중공 섬유 관류 생물반응기에서 고밀도 3D 세포 배양을 통한 세포외 소포의 대규모 생산

요약

MSC 및 기타 세포 유형으로부터 세포외 소포를 생산하기 위한 3D 관류 중공 섬유 바이오반응기 설치 및 사용법도 제공됩니다. 이 프로토콜은 중공 섬유 바이오리액터에서 세포 밀도를 조절하면서 고농도로 연속적으로 세포외 소포를 생산하는 방법을 설명합니다.

초록

엑소좀 연구의 진전은 전통적인 2차원 세포 배양에서 분비되는 엑소좀의 작은 세포 수와 낮은 생산성으로 인해 저해되고 있습니다. 중공섬유 생물반응기(HFBR)에서의 고밀도 세포 배양은 많은 세포로부터 장기간 고농도로 분비된 생체분자와 세포외 소포(EV)를 3D 배양 내에서 지속적으로 생산할 수 있게 합니다. 이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 HFBR에서 수주 또는 수개월 동안 고밀도 세포 성장을 지원하는 최적의 세포 질량과 3D 관류 배양 조건을 유지하면서 농축된 분비된 엑소좀을 수집하는 방법을 설명합니다. 이 시스템은 컴팩트하고 밀폐되며 일회용이며, cGMP 준수가 가능하고, 사용이 간편하며, 표준 CO2 인큐베이터에 들어갈 수 있습니다. 중간엽 줄기세포(MSC)와 인간 양수 줄기세포(HAFSC)와 같은 특정 세포는 이러한 조건에서 증식이 감소하여 시간이 지남에 따라 분화와 표현형에 영향을 미칠 수 있습니다. 대표적인 결과는 수주 이상 연속 생산을 지속해도 전형적인 EV 수율과 세포 생존성을 보여줍니다. 이 방법은 연구와 임상 응용 모두에 적합한 재현 가능하고 고품질의 EV 수집을 제공합니다.

서론

세포외 소포는 재생 의학을 포함한 세포 간 소통과 치료적 응용 분야에서 점점 더 인정받고 있습니다. 전통적인 2D 세포 배양 방법은 노동 집약적이고 수확량이 제한적이어서, 실험이나 동물 실험을 위해 충분한 EV를 얻기 위해 수백 개의 배양 플라스크가 필요할 때도 있습니다 ^1,2. 임상 번역 스케일업은 일반적으로 마이크로캐리어나 기타 지지체를 이용한 전통적인 교반 생물반응기를 사용합니다. 이러한 시스템은 본질적으로 비생리적이고, 비효율적이며, 결과가 다양할 수 있습니다. 중공 섬유 바이오리액터는 3차원적이고 관류 기반 환경을 제공하여 고밀도 세포 배양을 작은 공간 내에서 지원하며,^{임상 응용}에 적합한 규모로 ^3,4.

HFBR은 작고 고밀도 세포 배양 시스템을 제공하여 전통적인 2차원 배양⁵에 비해 노동, 시간, 공간을 줄여 농축 EV를 연속적으로 생산할 수 있게 합니다. 이들은 작은 공간에서 고밀도 세포 배양을 가능하게 하여 어떤 실험실에서든 대규모 전기차 생산을 지원합니다. HFBR은 표준_CO2 인큐베이터에서 소량(20–60 mL) 용량의 대량 세포(1X10⁹ to 1×10¹⁰)를 배양하며, 특수 장비가 필요하지 않습니다. 이 시스템들은 몇 주 또는 몇 달에 걸쳐 연속적이고 농축된 전기차 채취를 가능하게 하며, 환원된 혈청이나 화학적으로 정의된 배지 사용을 용이하게 합니다. HFBR에서는 세포가 반투과성 중공섬유막(분자량 차단(MWCO)으로 재순환 배지와 분리된 추가 모세관 공간(ECS)의 작은 부피에 머무릅니다(그림 1). 포도당과 락테이트와 같은 작은 분자는 섬유를 쉽게 통과할 수 있고, 항체나 세포외 소포와 같은 큰 원소는 ECS에 보존되어 농축되어 채취할 수 있습니다.

중공섬유 세포 배양을 다른 어떤 방법과 구별하는 세 가지 기본 특성이 있습니다: 1) 높은 표면적 대비 부피 비율(200 cm²/mL)은 생 체 내 세포 밀도를 허용하며, 1 –2 ×^{10 8}세포를 1mL당 달성할 수 있습니다. 2) 세포는 비다공성 플라스틱 접시가 아닌 다공성 지지대에 결합되어 있습니다. 세포 분할은 필수가 아닙니다³. 섬유의 분자량 차단(MWCO)은 조절할 수 있습니다. 분비된 산물은 카트리지 ECS 내에서 2차원 플라스크 배양에 비해 10배에서 10배에서 10배 이상 집중되어 보존되고 농축됩니다. 또한, 섬유 표면에 섬유 표면에 쉽게 적용할 수 있는 섬유 표면에 섬유 간 플럭스에 영향을 주지 않습니다.

HFBR은 2차원 배양⁶보다 생체 내에서 더 유사한 3D 관류 기반 배양 환경을 제공하며, 세포의 혈청 의존도를 독특하게 줄이고 배양지 요구량을 단순화합니다. 이 고밀도 배양 환경은 2차원 배양과 비교했을 때 단백질 처리 차이를 지원할 수 있으며, 보고된 향상된 EV 생활성 ^7,8,9. 중공 섬유 생물반응기는 '조직중심적(histocentric)' 구조를 가지고 있습니다; 이들은 생체 내 세포 생리학의 조직과 유사한 특성을 모방하려고 시도합니다.¹⁰. 조직중심 바이오리액터의 두 가지 핵심 특징 은 1) 세포 밀도가 높아 세포가 자체 특정 미세환경을 생성할 수 있게 함, 2) 세포 간 분리나 통과가 필요 없어 세포 간 상호작용과 구체와 같은 3D 구조가 시간이 지남에 따라 유기적으로 발달할 수 있게 한다는 점입니다. 이 방법은 기존 2D 배양 시스템으로는 달성하기 어려운 세포 밀도를 가능하게 하며, 단순화되고 단백질이 없으며 화학적으로 정의된 배지 사용을 용이하게 합니다.

플라스크에서 배양할 수 있는 모든 세포 유형은 중공 섬유 바이오반응기에서 배양할 수 있습니다. 형질전환된 세포주는 증^{식을 일}으킬 것입니다. 모니터링해야 할 핵심 매개변수는 포도당 흡수율입니다. 포도당 모니터링은 대사 활동을 직접 측정하여 수확 시기 최적화와 세포 밀도 조절을 가능하게 합니다^. 카트리지 내 세포 질량을 조절하여 포도당 흡수율이 산소 전달 능력과^CO2 제거 능력을 초과하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이는 수확 시 세포 덩어리를 단순히 제거하는 방식으로 이루어집니다. MSC와 HAFSC는 속이 빈 섬유 바이오리액터에서 증식하지 않고 조용히 유지됩니다. 이 세포들은 바이오반응로에 씨앗을 뿌리기 전에 확장이 필요합니다. 하지만 배양이 확립되면 EV는 몇 주 또는 몇 달 동안 연속적으로 수확할 수 있습니다. MSC 표현형은 배양 30일 동안 변하지 않으며, CD105 발현은 이 기간 동안 감소하는 경우를 제외하고는 변하지 않습니다. 이후 바이오리액터에서 나온 MSC를 혈청 함유 배지와 함께 플라스크에 플레이트했을 때, CD105 발현은 초기¹³ 수준으로 돌아갔다. CD105 발현은 2차원 vs. 3D 배양의 마커가 될 수 있습니다. 일시적 트랜스펙션 기법은 준안정 트랜스펙턴트¹⁴를 만드는 데도 사용될 수 있습니다.

3D 중공섬유 세포 배양의 보다 생체 내 세포 배양 조건과 장점의 예로는 시간에 따른 완전하고 균일한 번역 후 변형^15,16, 크립토스포리디움 배양을 위한 위 상피에 의한 융모 형성¹⁷, 3D 간¹⁸, 3D 혈액-뇌 장벽 모델¹⁹, 포로조이트 원균 형성²⁰, 골수/줄기세포 공동 배양²¹ 등이 있습니다.

HFBR에서는 세포 용해가 제한되어 세포 내 단백질과 막 조각의 오염이 적게 농축되어 있습니다. 중공 섬유 바이오리액터는 섬유를 교차하지 않는 고분자량 성분이 없다면 어떤 매질과도 호환됩니다. 필요 시 이 큰 분자들은 바이오리액터의 ECS에 직접 추가할 수 있습니다. DMEM과 같은 고포도당 매체가 선호됩니다. 덜 복잡하고 단백질이 없는 세포 배양 배지는 단백질 부하를 줄여 정제를 단순화할 수 있습니다. 간엽 줄기세포와 인간 양수 줄기세포는 표준 기저 배지 및 FBS에서 배양되었으며, 여러 상업적으로 이용 가능한 MSC 배지 제형으로도 배양되었습니다. HFBR은 시중에서 구입할 수 있는 카트리지를 사용해 그램 단위의 엑소좀을 생산할 수 있습니다. 중공 섬유 바이오리액터는 잠재적 cGMP 조건에서 대규모 엑소좀 생산에 유용한 방법이며, 엑소좀 연구와 임상 번역 모두에 있어 패러다임 전환을 의미합니다.

세포외 소포 생산을 위한 중공 섬유 바이오리액터의 성공적인 사용은 매우 프로토콜 특화적입니다. 바이오리액터 조작, 세포 시딩 밀도, 수확 빈도, 사용되는 배지 등이 성공적인 바이오리액터 가동에 기여할 수 있습니다. 이 프로토콜은 고밀도 세포 배양에서 세포외 소포를 생산하고 수집하기 위해 중공 섬유 바이오리액터를 사용하는 표준화된 방법을 설명합니다. 목표는 시스템 설정, 세포 접종, 배양 유지보수, 수확 절차에 대한 지침을 포함하여 EV 수확에 대한 재현 가능한 접근법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 연구 응용을 위한 일관된 EV 생성을 지원하고, 다양한 세포 유형과 실험 목표에 맞게 조정할 수 있는 프레임워크를 제공하는 것을 목적으로 합니다.

프로토콜

모든 절차는 표준 우수 실험실 실무(GLP) 및 우수 세포 및 조직 배양 실무 지침을 준수합니다.

참고: 카트리지는 미리 조립되어 감마 멸균 처리되어 있습니다. 이중 봉투로 되어 있고, 각 연결부에 루어 캡이 있어 완전히 밀봉되어 봉지 밖에서도 멸균 상태를 유지합니다. 카트리지 포트 식별 은 그림 2를 참조하세요. 모든 단계는 상온에서 층류 후드 내에서 수행되었습니다.

1. 저수지 캡의 준비 및 멸균.

1. 이중 봉지 카트리지에서 두 개의 짧은 튜브 조각을 제거하세요.
2. 튜빙을 저수지 캡의 스테인리스 스틸 튜브에 있는 호스 바브에 연결하세요.
3. 오토클레이빙 후 멸균을 유지하기 위해 짧은 튜빙과 노출된 스테인리스 튜브 끝을 알루미늄 호일로 감싸세요. 조립된 부품을 오토클레이브 백에 넣으세요.
4. 121°C에서 15–30분 동안 드라이 사이클을 사용해 오토클레이브합니다. 사용 전에 캡을 실온까지 식히세요.

2. 중공 섬유 카트리지를 저장소 병에 부착

1. 1L 병에서 50mL의 PBS를 50mL 원뿔 튜브로 옮겨 나중에 사용하세요.
2. 오토클레이브 백에서 저장소 뚜껑을 제거하고, 긴 강철 튜브에서 보호용 호일을 제거하세요.
3. PBS 병의 뚜껑을 떼고 저장소 캡을 제자리에 나사로 고정하세요. 내부 멸균 백에서 카트리지를 꺼내세요.
4. 저수지 뚜껑 상단의 튜브 중 하나에서 알루미늄 호일을 제거하세요.
5. 긴 카트리지 튜브 중 하나에서 루어 캡을 분리해서 저장소 캡의 저수지 튜브에 부착하세요. 꼬임을 막기 위해 약간의 백스핀을 사용하세요.
6. 두 번째 튜빙 연결부도 반복합니다.
7. 갈색 펌프 튜브를 부드럽게 눌러 PBS를 시스템 전체에 흐르게 하여 모든 기포가 제거될 때까지 유지하세요.

3. 추가 모세관 공간(ECS) 채우기(ECS)

1. 길이 최소 1.5인치의 굵은 바늘을 사용해 멸균 주사기에 20mL PBS를 채취합니다; 안전을 위해 무딘 바늘이 선호됩니다.
2. 사이드 포트 루어 피팅 두 개를 알코올로 소독하고 건조시키세요.
3. PBS가 채워진 주사기는 한쪽 측면 포트에, 빈 멸균 주사기는 반대쪽 포트에 연결하세요. 양쪽 끝 포트를 닫고 양쪽 포트를 열어보세요.
4. 공기 방울을 최소화하기 위해 카트리지를 약간 각도로 들고 천천히 PBS를 ECS에 주입하세요. 반대편 포트에 있는 빈 주사기는 공기로 채워집니다.
5. ECS에 공기가 있으면 오른쪽 끝 포트를 열고 액체를 빈 주사기로 빼 ECS가 액체로 채워질 때까지 마시고(이 과정에서 PBS가 저장소 병에서 섬유를 거쳐 ECS로 끌어당깁니다).
6. 양쪽 포트 슬라이드 클램프를 닫고, 양쪽 끝 포트 슬라이드 클램프를 열어 펌프 튜브를 손가락으로 부드럽게 눌러 유량을 확인하세요.
7. 빈 주사기는 측면 포트에 붙여 캡 역할을 하도록 두세요. 라미나 플로우 후드에서 나온 주사기마다 새 주사기로 교체하세요.

4. 섬유 코팅 및 세포 접종

참고: 섬유에 특정 매트릭스 단백질을 코팅하는 것과 세포 접종 절차는 본질적으로 동일합니다. 과도한 액체는 섬유를 통해 저장소로 흐르지만, 셀이나 코팅 재료는 ECS 내에서 섬유 외부에 남아 있습니다. 씨앗 뿌리기에는 1× 10^{8개의 셀} 이 권장됩니다. 4,000 cm² HFBR에는 20mL PBS에 100–500 μg의 매트릭스 단백질을 권장합니다. 섬유 표면에 결합된 매트릭스 단백질은 MWCO에 영향을 주지 않습니다

1. 멸균된 50mL 원뿔형 튜브에 코팅 용액 또는 세포 현탁액을 준비합니다. 플라스크 확장 또는 PBS 내 100–500 ug 매트릭스 단백질 조절 배지 내 1 X 108 세포. 용량 20 mL.
2. 굵은 바늘을 사용해 멸균 주사기에 세포 또는 코팅 용액 20mL를 추출합니다.
3. 용액이 담긴 주사기는 한쪽 포트에, 빈 멸균 주사기는 다른 쪽 포트에 연결하세요.
4. 양쪽 끝 포트를 닫고 양쪽 포트를 열어보세요.
5. 두 주사기 사이로 액체를 옮겨 용액을 부드럽게 섞으세요. 각 주사기에 용액의 절반만 남겨두세요. 양쪽 포트를 닫아.
6. 오른쪽 끝 포트를 열고 리저버 캡을 1/4회전 느슨하게 하세요.
7. 한 대의 주사기에서 용액을 ECS에 주입하세요. 연결된 측면 포트를 닫으세요.
8. 다른 주사기에서 용액을 주입하세요. 연결된 측면 포트를 닫으세요. 양쪽 끝 포트를 열어.
9. 세포에 접종을 할 때는 카트리지를 실온에서 30분간 수평으로 두고, 이후 장축을 따라 180° 회전시키고 추가로 30분간 두세요.
   1. 섬유에 매트릭스 단백질을 코팅할 경우, 실온에서 하룻밤 두세요.
10. 카트리지를 듀엣 펌프 시스템에 넣고 25에서 유량을 시작하세요.

5. 수확 준비 ( 그림 2 참조)

1. 3방향 스톱콕과 멸균 필터가 달린 빈 멸균 주사기를 오른쪽 포트에 부착하세요.
2. 멸균 필터를 통해 배출할 수 있도록 3방향 스톱콕을 설정하세요. 왼쪽 포트에 빈 무균 주사기를 두 번째 연결하세요.

6. 조절 배지 수집 (수확)

1. 오른쪽 포트를 열고 필터를 통해 멸균 배출을 유지하세요.
2. 카트리지의 오른쪽 끝을 위로 기울이고 조절된 배지(제품)를 왼쪽 주사기로 빼냅니다. ECS 내용물을 왼쪽 주사기로 완전히 빼내세요.
3. 오른쪽 포트를 닫아. 왼쪽 포트를 닫고 주사기를 제거한 후 50mL 원뿔 튜브에 수확물을 모으세요.
4. 왼쪽 포트에 있는 주사기를 교체하세요. 왼쪽 포트를 열어. 오른쪽 끝 포트를 열어.
   저장소 뚜껑을 1/4회전 돌려 풀어보세요.
5. 카트리지의 왼쪽 끝을 위로 기울인 후 왼쪽 포트에 연결된 주사기로 ECS를 빼서 ECS를 채웁니다. ECS를 완전히 채워서 액체 반월판이 측면 포트 튜브 중앙에 들어오게 하세요.
6. 오른쪽 끝 포트를 닫으세요. 오른쪽 포트를 열고 3방향 스톱콕을 필터를 통해 배출되도록 설정하세요.
7. 왼쪽 포트를 열어. 카트리지를 오른쪽으로 기울이고 ECS를 완전히 왼쪽 주사기로 빼세요.
8. 왼쪽 포트를 닫아. 주사기를 제거하고 채취한 ECS를 50mL 원뿔형 튜브에 모으세요.
9. 주사기를 왼쪽 포트에 다시 꽂으세요. 오른쪽 포트를 닫아. 오른쪽 끝 포트를 열어
10. 카트리지 왼쪽을 위로 기울이고 왼쪽 주사기로 빼서 ECS를 채우세요. ECS를 완전히 채워서 액체 반월판이 측면 포트 튜브 중앙에 들어오게 하세요.
11. 왼쪽 포트를 닫아. 왼쪽 끝 포트를 열어. 저장소 뚜껑을 조여.
12. 카트리지를 듀엣 펌프로 돌려보내기 전에 펌프 튜빙을 수동으로 압축하여 시스템 흐름을 확인하세요.

7. 바이오리액터를 펌프 시스템에 삽입합니다.

1. 제어 박스에서 펌프 유량을 25로 설정하세요. 펌프가 작동 중일 때 카트리지를 설치하기가 더 쉽습니다.
2. 흐름 경로 스탠드의 오른쪽 가장자리를 잡으세요. 펌프 튜빙을 튜브 안에 밀어 넣으세요.
3. 유동 경로의 바닥을 펌프 베이스의 슬롯에 밀어 넣으세요. 직사각형 레지스터가 플로우 패스 스탠드의 컷아웃에 스냅되도록 하세요.
4. 펌프 베이스 옆면의 움푹 들어간 곳에 저장소 병을 놓으세요.
5. 가느다란 전원 코드는 인큐베이터 개스킷 사이에 끼워집니다. 제어 박스에는 인큐베이터 측면에 부착하는 자석이 있습니다.

8. 혈당 수치 모니터링

1. 1mL 피펫을 사용해 저장소 병에서 1mL 배지 샘플을 추출합니다.
2. 호환되는 포도당 측정기를 사용해 샘플링한 배지를 소량의 배지를 미터 테스트 스트립에 떨어뜨려 포도당 농도를 측정합니다.

9. 포도당 흡수율 계산

참고: 포도당 흡수율은 초기 혈당 측정값에서 24시간 후 측정값을 빼어 계산합니다. 비율은 저류층 부피에 따라 달라지므로, 포도당 농도 감소에 리터 단위의 저류층 부피를 곱합니다. 예를 들어, 저수지 병에 250mL가 있다면 0.25(25%)를 곱합니다. (포도당1-포도당2) X (리터 단위의 저장 병). 250 mL는 0.25 L입니다. 하루 이상 경과했다면, 이를 일수로 나누세요. 예를 들어: 시작 혈당 4.5 g/L; 24시간 후 혈당 측정: 2.7 g/L; 저수지 병: 250 mL. 4.5-2.7=1.8 g. 1.8X.25 (저장 병 용량 0.25L), 0.45g 포도당 섭취. 포도당 흡수율은 하루 450mg입니다.

10. 실행 가능성 검사

1. 수확 프로토콜을 이용해 소량의 세포 샘플을 채취하세요.
2. 세포를 T 25 배양 플라스크에 신선한 10% 혈청 함유 배지로 배지합니다. 부착 상태와 생존 가능성을 시각적으로 평가하세요.

11. 카트리지 일일 유지 및 배양 첫 주.

참고: 배양 첫 주 동안 증식 세포는 하루 1–2그램의 포도당 섭취 목표 속도로 확장됩니다.

1. 0일차: 세포에 접종을 하고, 배지 조성에서 포도당 시작 농도를 결정합니다. 시작 저수지 용량: 125 mL.
2. 1-2일차: 매일 혈당을 측정합니다. 시작 포도당이 50% 소모되면 125 mL 저장소를 250 mL 신형 배지로 교체하고 혈청을 7.5%로 낮춥니다.
3. 3-4일차: 혈당을 측정합니다. 시작 포도당이 50% 소모되면 250 mL 저장소를 500 mL 신규 배지로 교체하고 혈청을 5%로 감원합니다.
4. 4-5일차: 포도당 측정. 시작 혈당이 50% 소모되면 500mL를 1L 신선한 배지로 교체하세요. 혈청을 2.5%로 줄이고 원한다면 화학적으로 정의된 배지로 전환하세요.
5. 6일차+: 혈당 측정, ECS 수확. 포도당 흡수를 하루에 1에서 2g 사이로 유지하기 위해 수확하여 세포 밀도를 조절하세요.
6. 비증식 세포의 경우, 저장소 병에 125mL를 넣고 3일마다 배지를 교체하세요.
7. 포도당 소비가 심하면 저장소를 250mL로 늘리세요. 3일째에서 4일째에 ECS에서 혈청을 제거하고 기저 배지로 교체하세요.

결과

이 프로토콜에 따르면, 증식하는 세포주가 심어진 4,000 cm² 카트리지는 일반적으로 하루에 1–2g의 포도당을 섭취합니다. 이는 DMEM과 같은 고포도당 배지를 사용할 경우 2–3일마다 1리터의 미디엄을 투여하는 셈입니다. 세포는 씨앗 후 일주일 이내에 최대 밀도에 도달합니다. 수확은 5일에서 7일 후, 또는 포도당 흡수율이 하루 1g에 도달할 때 시작해야 하며, 가능하다면 매일 시행하는 것이 좋습니다. 배양 첫 주 동안, 혈청이 필요한 경우 ECS의 혈청 함유 배지를 순환 배지에 유지하면서 혈청 함유 기저 배지를 교체할 수 있습니다. 포도당 흡수율이 하루 1g에 도달하면 쉽게 환원혈청 배지나 다른 화학적으로 정의된 배지로 전환할 수 있습니다. MSC와 HAFSC는 CHO, 293, 또는 하이브리도마와 같은 형질전환 세포주보다 훨씬 낮은 속도로 포도당을 소비합니다. 구형 형성은 MSC와 HAFSC, 그리고 다른 세포 유형에서 전형적으로 이루어집니다(그림 3). 일일 혈당 모니터링은 배양 건강과 대사 활성에 대한 신뢰할 수 있는 측정 수단을 제공합니다. 표준적이고 상업적으로 구할 수 있는 외계 없는 미디어가 MSC와 HAFSC와 함께 성공적으로 사용되었습니다. 수확 용량은 약 20mL입니다. 수확 간격 24시간이 최적이며, EV 농도는 24시간 이후 최고치에 도달합니다(그림 4). 수확된 배지에서의 일반적인 엑소좀 농도는 세포 유형, 세포 시딩 수 및 기타 요인에 따라 1–5 ×^{10 12} 입자/mL 사이이며, 원심분리 후 눈에 띄는 페릿이 나타날 수 있습니다(그림 5). 많은 수의 세포를 씨앗할 수 있으며, 배양 면적이 아닌 세포 수를 기준으로 해야 합니다(그림 6).

결과는 EV 생산이 포도당 소비로 측정된 대사 활동과 상관관계를 가지며, 배양 성능을 모니터링하고 최적화하는 데 실질적인 매개변수를 제공함을 보여줍니다. 24시간 간격으로 매일 수확하면 EV 농도를 극대화하면서 배양 안정성을 유지할 수 있습니다. 이러한 발견은 중공섬유 바이오리액터에서 재현 가능한 전기차 생산을 위한 핵심 매개변수로서 포도당 모니터링과 수확 제어 빈도를 지지합니다.

그림 1: 중공 섬유 바이오리액터의 단면도. 매질은 섬유 내부를 통해 흐르고, 세포는 섬유의 외부에 부착됩니다. 포도당과 락테이트와 같은 소분자량 성분은 섬유를 쉽게 교차할 수 있습니다. EV와 같은 분비된 산물은 섬유를 통과하지 못해 섬유 밖 영역인 ECS(모세외 공간)에 고도로 농축됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 포트와 클램프가 확인된 카트리지 사진. 유동 경로의 일방향 체크 밸브는 매질의 재순환 흐름을 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 중간엽 줄기세포, 인간 양수 줄기세포, 심장 전구세포 및 일부 기타 세포 유형은 충분한 수로 카트리지에 씨앗을 주입하면 구형체를 형성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 서로 다른 시간 간격의 수확 후 EV 농도 측정. 24시간이 지나면 EV 농도가 최대 농도에 도달합니다. 최적 수확은 24시간 후입니다. (데이터는 로스앤젤레스 어린이병원 EV 코어 파올로 네비아니 제공). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: C2011 중공 섬유 바이오원자로에서 배양된 DIFI 세포에서 1주일간 EV를 수확한 모습. 차동 원심분리로 분리된 전기차. (데이터 제공: 제프 프랭클린, 밴더빌트 대학교)^{18, 19}. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: 놀랍게도 많은 수의 세포를 속이 빈 섬유 바이오리액터에 시딩할 수 있습니다. MSC는 2차원 문화에서 많은 영역을 차지합니다; 3D 배양에서 구형으로 성장할 때는 공간을 차지하는 공간이 적습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

속이 빈 섬유 바이오리액터는 진정한 상업적 양의 단백질이나 항체를 합리적으로 생산할 수 없습니다. 그러나 이들은 비교적 많은 수의 세포를 고밀도로 배양하고, 임상적으로 중요한 규모로 농축된 EV 산물을 분비할 수 있는 독특한 능력을 가지고 있습니다. 조직중심 바이오리액터의 진정한 장점이 인식된 것은 최근 몇 년 사이입니다. 고밀도 관류 배양 조건은 cGMP 준수 배지를 사용하여 연구 및 잠재적 임상 응용에 적합한 농축 EV를 생성합니다. 4,000 cm²에서 한 번의 수확은 10–20 mL 부피에 5 × 10¹² 또는 1 × 10¹⁴ EV를 포함할 수 있습니다. 이 수율은 EV 투여 평가 연구에서 보고된 범위 내에^{있습니다.}

포도당 흡수율의 일일 모니터링은 배양 성능을 평가하는 중요한 매개변수이며, 세포 대사, 세포 수, 건강 상태를 직접 측정하는 지표입니다. 일반적으로 DMEM과 같이 시작 포도당 농도가 4.5 g/L인 높은 포도당 배지가 선호됩니다. 포도당이 50% 소비되면 배지를 신선한 배지로 교체해야 합니다. MSC와 같은 특정 세포는 3 g/L 이상의 포도당 농도에서 포도당을 섭취하고 락테이트를 생성한 뒤, 3 g/L 이하에서는 글루타민을 섭취하며 암모니아를 생성하는 것으로 보입니다. 3D 배양에서 MSCs의 완전한 대사 프로파일링은 아직 수행되지 않았습니다.

성공적인 바이오리액터 배양을 위한 가장 중요한 매개변수는 세포 접종 횟수입니다. 4,000cm²C2011 생물반응기의 최소 접종 셀 수는 1×^{10 8} 셀입니다. MSC나 HAFSC와 같은 비증식 세포의 경우, 최대 1×^{10 9} 개의 세포가 선호됩니다. 저장소 용량은 카트리지 내 셀 수에 비례해야 합니다. 1×^{10 8}셀은 125ml를 넘지 않는 저장소를 사용해야 합니다. 1×^{10개의 9} 셀은 1L를 넘지 않는 저장소를 가져야 합니다. 저수지가 너무 크면 세포가 지연 단계로 들어가게 될 수 있습니다. 이는 트리판 블루 염색으로 생존 가능함을 확인했음에도 세포가 포도당을 소비하지 않는 것이 특징입니다. 이 경우에는 저장소 용량을 줄이거나 더 많은 세포를 시딩하세요. 효과적인 생물반응기 배양을 위해 충분한 세포 수를 얻기 위해 여러 차례 세포 접종이 필요할 수 있습니다. 카트리지 안에 이미 있는 셀 위에 더 많은 셀을 시딩하면 됩니다. 바이오리액터 성능을 평가할 때는 세포 접종량을 주목하세요. 세포 시딩이 10배 증가하면 EV 생산량이 10배 증가할 수 있습니다.

프로토콜의 수정에는 세포 종류와 원하는 수확량에 따라 배지 조성, 표면 코팅, 셀 수, 수확량, 수확 빈도, 주사기 크기 등의 변경이 포함될 수 있습니다. 연속 배양은 배양 중에 변화를 주고 결과를 실시간으로 얻을 수 있어 쉽고 실시간 상태 최적화를 가능하게^합니다. 문제 해결은 불임 유지와 대사 활동 모니터링에 집중해야 합니다. 특히 슬라이드 클램프 주변에 막힘이나 꼬임이 없는지 확인하세요. 박테리아 오염은 빠른 포도당 소비와 저장소 병 내 탁을 초래합니다. 곰팡이 오염은 카트리지 왼쪽 끝 캡에 부드럽고 하얀 축적이 형성되어 흐름을 막는 것으로 나타난다. 중공 섬유 바이오리액터 시스템 사용에는 숙련된 조작과 엄격한 프로토콜 준수가 필요합니다. 중요한 단계로는 정확한 세포 수를 씨앗 뿌리고, 수확 중 불임을 유지하며, 과도한 성장이나 영양분 고갈을 방지하기 위해 포도당 섭취량을 면밀히 모니터링하는 것이 포함됩니다. 대부분의 세포는 섬유에 부착되며, 때로는 피브로넥틴 코팅된 단백질 기질에 따라 빠른 세포 부착을 돕습니다. MSC, HAFSC, 심장 전구세포와 같은 일부 세포는 섬유에 붙어 3D 구형을 형성합니다.

HFBR 시스템은 대부분의 세포 유형에서 고밀도, 화학적으로 정의되고 외계인이 없는 배양을 지원하여 대규모 EV 생산을 용이하게 합니다²³. 일일 혈당 모니터링은 바이오리액터 성능을 신뢰할 수 있는 지표로 제공합니다. 폐쇄형 관류 기반 시스템은 cGMP 표준과 호환되며, 더 큰 카트리지 또는 여러 개의 카트리지를 사용해 스케일업이 가능합니다. 최적화된 조건에서 그람 규모의 전기차 생산이 가능할 수 있습니다. 중공 섬유 바이오리액터는 통제된 조건 하에서 지속적인 전기차 생산 및 수집을 위한 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다. 여기서 제시된 프로토콜은 시스템 설정, 무균 처리, 대사 모니터링 등 실질적인 고려사항을 강조하여 일관된 운영과 신뢰할 수 있는 결과를 지원합니다. 다양한 배양 조건에서 EV의 특성과 기능적 특성을 평가하고 대체 생산 시스템과의 성능을 비교하기 위한 추가 연구가 필요할 수 있습니다.

이 방법은 재생 의학과 치료적 응용 분야를 포함한 연구 및 임상 EV 생산에 널리 적용 가능합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16 gauge 1.5" needle	Stellar Scientific	SOLM-111615
3-way stopcock, sterile	Cole-Parmer	UX-48523-28
20mL luer lock syringe	Becton Dickenson	302830
25mL serological pipette, sterile	Stellar Scientific	TC50-TAU-25
25mm syringe filter, sterile	Thomas Scientific	1162B74
38 mm reservoir cap	FiberCell Systems	A1006
50 mL conical centrifuge tubes	Stellar Scientific	T50-101-PK
500 mL Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
CVS Sterile Alcohol Prep Pads, 480 CT	CVS Pharmacy	Item # 376560
Hollow fiber bioreactor	FiberCell Systems	C2011
Human Fibronectin, 1 mg	Corning	354008