본 연구는 네트워크 약리학, 분자 도킹, 쥐 꼬리디스크 천자 모델을 사용하여 Yi Qi Huo Xue Decoction이 요추 디스크 퇴행에 미치는 잠재적 전임상 효과를 조사했으며, 특히 AKT1, BCL2, STAT3 등 후보 표적과 PI3K-AKT 신호 전달과 같은 경로에 중점을 두었습니다.
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본 연구는 네트워크 약리학, 분자 도킹, 쥐 꼬리디스크 천자 모델을 사용하여 Yi Qi Huo Xue Decoction이 요추 디스크 퇴행에 미치는 잠재적 전임상 효과를 조사했으며, 특히 AKT1, BCL2, STAT3 등 후보 표적과 PI3K-AKT 신호 전달과 같은 경로에 중점을 두었습니다.
본 연구에서는 네트워크 약리학, 분자 도킹, 분자 역학 시뮬레이션 및 실험적 검증을 활용하여 요추 디스크 퇴행(LDD)에서 Yi Qi Huo Xue Decoction(YQHXD)의 약리학적 기초와 잠재적 분자 메커니즘을 조사하였습니다. 총 678개의 활성 화합물 관련 표적과 296개의 잠재적 LDD 관련 치료 표적이 확인되었습니다. 단백질-단백질 상호작용 네트워크 분석 및 위상학적 분석을 통해 AKT1, IL6, TNF, BCL2, STAT3 등 여러 후보 표적이 확인되었습니다. 유전자 온톨로지와 교토 유전자 및 유전체 백과사전을 이용한 풍부화 분석 결과, 후보 표적은 단백질 결합과 ATP 결합 등 기능과 연관되어 있으며, 경로 풍부화에는 PI3K-AKT 신호전달이 포함되었습니다. 분자 도킹은 쿼세틴, 테트라뉴린 A, 이소르함네틴과 같은 선택된 활성 화합물과 핵심 표적 간의 상호작용을 예측했습니다. 분자 동역학 시뮬레이션은 또한 가장 낮은 에너지 복합체들이 안정적으로 유지되고 있음을 시사했다. 70마리의 수컷 스프래그-도울리 쥐가 무작위로 대조군, 가짜 수술군, 모델군, 양성 대조군, 그리고 저용량, 중용량, 고용량 YQHXD 그룹에 배정되었습니다. 모델, 양성 대조군, YQHXD 그룹에서 꼬리추간판 천자 모델이 확립된 후, 쥐들은 경구 관개로 YQHXD 또는 셀레코식스를 8주간 투여받았으며, 대조군과 가짜 수술군은 정상식염수를 투여하였다. 조직병리학적 평가는 이 모델에서 YQHXD 치료가 추간판 퇴행성 감소와 연관되어 있음을 보여주었습니다. 효소 결합 면역흡착 분석법, 중합효소 연쇄반응, 웨스턴 블롯 분석 결과, AKT1, BCL2, STAT3 등 선정된 표적의 mRNA 및 단백질 발현 수준에 변화가 관찰되었습니다. 이 결과는 YQHXD가 염증 및 세포자사멸사 관련 기전을 포함하는 다구성 요소 및 다중 표적 조절을 통해 LDD에서 전임상 보호 효과를 발휘할 수 있음을 시사합니다. 본 연구는 LDD에 대한 YQHXD의 추가 연구를 뒷받침하는 예비 전임상 증거를 제공합니다.
요추 디스크 퇴행(LDD)은 늦게 발병하고, 치료가 어렵고, 재발률이 높으며, 장애가 특징인 흔한 연령 관련 정형외과 질환입니다. LDD는 추간판(IVD) 내 세포외기질(ECM)의 이화작용과 동화대사 대사 불균형과 관련된 퇴행성 병리학적 변화를 포함하며, 요통과 밀접한 관련이 있습니다1. 역학 연구에 따르면 LBP는 임상 실무에서 장애의 주요 원인 중 하나임을 보여줍니다.
1990년부터 2017년까지 전 세계 확진자 수는 4,250만 건에서 6,490만 건으로 증가했으며, 이는 일상생활에 영향을 미치고 상당한 사회적·경제적 부담을 가했다. 따라서 LDD의 효과적인 치료는 임상적으로 여전히 중요합니다. 임상 실무에서는 LDD가 보존적 또는 수술적 증상 치료를 통해 관리되며, 이는 증상을 완화할 수 있지만 일반적으로 추간판 퇴행(IVDD)을 되돌리지는 못합니다. 보존적 치료에 흔히 사용되는 경구용 비스테로이드 소염제는 신장, 위장관, 심혈관 부작용과 연관될 수 있습니다.
전통 중의학(TCM)은 오랫동안질병 관리에 사용되어 왔습니다. 허브 화합물과 개별 성분은 IVDD 진행을 지연시키고 조직 재생을 촉진하는 것으로 보고되었습니다5. 임상 실무에서는 퇴행성 골 및 관절 질환에 대한 보존적 관리 전략의 일부로도 TCM 조제법이 사용됩니다. 쑤저우 지역의 우 가문 의과대학은 요추 경박장애 치료에 필수 처방으로 이기화설(YQHXD)을 사용했으며; 그러나 LDD에서의 잠재적 역할을 명확히 하기 위해서는 추가적인 기전적 증거가 필요합니다.
이전 연구들은 YQHXD가 세포 자가포식을 촉진하고 노화 항전 효과를 발휘함으로써 IVDD를 지연시킬 수 있음을 시사했습니다 6,7. 그러나 YQHXD가 LDD에 영향을 미칠 약리학적 기전은 여전히 명확하지 않으며, 그 작용 기전에 대한 체계적인 분석도 아직 이루어지지 않았습니다. 본 연구에서는 네트워크 약리학을 사용하여 YQHXD의 다성분 및 다중 표적 특성을 LDD와 관련하여 분석하였습니다. 분자 도킹을 통해 화합물과 표적 단백질 간 상호작용을 평가하고, 이후 분자 역학 시뮬레이션이 진행되었습니다. 이 예측들은 이후 쥐 꼬리디스크 천공 모델을 사용하여 LDD8에서 YQHXD의 잠재적 기전을 조사하였습니다. 그림 1에서 보듯, 본 연구는 YQHXD가 AKT1, BCL2, STAT3와 같은 유전자 및 단백질을 조절함으로써 LDD 관련 과정에 영향을 미칠 수 있다는 전임상 증거를 제공하며, PI3K-Akt 신호전달 및 기타 질병 관련 경로 범주의 경로 풍부화를 포함합니다.
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모든 실험은 난징 중의대학 기관심의위원회(프로토콜 코드: 202501A018)의 승인을 받았으며, 국립보건원(NIH) 실험동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 실험 절차는 ARRIVE 지침을 준수했습니다.
실험 약물
YQHXD 샘플 용액에는 Astragalus membranaceus 뿌리 20g, Angelica sinensis 뿌리 20g, Ligusticum chuanxiong rhizome 15g, Stephania tetrandra 뿌리 6g, Chaenomeles speciosa 과일 15g, Sinapis alba 성숙 씨앗 10g이 포함되어 있었으며, 처방전당 총 원시 중량은 86g이었습니다. 모든 한방 재료는 광서 중의학대학교 산하 루이캉병원 약학과에서 2020년판 중국 약전에 따라 인증되었습니다. YQHXD 샘플 용액은 물 조제법으로 제조되었습니다. 총 원료 부피의 8배에 달하는 멸균 증류수를 넣고, 허브를 30분간 담가 완전히 잠겼다. 혼합물을 끓여 약한 불에서 30분간 가열한 후 여과했습니다. 잔류물은 같은 양의 멸균 증류수로 같은 절차를 따라 다시 추출되었다. 두 추출에서 나온 여과액을 결합하여 저압 회전 증발을 이용해 55.5mL로 농축하여 YQHXD 정액을 얻었습니다. 총 원약 중량을 기준으로 최종 원약 농도는 1.55 g/mL였으며, 추출 효율은 약 64.5%였습니다. 실험용 쥐에게 투여된 용량은 임상 성체 용량에서 체표면적 정규화 방법을 사용해 변환하였습니다. 인간과 쥐 간의 변환 계수는 약 6.3이었으며; 따라서 쥐 용량(mg/kg)은 인간 용량(mg/kg) × 6.3으로 계산되었습니다. 고용량 그룹은 기준 용량으로 15.48 g/kg/day를 받았고, 중간 및 저용량 그룹은 각각 7.74 g/kg/day와 3.87 g/kg/kg/일의 용량을 받았습니다. 10 mL/kg의 가베지 부피에 대해, 고용량군은 각각 1.548, 0.774, 저용량군의 작업 농도는 0.387 g/mL였습니다. 각 실험군의 목표 용량을 달성하기 위해 스톡 용액은 투여 전에 적절히 희석되었습니다. 준비 후 증제물을 냉각하고 멸균 조건에서 분리한 후 −40 °C에서 보관하다가 사용했습니다.
네트워크 약리학 분석
활성 성분 표적 단백질의 예측
2025년 11월 24일, TCMSP 데이터베이스에서 "황기(Huangqi), 안젤리카(Angelica), 천슝(Chuanxiong), 스테파니아(Stephania), 무과(Mugua), 제지(Jiezi)"라는 검색어를 사용해 활성 화합물을 검색했습니다. 조합물은 경구 생체이용률(OB ≥ 30%)과 약물 유사성(DL ≥ 0.18)9를 기준으로 선별되었습니다. 이 임계값의 근거는 다음과 같습니다: TCMSP 데이터베이스는 PubChem, ChEMBL, ChemSpider와 같은 권위 있는 출처의 화합물 데이터를 통합하고, 구강 생체이용률을 포함한 ADME 관련 매개변수를 제공합니다. 경구 생체이용률은 경구 투여 용량 중 전신 순환에 변함없이 도달하는 비율을 의미하며, 높은 OB는 생체 활성 분자를 식별하는 데 필수적입니다. 약물 유사성은 화합물의 약물 가능성을 평가하고 용해도와 안정성을 예측하는 데 사용되는 지표입니다. 본 연구에서는 데이터베이스 권장값(≥20%)을 초과하는 보다 엄격한 OB 임계값(≥30%)을 적용하여 경구 흡수 및 약동학 프로필이 유리한 후보 화합물을 식별하였습니다. 한편, DL은 화합물의 약물 유사 잠재력을 추정하는 데 사용되었고, 전통 중국 의학 화합물에서 관찰된 평균 DL 값을 바탕으로 DL ≥ 0.18의 컷오프를 채택하였습니다. 선택된 활성 화합물은 PubChem 데이터베이스에서 SMILES 형식으로 검색되어 SwissTargetPrediction 데이터베이스에 가져와 표적 예측을 위해 Homo sapiens로 지정했습니다. 표적 단백질은 공식 유전자 기호를 사용하여 표준화되었고, 예측 신뢰성을 높이기 위해 확률 값이 0인 표적만 유지되었습니다. 예측 표적이 없는 화합물은 후속 네트워크 분석에서 제외하였다. 모든 타겟을 병합한 후, 스프레드시트 소프트웨어를 사용해 중복 항목을 제거하여 각 타겟이 최종 데이터셋에서 한 번만 표현되도록 했습니다.
주요 목표 수집
질병 관련 유전자는 GeneCards10, OMIM11, TTD12 데이터베이스에서 "요추 디스크 변행"이라는 키워드를 사용해 수집했습니다. 수집된 유전자 표적들은 병합되었고, 중복된 항목을 제거하여 최종 질병 관련 표적 세트를 얻었습니다.
LDD 치료를 위한 YQHXD의 잠재적 표적
Venny 2.1.0 플랫폼을 사용하여 LDD에서 YQHXD의 잠재적 타깃을 결정했습니다. 그 후 활성 성분과 예측된 표적 간의 연관성을 보여주는 네트워크를 생성했습니다. 코어 활성 부품은 네트워크 내 차수 값에 따라 선택되었습니다.
약물 성분 및 질병 교차 표적의 네트워크 구축
TCM 공식 YQHXD의 활성 성분, 표적 단백질, LDD 관련 유전자가 Cytoscape 소프트웨어13 에 도입되어 약물-성분-표적-질병 네트워크 다이어그램을 구성했습니다.
PPI 네트워크 구축 및 핵심 목표물 식별
교차하는 표적들은 STRING 플랫폼14 에 제출되어 분석되었으며, 생물체는 호모 사피엔스로 설정되었습니다. 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 구축하기 위해 상호작용 점수 임계값을 >0.4로 설정하고, 분리된 노드는 숨기고, 다른 모든 설정은 기본값으로 유지했습니다. 생성된 데이터는 소프트웨어로 가져와, NetworkAnalyzer 도구를 사용해 위상 특성을 평가하고 노드 차수를 계산했습니다. 등급별로 상위 5개 노드가 주요 허브 목표로 식별되었습니다.
핵심 타겟의 농축 분석
교차하는 표적은 DAVID 데이터베이스15 에 업로드되어 유전자 온톨로지(GO) 기능 주석과 교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG) 경로 풍부화 분석을 수행하였습니다. 생물체 배경은 호모 사피엔스(Homo sapiens)로 설정되었으며, 농축 컷오프는 기본 DAVID 매개변수에 따라 정의되었으며, 여기에는 EASE 임계값 <0.1과 Count 임계값 ≥ 2가 포함됩니다. 유전자 우주는 DAVID가 제공한 기본 전유전체 배경을 기반으로 했습니다. 벤자미니-호흐버그 방법을 사용하여 거짓 발견률(FDR)을 조절하기 위해 다중 검사를 보정하였고, 이를 바탕으로 DAVID 결과가 조정되었습니다. 풍부 경로는 카운트 값에 따라 내림차순으로 정렬되었습니다. GO와 KEGG 농축 바 그래프는 온라인 생물정보학 플랫폼을 사용하여 제작되었습니다.
분자 도킹
YQHXD의 주요 활성 성분과 LDD의 핵심 표적 간 상호작용을 예측하기 위해 분자 도킹 분석을 수행했습니다. 네트워크 위상 단계 값과 표적 관련성에 따라 상위 5개의 주요 활성 화합물이 리간드로 선정되었고, 해당 핵심 표적 단백질이 수용체로 사용되었습니다. PubChem에서 리간드 SDF 파일을 가져왔고, 표적 단백질의 3차원 구조는 단백질 데이터 뱅크(PDB)에서 다운로드되었습니다. 도킹 분석은 CB-Dock2 플랫폼의 완전 자동화 블라인드 도킹 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다. 단백질 구조를 업로드한 후, 플랫폼은 소분자, 이온, 물 분자를 포함한 이형원자를 자동으로 제거하고, 결손된 원자와 수소 원자를 수리했습니다. 자동 블라인드 도킹 모드가 사용되었습니다. 이 모드에서 CB-Dock2는 곡률 기반 공동(cavity detection algorithm)으로 잠재적인 단백질-표면 결합 주머니를 식별한 후, 통합 AutoDock Vina 엔진16을 사용해 도킹 계산을 수행합니다. 도킹 과정에서 단백질은 강체 구조로 취급되었고, 리간드는 유연하게 간주되었으며, 모든 도킹 매개변수는 플랫폼 기본값으로 설정되었습니다. 도킹 결과는 CB-Dock217에 내장된 도구를 사용하여 3차원 시각화 및 상호작용 분석을 수행했으며, 결합 에너지를 계산하여 활성 화합물과 표적 단백질 간의 예측된 결합 친화도를 추정하였습니다.
분자 역학 시뮬레이션
GROMACS 2022.2를 사용하여 표적 단백질-리간드 복합체에 대한 분자 동역학 시뮬레이션이 수행되었습니다. 단백질은 Amber14SB 힘장으로 모델링되었고, 용매 시스템은 TIP3P 물 모델로 표현되었습니다. 리간드 원자 전하는 Antechamber에서 구현된 AM1-BCC 방법으로 계산한 후 GAFF2 원자 유형을 할당했습니다. 결과된 토폴로지 파일들은 ACPYPE를 사용해 GROMACS(GROMACS) 호환 형식으로 변환되었습니다. TIP3P 물 모델과 일치하는 이온 매개변수는 Joung-Cheatham 매개변수 집합을 기반으로 할당되었습니다. 시작 복합체는 단백질 표면과 박스 가장자리 사이에 최소 1.2nm 간격을 둔 절단된 12면체 시뮬레이션 박스에 배치되었습니다. TIP3P 물 분자를 첨가하여 시스템을 용해화하고, Na+ 및 Cl− 이온을 도입해 시스템 전하를 중화시키고 이온 강도를 0.15 M로 설정했습니다. 최대 힘이 1,000 kJ·mol−1·nm−1 미만이 될 때까지 가장 가파른 하강 알고리즘으로 에너지 최소화가 수행되었습니다. 시스템은 이후 NVT 앙상블 하에서 298 K와 1 bar에서 100 ps의 평형을 맞췄습니다. 평형 이후에는 2 fs 시간 단계로 NPT 앙상블 하에서 100 ns 생산 시뮬레이션이 실행되었습니다. 비결합 상호작용은 Verlet 컷오프 스킴으로 처리되었습니다. 정전기 상호작용은 입자 메쉬 에발트(PME) 방법으로 계산되었으며, 반데르발스와 쿨롱 상호작용 모두에 대해 1.2 nm 컷오프가 사용되었습니다. 수소 함유 결합은 LINCS 알고리즘으로 제약되었습니다. 온도는 Nosé-Hoover 온도조절기로, 압력은 Parrinello-Rahman 기압기로 조절되어 시스템을 298 K와 1 bar로 유지했습니다. 탄도는 10ps마다 저장되었습니다. 구조 역학과 분자 간 상호작용은 내장된 GROMACS 도구, VMD, PyMOL을 사용하여 분석되었습니다. 결합 자유 에너지는 적용 가능한 gmx_MMPBSA로 추정되었습니다.
동물 연구
가축 사육
3주에서 8주 사이의 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐 70마리를 컴퓨터 생성 난수를 사용해 7개의 실험군(n=10명)에 무작위로 배정하여, 그룹 간 기저체중 차이가 통계적으로 유의하지 않았다. 모든 동물은 통제된 조건(22± 1°C, 55도 ± 10% 상대습도, 12시간 빛/암 주기)에서 사육되었으며, 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 환경 편향을 최소화하기 위해 케이지 위치는 각 케이지 교체마다 무작위로 조정되었습니다. 적응 후 1주일 후, 모델 그룹의 쥐들은 퇴행을 유도하기 위해 꼬리 IVD 천자를 받았습니다. 통증 완화를 위해 수술 전 부피바카인을 이용한 국소 침윤 마취가 시행되었습니다. 동물들은 수술 중과 수술 후 회복 기간 내내 면밀히 관찰되었습니다. 수술 후 관찰에는 회복 시간, 자발적 활동 회복, 음식과 물 섭취, 체중 변화가 포함되었습니다. 모델 구축 1주일 후, 각 그룹에서 무작위로 2마리의 쥐를 선정하여 수술 후 디지털 방사선 촬영(DR) 영상 촬영과 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색을 실시하였습니다. 방사선 검사에서는 꼬리 IVD 높이가 감소하는 것으로 나타났고, HE 염색 검사에서는 실추핵(NP) 척삭세포가 현저히 감소하고 섬유성 층층 구조18의 체계 붕괴가 나타나 모델 확립에 성공했다는 사실을 확인하였다. 수술 8주 후, 쥐들은 이소플루란 과다복용을 흡입해 안락사되었고, 꼬리 조직과 혈액 샘플이 채취되었다. 예비 검증 후, 각 그룹당 사전 정의된 품질 기준을 충족하는 독립 샘플 3개를 최종 조직학, ELISA, PCR 및 웨스턴 블롯 분석에 사용하였습니다. 조직학적 절편은 단일맹검 조건에서 평가되었으며, 슬라이드에는 동물 식별 번호만이 표시되었습니다. ELISA, PCR, 웨스턴 블롯 분석법의 경우, 샘플 알리쿼트 및 라벨링 시 블라인드 코딩이 적용되었고, 모든 샘플의 검사 순서는 실험 전에 무작위로 지정되었습니다. 흡수도값, Ct 값, 밴드 강도 등 원시 데이터는 실험적 그룹화나 표본 처리에 관여하지 않는 통계학자가 그룹 식별으로 해독한 후 통계 담당자에 의해 분석되었습니다. 모든 통계 분석은 실험 그룹화나 표본 처리에 관여하지 않은 통계학자들이 수행하였습니다. 상처 감염, 열개, 출혈, 심한 무기력 등 모든 부작용은 즉시 기록 및 평가하였습니다. 경미한 상태는 강화된 지지 치료를 통해 면밀히 모니터링되었습니다. 쥐가 기준치의 20% 이상으로 체중 감소, 진통제로 완화되지 않은 심한 통증, 운동성 상실, 음식이나 물 접근이 불가능, 감염, 괴사, 기타 중증 수술 후 합병증, 호흡 곤란 또는 생명을 위협하는 상태가 나타난 경우에는 인도적 평가 기준을 적용하였다. 이런 경우에는 동물들이 아이소플루란 과다복용을 흡입해 인도적으로 안락사되었다.
실험적 모델링
쥐들은 흡입한 이소플루란으로 마취하고 엎드린 자세로 배치되었습니다. Co6/7, Co7/8, Co8/9 꼬리 IVD는 X선 형광투시 유도 하에 위치했습니다. 21G 바늘을 IVD 안쪽으로 수직으로 밀어 넣어 피부 반대편에 도달한 후 바늘 끝을 꼬리 중앙 쪽으로 당겼습니다. 두 번째 니드는 위치 기준 역할을 했습니다. 지속적인 IVD 퇴행을 유도하기 위해 바늘을 360° 회전시키고 30초 동안 제자리에 둔 후 제거했습니다. 샴 그룹에서는 피부와 근육을 관통한 천자 깊이가 약 2mm였으며, IVD는 손상되지 않았습니다. 다른 그룹에서는 바늘을 IVD 중앙 쪽으로 5mm 삽입하여 혈관을 피했습니다. 삽입 후 바늘을 360° 회전시키고 30초간 그대로 두었습니다. 천공 부위는 소독되고 표시되었으며, 멸균 거즈로 보호되었습니다. 모델링 일주일 후, 꼬리척추 X선 영상에서 IVD 높이가 감소한 것이 확인되었습니다. HE 염색 결과 NP 척삭세포가 유의미하게 감소하고 환상 층상 구조가 무질서해져 모델 확립에 성공했다는 사실이 확인되었습니다. 성공적인 모델링 후, 한의학 치료를 받은 그룹과 양성 대조군(PC) 그룹은 인간과 쥐 간의 체표면적 비율을 기준으로 적절한 용량을 투여받았습니다.
그룹화 및 개입
총 70마리의 수컷 SD 쥐(3주에서 8주 사이의 수컷 SD 쥐)가 이 실험에 사용되었으며 7개 그룹으로 나뉘었습니다:
(1) 대조군 (Ctrl): 이 그룹의 쥐들은 실험군과 같은 시기와 조건에서 무작위로 배정되었습니다. 이들은 SPF 수준의 동물 시설 내 개별 우리에 수용되었으며, 표준 식사와 식수를 무료로 이용할 수 있었습니다.
(2) 샴 그룹: 쥐들은 이소플루란 흡입으로 마취되었다. 마취가 확립된 후, 꼬리 피부를 포비돈-요오드로 소독하고 쥐를 엎드린 자세로 배치했습니다. Co6/7과 Co7/8 IVD는 X선 형광투시 유도 하에 위치했습니다. 바늘은 피부와 근육을 약 2mm 더 통과했지만 IVD는 손상되지 않았습니다. 증류수(10 mL/kg)는 8주 동안 하루 한 번 가베지로 투여되었습니다.
(3) 모델 그룹: 쥐들은 흡입된 이소플루란으로 마취되었다. 마취가 확립된 후, 꼬리 피부를 포비돈-요오드로 소독하고 쥐를 엎드린 자세로 배치했습니다. X선 형광투시 유도 하에서 Co6/7, Co7/8, Co8/9 IVD가 발견되었습니다. 21G 바늘을 IVD 안으로 수직으로 밀어 피부 반대편에 도달한 후, 바늘 끝을 꼬리 중앙 쪽으로 당겼습니다.
두 번째 바늘이 위치 기준으로 사용되었습니다. 바늘은 360° 회전시키고 30초간 고정되어 IVD의 지속적인 퇴행을 유도한 후 제거했습니다. 증류수(10 mL/kg)는 8주 동안 매일 갭주(gavage)로 투여되었으며, 수술 후 쥐들의 회복 상황을 면밀히 관찰했습니다.
(4) PC 그룹: 양성 대조군은 모델 그룹과 동일한 모델링 절차를 받았고, 이후 0.5% 카복시메틸셀룰로오스(CMC-Na) 용액으로 현탁된 셀레콕시브(20 mg/kg/day) 경구 투여를 8주 연속으로 받았으며, 체중 무게 10 mL의 가베지 부피를 사용하였다.
(5) YQHXD 저용량군 [YQHXD(L)]: 모델링은 모델 그룹과 동일하게 수행되었습니다. 쥐들은 8주간 개비지로 하루 3.87 g/kg의 YQHXD를 받았으며, 개베지 용량은 10 mL, 작동 농도는 0.387 g/mL였습니다.
(6) YQHXD 중용량군 [YQHXD(M)]: 모델링은 모델 그룹과 동일하게 수행되었습니다. 쥐들은 8주간 하루 7.74 g/kg의 YQHXD를 가베지로 받았으며, 가베지 부피는 10 mL, 작동 농도는 0.774 g/mL였습니다.
(7) YQHXD 고용량군 [YQHXD(H)]: 모델링은 모델 그룹과 동일하게 수행되었습니다. 쥐들은 8주간 하루 15.48 g/kg의 YQHXD를 투여받았으며, 개베지 부피는 10 mL/kg, 작동 농도는 1.548 g/mL였습니다.
병리학적 변화
쥐의 꼬리 IVD 조직을 외과적으로 분리하여 IVD와 주변 근육 조직의 변화가 관찰되었습니다. 수집된 조직은 병리학적 절편으로 처리되었으며, 표본은 형태학적 관찰을 위해 종방향 절편으로 준비되었습니다. 포름알데히드에 96시간 고정된 후, 탈석화 용액을 사용해 빠르게 탈석화하고, 등급별 알코올 시리즈를 통해 탈수한 후 자일렌으로 정화하였습니다. 파라핀에 삽입한 후 5 μm 파라핀 절면을 준비했습니다. 자일렌으로 탈파라핀화하고 일련의 알코올 구배를 통한 탈수 과정을 거친 후, 절편들은 헤마톡실린과 에오신으로 염색되었다. 그 후 탈수되어 정리되어 장착되었습니다. 샘플들은 광학 현미경으로 관찰되어 그룹 전반에 걸친 꼬리 IVD 구조의 형태학적 변화를 조사하였습니다. 이후 매송의 트리크롬 스테인이 시행되었습니다. 절편들은 각각 3분간 칼륨 디크롬산염 용액과 헤마톡실린으로 순차적으로 염색한 후, 산성 에탄올로 분화한 후 10분간 피크로시리우스 레드로 염색하였습니다. 인산화 처리를 10분간 사용한 후, 절편을 5분간 톨루이딘 블루로 염색하였습니다. 탈수 후에는 절편을 자일렌으로 제거하고 부착한 후 현미경으로 관찰하여 꼬리 IVD 변화를 관찰하였습니다.
혈청 표적 단백질의 ELISA 검출
수술 8주 후, 쥐들은 흡입된 이소플루란으로 마취하고 복부 대동맥 혈액을 채취했다. 말초 혈액 샘플은 상온에서 1시간 보관한 후 1,400 × g 에서 10분간 원심분리되었습니다. 세럼은 분리되어 −80°C에서 보관되어 사용되었다. 혈청 AKT1, STAT3, Bcl-2 수치는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 통해 정량화하였습니다. 분석은 제조사 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 흡광도는 450 nm에서 측정되었고, 농도는 표준 곡선에서 측정되었습니다. AKT1, STAT3, BCL-2의 검출 범위는 각각 0.625–40 ng/mL, 31.25–1000 pg/mL, 0.16–10 ng/mL였으며, 감도는 0.1 ng/mL, 10 pg/mL, 0.1 ng/mL였습니다. 모든 혈청 샘플은 희석 없이 분석되었으며, 모든 결과는 해당 표준 곡선 범위 내에 속했습니다. 모든 샘플과 표준체를 중복 분석하였고, 혈청 부피가 균등한 상태에서 정규화가 수행되었습니다.
유전자 발현 수준의 PCR 검출
쥐의 후미척추에서 척추간판 조직을 제거하였으며, 각 샘플에서 약 20mg을 채취하였습니다. 조직은 액체 질소로 분쇄된 후 500 μL 비효소 용해 완충제에 15분간 용해되었습니다. 총 RNA를 추출하여 그 농도와 순도를 분광광도계로 측정했습니다. A260/A280 값이 1.8–2.0인 샘플을 분석용으로 채택했으며, RNA 농도는 500 ng/μL로 조정되었습니다. 역전사는 제조사 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 실시간 PCR 시스템에서 Akt1, Bcl-2, Stat3 mRNA 발현을 측정하기 위해 정량적 PCR(qPCR)을 수행하였습니다. 프라이머 서열은 표 1에 제공되어 있습니다. PCR 프로그램은 95°C에서 30초간 초기 변성, 이어서 95°C에서 5초, 60°C에서 30초간 40회 과정을 거치는 것으로 구성되었습니다. 증폭 후 제품 특이성을 검증하기 위해 용융곡선 분석이 수행되었습니다. Gapdh 가 기준 유전자로 사용되었고, 모든 샘플은 3배로 분석되었습니다. 프라이머 증폭 효율은 90%에서 110%였다. 상대 유전자 발현은 2−ΔΔCt 방법으로 계산되었습니다.
단백질 발현 수준을 위한 웨스턴 블롯팅
총 단백질은 각 그룹의 쥐 꼬리 추간판 조직에서 분리하였다. 조직은 프로테아제 억제제를 보충한 RIPA 버퍼 내에서 용해되었습니다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트를 사용해 측정하고 2 μg/μL로 조정하였다. 동일한 양(샘플당 15 μg)을 10% SDS-PAG로 분리한 후, 습식 전달 시스템을 사용해 300 mA의 일정 전류로 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막에 90분간 전달했다. 그 후 막을 5% 무지방 우유로 실온에서 1시간 동안 차단하고, 4°C에서 AKT1(1:5,000), STAT3(1:6,000), Bcl-2(1:1,500), β-액틴(1:4,000)에 대한 1차 항체와 함께 하룻밤 배양했습니다. TBST 세척 후, 막은 고추냉이 과산화효소(HRP) 결합된 2차 항체와 1:5,000 희석된 상태로 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 단백질 밴드는 증강 화학발광(ECL) 시약을 사용해 검출되었고, 동일한 노출 조건에서 젤 이미징 시스템으로 이미지를 획득하였습니다. 밴드 강도는 ImageJ를 사용해 측정하고 β-액틴으로 정규화하여 상대적 단백질 발현을 결정하였습니다. 각 실험은 독립적으로 3회로 수행되었으며, 각 샘플은 서로 다른 동물로부터 채취되었습니다.
통계
결과는 평균 ± 표준편차(SD)로 표현됩니다. 그룹 간 차이는 일방향 분산 분석(ANOVA)으로 평가한 후 사후 검사(LSD)로 평가하였습니다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 정의되었습니다.
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연구에서 도출된 결론
이 연구는 네트워크 약리학, 분자 도킹, 분자 역학 시뮬레이션, 생체 내 실험을 통합하여 YQHXD가 LDD에 대해 가질 수 있는 잠재적 보호 효과를 조사하였습니다. 결과는 YQHXD가 적어도 부분적으로 AKT1/STAT3/BCL-2 신호축 조절을 통해 작용할 수 있음을 시사하며, STAT3 발현 감소와 AKT1 및 Bcl-2 발현 증가가 특징입니다. 조직학 및 분자 분석 결과, YQHXD 치료가 쥐 꼬리디스크 천공 모델에서 수핵 무결성, 섬유 구조, 세포외 기질 조직 개선과 연관되어 있음이 나타났습니다. 분자 역학 시뮬레이션은 TNF와 테트라뉴린 A 간의 안정적인 예측 상호작용을 지지하며, 잠재적 활성 화합물-표적 상호작용에 대한 구조적 증거를 제공했습니다. 종합적으로 이 결과들은 YQHXD가 다성분 및 다중 표적 조절 메커니즘을 통해 LDD 진행을 지연시킬 수 있음을 시사합니다.
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전통 한약은 항염증, 진통, 혈액순환촉진 등 약리학적 효과를 발휘하는 것으로 보고되었습니다. 이전 연구들은 YQHXD의 전구체인 샤오수이 화허 조제가 질핵(NP) 흡수와 IVD 흡수에 영향을 줌 심 IVD 탈출증 흡수를 촉진할 수 있음을 시사했다. 그러나 그 근본적인 분자 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다. 본 연구에서는 네트워크 약리학을 사용하여 LDD에서 YQHXD의 효과에 관여하는 여러 화합물, 표적 및 신호 경로 간의 잠재적 상호작용을 조사하였다21,22. 분석 결과 YQHXD의 우선 활성 성분으로 케르세틴, 테트라뉴린 A, (3R)-3-(2-하이드록시-3,4-디메톡시페닐) 크로만-7-올, 이소르함네틴, 자라놀이 확인되었습니다. 이전 연구들은 이러한 화합물 또는 관련 플라...
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저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.
이 연구의 모든 단계에서 도움을 주신 쑤저우 중의학병원 소속 소저우 중의학병원의 Jintao Liu 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 중국 국가자연과학기금 프로젝트(82474529)의 보조금을 받았습니다; Liu 2024, 중국 국가자연과학기금 프로젝트 (82374220); 장쑤성 자연과학재단(번호: BK20250396); 장쑤성 전통 중의학 과학기술 개발 계획 프로젝트(NO. QN202419); 쑤저우 응용기초연구(의학 및 보건) 과학기술 혁신 프로젝트(NO. SYWD2024154); 장쑤성 전통 중의학 기술 개발 프로젝트(MS2022080); 장쑤성 전통 중의학 분야의 세 번째 선도 인재들(Su TCM Science and Education [2023] 제17호); 장쑤성 과학교육역량강화 프로젝트: 장쑤성 의학 핵심 학과 및 의학 핵심 실험실 건설 프로젝트(수웨이 과학교육[2022] 제17호); 장쑤성 자연과학기단 프로젝트(번호: BK20241802); 쑤저우 과학기술발전계획 29기(2022년(신중점 실험실 건설) 프로젝트(SZS2022019); 광시 대학 청년 및 중년 교사 기초 연구 능력 향상 프로젝트(2024KY0300)에서 위안 차이 (2024KY0300); 광서성 장자치구 전통중의학 자비 과학연구사업(GXZYA20240113); 광시 중의학대학교 대학급 연구 프로젝트에서 위안 차이에게 지원금을 받았다(2023QN010); 광시 좡자치구 대학생 혁신 훈련 프로젝트에서 용위안 리 용원(202410600022)에게 지원금; 광시 중의대학 대학생 혁신 훈련 프로젝트에서 수지에 류(X202410600062)에게 지원금; 광시 중의학대학교 대학생 혁신 훈련 프로젝트에서 멩페이 린(S202410600084)에게 보조금을 제공
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| 2× 유니버설 블루 SYBR 그린 qPCR 마스터 믹스 | 서비스바이오 테크놀로지 유한회사, 우한 | G3326 | qPCR 증폭 시약. |
| 30% 아크릴아마이드/비스-아크릴아마이드 젤 용액 (29:1) | 솔라비오 주식회사 | SDS-PAGE용 젤 제조 솔루션; 원본 재료 표에는 30%/29:1 젤 용액으로 기재되어 있습니다. | |
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| 젤 이미징 시스템 | 천엔과학, 상하이 | 웨스턴 블롯 이미지를 촬영하는 데 사용되었습니다. | |
| 유전자 카드 | 와이츠만 과학 연구소 | 버전 5.26 | 질병 관련 표적을 검색하는 데 사용되는 인간 유전자 데이터베이스. |
| gmx_MMPBSA | gmx_MMPBSA 프로젝트 | 적용 가능한 경우 MM-PBSA 결합 자유 에너지 추정에 사용됨. | |
| 그래프패드 프리즘 | 그래프패드 소프트웨어 | 버전 8.0 | 저자들의 이전 원고 버전에 나열된 통계/그래프 소프트웨어. |
| 비즈 분쇄 | 서비스바이오 테크놀로지 유한회사, 우한 | 조직 분쇄/균질화에 사용됩니다. | |
| 그로맥스 | GROMACS 개발팀 | 버전 2022.2 | 분자 역학 시뮬레이션에 사용됩니다. |
| 헤마톡실린 및 에오신 염색 시약 | 명시되지 않음 | 후륜 IVD 절편의 HE 염색에 사용됩니다. | |
| 고속 원심분리기 | 에펜도르프, 독일 | 실험실 원심분리기. | |
| 고속 저온 조직 분쇄기 | 서비스비오, 중국 | 저온 조직 분쇄에 사용됩니다. | |
| 수평 셰이커 | 치린벨 컴퍼니 | 실험실 셰이커. | |
| HRP 표지 염소 항토끼 항체 | 서비스바이오 컴퍼니 | 서부 블롯팅을 위한 2차 항체; 희석 1:5,000. | |
| HyperScript III qPCR과 gDNA 제거제를 위한 RT 슈퍼믹스 | 서비스바이오 테크놀로지 유한회사, 우한 | 역전사 시약은 기존 재료 표에 나열되어 있습니다. | |
| 제빙기 | 시막, 중국 | 제빙기. | |
| 이미지J | 국립보건원(NIH) | 웨스턴 블롯 밴드 강도 정량화에 사용됩니다. | |
| 역형 생물학 현미경 | 올림푸스, 일본 | 염색된 절면의 현미경 관찰에 사용됩니다. | |
| 이소플루란 | 명시되지 않음 | 흡입 마취제/안락사제. | |
| 이소프로판올 시약 | 중국국가제약그룹 화학시약 유한회사. | RNA 추출 시약. | |
| 중-치덤 이온 파라미터 | 해당되지 않음 | 분자 동역학 시뮬레이션에 사용되는 이온 매개변수 집합. | |
| 리구스티쿰 촨슝 리좀 | 중국 광시성 난닝의 지안수우 약국 | 배치 번호 20250301 | YQHXD 식물 구성 요소; 처방전당 15g. |
| 액체 질소 | 명시되지 않음 | RNA 추출 전 조직 분쇄에 사용됩니다. | |
| 저속 원심분리기 | 에펜도르프, 독일 | 혈청 분리 및 기타 저속 원심분리 단계에 사용됩니다. | |
| 매송의 트리크롬 스테인 솔루션 | 명시되지 않음 | 꼬리 IVD 절면의 마송 염색에 사용됨. | |
| 마이크로플레이트 리더기(TECAN) | 스위스 테칸 | 450nm 흡광도 측정에 사용; 기존 재료 표에 나열되어 있습니다. | |
| 마이크로플레이트 리더기 (Thermo Fisher Scientific) | 서모 피셔 사이언티픽, 미국 | 다기능 마이크로플레이트 리더는 기존 재료 표에 나열되어 있습니다. | |
| 마이크로소프트 엑셀/스프레드시트 소프트웨어 | 마이크로소프트 | 중복 대상 항목을 제거하고 표 형태 데이터를 관리하는 데 사용됩니다. | |
| 나노드롭 2000 분광광도계 | 서모 피셔 사이언티픽, 미국 | RNA 농도와 순도를 측정하는 데 사용되었습니다. | |
| 비효소 용해 완충제 | 명시되지 않음 | RNA 추출 전 조직 용해에 사용됩니다. | |
| 오맘 | 존스 홉킨스 대학교 의과대학 | 온라인 멘델 유산의 인간; 질병 관련 표적을 회수하는 데 사용된다. | |
| 온라인 생물정보학 플롯팅 플랫폼 | 명시되지 않음 | GO와 KEGG 바 플롯을 생성하는 데 사용되었습니다. | |
| PAGE 겔 중합제 | 솔라비오 주식회사 | 웨스턴 블롯 젤 준비 시약. | |
| 파라핀 | 명시되지 않음 | 조직학적 절편을 위한 임베딩 배지. | |
| Akt1, Bcl-2, Stat3, Gapdh PCR 프라이머 | 우한 서비스바이오 테크놀로지 유한회사. | 프라이머 서열은 표 1에 나열되어 있습니다. | |
| PDB | RCSB PDB | 단백질 데이터 뱅크; 표적 단백질의 3D 구조를 얻는 데 사용되었습니다. | |
| 인산화/프로테아제 억제제 | 서비스바이오 컴퍼니 | 단백질 추출을 위해 RIPA 용해 버퍼에 첨가합니다. | |
| 인산화산 | 명시되지 않음 | 매슨 염색에 사용됩니다. | |
| 피크로시리우스 레드 | 명시되지 않음 | 매슨 염색에 사용됩니다. | |
| 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 (0.45 & mu; m) | 서비스바이오 컴퍼니 | 웨스턴 블롯 전이에 사용되는 PVDF 막. | |
| 양성 통제 약물 차량 | 명시되지 않음 | 셀레코식스용 0.5% CMC-Na 서스펜션 차량. | |
| 포비돈-아이오딘 | 명시되지 않음 | 수술 부위 소독에 사용됩니다. | |
| 단백질 마커 | 서모 피셔 사이언티픽, 미국 | 서양 블롯팅의 분자량 마커. | |
| 단백질 전달 장치 | 바이오-래드, 미국 | 웨스턴 블롯팅을 위한 습식 전사 장비. | |
| 단백질 전달 모듈(습식 전송) | 바이오-래드, 미국 | 웨스턴 블롯 습식 전이 모듈. | |
| 퍼블켐 | 국립생명공학정보센터(NCBI) | 복합 구조의 SMILES/SDF 파일을 얻는 데 사용됩니다. | |
| 순수 준비 시스템 | 러펑 바이오테크놀로지 유한회사, 상하이 | 순수 물 준비에 사용됩니다. | |
| 파이몰 | 슈르둸름; 딩거, LLC | 분자 역학/도킹 출력의 시각화 및 분석에 사용됩니다. | |
| qPCR 실시간 PCR 시스템 | 응용 생명시스템 QuantStudio, 미국 | 정량적 PCR 증폭에 사용됩니다. | |
| RIPA 조직/세포 용해 완합 | 솔라비오 주식회사 | 총 단백질 추출에 사용됩니다. | |
| RNA 용해 해액 | 서비스바이오 테크놀로지 유한회사, 우한 | RNA 처리 시약. | |
| 회전 증발기 | 명시되지 않음 | 저압 하에서 결합된 YQHXD 여과물을 농축하는 데 사용됩니다. | |
| 시나피스 알바 성숙한 씨앗 | 중국 광시성 난닝의 지안수우 약국 | 배치 번호 20240801 | YQHXD 식물 구성 요소; 처방전당 10g. |
| 스프래그-도울리 쥐 | 상하이 슬랙 실험동물 주식회사 | SCXK (상하이) 2022-0004 | 3세 이상 수컷 쥐 70마리; 8주, 꼬리디스크 천자 모델에 사용됨. |
| SPSS | IBM, 미국 | 버전 21.0 | 저자들의 이전 원고 버전에 수록된 통계 소프트웨어. |
| STAT3 ELISA 키트 | 항저우 업핑바이오 테크놀로지 유한회사. | SYP-R1555 | 혈청 STAT3 수치 측정에 사용; 탐지 범위 31.25– 1000 pg/mL. |
| 스테파니아 테트란드라 뿌리 | 중국 광시성 난닝의 지안수우 약국 | 배치 번호 230301 | YQHXD 식물 구성 요소; 처방전당 6g. |
| 멸균 거즈 | 명시되지 않음 | 모델링 후 천공 부위를 보호하기 위해 사용되었습니다. | |
| 스트링 | 스트링 컨소시엄 | 버전 12.0 | 단백질-단백질 상호작용 네트워크 플랫폼. |
| qPCR용 SweScript 올인원 RT 슈퍼믹스 | 서비스바이오 테크놀로지 유한회사, 우한 | G3337 | 역전사 시약은 기존 재료 표에 나열되어 있습니다. |
| 스위스타겟 예측 | SIB 스위스 생물정보학 연구소 | 화합물의 잠재적 표적을 예측하는 데 사용됩니다. | |
| TBST 버퍼 | 명시되지 않음 | 웨스턴 블롯팅 시 멤브레인 세척에 사용됩니다. | |
| TCMSP | 생명과학대학 생물정보학 센터, 노스웨스트 A& F 대학교 | 버전 2.3 | 전통 중의학 시스템 약리학 데이터베이스; 중국 한방 화합물의 활성 성분을 얻기 위해 사용되었습니다. |
| TIP3P 수질 모델 | 해당되지 않음 | 분자 역학 시뮬레이션에 사용되는 물 모델. | |
| 톨루이딘 블루 | 명시되지 않음 | 매슨 염색에 사용됩니다. | |
| 전송 버퍼 | 서비스바이오 컴퍼니 | 서부 블롯 전이 버퍼. | |
| 트라이퀵 시약 | 서비스바이오 테크놀로지 유한회사, 우한 | RNA 추출 시약. | |
| 트리졸 시약 | 명시되지 않음 | 원고에 언급된 총 RNA 추출 시약. | |
| TTD | 홍콩 중문대학교(IDRBLab) | 치료 표적 데이터베이스; 질병 관련 표적을 회수하는 데 사용된다. | |
| 베니 | 바이오인포GP, CNB-CSIC | 버전 2.1.0 | YQHXD와 LDD 간 겹치는 표적을 식별하는 데 사용됩니다. |
| Verlet 컷오프 스킴 | 그로맥스 | 분자 동역학 시뮬레이션에서 사용되는 비결합 상호작용 체계. | |
| 수직 전기영동 장치 | 바이오-래드, 미국 | SDS-PAGE에 사용됩니다. | |
| VMD | 일리노이 대학교 어배너-섐페인 캠퍼스 | 분자 역학 출력의 시각화 및 분석에 사용됩니다. | |
| 습식 전송 시스템 | 바이오-래드, 미국 | 서부 블롯팅에서 단백질 전달에 사용됩니다. | |
| X선 형광투시 시스템 | 명시되지 않음 | 천자 모델링 중 꼬리 IVD 수치를 식별하는 데 사용됨. | |
| 자일렌 | 명시되지 않음 | 조직학 중 탈파라핀화/정화에 사용됩니다. | |
| &베타;-액틴 1차 항체 | 우한 산잉 유한회사. | 서부 블롯팅을 위한 로딩 조절 1차 항체; 희석 1:4,000. |