, 유충을 등쪽에 부착하여 복측면이 커버슬립과 접촉하도록 합니다. 이 방향 덕분에 VNC 내 Basin-4 중간뉴런이 커버슬립을 통해 대물렌즈를 마주할 수 있습니다.
3. 유충이 들어있는 커버 슬립 위에 깨끗한 현미경 슬라이드를 올려놓으세요.
4. 커버슬립을 모서리에 추가로 조형용 점토를 발라서 고정하세요. 유충이 파열되거나 커버슬립이 터지지 않도록 충분한 압력을 가해 움직이지 못하게 하세요.

3. 자극, 광변환 및 영상 작업 흐름

1. CaMPARI를 발현하는 시냅스 후 신경세포의 기본 z-스택을 동시에 녹색(488 nm, 레이저 출력 0.8%)과 빨간색(~561 nm, 0.8% 레이저 출력) 채널을 사용합니다. Z-스텝 1 μm, 256 × 256 픽셀 해상도, 라인 평균 2, 양방향 주사, 40×/1.2 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경에서 스캔 속도 9를 사용하세요. 모든 영상 촬영은 어두운 환경에서 수행하세요. 실험 내내 동일한 z-스택 매개변수를 유지하세요.
   참고: 유충 VNC에서는 전형적인 위치에서 밝은 녹색 세포체가 나타나며, 기저선에서는 검출 가능한 붉은 형광이 없습니다.
2. 유충을 30초 동안 동시 광변환광(405nm, 레이저 출력의 0.5%)과 광유전자극광(594nm, 레이저 출력의 0.8%)을 사용해 연속적으로 자극합니다.
3. 3.1단계와 동일한 매개변수를 사용하여 빨강(~561 nm)과 초록색(488 nm) 채널 모두에서 자극 후 z-스택을 획득합니다. VNC 세포체는 기준선과 유사한 위치에 있을 것으로 예상됩니다. ATR 영양 유충에서 자극 중 활성화된 뉴런에서 붉은 CaMPARI 형광을 검출하며, 무-ATR 대조군에서는 광변환이 최소화됩니다.
   참고: 워크플로우와 매개변수는 그림 1에 요약되어 있습니다.

그림 1: 자극, 광변환(PC), 영상 작업 흐름. 세 단계의 순차적 영상 검사를 통해 4번 분지 뉴런의 칼슘 활성을 평가하였습니다. 기초 단계에서는 488nm 및 561nm 레이저를 사용해 자극 전에 녹색과 적색 CaMPARI 형광을 포착하기 위해 z-스택을 획득했습니다. 자극 단계에서 cIVda 뉴런은 CsChrimson(594 nm)을 통해 광유전학적으로 활성화되었고, 동시에 405 nm 조명으로 활성 CaMPARI를 녹색 형광에서 적색 형광으로 변환했습니다; 이 30초 동안 영상 촬영은 이루어지지 않았습니다. 자극 후 단계에서는 베이스라인과 동일한 레이저 설정으로 z-스택을 재획득하여 Basin-4 세포체 내 광변환 적색 신호를 검출했습니다. 모든 z-스택은 256 × 256 픽셀로 1 μm Z-스텝, 2 선평균, 40×/1.2 NA 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용해 어두운 환경에서 양방향 스캔을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

4. 영상 분석

1. Bio-Formats가 활성화된 상태에서 피지(RRID:SCR_002285)에서 z-스택 이미지를 엽니다. 스택 뷰잉을 하이퍼스택으로, 컬러 모드를 컴포지트로 설정한 뒤 자동 스케일링을 활성화하세요. Z평면을 스크롤하며 최적의 초점이 맞는 평면을 선택하세요. 선택한 비행기를 복제하기(복제 → 이미지 참조; 채널: 1–2; 선택된 Z-평면).
2. 빨간색과 녹색 채널 분할(이미지 → 컬러 → 분할 채널).
   참고: Image → 두 채널 모두에 대해 밝기/명암 → 조정 → Auto를 사용하세요.
3. 50픽셀의 롤링 볼 반경을 사용해 두 채널에서 배경을 빼기(프로세스 → 배경 빼기).
4. 면적, 평균 회색값, 통합 밀도(IntDen), 표준편차, 최소 및 최대 회색값을 포함하도록 측정값(분석 → 세트 측정값)을 구성하세요.
5. Freehand 도구를 사용해 녹색 채널의 각 셀 주변에 관심 영역(ROI)을 그리세요. ROI 매니저에 ROI를 추가하고 측정하세요. 같은 ROI를 빨간 채널에 적용하고 측정하세요.
6. 유충과 세포 식별자를 포함한 모든 측정값을 스프레드시트에 기록하세요.
   참고: 자극 전후 이미지 모두에 대해 측정을 수행하세요.
7. 적색-녹색 형광 비율을 적적밀도 값을 사용하여 각 세포의 (R/G)_사후 및 (R/G)_전 을 산출합니다. 유충당 평균 세포 수준 수치.
   참고: 통합 밀도(면적× 평균)는 서로 다른 크기의 셀 간 비교를 가능하게 합니다.
8. Δ(R/G)는 유충 평균을 이용해 (R/G) _이후 − (R/G)_pre 로 계산합니다. 양의 Δ(R/G) 값을 광변환 중 시냅스 후 칼슘 활성 증가로 해석합니다.
   참고: 음의 Δ(R/G) 값은 잡음이나 배경 비대칭성에서 발생할 수 있습니다. 음수 값을 0으로 설정하세요. 이 데이터셋에서 한 유충은 음수(−0.008)를 보였고, 이 값은 0으로 설정되었습니다.

Results

이 프로토콜에 따라, CaMPARI를 이용한 생해부 미해리 D. melanogaster 3령 유충에서 cIVda 뉴런과 Basin-4 중간뉴런 간의 기능적 연결성을 평가하였다(그림 2). 광변환(PC) 빛이나 광유전학적 활성화 자극 이전에 Basin-4 중간뉴런은 세포질 CaMPARI 발현으로 인해 녹색 형광을 보였습니다(그림 2A). 기저 조건에서는 적색 형광이 검출되지 않아 자극 전 광변환이 없었음을 확인했습니다(그림 2B).

PC 빛과 광유전학적 자극에 동시 노출되면 CaMPARI가 녹색 형광에서 적색 형광으로 전환되었습니다(그림 2C, D). 광전환이 CsChrimson 매개 신경 활동에 의해 특별히 유발된다는 것을...

Discussion

여기서 설명하는 프로토콜은 온전한 D. melanogaster 유충에서 정의된 시냅스 파트너 간의 시냅스 연결성을 정성적·정량적으로 평가할 수 있게 합니다. 이 접근법은 cIVda 감각 뉴런의 옵토유전적 자극과 활성화된 시냅스 후 분지 4 중간뉴런의 CaMPARI 기반 시각화를 결합하여 해부되지 않은 유충의 중추신경계(CNS)에서 시냅스 활동을 모니터링합니다. 이전에 D . melanogaster 에서 CaMPARI의 적용은 주로 성체^{단계 20} 에 집중되었거나 신체적 시냅스 전 자극(예: 통각수용 열 자극)을 필요로 했습니다¹⁷. 본 방법은 CaMPARI 사용을 초기 발달 단계까지 확장하고, 광유전학적 시냅스 전 자극과 CaMPARI 기반 시냅스 후 검출을 결합하여 시냅스 활동의 기능적 평가 전략을 도입합니다. 광유전활성화는 시냅스 전 입력의 정밀한 시...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK	유충을 수화하고 장착하는 용액에 사용되는 화학 물질
All-trans-retinal (ATR)	Sigma Aldrich	R2500-500mg	옵토유전공학 도구를 활성화하기 위해 음식에 추가되는 화학 물질
Confocal Microscope	ZEISS	LSM900 Confocal	콘포컬 현미경, 객관 렌즈 (40×/1.2 NA), 광/레이저 소스 (405, 488, 561 nm)
Coverslips (18x18mm)	VWR	48366-205	영상 촬영을 위해 동물을 장착하는 데 사용
Ethanol (95%)	Sigma Aldrich	E7023	분말 ATR의 용매로 사용
Fiji (ImageJ)	Open source	RRID:SCR_002285	영상 분석에 사용
Prism version 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID:SCR_002798	통계 분석에 사용
Microscope slides	VWR	48300-041	영상 촬영을 위해 동물을 장착하는 데 사용
Modeling clay	Flinn scientific	FB0600	미세한 유리판 위에 유충이 있는 슬라이드를 고정하는 데 사용
Paintbrush	Genesee scientific	59-204	유충을 다른 위치로 옮기는 데 사용
Standard cornmeal agar medium	Genesee scientific	66-123	유사한 표준 레시피와 재료를 사용하여 음식을 준비할 수도 있음
Standard Drosophila plastic vials (25mm x 95mm Drosophila narrow vials)	Genesee scientific	32-109	큰 바이알이나 병도 사용할 수 있음
Three-well micro spot plate	Electron Microscopy Sciences	71561-01	개별 유충을 분리하고 세척하는 데 사용하는 플레이트
Drosophila stock (genotype: w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079	RRID:BDSC_54899과 RRID:BDSC_32079를 재조합하여 얻음
Drosophila stock (genotype: w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_81085	RRID:BDSC_81085와 두 번째 염색체 마커를 재조합하여 얻음