확장보조 하이브리드화 연쇄 반응-smFISH와 초파리 뇌의 면역조직화학

요약

이 프로토콜은 초 파리 뇌에서 RNA 및 단백질 발현의 세포 유형별 정량적 분석을 위한 확장성 보조 HCR-smFISH 및 면역조직화학 워크플로우를 설명합니다. 여기에는 광판 현미경 또는 공초점 현미경 영상, 핵 및 세포질 전사체의 자동 정량 등이 포함됩니다.

초록

유전자 발현의 정량적이고 공간적으로 분해된 분석은 세포 유형별 분자 프로필을 평가하는 데 필수적입니다. 초파리 시각 시스템에서는 광범위한 유전학 도구들이 정의된 신경 집단 내에서 RNA와 단백질 수준을 직접 평가할 수 있는 틀을 열어줍니다. 여기서는 확장 보조 HCR-smFISH(하이브리드화 연쇄 반응 단일 분자 형광 현장 하이브 리다이제이션)와 면역조직화학을 결합하여 유전적으로 정의된 시각 신경 유형 내 세포 유형 특이적 분자 프로필 을 정량적으로 분석할 수 있는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 워크플로우는 핵 국소화 또는 막 결합 마커로 표지된 세포에 최적화되어 동일한 뉴런 내에서 전사체와 단백질 수준을 측정할 수 있습니다. 조직 확장 후에는 빠른 체적 획득을 위해 라이트 시트 현미경으로 샘플을 이미징하며, 표준 역방향 레이저 스캐닝 및 회전 디스크 공초점 현미경에서는 대체 마운팅 및 이미징 워크플로우가 시연되었습니다. 또한 핵 및 세포질 전사체를 구별하는 자동 분할 알고리즘을 제공하여 전사 상태 및 세포 내 RNA 위치 분석을 가능하게 합니다. 실험 매개변수와 신호 품질, 조직 무결성, 정량적 성능에 영향을 미치는 일반적인 함정에 대한 실질적인 지침이 제공됩니다. 대표적인 응용 분야로는 RNA와 단백질 레벨의 관련 변화를 정량화하여 세포 유형 특이적 RNA 간섭을 검증하는 것이 포함됩니다. 세포 유형 특이성을 가진 통합 RNA 및 단백질 수준 측정을 가능하게 함으로써, 이 접근법은 가설 기반 분자 분석에 확장 가능한 전략을 제공하며, 표적 맥락에서는 단일 세포 전사체 분석의 실용적인 대안이 됩니다. 이 프로토콜은 온전한 초파리 뇌의 해부학적 맥락을 보존하면서 세포 유형별 분자 교란을 검증하는 실용적인 접근법을 제공합니다.

서론

초파리 흑위 시각 시스템은 신경 분화 ^1,2, 세포 유형 명세 ^3,4, 뇌 배선 분자 논리 ^5,6,7 등 발달 신경과학의 광범위한 문제를 해결하는 강력한 모델로 활용되어 왔습니다. 이러한 진전은 세포 유형별 유전적 드라이버 라인 ^8,9,10의 대규모 컬렉션, 최근의 포괄적인 커넥토믹 재구성(10,11,12), 그리고 점점 더 상세해지는 단세포 전사체 13,14 및 다중체체 ¹⁵ 등 매우 풍부한 실험 도구 키트에 의해 추진되었습니다 데이터셋. 이 자원들은 신경 유형을 다중 양식적으로 정의하고 정밀한 유전적 조작을 가능하게 합니다. 그 결과, 이 분야는 특정 유전자가 신경세포의 정체성, 연결성^{, 기능을 어떻게} 조절하는지에 대해 점점 더 예측 가능한 가설을 생성할 수 있게 되었습니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱은 전사 상태에 대한 강력한 통찰을 제공하지만, RNA 개체 수가 항상 단백질 발현을 예측하는 것은 아니며(¹⁷), 많은 교란 실험은 궁극적으로 동일한 뉴런 내에서 RNA와 단백질을 직접적이고 정량적으로 측정해야 합니다.

단일 분자 형광 제자리 하이브리다이제이션(smFISH)^18,19는 해부학적 맥락을 보존하면서 세포 및 아세포 해상도로 전사체 풍부도를 정량적으로 측정할 수 있게 합니다. smFISH와 확장현미경 20,21,22의 결합은 부풀어 오르는 수소겔 내 조직을 물리적으로 확대함으로써 분자 혼잡을 줄이고 광학 접근성을 개선하며 효과적인 공간 해상도를 높여 완전한 뇌에도 그 유용성을 확장했습니다. 하이브리다이제이션 연쇄 반응(HCR) 기반 신호 증폭과 결합될^{경우, 확장} 보조 smFISH는 두꺼운 신경 조직 전반에 걸쳐 이산 전사체를 강력하게 검출할 수 있으며, 라이트시트 또는 공초점 현미경을 이용한 전뇌 영상을 지원합니다.

초파리 뇌에는 다양한 현장 RNA 영상 기법이 적용되어 다양한 실험적 우선순위를 반영하고 있습니다. 확장 보조 반복 HCR-FISH는 전체 뇌에서 공간적으로 분해된 RNA 검출을 가능하게 했습니다²⁴. 이와 병행하여, 유전적으로 표지된 뉴런에서 RNA 측정을 위해 비확장형 전체 마운트 FISH 접근법이 사용되었으며, 여기에는 즉각적인 초기 유전자를 중심으로 한 HCR 기반 활성 매핑^{전략과 막}에 묶여 있는 유전적으로 암호화된 마커를 이용한 분할 기반 전사체 계수 워크플로우²⁶이 포함됩니다. RNAscope와 같은 상업적 프로브 기반 방법은 전체 뇌에서 다중화 RNA 검출을 가능하게 했으며, 종종 면역조직화학과 결합하여 표적 세포 집단을 식별하는 데 도움을 주었습니다²⁷. 이 방법들을 종합해 파리 뇌에서 공간적으로 해상도된 RNA 분석이 기술적으로 가능함을 입증합니다. 하지만 가설 기반 섭동 실험은 기존 단일 워크플로우로는 완전히 해결되지 않는 보다 구체적인 요구사항을 요구합니다. 많은 방법들은 다중화 발견 스타일의 전사체 매핑, 활성-상태 프로파일링, 또는 RNA 정량만을 우선시하며, 면역염색은 일반적으로 교란된 단백질의 일치 판독보다는 세포 식별자로 사용되거나 유전적 세포 유형^{할당 28}이 없는 상태에서 적용됩니다. 또한, 일상적인 애플리케이션은 여러 영상 플랫폼과의 호환성과 자동화되고 확장 가능한 분석 파이프라인의 이점을 누릴 수 있습니다.

여기서는 확장에 의존하는 HCR-smFISH와 확장 전에 수행된 면역조직화학을 결합한 초파리 시각 시스템의 통합된 단계별 워크플로우를 제시하여, 동일한 생체 표본 내에서 동일한 뉴런 내에서 RNA와 단백질 수준을 쌍으로 측정할 수 있게 합니다. 이전에 개발한 FlySeg 프레임워크²⁹ 를 바탕으로, 핵 분절과 세포질 지점을 구분하는 자동 정량화 파이프라인을 제공하며, 총 발현 측정과 전사 상태 민감 분석을 지원합니다. 이 프로토콜은 라이트시트 현미경과 두 개의 공초점 시스템에서 시연되며, 대체 마운팅 및 영상 워크플로우도 제공됩니다. 마지막으로, 통합 RNA-단백질 판독의 유용성을 대표성 교란-검증 실험(즉, 정의된 표적의 RNAi 매개 넉다운)을 통해 신호 품질, 조직 무결성, 정량적 성능에 영향을 미치는 매개변수와 함정에 대한 실질적인 지침을 제공합니다.

이 프로토콜은 일반적으로 초파리에서 뇌 전체 RNA 검출을 위한²⁴ EASI-FISH 프레임워크를 기반으로 하며, RNA 고정, 하이드로겔 확장, HCR 기반 신호 증폭이라는 핵심 원리를 유지합니다. 본 프로토콜은 확장 전 면역조직화학을 통합하여 동일한 뉴런 내에서 RNA와 단백질의 일치 측정을 가능하게 하고, 작업 흐름 전반에 걸쳐 여러 처리 및 취급 단계를 수정하여 견고성과 재현성을 개선하며, 광판 현미경과 기존 역방향 공초점 현미경에 대한 실용적인 장착 및 영상 전략을 제공하고, 자동 소마 분할 및 전사체 정량화를 통합함으로써 이 접근법을 확장하고 정교화합니다 핵 및 세포질 RNA 풀의 명확한 분리를 포함합니다.

이 워크플로우는 해부학적 맥락을 유지하면서 유전적으로 식별된 뉴런에서 정의된 RNA 및 단백질 판독값을 정량화하는 목표 대상 실험에 가장 적합합니다. 특히 정의된 유전자 또는 소수의 후보 유전자의 상향 또는 하향 조절을 측정하거나, 유전자형 또는 발달 단계 간 발현을 비교하거나, 핵 및 세포질 전사체 위치를 통해 전사 상태를 평가하는 것이 목표일 때 분자 교란을 검증하는 데 유용합니다. 편향 없는 전사체 발견이나 고플렉스 전뇌 발현 매핑에는 덜 적합하며, 단세포 시퀀싱, 공간 전사체학, 또는 반복적 다중화 FISH 접근법이 더 적합할 수 있습니다.

프로토콜

윤리 선언

이 프로토콜은 Drosophila melanogaster를 사용합니다. 척추동물이나 인간 대상은 사용하지 않았습니다. 따라서 기관 동물 관리 및 이용 위원회의 승인은 필요하지 않았습니다.

참고: RNase-clean 기법을 계속 사용하세요. 장갑을 착용하고, 표면과 도구를 RNase 오염 제거액으로 닦으며, 모든 용액은 RNase 무첨가 물로 준비하세요.

그림 1. 샘플 준비 프로토콜의 단계별 워크플로우 (A) 프로토콜의 대략적인 일별 진행 및 야간 배큐 단계를 나타내는 도식적 타임라인. (B–J) 뇌 해리 및 고정부터 면역조직화학, RNA/단백질 가교결합, 하이드로겔 삽입, 소화, 프로브 하이브리다이제이션, HCR 신호 증폭에 이르기까지 주요 샘플 준비 단계의 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

1. 뇌 박리, 고정 및 면역조직화학 (1일차–3일차)

참고: 별도의 언급이 없는 한 모든 단계는 테라사키 스타일의 다중 웰 플레이트에서 수행하십시오. 배양과 세척에는 우물당 10 μL을 사용하세요. 습도를 유지하려면 접시 한쪽 모서리에 적신 실험실용 물티슈를 깔아두세요.

주의: 파라포름알데히드와 글리옥살 고정제는 독성이 있거나 자극적입니다. 배기구 후드에 넣고 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.

1. 얼음처럼 차가운 S2 곤충 배지에서 뇌를 해부하세요. 뇌를 우물로 옮기며, 우물당 최대 10개의 뇌를 수용합니다(그림 1B–C).
   참고: 여기 제시된 대표 실험에서는 72개의 고대 번데기 뇌가 사용되었습니다.
2. S2 매개체를 10 μL 고정제로 교체하고 한 번 교환하세요.
3. Addax 무산 글리옥살에 5% 자당(w/v) 자당을 4°C에서 하룻밤 고정합니다(그림 1C).
4. 뇌 3×를 10 μL PBST(0.5% Triton X-100 in PBS)에 실온에서 각각 10분간 세척합니다.
   주의: Triton X-100은 불편한 기기입니다; 피부와 눈 맞춤을 피하세요.
5. 뇌를 10 μL 1차 항체 용액(PBST 용액, 재료표에 명시된 희석도)에서 4 °C에서 24시간 동안 배양합니다. (그림 1D).
6. 뇌×를 4°C에서 10 μL PBST에 10분간 세척합니다. 각 세척마다 배양 중간에 용액을 한 번 교체하세요(세척당 두 번 교환).
7. 뇌를 10 μL 2차 항체 용액(PBST 내, 재료표에 명시된 희석도)에서 4 °C에서 24시간 동안 배양합니다(그림 1D).
   참고: 샘플을 빛으로부터 보호하세요.
8. 뇌×를 4°C에서 10 μL PBST에 10분간 세척합니다. 각 세척마다 배양 중간에 용액을 한 번 교체하세요(세척당 두 번 교환).
   참고: 1차 및 2차 항체 농도를 표준 전장 면역조직화학 농도보다 2–3배 높게 사용하세요
   일시정지: 뇌를 10 μL 1× PBS에 4°C에서 최대 96시간 동안 보관합니다.

2. RNA와 단백질의 공유 결합 고정 (4일차) (그림 1E)

주의: RNA 고정 알킬레이터와 AcX는 위험합니다(독성/자극성; 일부는 발암물질로 의심됨). 적절한 개인 보호 장비(PPE)와 함께 화학 연기 후드에서 용액을 준비하고 다루세요. 모든 폐기물을 유해 화학 폐기물로 수집하세요.

1. 뇌를 37°C에서 20 mM MOPS 완충제(pH 7.7) 10 μL 용량에 20분간 배양합니다.
2. 49.5% (v/v) 20 mM MOPS, 49.5% (v/v) 멜팔란 스톡(2.5 mg·^mL-1 in DMSO), 1% (v/v) AcX 스톡(10 mg·^mL-1 in DMSO)을 혼합하여 고정액을 준비합니다. 최종 농도는 1.24 mg·^mL-1 멜팔란과 0.10 mg·^mL-1 AcX입니다.
3. MOPS를 웰당 7–8 μL 고정액으로 교체하고, 용액을 한 번 교환한 뒤 37°C에서 어둠 속에서 하룻밤 배큐합니다.
   참고: 과잉 및 교차 혼합을 최소화하면서 완전한 샘플 커버리지를 유지하기 위해 7–8 μL를 사용하세요.

3. 젤화(뇌를 하이드로겔에 삽입) 및 단백질분해효소 K 소화 (5일차)

주의: 아크릴 단량체, APS, TEMED는 자극물/독성이 있습니다. 개인 보호 장비(PPE)로 손잡이; 휘발성/발열 성분을 연기 후드에 준비하세요.

1. 0.5mm 두께의 접착제 실리콘 가스켓을 충전되지 않은 유리 현미경 슬라이드(그림 1F, 왼쪽 하단)에 부착하고, 완전히 접촉하고 밀봉되도록 단단히 눌러주세요.
2. 챔버에 폴리-L-라이신 용액 200 μL을 넣고 표면을 고르게 펴 덮은 후, 실온에서 5분간 배양한 후 피펫으로 용액을 제거합니다.
3. 폴리-L-라이신을 완전히 증발시켜 표면이 눈에 띄게 건조해질 때까지 기다립니다.
   참고: 폴리-L-라이신 증발은 느립니다. 신뢰할 수 있는 결과를 위해 챔버는 미리 준비하고 먼지 없는 환경에서 하룻밤 건조하세요. 또는 사용 당일 37°C 인큐베이터에서 ≥ 1시간 동안 건조 챔버를 보관하세요.
4. 뇌 2×를 10 μL 1× PBS에 각각 10분간 실온에서 세척합니다.
5. 젤 단량체 용액을 준비하고 4HT, TEMED, APS(신선하게 만들기)와 혼합하여 사용 직전에 중합 시약을 47:1:1:1:1 비율로 첨가하세요. 최종 젤화 용액에는 1M 아크릴레이트 나트륨, 14% 아크릴아마이드, 0.1% 비스-아크릴아마이드, 1× PBS, 0.01% 4HT, 0.2% TEMED, 0.2% APS가 포함되어 있습니다.
6. 잠시 소용돌이를 돌리고 최종 젤화 용액은 얼음 위에 보관하세요. 즉시 용액을 사용하세요.
7. 뇌를 10 μL 냉 젤화 용액에 15분간 얼음 위에 배양합니다.
8. 예평형 상태에서 새 면도날을 사용해 실리콘 개스킷 양쪽에 좁은 채널을 하나씩 잘라 충전 중 공기가 빠져나갈 수 있게 했습니다(그림 1F, 왼쪽 위
9. 피펫 팁을 사용해 뇌를 준비된 겔화 챔버로 옮기며, 각 뇌가 항상 겔화 용액에 잠겨 있도록 합니다.
   주의: 고정과 평형 상태가 된 후 뇌는 매우 끈적하게 작용하여 플라스틱 표면에 쉽게 달라붙습니다. 샘플 손실을 방지하기 위해 넓은 보어 피펫 팁을 사용하거나 표준 팁 끝을 다듬어 입구를 넓히세요.
10. 표면 실리콘 가스켓 접착제에서 보호 라이너를 제거하고, 깨끗한 1.5H 유리 커버를 챔버 위에 부드럽게 덮어 공기 방울이 생기지 않도록 하세요.
11. 신선하게 만든 젤화 용액 200 μL을 측면 채널 중 하나를 통해 챔버에 천천히 피펫을 주입하여 챔버가 완전히 채워질 때까지 합니다.
12. 밀봉된 챔버를 어두운 용기에 넣고 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
    참고: 물에 젖은 실험실용 물티슈를 용기 안에 넣으세요. 슬라이드가 액체 상태의 물과 직접 접촉하지 않도록 주의하세요.
13. RNase 무첨가물에 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% (v/v) Triton X-100으로 구성된 분해 완충제를 준비합니다.
14. 사용 직전에 20 mg·^mL-1 스톡에서 1:100 비율로 프로테�나제 K를 최종 농도 0.2 mg·^mL-1로 첨가합니다.
    주의: 프로테�나제 K는 자극 물질이므로 장갑을 착용해 다루어야 합니다; 흡입과 피부 접촉을 피하세요.
15. 커버슬립을 제거하기 전에 실온에서 5분간 식히세요. 젤을 메스로 직사각형 모양으로 다듬어 단일 직선 절단을 사용하세요. 각 뇌를 둘러싼 과도한 젤 부피를 최소화하세요(그림 1F, 오른쪽 상단).
16. 각 다듬은 젤을 1000 μL 소화액이 들어 있는 24웰 플레이트의 개별 웰에 넣습니다. 젤이 완전히 잠기도록 하세요.
17. 플레이트를 파라필름으로 밀봉한 후 상온에서 0.11 g 의 궤도 셰이커에서 하룻밤 배양합니다(그림 1G).

4. DNase 소화 및 HCR-smFISH 프로브 하이브리다이제이션 (6일차)

1. 젤과 접촉하거나 변형되지 않도록 웰 가장자리에 위치한 피펫을 사용해 소화액을 조심스럽게 흡입하세요.
2. 3× 젤을 500 μL 1× PBS와 함께 상온에서 0.11 g의 궤도 셰이커에서 각각 15분간 세척합니다.
   일시정지: 겔을 4°C의 500 μL 1× PBS에 최대 7일간 담근 후 보관합니다.
3. QIAGEN RNase-Free DNase 세트 1:10의 DNase I 재고를 RDD 버퍼에 희석하여 겔당 500 μL DNase 작업 용액을 준비합니다. 최종 작동 용액은 약 0.27 Kunitz 단위·^μL-1을 포함합니다.
4. 500 μL DNase 작업 용액에 37°C에서 2시간 동안 부드럽게 흔들며 인큐베이팅합니다(그림 1H).
5. 실온에서 500 μL RNase Free 1× PBS와 함께 젤 4×를 15분씩 세척합니다.
6. 500 μL 사전 가열된 프로브 하이브리다이제이션 버퍼에 37 °C에서 30분간 평형 겔을 사용합니다
7. 희석된 HCR smFISH 프로브 스톡(1 μM; 분자 기기) 1:300 프로브 하이브리다이제이션 버퍼에서 최종 농도는 ~3.3 nM으로 변환합니다. 소용돌이 혼합
8. 평형 버퍼를 500 μL 프로브 믹스로 교체하고, 0.11g 의 궤도 셰이커에서 37°C에서 하룻밤 배양합니다(그림 I).
   주의: 프로브 하이브리다이제이션 버퍼에는 독성이 있는 포름아마이드가 포함되어 있습니다. 장갑을 착용하고 흡입을 피하세요.

5. 하이브리드화 연쇄 반응 (7일차) (그림 1J)

1. 워시 젤 3×을 500 μL 미리 가열된 프로브 워시 버퍼와 함께 37°C에서 각각 30분간 0.11g 궤도 셰이커에서 세척합니다.
   주의: 프로브 워시 버퍼에는 독성이 있는 포름아마이드가 포함되어 있습니다. 장갑을 착용하고 흡입을 피하세요.
2. 3× 젤을 500 μL 1× PBS와 함께 상온에서 0.11 g의 궤도 셰이커에서 각각 30분씩 세척합니다.
3. 젤을 1mL 1× PBS에 담아 실온에서 0.11g의 궤도 셰이커에 하룻밤 두세요.
   참고: 연장된 밤샘 세척은 오프타겟 프로브 결합과 배경 지점을 줄여 신호 대 잡음비를 향상시킵니다. 당일 처리를 위해서는 바로 HCR 증폭으로 진행하세요.
   잠시 멈추는 지점: 하이브리다이제이션 후 세척 후 젤을 1 mL 1× PBS에 실온 또는 4 °C에서 최대 96시간 동안 보관한 후 HCR 증폭을 진행합니다.
4. PBS를 500 μL 증폭 완충제(이전에 상온에 평형화된 상태)로 교체하고, 0.11 g의 궤도 셰이커에서 실온에서 30분간 배양합니다 .
5. 각 프로브 세트마다 h1과 h2 헤어핀(3 μM 스톡; 분자 기기) 1:100 완충 내에서(최종 농도 30 nM 증폭 완충) 사용. 웰당 희석된 헤어핀 혼합물 350 μL를 준비합니다.
6. 열로 희석한 헤어핀 용액을 PCR 튜브에서 95°C에서 열로 사이클러나 열 블록에서 90초간 보관합니다. 튜브당 총 부피 100 μL를 사용하여 균일한 가열과 온도 평형을 보장합니다.
   참고: HCR 지침은 일반적으로 스냅 히팅 헤어핀 H1과 H2를 따로따로 그리고 냉각 후에만 결합할 것을 권장합니다. 또는 간소화된 취급이 필요할 때는 스냅 히팅 전에 H1과 H2를 결합하는 것이 좋습니다.
7. 머리핀을 어둠 속에서 10분간 실온까지 식히고 방해받지 마세요.
8. 증폭 버퍼를 제거하고 웰당 350μL 헤어핀 혼합물을 추가하세요.
9. 젤을 실온에서 어두운 궤도 셰이커 0.11g에서 2시간 동안 배큐하세요.
10. 500 μL 5×× SSCT와 함께 실온에서 0.11g의 궤도 셰이커에서 10분간 500 μL 5 SSCT를 세척합니다.
11. 증폭 후 머리핀 용액을 회수하여 빛으로부터 보호하고, 재사용을 위해 -20°C에 보관하세요.
12. 젤을 500 μL 1× PBS에 옮기고 3× μL 상온에서 30분간 세척합니다.
13. 젤은 500 μL 1× PBS 4 °C에 빛으로부터 보호하여 보관합니다.
    멈춤 지점: 증폭된 젤은 영상 촬영 전 최대 2주간 신호 손실 없이 보관할 수 있습니다.

6. 확장된 샘플의 준비, 장착 및 영상 (8일차) (그림 2)

1. DAPI가 포함된 1× PBS 젤을 4°C에서 0.11g의 궤도 셰이커에서 하룻밤 배양합니다.
2. 짧은 자외선 조명을 사용해 젤 안의 뇌를 시각화하세요. 샘플의 방향을 맞추고 필요하면 남는 젤을 다듬으세요.
   주의: 시료 위치 지정 및 장착 시 UV 조명이 사용됩니다. 적절한 안경 보호구를 착용하세요.
3. 1× PBS에 샘플을 장착하고, 선택한 영상 플랫폼에 맞는 적절한 구성을 사용하여 DAPI(1:1000)를 보완합니다(표 1 참조).
4. 샘플을 채취하기 전 최소 1시간 이상 평형을 유지하세요.
5. 확장 젤을 통과할 수 있는 충분한 작업 거리의 물에 담긴 대물렌즈를 사용하세요.
6. 라이트시트 현미경, 레이저 주사 공초점 현미경, 또는 회전 디스크 공초점 현미경을 이용한 이미지 샘플. 본 연구에서 사용된 대표적인 플랫폼별 장착 및 획득 매개변수는 표 1에 요약되어 있습니다.
   참고: 영상 촬영 후 앞서 설명한 대로 DNase 소화로 프로브와 HCR 헤어핀을 제거할 수 있습니다. 그 후 젤은 추가 프로브 하이브리다이제이션과 HCR 증폭을 거칠 수 있습니다.

강령	샘플 시각화, 장착 및 위치 파악	대물렌즈 / 검출기	대표 획득 설정
자이스 라이트시트 7	짧은 자외선 조명을 사용해 젤 내에서 뇌 위치를 시각화하세요. 과잉 젤을 제거하고 각 뇌를 검출 목표 방향으로 조정하세요. 1 × 1cm 크기의 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립에 5–6개의 젤을 바깥쪽을 향하게 놓습니다(그림 2A). 커버슬립을 LS7 샘플 홀더에 UV 경화 접착제 한 방울을 사용해 부착합니다; 접착제를 바르기 전에 UV 램프를 꺼야 합니다. LS7 챔버에 장착하고 ZEN Black의 라이브 뷰를 이용해 뇌 영역을 찾아보세요.	20×/1.0 NA 수중 탐지 목표; 광학 줌 2.5×(전체 배율 50×).	Z-스텝, 2.5× 줌, 2× 팽창에서 0.4 μm. 피벗 스캔 활성화. 노출, 모든 채널에 50ms. 레이저: 5% 405nm, 2% 488nm, 8% 561nm. 방출: 420–470 nm, 505–545 nm, 570–620 nm.
			(그림 2C, 왼쪽)
니콘 Ti2-E AXR NSPARC 레이저 스캐닝 공초점	짧은 자외선 조명을 사용해 젤 안의 뇌를 시각화하세요. 한 개의 젤을 뇌가 뒤집힌 대물렌즈를 향해 아래를 향하도록 배치하세요. 1× PBS + DAPI가 채워진 유리 바닥 영상 접시로 옮깁니다(그림 2B). 4× 목표로 뇌를 찾고, 20× 목표를 가진 ROI를 식별하며, NIS-Elements에 X-Y 위치를 등록합니다. 몰입 매체를 추가하고, 등록된 ROI를 다시 검토하여 초점을 맞추세요.	40× 장거리 수중 잠수 대물렌즈(니콘 CFI APO LWD 40× WI, 1.15 NA 람다 S, 0.61 mm 작업 거리); 초해상도 모드의 NSPARC 검출기.	갈바노미터 스캔, 2048 × 2048 픽셀, 1.6 μs/픽셀, 8.0× 줌. 레이저: 2%에서 488nm, 20%에서 640nm. 방출 범위: 502–546 nm, 666–732 nm.
			(그림 2C, 중간)
명백한 과학 IXplore IX85 / 요코가와 CSU-W1 회전 원반 공초점	역방향 공초점 영상과 마찬가지로 샘플을 마운트하면: 뇌가 대물렌즈를 향하도록 젤을 배치하고, 1× PBS + DAPI와 함께 유리 바닥 영상 접시에 넣습니다(그림 2B). cellSens 소프트웨어를 사용하여 레이저 주사 공초점 현미경에서 설명한 관심 영역을 식별합니다.	60× 장거리 수중 물에 잠기는 대물렌즈(올림푸스LUMFLN60XW LWD, 1.10 NA, 1.5 mm 작업 거리); 하마마츠 ORCA-Fusion BT GenIII 카메라 (2304 × 2304 픽셀; 6.5 × 6.5 μm 픽셀 크기).	75% 출력에서 488 nm 여기, 200ms 노출; 640nm 여기, 100% 출력, 800ms 노출. 방출 범위: 500–550 nm, 665–705 nm.
			(그림 2C, 오른쪽)

표 1: 현미경 플랫폼 전반에 걸친 대표적 마운팅, 샘플 위치 및 영상 파라미터. 광판 및 공초점 현미경 플랫폼 전반에 걸쳐 사용되는 샘플 마운팅 전략, 위치 추적 접근법, 대물렌즈 및 획득 매개변수에 대한 요약.

7. RNA 및 단백질 발현의 정량적 분석

참고: 분석 워크플로우는 실험 목표에 따라 선택하세요. 이 접근법들의 비교는 보충 표 1에 제공되어 있습니다.

1. FlySeg를 이용한 인구 규모 전사체의 정량화.
   참고: 분석은^{FlySeg 29} 파이프라인의 업데이트 버전을 기반으로 합니다. 분석 워크플로우의 개요는 그림 3A–B에 나와 있습니다
   1. FlySeg라는 Python 기반 패키지를 설치하세요. Conda 환경을 다음 방법으로 만듭니다:
      conda env Create -f environment.yml
   2. 분석 전에 다음 도구를 사용하여 환경을 활성화하세요:
      콘다 활성화 FLYSEG
   3. 분석을 다음으로 시작하세요:
      파이썬 main.py --파일 >
      CZI 또는 NPY 파일을 포함한 지원되는 입력 형식을 사용하세요.
   4. 필요에 따라 선택적 인수를 사용하여 분석을 맞춤화할 수 있습니다. 예를 들면 다음과 같습니다:
      채널 수 (--채널)
      핵 채널 (--nuclei_ch 또는 --nuclei_wavelength)
      세포질 채널 (--cytoplasm_ch 또는 --cytoplasm_wavelength)
      핵 검출 매개변수 (--nuclei_sigma_range, --nuclei_threshold)
      핵 희소 계수 (--nuclei_dilation)
      FISH 감지 임계값 (--fish_threshold_range)
      출력 디렉터리 (--output_dir)
      Napari를 통한 시각화 (--visualize)
   5. 모든 가능한 옵션을 다음을 사용하여 표시하기:
      파이썬 main.py –도움말
   6. 이미지 메타데이터를 다음과 같이 검사합니다:
      파이썬 main.py --metadata_only.
      복셀 크기, 채널 수, 채널 식별을 확인하세요.
   7. 데이터셋에 맞게 적절히 조정된 매개변수를 사용하여 분석을 수행하세요. 일반적으로 총 채널 수, 핵 채널, 세포질 채널(가능한 경우), 핵 확장 계수를 명시합니다.
      참고: 원하는 핵/세포질 경계에 적합한 --nuclei_dilation 값을 설정하세요. 예시는 그림 3C–D 를 참고하세요.
   8. 처리 기록을 모니터링하세요. 모든 출력은 입력 파일 이름을 딴 폴더에 저장됩니다.
   9. 하위 분석을 위한 주요 산출물을 식별하세요:
      1. <파일>-Nuclei-df.csv
         이 데이터베이스는 각 FISH 채널의 핵별 특징 측정값과 관련 펀크타 수를 포함하며, 통계 분석을 위한 정량적 데이터를 제공합니다.
      2. <파일>-Nuclei-equivalent-diameter-area-scatter.png
         이는 핵 크기와 강도에 따라 분할 이상치를 식별하는 산점도입니다; 이상치로 표시된 핵은 추가 분석에서 제외합니다.
   10. 필요하다면 고급 후처리를 위해 추가 중간 출력(예: 세그먼트 마스크, 펀크타 감지 테이블, 병합된 FISH 요약 파일)을 사용하세요.
2. Imaris를 이용한 개별 식별 가능한 세포에서의 전사체 계수
   1. Surfaces 도구를 사용하여 세포질 또는 막 마커 채널을 기준으로 관심 있는 뉴런을 분할합니다.
   2. 표면 평활화와 강도 임계값 매개변수를 조정하여 결과 표면이 소마를 정확히 포함하되 인접 구조를 제외하도록 합니다.
   3. Spots 탐지 도구를 사용하여 FISH 채널에서 전사체 구점을 식별합니다. 지점 크기와 신호 강도(예: 조직 팽창 2배 시 0.25 μM)를 기준으로 추정 스팟 직경과 강도 임계값을 설정합니다.
   4. 점검은 이전에 생성된 표면으로 제한하여 뉴런 내 지점만 집계하도록 합니다.
   5. 통계 패널을 사용하여 뉴런 표면 내에서 검출된 점의 총 수를 추출합니다.
   6. 스팟 카운트와 관련 측정값을 내보내 후속 분석을 수행합니다.
3. FIJI/ImageJ를 이용한 ROI 기반 형광 정량
   1. FIJI에서 이미지 스택을 열고 이미지 > 스택 > Z 프로젝트 > 최대 강도 투영을 생성하세요. 실험 내 모든 샘플에 동일한 투사 설정을 사용하세요.
   2. 해부학적 마커 채널(예: 막 또는 세포질 GFP)을 사용하여 관심 있는 신경 구조를 식별합니다. Freehand 또는 Polygon 선택 도구를 사용해 구조(예: 거대 섬유 덴드라이트)에 해당하는 ROI를 수동으로 그려보세요.
   3. 단백질 채널로 전환하여 정의된 ROI 내에서 Analyze > Measure 를 사용하여 형광 강도를 측정하세요. 다음 매개변수를 기록하세요: 평균 형광 강도; 집적 밀도; 투자 수익률(ROI) 영역.
   4. 특정 신호가 없고 표지된 신경 구조 밖에 위치한 비슷한 크기의 인근 배경 ROI에서 형광 강도를 측정합니다. 실험 내 모든 샘플에 동일한 배경 ROI 전략을 사용하고, ROI 측정값에서 배경값을 빼세요.
   5. 배경 보정된 통합 밀도 또는 평균 강도 값을 사용하여 유전자형 또는 실험 조건 간 정량적 비교를 수행합니다. 비교하는 모든 샘플에 동일한 영상 설정을 사용하는지 확인하세요.

결과

생물학적으로 관련된 환경에서 확장에 의한 HCR-smFISH 및 면역조직화학 워크플로우를 검증하기 위해, 우리는 초파리 시각 시스템의 다가오는 탈출 회로에 집중했습니다. 이 회로는 유전적으로 정의된 LC4 시각 투사 뉴런^30,31로 구성되어 다가오는 자극을 감지하고, 빠른 이륙을 유도하는 잘 특성화된 거대 섬유(GF) 하강 뉴런^32,33으로 구성되어 온전한 뇌에서 세포 유형 특이적 분자 측정을 위한 해부학적 고정관념 시스템을 제공합니다.

초파리 간극 접합 단백질인 Shaking-B(ShakB)³⁴는 GF 회로의 여러 구성 요소 내에서 전기적 전달에 관여하는 것으로 밝혀졌으며, 축삭 출력 시냅스³⁵와 청각 입력³⁵를 포함합니다. GF 수상돌기에서 감지 시 전기적 결합에 대한 직접적인 증거는 제한적이지만, 최근 연구에서는 LC4 뉴런이 높은 수준의 shakB³⁶을 발현한다는 사실이 나타났습니다. 이러한 관찰은 ShakB 녹다운 및 태깅 전략을 시험 사례로 사용하여 프로토콜이 유전적으로 정의된 신경 유형에서 RNA와 단백질 수준에서 표적 분자 교란을 정량적으로 평가할 수 있는지 평가하는 데 영향을 주었습니다.

우리는 먼저 HCR-smFISH와 ShakB 항체 염색을 결합하여 GF와 LC4에서 shakB 녹다운 효율을 평가했습니다. GF는 반뇌당 단일 뉴런으로 이루어져 막 마커로 표지되었다(그림 4A). LC4는 반뇌당 약 60개의 뉴런으로 구성된 집단으로, 집단 수준 정량화를 위해 핵 마커가 표지되었습니다(그림 4B). 대조 뇌에서는 ShakB 전사체가 GF와 LC4 뉴런 모두에서 명확히 검출되었습니다. shakB RNAi의 발현은 두 세포 유형의 표적 뉴런에서 shakB mRNA 지점이 유의미하게 감소하는 결과를 낳았습니다(그림 4C–D). RNA 간섭의 세포질 부위와 일치하게, 전사체 고갈은 세포질 구획에서 가장 두드러졌습니다. FlySeg 기반 정량을 이용한 핵 및 세포질 지점 분리 결과, LC4 집단 전반에 걸쳐 세포질 ShakB 전사체가 선택적으로 감소한 반면, 핵 지점은 유의하게 덜 영향을 받았습니다(그림 4D, 각각 69% 대 22% 감소).

우리는 GF 수상돌기가 거대 선교 중간신경세포(GCI)의 축삭과 겹치는 부위에 국한되어 ShakB 항체 염색을 발견했으며, 이 축삭은 두 거대 섬유를 연결하고 반대쪽 시각 반응을 가능하게 한다³⁷ (그림 4E). 이 관찰은 GF와 GCI 간 ShakB 의존적 전기적 결합을 입증한^{이전 연구들과} 일치합니다. 또한 LC4 축삭이 GF 수상돌기와 접촉하는 부위에서도 ShakB 항체 염색이 관찰되었으나, 이 부위의 국소 정화는 덜 명확히 밝혀졌습니다. 정확한 세포 내 위치와 상관없이, GF 수지상 영역과 관련된 ShakB 항체 신호는 RNAi 발현 후 현저히 감소했습니다(그림 4F).

그러나 항체 기반 검출로는 접촉 부위에서 시냅스 전 LC4 말단과 시냅스 후 GF 수상돌기의 ShakB 단백질을 명확하게 할당할 수 없습니다. 또한, 시각 시스템 전반에 걸쳐 ShakB가 널리 발현되어^34,36 LC4 뉴런에서 항-ShakB 면역염색을 이용한 세포 유형 특이적 정량이 제한됩니다. 이러한 한계를 극복하고 세포 유형 특이적 ShakB 위치를 직접 평가하기 위해, 우리는 이전에 생성한 내인성 태그된 ShakB 대립유전자를 사용했습니다^36,38. 이로 인해 LC4 뉴런 내에서 ShakB 단백질을 선택적으로 시각화할 수 있었습니다. SmGdP-10×V5 표지된 ShakB는 수상돌기(상류 시각 신경세포의 입력 영역에 해당)와 GF 수상돌기와 접촉하는 축삭 말단에 모두 농축되었다(그림 4G). shakB RNAi의 발현은 수지상과 축삭 구획 모두에서 V5 신호가 거의 완전히 사라지게 만들었다(그림 4H). 이 결과는 프로토콜이 신경 신경이 밀집된 신경실 내에서 세포 유형 특이적 및 아세포 내 단백질 위치 정의를 가능하게 함을 보여줍니다.

추가 질적 통제군으로, 확인된 신경 집단에서 비확장형 FISH와 면역조직화학을 결합하여 검사했습니다(보충 그림 1). grd 에서 나온 FISH 신호는 LC22 체면과 겹쳐 시엽 scRNA-seq 데이터에서 예측된 발현과 일치한다(보충 그림 1A–C)¹³. tdTomato를 발현하는 Tm3 뉴런에서는 tdTomato mRNA가 tdTomato 단백질과 겹친 반면, VGlut1 mRNA는 Tm3 소마타와 겹치지 않아 Tm3 뉴런의 콜린성 동일성과 일치한다(보충 그림 1)¹³. 이러한 예시들은 확장되지 않은 FISH + IHC만으로도 정성적 존재/부재 평가에 충분하며, 신뢰할 수 있는 단일 지점 정량화에는 확장이 필요함을 보여줍니다.

이 프로토콜의 성공적인 구현은 명확한 세포 유형 특이적 표지, 낮은 배경을 가진 이산적인 smFISH 지점, 개별 핵 또는 수작업 정의 세포 부피의 신뢰성 있는 분할, 교란 후 표적 RNA 또는 단백질 신호의 일관된 감소로 나타난다. 음성 또는 저신호 결과도 해석 가능해야 합니다. 예를 들어 , shakB RNAi는 ShakB mRNA와 ShakB 단백질 신호를 감소시켰으며, 비확장된 FISH는 tdTomato mRNA가 명확히 검출되었음에도 불구하고 Tm3 소마타에서 VGlut1 신호가 부족함을 보였습니다. 최적이 아닌 결과로는 약한 항체 또는 smFISH 신호, 높은 배경 지점, 불완전한 분할, 지점 잘못 할당, 영상 중 샘플 드리프트 등이 있으며, 이들은 모두 후속 정량에 영향을 줄 수 있습니다.

그림 2. 광판 및 공초점 현미경 플랫폼을 이용한 확대 샘플의 마운트 및 영상화가 이루어졌습니다. (A) 확장된 하이드로겔의 시각화 및 트리밍(1–2), 모든 영상 플랫폼에서 공통적으로 적용된 후 라이트시트 현미경 장착(3–4); 자이스 라이트시트 7). (B) 역방향 레이저 주사 공초점 현미경(니콘 Ti2-E AXR)에 장착된 확대 시료 사진. (C) 확장된 초파리 시각 시스템 샘플(형광 핵 마커로 표시된 LC4 뉴런)의 대표적인 단일 광학 절면(단일 Z면)을 세 개의 영상 플랫폼에서 채취하여 shakB mRNA를 탐침합니다( 그림 4 참조). 스케일 바, 10 μm (확장 후 조직). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3. FlySeg를 이용한 smFISH 펀크타의 정량적 분석. (A) 식별된 셀 내 자동 분할 및 펀크타 정량화를 위한 FlySeg 분석 워크플로우의 개략적 개요. (B) FlySeg의 핵심 분할 논리를 보여주는 3차원 보로노이 테셀레이션. 영상 볼륨은 공간 영역(각각 다른 색상으로 표시됨)으로 분할되며, 각 영역은 최대 하나의 핵을 포함하도록 제한되어 단일 세포 할당을 보장합니다. 각 보로노이 도메인 내에서는 핵 및 주변 세포질 강도 값을 기반으로 최적의 핵 표면을 결정하는 기능 최적화 절차를 통해 핵을 분할합니다. (C) 핵과 세포질 전사체를 구분하는 --nuclei_dilation 옵션 시연 단일 광학 절면에서 smFISH 지점으로 둘러싸인 GFP 표지된 핵과 DNase 처리 후 세포질 구획을 확산된 DAPI 신호로 드러내는 모습. 선은 각각 핵 및 세포질 부피에 해당하는 0과 0.5 확장 계수를 나타냅니다. (D) (C)의 최대 강도 투영으로, 펀크타가 핵과 세포질 구획을 모두 위치시키고 있음을 보여줍니다. 스케일 바, 10 μm (확장 후 조직). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4. RNAi 매개 분자 교란(A) 광시트 투사(두께 10 μm, 전체 세포 부피를 덮지 않음)를 이용한 자이언트 파이버(GF) 소마의 정량적 워크플로우 검증, 막 표지로 표지한 후 대조군(위)과 샤크B RNAi(하위) 조건에서 ShakB mRNA를 탐침함. 점선화된 녹색 윤곽은 세포질 mRNA 풀의 고갈을 강조하기 위해 소마 경계를 나타냅니다. N, 뇌(동물당 한쪽 면). (B) 핵 표지가 부착된 LC4 뉴런과 (A)와 동일합니다. (C) 조절 및 ShakB RNAi 조건 하에서 GF 뉴런(핵 및 세포질 결합 풀)에서 shakB FISH 지점의 정량화. 점은 개별 뉴런을 나타냅니다(뇌당 하나, 동물당 한 쪽). (D) LC4 뉴런에 대해 (C)와 동일합니다. 점들은 개별 뇌를 나타냅니다(동물당 한 면; 뇌당 평균 단위의 세포당 포인트 수). (E) GF 수상돌기의 공초점 돌출부, 막 마커로 표지하고 ShakB 염색된 상태에서 대조군(상단) 및 ShakB RNAi(하단) 조건에서 염색됨. (F) GF 수상돌기 내 ShakB 단백질 농도를 조절 하에서 평균 형광 강도와 GF>shakB RNAi 조건으로 측정하는 것. N, 뇌(동물당 한쪽 면). (G) LC4 뉴런의 막 표지와 smGdP-10xV5 태그 ShakB를 발현하는 공초점 투사(대조군, 위)와 shakB RNAi 조건(아래). 점선 녹색 윤곽은 ShakB-V5 밀도가 평가된 LC4 수상돌기와 축삭 말단 영역을 나타냅니다. (H) LC4 수상돌기와 축삭 말단의 ShakB-smGdP-V5 단백질 농도는 대조 하에서 평균 형광 강도로 측정되었고, LC4는 ShakB RNAi 조건> 측정되었습니다. N, 뇌(동물당 한쪽 면). 오차 바는 SEM의 평균± 나타냅니다. 모든 통계적 비교는 양측 웰치 t-검정을 사용하여 수행되었습니다. 모든 이미지에서 10 μm 스케일 바(확장 후 조직). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

이 프로토콜은 확장 보조 HCR-smFISH, 확장 전 면역조직화학, 분할 기반 전사체 정량을 결합하여 동일한 유전적으로 정의된 뉴런 내에서 RNA와 단백질의 일치 측정을 가능하게 합니다. 이 구성 요소를 하나의 워크플로우로 통합함으로써, 이 방법은 온전한 초파리 뇌에서 정량적이고 세포 유형별 분자 분석을 용이하게 할 것입니다.

여기서 소개된 몇 가지 실용적 변형은 초파리 뇌에서 면역조직화학과 확장 보조 HCR-smFISH를 결합하는 데 중요한 단계^입니다. 첫째, 조직 확장과 smFISH 전에 면역조직화학을 수행해야 합니다. 프로토콜에 단백질나아제 K 소화 단계가 포함되어 있기 때문에, 확장 후 면역조직화학 검사를 수행하면 에피토프 무결성이 저하될 수 있습니다. 중요한 점은, 증폭 전 항체 인큐베이션(24시간 1차 + 24시간 2차 포함)은 RNase-clean 기법과 공유 공유 RNA 고정 방식을 사용할 때 RNA 신호 강도를 눈에 띄게 감소시키지 않는다는 것입니다. 둘째, 1차 및 2차 항체 농도를 표준 전장 IHC에 비해 일반적으로 2–3× 증가시켜 단백질효소 K 소화 및 조직 확장과 관련된 신호 손실을 보상해야 합니다. 셋째, 고정 조건은 단백질과 RNA 신호 보존에 중요합니다. 산성 없는 글리옥살 고정은 점상 시냅스 단백질의 위치 보존을 강화하고, 신경 과정의 구조적 완전성을 유지하며, mRNA 지점의 정량적 검출을 저해하지 않습니다. 또한 RNA와 단백질의 동시 고정이 하류 HCR-smFISH 및 면역형광 검출과 양립할 수 있음을 관찰했습니다. 이러한 조정들은 면역조직화학과 확장 보조 전사체 검출 간의 호환성을 향상시킵니다.

확장은 단일 밤 단계를 추가하며 기술적으로 복잡하지 않지만, 그 사용법은 실험 목표에 따라 달라집니다. 보충 그림 1에서 보듯, 확장되지 않은 FISH와 면역조직화학을 결합하면 특정 세포 유형에서 유전자가 발현되는지 평가하기에 충분하며, 개별 smFISH 지점을 신뢰성 있게 분리하고 개별 체형에 할당하고 정량적으로 분석해야 할 때는 확장이 필요합니다. 이는 효과적인 공간 해상도가 크게 향상되기 때문입니다. 마찬가지로 테라사키 스타일 멀티웰 플레이트는 반드시 필요하지는 않지만, 시약 사용량을 줄이고 여러 조건을 병행 처리할 수 있게 하며, 소규모 배치에서 샘플 식별을 유지하는 데 도움을 줍니다; 시약 용량이 제한이 적을 때는 표준 마이크로 원심분리관도 사용할 수 있습니다. 라이트시트 현미경은 팽창된 조직의 빠른 체적 영상을 가능하게 하지만, 우리는 표준 역레이저 스캔 및 회전 디스크 공초점 시스템만으로도 확장된 초파리 뇌 내 특정 신경 집단의 완전한 영상화에 충분함을 입증했습니다. 공초점 현미경의 일반적인 한계는 짧은 작업 거리입니다. 그러나 파리 뇌가 작고 샘플이 약 2× PBS로 확장되기 때문에, 장거리 수중 침수 목표물은 충분한 침투 깊이를 제공합니다. 정량적 비교를 위해서는 샘플 간 획득 설정을 동일하게 유지해야 하며, 채도가 높은 픽셀을 피하고, 개별 smFISH 펀크타를 분리할 수 있을 만큼 복셀 크기가 적절해야 합니다. 이로 인해 전용 라이트 시트 기기가 없는 실험실에서도 프로토콜 접근성이 확대됩니다.

업데이트된 FlySeg 구현은 이전에 발표된 FlySeg 프레임워크를 기반으로 하며, 이 프로토콜에 두 가지 주요 추가 기능을 도입합니다. 첫째, 구성 가능한 핵 확장 매개변수를 통해 smFISH 지점을 분할된 핵과의 공간적 관계에 따라 핵 또는 세포질 형태로 분류할 수 있습니다. DNase 처리 후 세포질 DAPI 염색은 세포체를 드러내는 확산 신호를 제공하고 신뢰할 수 있는 핵 분절을 지원하여 핵 및 세포질 전사체 풀의 분리를 지원하기 때문에 이 단계에서 중요합니다. 둘째, 자동 이상치 검출은 분절이 잘 안 된 핵을 식별하여 하위 정량화에서 제외할 수 있습니다. 세포형 특이적 유전자 녹다운의 분자적 효과 평가 외에도, 전사체 위치가 지속적인 전사 활동을 반영할 때 핵 및 세포질 전사체를 분리하는 것은 유익할 수 있습니다. 포유류 뇌에서는 활동에 의해 유도된 즉각적인 초기 유전자 전사체가 먼저 핵에 나타나고, mRNA가 처리되고 배출되는 과정에서 세포질에 축적됩니다.³⁹, 이는 catFISH⁴⁰ 의 신경 활성화 시간 분석에 사용되는 원리입니다. 초 파리 뇌에서도 유사한 전사 역학이 일어나는지는 현재 알려지지 않았으나, 원칙적으로 현재의 작업 흐름을 통해 탐구할 수 있습니다. 다른 펄스 체이스 실험에서는 핵과 세포질 지점을 구분하는 것이 전체 전사체 수를 넘어서는 시간적 정보를 제공할 수 있습니다. 동시에, 작업 흐름은 핵 분할에만 국한되지 않고 전체 세포(즉, 막에 의해 정의된) 세포 분할에 적용할 수 있습니다. 현재의 정량적 작업 흐름은 신경세포 소마타에 최적화되어 있으며; 신경필 영역은 영상화가 가능하지만, mRNA 지점을 개별 축삭이나 수상돌기에 정량적으로 할당하려면 추가적인 구획별 분절 전략이 필요합니다. FlySeg는 집단 수준 통계가 필요한 밀집된 신경 집단에서 자동화되고 고처리량 정량화에 가장 유용합니다. 개별적으로 식별 가능한 뉴런이나 수동으로 정의한 구획의 경우, Imaris나 FIJI/ImageJ와 같은 다른 도구가 더 적합할 수 있습니다. 이러한 정량화 전략의 요약과 주요 적용 방법, 장점, 한계는 보충 표 1에 제공되어 있습니다.

일반적인 문제 해결 지점으로는 약한 항체 신호, 높은 smFISH 배경, 겔 손상 또는 샘플 손실, 영상 중 샘플 드리프트, 그리고 부실한 분할 등이 있습니다. 약한 항체 신호는 항체 농도를 추가로 높이거나 1차 및/또는 2차 항체 배큐 기간을 24시간에서 48시간으로 연장함으로써 개선될 수 있습니다. 높은 smFISH 배경은 혼합 후 워시를 연장하고 포화 획득 설정을 피함으로써 종종 줄일 수 있습니다. 젤 손상과 샘플 손실은 넓은 보어 팁을 사용하고, 젤을 직선 절단으로 다듬으며, 챔버 충전 중 기포를 방지하기 위해 통풍 채널을 절단함으로써 최소화됩니다. 영상 촬영 중 샘플 드리프트는 획득 전 최소 1시간 동안 장착된 젤을 평형으로 유지함으로써 줄여집니다; 드리프트가 지속되면 평형을 2시간 이상 연장할 수 있습니다. 세포질 DAPI 염색이 약하거나 샘플 평형이 불완전할 경우 세포-경계 신호가 감소하거나 획득 시 X-Y-Z 이동이 발생할 수 있습니다; FlySeg 매개변수를 조정하기 전에 반드시 확인해야 합니다. 이 프로토콜에서는 젤을 1× PBS 상태로 유지하여 약 2× 등방성 팽창을 이룹니다. 더 높은 공간 해상도가 필요하다면, 희석된 PBS나 탈이온수에서 더 큰 팽창을 달성할 수 있습니다. 반대로, 특정 세포 유형에서 발현의 유무를 평가하는 것만이 목표일 경우, 확장되지 않은 FISH와 면역조직화학을 결합하는 것만으로도 충분할 수 있으며, 이는 보충 그림 1에서 확인할 수 있습니다. 프로토콜은 반복적인 FISH 워크플로우와 호환됩니다. 프로브와 HCR 헤어핀은 DNase 처리로 제거할 수 있어, 동일한 표본 내에서 추가적인 하이브리드화 및 증폭 라운드가 가능합니다. 향후 기술적 확장으로는 더 높은 플렉스 반복 HCR-smFISH, 영상 라운드 전반 자동 등록, 향상된 전체 세포 또는 신경돌 분절, 그리고 실험 간 RNA와 단백질 신호 비교를 위한 보다 표준화된 분석 파이프라인 등이 포함될 수 있습니다. 구획별 세분화 전략의 추가 개발은 신경 체세포를 넘어 축삭과 수상돌기로 정량적 분석을 확장할 수 있습니다. RNA-단백질 읽기, 구획 분해 전사체 정량, 표준 영상 플랫폼과의 호환성이 결합되어 이 워크플로우는 온전한 초파리 뇌의 유전적으로 정의된 뉴런에서 표적 분자 검증 실험에 적합하다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10N 수산화나트륨 용액	피셔 사이언티브	카테고리# SS255-1
1N 수산화나트륨 용액	피셔 사이언티브	카테고리# SS266-1
20X 식염수-나트륨 시트레이트 완충제  그리고 nbsp;	인비트로젠	카테고리# AM9763
4-하이드록시-템포	시그마-올드리치	캣# 176141
5M 염화나트륨 용액	시그마-올드리치	Cat# S5150
아크릴아마이드	시그마-올드리치	카테고리# A9099
아크릴산	시그마-올드리치	카탈로그# 147230
아크릴로일-X, SE	인비트로젠	카탈로그# A20770
어도비 일러스트레이터	어도비	해당 없음
알렉사 플루어 488 염소 안티-치킨 (1:200)	잭슨 면역연구소	캐트#103-545-155, RRID:AB_2337390
Alexa Fluor 568 염소 안티마우스 IgG1 (1:200)	인비트로젠	Cat# A-21124, RRID:AB_2535766
알렉사 플루어 568 염소 안티-래빗 IgG1 (1:200)	인비트로젠	Cat# A-11011, RRID:AB_143157
과황산암모늄	시그마-올드리치	카탈로그# A3678
무수성 DMSO	시그마-올드리치	Cat# 900645-4X2ML
본딕 UV 경화 접착제	본딕	본딕 스타터 키트
셀센스 이미징 소프트웨어 v4.4.1	명백한 과학	해당 없음
치킨 폴리클론 항GFP (1:400)	앱캠	Cat# ab13970, RRID:AB_300798
콘다 (환경 관리자)	아나콘다 주식회사	해당 없음
코닝&트레이드; 서리가 낀 현미경 슬라이드	코닝	카탈로그# 2948-75X25
맞춤 설계된 LS7 샘플 홀더	자넬리아 테크	ID 2021-021
다피	시그마-올드리치	카테고리# D9542
일회용 스테인리스 멸균 메스	메드프라이드	MPR-47101
에틸렌디아미네테트라아세트산	시그마-올드리치	Cat# EDS-100G
피지(ImageJ) 이미지 분석 소프트웨어 v2.14.0	ImageJ 컨소시엄	해당 없음
FlySeg (커스텀 파이프라인)	https://github.com/avaccari/DrosophilaFISH	해당 없음
GAF 고정액 및 nbsp;	애닥스 바이오사이언스	카테고리# VI25
GenClone® 24개의 웰 세포 배양 플레이트, 처리되지 않은 상태	제네시 사이언티브	카탈로그# 25-102
GMR-86D05-Gal4 (LC4)	블루밍턴 가축 센터	#41315
염소 혈청 기증자 무리와 nbsp;	시그마-올드리치	카테고리# G6767
HCR™ RNA-FISH(v3.0) 증폭기 버퍼	분자 기기	해당 없음
HCR™ RNA-FISH(v3.0) 증폭기: AF546, JF669	분자 기기	해당 없음
HCR™ RNA-FISH(v3.0) 프로브 하이브리다이제이션 버퍼	분자 기기	해당 없음
HCR™ RNA-FISH(v3.0) 프로브 워시 버퍼	분자 기기	해당 없음
HCR™ RNA-FISH(v3.0) ShakB 프로브	분자 기기	해당 없음
이마리스 10.1	옥스퍼드 인스트루먼트	해당 없음
IXPlore IX85 SpinSR 회전 디스크 공초점 현미경	명백한 과학	해당 없음
LS7 라이트 시트 현미경	칼 자이스와 nbsp;	해당 없음
멜팔란  그리고 nbsp;	케이맨 케미컬	카탈로그# 16665
MOPS 버퍼	피셔 사이언티브	Cat# BP308-100
마우스 단클론 안티-V5 (SV5-PK1) (1:100)	앱캠	Cat# ab27671, RRID:AB_471093
N,N,N',N'-테트라메틸레틸렌디아민 	시그마-올드리치	카테고리# T7024
N,N'-메틸렌비사크릴아마이드	시그마-올드리치	Cat# M7279
나파리	오픈 소스 커뮤니티	해당 없음
NIS-엘리츠 고급 연구 영상 소프트웨어	니콘 코퍼레이션	해당 없음
뉴클레아제 없는 물	치아겐	캣# 129114
Nunc™ Nunclon과 trade와 함께하는 미니트레이; 델타 표면 및 nbsp;	인비트로젠	캣# 163118
PBS (10X), pH 7.4 & nbsp;	깁코	캣# 70011044
포토플로 세제	전자현미경 과학	카탈로그# 74257
폴리-L-라이신 용액	테드 펠라와 nbsp;	카탈로그# 18026
정밀 덮개 안경, #1.5H 두께	토를랩	캣# CG15CH2
프레스-투-씰 & 트레이드; 접착제가 있는 실리콘 아이솔레이터, 1개의 웰, 직경 20mm, 깊이 0.5mm	인비트로젠	카테고리# P24740
단백질분해효소 K	뉴잉글랜드  생물학 실험실	카테고리# P8107S
래빗 안티샥B (1:400)	조르드 암머의 선물	해당 없음
RNase AWAY™ 표면 오염 제거	인비트로젠	카탈로그#7002
RNase-Free DNase 세트	키아겐	카탈로그#79256
슈나이더' 초파리 미디어	깁코	캣# 21720001
shakB-KDRT-stop-KDRT-smGdP-V5;;	Frighetto 외, 2025	PMID: 41278920
나트륨 아지드	시그마-올드리치	Cat# S8032
스테미 508 입체 현미경	칼 자이스	해당 없음
SYTO™ 41 파란색 형광 핵산 염색	인비트로젠	카탈로그# S11352
Ti2E AXR NSPARC 레이저 주사 공초점 현미경	니콘 코퍼레이션	해당 없음
트리스 베이스와 nbsp;	피셔 사이언티픽	Cat# BP152-500
트리톤과 트레이드; X-100	시그마-올드리치	카탈로그# T8787
UAS-GFP-2A-KDR;	산필리포 외, 2024	PMID: 38262414
UAS-his2A-GFP;	돔브로브스키 외, 2025	PMID: 40468081
UAS-m체리 RNAi	블루밍턴 가축 센터	#35785
UAS-myr::GFP;	블루밍턴 가축 센터	#32198
UAS-shakB RNAI	Ammer 외, 2022	PMID: 35385694
울트라퓨어&트레이드; 1M 트리스-HCI, pH 8.0 & nbsp;	인비트로젠	캣# 15568025
VT042336-Gal4 (거대 섬유)	돔브로브스키 외, 2025	PMID: 40468081
젠 블랙 3.1	칼 자이스와 nbsp;	해당 없음