본 연구에서는 토끼 무릎 골관절염 모델에서 침도요법(acupotomy)이 연골 재생을 촉진하는지 조사하였습니다. 50마리의 토끼를 5개 그룹으로 나누었으며, 4주 동안 매주 침도요법을 시행하였습니다. 기저 기전을 탐구하기 위해 관절 부종, 조직 병리학, 염증성 사이토카인 및 circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK 축 관련 마커를 평가하였습니다.
연구 논문
침도요법은 circRNA 스캐폴드 기반의 RIC8A/P38 MAPK 축을 조절하여 무릎 골관절염의 연골 재생을 촉진한다
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
무릎 골관절염(KOA)은 점진적인 연골 퇴행과 염증을 특징으로 합니다. 본 연구에서는 KOA 토끼 모델에서 도침요법의 치료 효과와 circPDE4B(circular RNA phosphodiesterase 4B)/RIC8A(resistance to inhibitors of cholinesterase 8A)/p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 신호 전달 축과의 연관성을 조사하였습니다. 50마리의 뉴질랜드 화이트 토끼를 대조군, KOA 모델군, celecoxib 투여군, 도침요법군, 가짜 도침요법군의 5개 그룹(그룹당 n = 10)으로 무작위 배정하였습니다. KOA는 수정된 Videman 방식으로 유도되었습니다. 모델링 6주 후부터 도침요법은 4주 동안 주 1회 실시하였으며, celecoxib은 4주 동안 24 mg/kg의 용량으로 매일 경구 투여하였습니다. 무릎 부종과 연골 조직 병리학적 상태를 평가하였습니다. 연골 조직 균질물 내의 interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α) 및 interleukin-6 (IL-6) 수치는 효소 결합 면역 흡착 분석법으로 측정하였습니다. 연골 대사 및 circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK 축과 관련된 유전자 및 단백질 발현은 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응 및 Western blotting으로 분석하였습니다. KOA 모델군과 비교했을 때, 도침요법은 무릎 부종을 감소시키고, 조직 병리학적 점수를 개선하며, 염증성 사이토카인 수치를 낮추었습니다. 또한 matrix metalloproteinase-3 (MMP-3), matrix metalloproteinase-13 (MMP-13), RIC8A 및 인산화된 p38 MAPK의 발현을 하향 조절하였고, SRY-box transcription factor 9 (SOX9), aggrecan 및 상대적 circPDE4B의 발현을 상향 조절하였습니다. 이러한 효과는 celecoxib 투여군과 유사하였으나, 가짜 도침요법에서는 유의미한 개선이 나타나지 않았습니다. 이 결과는 도침요법이 토끼 KOA의 염증과 연골 퇴행을 완화하며, 이는 circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK 축의 조절과 관련이 있음을 시사합니다.
서론
무릎 골관절염(KOA)은 점진적인 연골 퇴화, 활막 염증, 연골하골 경화 및 골극 형성을 특징으로 하는 흔한 퇴행성 관절 질환입니다1,2,3. 전 세계적인 인구 고령화로 인해 KOA의 발생률이 지속적으로 증가하고 있으며, 이는 전 세계 중장년층 및 노년층에서 관절 기능 장애와 만성 통증의 주요 원인이 되고 있습니다4,5,6. 현재의 임상 치료는 주로 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs) 및 관절 내 코르티코스테로이드 주사와 같은 약물 제제를 통한 증상 완화에 집중되어 있습니다. 그러나 질병의 진행을 중단시키거나 연골 재생을 촉진할 수 있는 질병 수정 요법(disease-modifying therapies)은 여전히 제한적인 실정입니다7,8.
최근 연구 결과들에 따르면 비부호화 RNA(ncRNA)가 무릎 골관절염(KOA)의 발병 기전과 진행 과정에서 중요한 조절 역할을 한다는 점이 강조되었습니다9,10,11. 이러한 ncRNA 중에서 원형 RNA(circRNA)는 선형 RNA보다 더 높은 안정성을 부여하는 독특한 공유 결합 폐쇄 루프 구조와 다양한 생물학적 기능으로 인해 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다12,13. Shen 등은 circPDE4B가 resistance to cholinesterase 8A(RIC8A)/p38 mitogen-activated protein kinase(MAPK) 신호 전달 경로 억제제에 대한 저항성을 조절하는 분자 스캐폴드로 작용하여, 연골세포의 세포외 기질 대사와 염증 반응에 영향을 미친다고 보고했습니다14. RIC8A/p38 MAPK 경로는 연골세포의 염증, 이화 작용, 세포 사멸 및 노화를 조절하는 데 중요한 역할을 하며, 이러한 모든 과정은 골관절염의 발병 기전에 기여합니다15.
도침요법(Acupotomy)은 전통 중의학 이론과 현대 해부학적 원리를 결합한 최소 침습적 치료법으로, 무릎 골관절염(KOA)의 임상 관리에 있어 유망한 효능을 보여주었습니다16,17. 이 기술은 특수 설계된 침도(needle-knife) 장치를 사용하여 연부 조직의 유착을 해소하고 국소 순환을 개선하며, 환부 관절 주변의 생체역학적 균형을 복원함으로써 KOA 환자의 통증을 완화하고 기능을 개선합니다18. 이러한 임상적 이점이 보고되었음에도 불구하고, 도침요법의 치료 효과에 관한 분자적 기전, 특히 연골 재생에 관여하는 circRNA 매개 신호 전달 경로의 조절 가능성에 대해서는 여전히 연구가 많이 이루어지지 않은 상태입니다.
기전적으로, 도침요법은 관절 주변 연부 조직 이완을 통해 국소적인 기계적 자극을 생성합니다. 연골세포는 생체역학적 신호에 반응하는 기계감수성 세포이며, circRNA는 연골세포의 기계적 자극 전달 반응에 관여하는 것으로 밝혀졌습니다19,20. 도침요법이 관절 연골 특이적 circRNA의 조절과 연결된다는 직접적인 증거는 부족하지만, 도침요법에 의해 생성된 기계적 신호가 circPDE4B와 같은 기계감수성 circRNA를 조절할 수 있다는 점은 생물학적으로 타당합니다. 이러한 가능성이 본 연구의 기초가 되었습니다.
RIC8A/p38 MAPK 신호 전달 축에서 circPDE4B의 조절 역할에 관한 이전 연구 결과를 바탕으로, 본 연구에서는 변형된 Videman법으로 유도된 토끼 KOA 모델을 사용하여 도침요법이 circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK 신호 경로를 조절함으로써 연골 재생을 촉진한다는 가설을 검증하였다. 다른 KOA 중재법 대신 도침요법을 선택한 이유는 다음과 같다. 첫째, 주로 증상 완화만을 제공하며 질병 수정 효과가 제한적이고 잠재적인 장기 부작용과 관련이 있는 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs) 및 सेलेcoxib와 같은 약물 치료제와 비교하여7,8, 도침요법은 국소적인 기계적 요인과 생물학적 신호 경로를 모두 해결하는 비약물적 접근 방식을 제공한다. 둘째, 반복적인 관절 내 투여가 필요하며 감염 및 관절 손상의 위험이 있는 관절 내 코르티코스테로이드 또는 히알루론산 주입과 달리, 도침요법은 관절 주변 연부 조직을 대상으로 하여 지속적인 생체역학적 및 생화학적 효과를 나타낼 수 있다21. 셋째, 임상적 근거에 따르면 도침요법은 KOA 환자의 통증 감소 및 관절 기능 개선에 있어 기존 치료법과 비슷하거나 더 우수한 결과를 보였으며, 실험적 연구들은 도침요법이 염증 반응과 연골 세포 대사를 조절함을 시사하였다21,22. 하지만 도침요법이 연골 보호 효과를 나타내는 구체적인 분자 경로, 특히 circRNA 매개 신호 전달과 관련된 기전은 아직 충분히 밝혀지지 않았다. 따라서 도침요법과 circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK 축 사이의 연관성을 조사하는 것은 새로운 기전적 통찰력을 제공하고 KOA의 질병 수정 중재법으로서 도침요법의 사용을 뒷받침할 수 있을 것이다16,18. 주요 평가 지표는 무릎 관절 부종, 조직병리학적 연골 퇴행(Mankin 및 Moran 점수), 염증성 사이토카인 수치(interleukin-1β, tumor necrosis factor-α, interleukin-6), 연골 대사 관련 마커의 발현(matrix metalloproteinase-3, matrix metalloproteinase-13, SRY-box transcription factor 9, aggrecan), circPDE4B 및 RIC8A의 발현, 그리고 p38 MAPK의 인산화였다. 도침요법은 4단계 기법(종적 박리, 횡적 분리, 결절 절개)을 사용하여 선정된 관절 주변 혈위에 4주 동안 주 1회 실시되었다. 조직병리학적 평가, 염증성 사이토카인 측정, 유전자 및 단백질 발현 분석을 통해 도침요법의 효과를 규명하고 KOA에서의 잠재적인 분자적 근거를 탐색하였다.
프로토콜
모든 동물 실험 절차는 실험동물의 관리 및 사용에 관한 기관 지침에 따라 수행되었으며, 중국 안후이 중의대학교 동물윤리위원회(승인 번호 AHUCM-rabbits-2023195)의 승인을 받았습니다. 본 프로토콜에 사용된 시약, 화학 물질, 소프트웨어 및 도구는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 실험 동물 및 그룹화
건강한 성체 수컷 뉴질랜드 화이트 토끼 50마리(6개월령, 체중 2.0–2.5 kg)를 Nanjing Pukou District Laifu Breeding Farm(동물 생산 허가 번호: SCXK (Su) 2024-0007)에서 분양받았다. 모든 동물은 실험 전 1주간의 순화 급여 기간을 거쳤다. 특정 실험적 가설이 아닌 일관된 절차적 관행에 따라 오른쪽 무릎은 부종 평가용으로, 왼쪽 무릎은 연골 조직 수집용으로 지정하였다. 순화 후, 토끼를 무작위로 5개 그룹(그룹당 n = 10)으로 배정하였다: 모델링 절차나 처치를 받지 않은 대조군, 수정된 Videman법을 사용하여 KOA를 유도한 KOA 모델군, 모델링 6주 후 약물 치료를 시작한 celecoxib군, 모델링 6주 후 침도절개술 치료를 시작한 acupotomy군, 그리고 모델링 6주 후 절개나 박리 없이 침 삽입만을 시행한 sham acupotomy군으로 나누었다.
2. KOA 모델 구축
대조군을 제외한 모든 토끼에게 KOA를 유도하기 위해 수정된 Videman procedure를 시행하였습니다. 동물들은 수술 전 12 h 동안 금식하였습니다. 마취는 3% pentobarbital sodium 30 mg/kg을 귀 주변 정맥을 통해 정맥 투여하여 유도하였습니다. 수술 부위의 일반적인 준비, 소독 및 멸균 드레이핑 후, 무릎 관절의 내측을 따라 종절개를 가하였습니다. 내측 측부 인대와 전방 십자 인대를 순차적으로 절단하고, 내측 반월판을 완전히 제거하였습니다. 그 후 절개 부위를 층별로 봉합하였습니다.
수술 후 감염 위험을 줄이기 위해, 페니실린을 40,000 U/kg/day의 용량으로 3일 연속 근육 내 투여하였다. 수술 후 토끼들을 케이지로 돌려보냈으며, 관절 고정 없이 자유롭게 움직이도록 하였다.
3. 가짜 도침 치료
KOA 모델링 6주 후, 가짜 도침 치료군의 토끼를 대상으로 실제 도침 치료와 동일한 촉진 및 혈위 표시 과정을 수행하였다. 0.35 mm × 25 mm 크기의 멸균 일회용 도침을 각 표시된 지점의 피부를 통해 피하 조직에 도달할 때까지 수직으로 삽입하였다. 절개, 박리, 횡방향 조작 또는 기타 기계적 해방 기법은 수행하지 않았다. 도침은 조직 조작 없이 삽입 직후 즉시 제거하였다. 가짜 치료는 4주 연속으로 주 1회 실시하였다.
4. 도침 치료
KOA 모델링 6주 후, 도침 치료군의 토끼를 치료대 위에 고정시켰습니다. 환측 무릎 주변의 관절 주위 조직, 특히 슬개골 주변과 내측 및 외측 관절 공간을 촉진하여 끈 모양의 구조물이나 딱딱한 결절을 확인했습니다. 촉진 결과에 따라 4~6개의 치료점을 선정하여 피부에 표시했습니다.
치료 부위를 면도하고 일반적인 멸균 절차를 사용하여 소독하였습니다. 0.35 mm × 25 mm 크기의 멸균 일회용 침도(acupotomy needle)를 각 표시된 지점에 뼈 표면에 닿을 때까지 천천히 수직으로 삽입하였습니다. 시술은 4단계 침도 기법에 따라 수행되었습니다. 먼저 종방향 이완을 수행한 후 횡방향 분리를 진행하였습니다. 단단한 결절이 발견되면 침도를 통해 뚜렷한 이완감이 느껴질 때까지 절개하였습니다. 시술 후 침도를 제거하고, 각 삽입 부위를 멸균 거즈로 짧게 압박한 뒤 접착식 드레싱으로 덮었습니다. 치료는 4주 연속으로 주 1회 실시하였습니다.
5. 약물 처리
KOA 모델링 6주 후, celecoxib 투여군의 토끼에게 celecoxib 현탁액을 24 mg/kg의 용량으로 4주 연속 매일 1회 경구 투여하였습니다. 현탁액은 매일 생리식염수로 새로 조제하였습니다. 공급업체 및 카탈로그 정보는 재료 표에 제공되어 있습니다.
6. 무릎 관절 부종 평가
KOA 모델링 후 10주에 해당하는 중재 기간이 종료되었을 때, 무릎 관절 부종을 평가하였다. 부드러운 실크사를 오른쪽 무릎 관절에서 가장 많이 부어오른 부위(일반적으로 경골 평탄부 높이)에 감았다. 실을 제거한 후 자를 사용하여 밀리미터 단위로 정밀하게 측정하였으며, 기록된 길이를 무릎 둘레로 정의하였다.
상대 팽윤비는 다음 식을 사용하여 계산하였습니다:
7. 시료 수집
중재 기간이 종료된 후, 토끼의 귀 가장자리 정맥을 통해 3% pentobarbital sodium을 30 mg/kg으로 정맥 투여하여 마취시켰습니다. 23번 메스 날을 사용하여 왼쪽 무릎 관절을 절개하고 경골 고평부와 대퇴 과두의 관절 표면을 노출시켰습니다. 해당 부위에서 관절 연골 조직을 수집하였습니다.
각 연골 샘플을 두 부분으로 나누었습니다. 한 부분은 조직병리학적 검사를 위해 4% paraformaldehyde로 고정했습니다. 다른 한 부분은 냉동 튜브에 넣어 액체 질소로 급속 냉동시킨 후, 분자 분석을 수행할 때까지 −80 °C에서 보관했습니다. 모든 조직 수집 절차가 완료된 직후, 토끼의 귀 주변 정맥을 통해 공기를 빠르게 정맥 주사하여 공기 색전증으로 안락사시켰습니다.
그룹당 10마리의 토끼 전수(n = 10)로부터 얻은 연골 샘플을 사용하여 조직학적 염색과 Mankin 및 Moran 점수 산정을 수행하였다. 그룹당 무작위로 선정된 3마리의 토끼로부터 대표적인 hematoxylin and eosin 및 Safranin O–Fast Green 이미지를 선택하였다. 면역조직화학 염색과 Western blotting은 그룹당 무작위로 선정된 3마리의 토끼 샘플(n = 3)을 사용하여 수행하였다. 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응과 효소결합 면역흡착 분석은 그룹당 무작위로 선정된 6마리의 토끼 샘플(n = 6)을 사용하여 수행하였다. 모든 하위 집단 선정은 그룹 배정 정보를 사전에 알지 못한 상태에서 무작위로 수행되었다.
8. 헤마톡실린 및 에오신 염색
4% paraformaldehyde로 고정된 연골 조직을 pH 7.4의 10% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 용액에서 4–6주 동안 탈석회화하였다. 탈석회화 용액은 3일마다 교체하였다. 바늘 관통 시험을 통해 탈석회화가 확인된 후, 조직을 70%, 80%, 90%, 95%, 100%의 단계별 에탄올 시리즈로 탈수시키고, xylene으로 투명화한 후, 파라핀에 매립하였다. 매립된 조직을 마이크로톰을 사용하여 5 µm 두께로 절편화하고, 절편을 유리 슬라이드에 부착하였다.
hematoxylin 및 eosin 염색을 위해, 절편을 60 °C에서 60분 동안 가열하고, xylene에서 5분씩 3회 교체하여 탈파라핀 처리를 한 후, 100%, 95%, 80%, 70% ethanol 순으로 단계적으로 재수화시키고 이어서 증류수로 세척하였습니다. 절편을 hematoxylin으로 5분 동안 염색하고, 흐르는 수돗물 아래에서 10분 동안 헹군 뒤, 70% ethanol로 제조한 1% hydrochloric acid에서 2–3초 동안 분별 염색을 하고 증류수로 헹구었습니다. 그 다음 절편을 eosin으로 2분 동안 염색하고, 증류수로 헹군 뒤, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% ethanol 순으로 탈수시키고, xylene으로 투명화 처리한 후 중성 수지로 봉입하였습니다. 연골 형태를 관찰하였으며, 광학 현미경을 사용하여 대표 이미지를 획득하였습니다.
9. Safranin O–Fast Green 염색
파라핀 매립 연골 절편을 섹션 8에서 설명한 대로 탈파라핀 처리 및 재수화하였다. 절편을 Weigert iron hematoxylin으로 5분간 염색한 후 증류수로 헹구었다. 이어서 절편을 0.05% Fast Green 용액으로 3분간 염색하고, 1% 아세트산으로 10–15초간 짧게 헹군 뒤, 0.1% Safranin O 용액으로 5분간 염색하였다.
염색 후, 절편을 95% 및 100% 에탄올에서 빠르게 탈수시키고, 자일렌으로 투명화한 후 중성 수지로 봉입하였다. 염색된 절편을 광학 현미경을 사용하여 관찰하였다. 프로테오글리칸 함량을 반영하는 Safranin O 염색 강도를 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 반정량적으로 분석하였다.
10. 조직학적 점수 산정
실험군 배정을 알지 못하는 두 명의 병리 전문의가 Mankin 및 Moran 점수 체계를 사용하여 염색된 절편을 독립적으로 평가함으로써 연골 퇴행 정도를 측정하였습니다. 평가 전, 모든 절편에는 무작위 식별 코드가 부여되었습니다. 모든 점수 산정이 완료될 때까지 치료법 배정 내용은 병리 전문의들에게 공개되지 않았습니다23.
11. 효소결합면역흡착측정법
냉동 연골 조직의 무게를 측정한 후, pH 7.4의 인산완충식염수로 혼합하여 얼음 위에서 완전히 균질화하였다. 균질액을 4 °C에서 3,000 × g로 20분간 원심분리하고, 상층액을 수집하여 분석에 사용하였다. 조직 상층액 내의 interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α) 및 interleukin-6 (IL-6) 농도는 제조사의 지침에 따라 토끼 특이적 효소결합면역흡착측정법 키트를 사용하여 측정하였다.
12. 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응
페놀-클로로포름 기반 방법을 사용하여 연골 조직에서 총 RNA를 추출하였다. 간단히 설명하면, RNA 추출 시약을 사용하여 조직을 용해시킨 후, 클로로포름을 첨가하여 수성층과 유기층을 분리하였다. 수성층을 수집하고, isopropanol로 RNA를 침전시킨 후, 75% ethanol로 세척하고 공기 건조하여 diethyl pyrocarbonate 처리된 물에 용해하였다. 분광광도계를 사용하여 RNA 농도와 순도를 측정하였다.
역전사 전, 게놈 DNA 제거 시약을 사용하여 잔류 게놈 DNA를 제거하였다. 그 후 제조사의 지침에 따라 역전사 키트를 사용하여 상보적 DNA를 합성하였다. 실시간 중합효소 연쇄 반응 시스템에서 SYBR Green 기반 검출법을 사용하여 정량적 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다. 사이클 조건은 다음과 같다: 95 °C에서 1분간 초기 변성시킨 후, 95 °C에서 20초간 변성 및 60 °C에서 1분간 어닐링 및 신장 과정을 40회 반복하였다. 증폭 특이성을 평가하기 위해 해리 곡선 분석을 수행하였다.
matrix metalloproteinase-3 (MMP-3), matrix metalloproteinase-13 (MMP-13), SRY-box transcription factor 9 (SOX9), aggrecan, RIC8A 및 circPDE4B의 발현 수준을 측정하였다. β-actin을 내부 표준 유전자로 사용하였다. 상대적 발현량은 해당 방법을 사용하여 계산하였다. 프라이머 서열은 표 1에 제공되어 있다.
13. 웨스턴 블롯 분석
연골 조직을 phenylmethylsulfonyl fluoride가 첨가된 radioimmunoprecipitation assay 버퍼에서 용해했다. 용해물을 4 °C에서 12,000 × g로 15분 동안 원심분리하고, 상층액을 전체 단백질 분획으로 수집했다. 단백질 농도는 bicinchoninic acid 분석법을 사용하여 측정했다.
동일한 양의 단백질(레인당 30 µg)을 10% sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis로 분리하고, 메탄올로 사전 활성화시킨 polyvinylidene fluoride 막으로 전이시켰다. 전이는 4 °C에서 300 mA로 수행되었다. 전이 시간은 다음과 같다: aggrecan (250 kDa) 90분, MMP-3 (60 kDa), RIC8A (59 kDa), SOX9 (56 kDa) 및 MMP-13 (52 kDa) 50분, p38 MAPK (41 kDa) 및 GAPDH (36 kDa) 40분. 막을 Tween 20이 포함된 Tris-buffered saline 내의 5% 무지방 건조 탈지분유로 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 그 후 막을 4 °C에서 MMP-3 (1:2,000), MMP-13 (1:1,000), SOX9 (1:1,000), aggrecan (1:1,000), RIC8A (1:1,500), phosphorylated p38 MAPK (1:1,000) 및 total p38 MAPK (1:2,000)에 대한 1차 항체와 함께 하룻밤 동안 반응시켰다. GAPDH (1:2,000)를 로딩 컨트롤로 사용하였다. Tween 20이 포함된 Tris-buffered saline로 3회 세척(각 10분)한 후, 막을 horseradish peroxidase-접합 2차 항체 (1:20,000)와 함께 상온에서 1.2시간 동안 반응시켰다. 3회 추가 세척 후, enhanced chemiluminescence 기질을 사용하여 단백질 밴드를 시각화하고 젤 문서화 시스템으로 이미지를 획득하였다. 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화하였으며 GAPDH로 정규화하였다.
14. 면역조직화학염색
파라핀 포매된 연골 절편을 단계별 에탄올 시리즈(자일렌 3회 교체, 각 5분; 이어서 100%, 95%, 80% 에탄올 순으로 각 3분)를 통해 탈파라핀 및 재수화시켰다. 항원 회복은 압력솥 내의 EDTA 완충액(pH 9.0)에서 절편을 가열하여 수행하였다. 완충액을 끓는점까지 가열하고, 가압 후 2분 동안 회복 과정을 지속한 다음 실온으로 냉각하였다. 내인성 과산화효소 활성은 3% 과산화수소로 실온에서 10분간 차단하였다. 세척 후, 비특이적 결합을 차단하기 위해 염소 혈청을 사용하여 실온의 암실에서 20분간 처리하였다.
절편을 인산화된 p38 MAPK (1:800) 및 인산화된 nuclear factor kappa B (NF-κB) (1:300)에 대한 1차 항체와 함께 37 °C에서 60분 동안 반응시켰다. Tween 20이 포함된 인산염 완충 식염수로 3회 세척한 후, 적절한 horseradish peroxidase 접합 2차 항체와 함께 37 °C에서 30분 동안 반응시켰다. 3회 추가 세척 후, diaminobenzidine을 사용하여 발색시켰으며(현미경으로 제어), 이어서 헤마톡실린 대조 염색(2분), 70% 에탄올 내 1% 염산으로 분별 염색, 그리고 탄산리튬 용액으로 청색화(30초) 과정을 거쳤다. 그 후 절편을 탈수, 투명화, 봉입하고 광학 현미경을 사용하여 관찰하였다. 염색 정도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 평가하였으며, 반정량 분석을 위해 통합 광학 밀도를 계산하였다.
15. 통계 분석
데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였다. 여러 그룹 간의 비교는 일원 분산 분석(one-way analysis of variance) 후 Tukey의 사후 검정(Tukey’s post hoc test)을 사용하여 수행하였다. P < 0.05인 값을 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
결과
침도요법은 관절 연골의 조직학적 변화를 완화한다
그림 1A, B에서 보는 바와 같이, KOA 모델군은 대조군에 비해 무릎 둘레와 상대적 부종률이 유의하게 증가했다. 이러한 지표들은 침도요법 또는 celecoxib 치료 후 유의하게 감소한 반면, 가짜 침도요법은 KOA 모델군과 비교하여 유의한 개선을 보이지 않았다.
그림 1C,D에 나타난 바와 같이, Mankin 점수는 대조군보다 KOA 모델군에서 유의하게 높았으며, 침도요법 또는 celecoxib 처리 후 유의하게 감소하였다. 가짜 침도요법(sham acupotomy) 그룹에서는 유의한 감소가 관찰되지 않았다. Moran 점수는 이와 반대되는 양상을 보였다.
Hematoxylin 및 eosin과 Safranin O–Fast Green 염색 결과, 대조군과 비교하여 KOA 모델군에서 관절 연골 표면의 얇아짐과 불연속성 및 국소적 침식이 관찰되었다(그림 1E,F). 도침 요법과 celecoxib는 더 명확해진 연골 윤곽과 구조적 손상의 감소가 나타난 것으로 보아 이러한 병리적 변화를 개선시켰다. 반면, 가짜 도침 요법군은 KOA 모델군과 유사한 병리적 특징을 보였다. 이러한 결과는 도침 요법이 KOA 모델에서 관절 부종과 연골 퇴행을 감소시키고 조직학적 점수를 개선하는 데 있어 celecoxib와 유사한 효과를 나타냈음을 시사한다.
침도요법은 염증성 사이토카인 수치를 감소시킨다
그림 2A-C에 나타난 바와 같이, 연골 조직 균질액 내 interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α) 및 interleukin-6 (IL-6)의 농도는 대조군보다 KOA 모델군에서 유의하게 더 높았다. 침도요법 또는 celecoxib 치료는 이 세 가지 염증성 사이토카인의 수치를 모두 유의하게 감소시켰다. 반면, 가짜 침도요법(sham acupotomy)군은 KOA 모델군과 비교하여 유의한 감소를 보이지 않았다.
아큐포토미(Acupotomy)는 단백질 수준에서 RIC8A/p38 MAPK 신호 전달 경로를 조절한다
면역조직화학 분석 결과, 인산화된 p38 mitogen-activated protein kinase (p-p38 MAPK) 및 인산화된 nuclear factor kappa B (NF-κB)의 발현이 KOA 모델군에 비해 아큐포토미군과 celecoxib군에서 유의하게 낮게 나타났다 (그림 3A). 가짜 아큐포토미(sham acupotomy)군과 KOA 모델군 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
Western blot 분석 결과, KOA 모델군에서 matrix metalloproteinase-3 (MMP-3), matrix metalloproteinase-13 (MMP-13), resistance to inhibitors of cholinesterase 8A (RIC8A) 및 p-p38 MAPK의 단백질 수준이 대조군보다 유의하게 높게 나타난 반면, 연골 합성 관련 단백질인 SRY-box transcription factor 9 (SOX9)와 aggrecan의 수준은 유의하게 낮게 나타났습니다. KOA 모델군과 비교하여, acupotomy군과 celecoxib군은 MMP-3, MMP-13, RIC8A 및 p-p38 MAPK의 발현이 감소하고 SOX9와 aggrecan의 발현은 증가했습니다. sham acupotomy군은 KOA 모델군과 유사한 단백질 발현 양상을 보였으며, 측정된 단백질들에서 유의미한 변화가 없었습니다 (Figure 3B–I). 이러한 결과는 acupotomy와 celecoxib가 KOA에 미치는 효과가 RIC8A/p38 MAPK 신호 전달 경로의 조절과 관련이 있음을 나타냅니다.
도침요법은 전사 수준에서 RIC8A/p38 MAPK 신호 전달 경로를 조절한다
그림 4A-G에서 보듯이, MMP-3, MMP-13 및 RIC8A의 발현 수준은 대조군보다 KOA 모델군에서 유의하게 높았으며, 반면 SOX9 및 aggrecan의 발현은 유의하게 낮았다. KOA 모델군과 비교하여, 도침요법과 celecoxib는 MMP-3, MMP-13 및 RIC8A의 발현을 감소시키고 SOX9 및 aggrecan의 발현을 증가시켰다. 가짜 도침요법군은 측정된 전사 수준에서 KOA 모델군과 유의한 차이를 보이지 않았다.
침도요법은 또한 상대적인 circPDE4B 발현을 증가시켰으며, 이는 침도요법의 치료 효과가 circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK 신호 전달축의 조절 및 염증 및 이화 작용 신호의 감소와 관련이 있음을 나타냅니다.
데이터 가용성 :
ELISA, H&E 염색, 면역조직화학, RT‑qPCR, Safranin O–Fast Green 염색 및 western blot 데이터를 포함하여 본 연구의 결과를 뒷받침하는 원시 데이터는 Figshare 저장소(https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33090935)에서 공개적으로 이용 가능합니다.
그림 1. 침도요법은 무릎 골관절염 토끼의 무릎 부종과 관절 연골 퇴행을 감소시킨다. (A) 무릎 둘레. (B) 상대적 무릎 부종 비율. (C) Mankin 조직학적 점수. (D) Moran 조직학적 점수. (E) 대조군, KOA 모델군, celecoxib군, 침도요법군 및 가짜 침도요법군의 관절 연골 대표 hematoxylin 및 eosin 염색 절편. (F) 5개 실험군의 대표 Safranin O–Fast Green 염색 절편. 조직학적 점수 산정(Mankin 및 Moran)은 군당 10마리 토끼(n = 10) 전체 샘플을 사용하여 수행되었으며, H&E 및 Safranin O–Fast Green 염색의 대표 이미지는 군당 무작위로 선택된 3마리의 토끼에서 얻었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되었다. 통계적 비교는 일원 분산 분석(one-way analysis of variance) 후 Tukey의 사후 검정을 사용하여 수행되었다. 수평 막대는 비교된 군을 나타낸다. P < 0.05, P < 0.01, 및 P < 0.001. 스케일 바, 100 µm. 약어: KOA = 무릎 골관절염; SEM = 평균 표준 오차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 침도요법은 무릎 골관절염 토끼의 염증성 사이토카인 수치를 감소시킨다. (A) Interleukin-1β 농도. (B) Interleukin-6 농도. (C) Tumor necrosis factor-α 농도. 사이토카인 농도는 그룹당 6마리의 토끼(n = 6)에서 채취한 샘플을 대상으로 효소결합면역흡착분석법(ELISA)으로 측정하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되었다. 통계적 비교는 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey의 사후 검정을 사용하여 수행되었다. 가로 막대는 비교된 그룹을 나타낸다. P < 0.05, P < 0.01, 및 P < 0.001. 약어: IL-1β = interleukin-1β; IL-6 = interleukin-6; KOA = knee osteoarthritis; SEM = standard error of the mean; TNF-α = tumor necrosis factor-α. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 침도요법은 무릎 골관절염 토끼의 염증 및 연골 대사 관련 단백질을 조절한다. (A) 대조군, KOA 모델군, celecoxib군, 침도요법군 및 가짜 침도요법군의 관절 연골에서 phosphorylated nuclear factor kappa B 및 phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase 발현을 보여주는 대표적인 면역조직화학 이미지. 스케일 바, 100 µm. (B) SOX9, RIC8A, MMP-13, phosphorylated p38 MAPK, total p38 MAPK, MMP-3, aggrecan 및 GAPDH 발현을 보여주는 대표적인 Western blot. (C) GAPDH로 표준화한 aggrecan의 밀도 측정 정량 분석. (D) GAPDH로 표준화한 MMP-13의 정량 분석. (E) GAPDH로 표준화한 MMP-3의 정량 분석. (F) GAPDH로 표준화한 total p38 MAPK의 정량 분석. (G) GAPDH로 표준화한 phosphorylated p38 MAPK의 정량 분석. (H) GAPDH로 표준화한 SOX9의 정량 분석. (I) GAPDH로 표준화한 RIC8A의 정량 분석. Western blot 분석은 그룹당 3마리의 토끼 샘플을 사용하여 수행되었다 (n = 3). 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되었다. 통계적 비교는 일원 분산 분석 후 Tukey 사후 검정을 사용하여 수행되었다. 가로 막대는 비교 대상 그룹을 나타낸다. P < 0.05, P < 0.01 및 P < 0.001. 약어: GAPDH = glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; KOA = knee osteoarthritis; MAPK = mitogen-activated protein kinase; MMP-3 = matrix metalloproteinase-3; MMP-13 = matrix metalloproteinase-13; NF-κB = nuclear factor kappa B; p-NF-κB = phosphorylated nuclear factor kappa B; p-p38 MAPK = phosphorylated p38 MAPK; RIC8A = resistance to inhibitors of cholinesterase 8A; SEM = standard error of the mean; SOX9 = SRY-box transcription factor 9. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 4. 침도요법(Acupotomy)이 무릎 골관절염 토끼의 연골 대사 관련 전사체 및 circPDE4B 발현을 조절한다. (A) 상대적 aggrecan 발현. (B) 상대적 MMP-3 발현. (C) 상대적 MMP-13 발현. (D) 상대적 p38 MAPK 발현. (E) 상대적 SOX9 발현. (F) 상대적 circPDE4B 발현. (G) 상대적 RIC8A 발현. 발현량은 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)으로 측정하였으며 기준 유전자로 표준화하였다. 분석은 그룹당 6마리의 토끼 샘플을 사용하여 수행되었다(n = 6). 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되었다. 통계적 비교는 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey의 사후 검정을 사용하여 수행되었다. 수평 막대는 비교된 그룹을 나타낸다. P < 0.05, P < 0.01, 및 P < 0.001. 약어: circPDE4B = circular RNA phosphodiesterase 4B; KOA = 무릎 골관절염; MAPK = mitogen-activated protein kinase; MMP-3 = matrix metalloproteinase-3; MMP-13 = matrix metalloproteinase-13; RIC8A = resistance to inhibitors of cholinesterase 8A; SEM = 평균 표준 오차; SOX9 = SRY-box transcription factor 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 유전자 | 앰플리콘 크기 | 정방향 프라이머 | 역방향 프라이머 |
| (bp) | （5'→3'） | （5'→3'） | |
| β-actin | 113 | CAGCCCTCCTTCATCGGTAT | GACATGACGTTGTTGGCGTA |
| MMP-3 | 108 | TGTGAGTTGAAGTGGCTCAT | CCTGTTTGAACACCCGTAAC |
| MMP-13 | 119 | GGCTCCTAGGCAAGTACAAT | GTGTACGCCCATCAGGATAA |
| SOX9 | 85 | GGAGGAAGTCGGTGAAGAAT | GCCTTGAAGATGGCGTTG |
| 어그레칸 | 70 | TTGATGAGTGCCTTTCAAGC | CATGTGAAAGAGTCGATGGC |
| RIC8A | 100 | ATAAACTTTCCAGAGAGGAGTTGC | TCGATGACAGAGTACTGGTTG |
| p38 MAPK | 103 | TGTTCAAGGTCTCCCACAAG | TGCAGCTCCCTTATGATCTG |
| CircPDE4B | 174 | GTCATTTTGCCGAACTCCC | CATTATCATCTGCCGTCACTG |
표 1: 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 사용된 프라이머 서열. 표에는 표적 유전자, 예상 앰플리콘 크기, 5′에서 3′ 방향의 정방향 및 역방향 프라이머 서열이 나열되어 있습니다. 약어: bp = base pairs; circPDE4B = circular RNA phosphodiesterase 4B; MAPK = mitogen-activated protein kinase; MMP-3 = matrix metalloproteinase-3; MMP-13 = matrix metalloproteinase-13; RIC8A = resistance to inhibitors of cholinesterase 8A; SOX9 = SRY-box transcription factor 9.
토론
본 연구에서는 토끼 무릎 골관절염(KOA) 모델에서 도침요법의 치료 효과를 평가하고, circPDE4B 발현과 RIC8A/p38 마이토젠 활성 단백질 키나아제(MAPK) 신호 전달 축 사이의 연관성을 확인하였습니다. 도침요법은 관절 부종과 조직병리학적 변화를 개선하였으며, 전사체 및 단백질 수준 모두에서 염증 및 연골 대사 관련 마커를 변화시켰습니다.
침도요법 치료 후 interleukin-1β, tumor necrosis factor-α 및 interleukin-6의 감소는 이전에 보고된 침도요법의 면역 조절 효과와 일치했습니다21. 이러한 사이토카인들은 기질 분해 효소를 촉진하고 세포외 기질 합성을 억제함으로써 연골 퇴행에 기여합니다22,24,25. 전사체 및 단백질 수준에서 matrix metalloproteinase-3 (MMP-3)와 matrix metalloproteinase-13 (MMP-13)이 동시에 감소한 것은 침도요법이 KOA와 관련된 이화 작용을 억제함을 추가로 시사합니다.
주목할 만한 발견은 acupotomy로 유도된 circPDE4B 발현 변화와 RIC8A/p38 MAPK 경로 조절 사이의 연관성이었습니다. 이 경로의 비정상적인 활성화는 염증, 산화 스트레스 및 세포외 기질 분해와 관련이 있습니다. acupotomy 후 RIC8A 발현과 p38 MAPK 인산화의 감소는 해당 치료가 이 경로 내의 신호 전달 균형을 회복하는 데 도움이 될 수 있음을 시사합니다. circPDE4B 및 RIC8A/p38 MAPK 관련 마커의 상대적 변화가 조화를 이루는 것은 이전에 제안된 바와 같이26,27 circPDE4B가 분자 스캐폴드로 기능할 수 있다는 가설과 일치합니다. 하지만 현재의 결과는 상관관계만을 나타내며, circPDE4B가 acupotomy의 치료 효과를 매개한다는 점을 확립하지는 않습니다. 인과 관계를 결정하기 위해서는 기능 상실(loss-of-function) 및 기능 획득(gain-of-function) 연구가 필요합니다.
침도요법(acupotomy)과 circRNA 조절 사이의 잠재적 연관성은 본 연구의 중요한 측면입니다. 기계적 자극은 여러 조직에서 circRNA 발현에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다28,29,30,31. 하지만 침도요법으로 유도된 기계적 자극이 관절 연골 특이적 circRNA의 조절과 연결된다는 직접적인 증거는 여전히 제한적입니다. 치료 후 관찰된 circPDE4B의 상대적 발현 변화는 기계적 자극에 대한 직접적인 반응이거나 염증 감소에 따른 간접적인 반응일 수 있습니다. 제어된 기계적 자극과 연골세포 특이적 circPDE4B 조작을 결합한 향후 연구를 통해 이러한 가능성들을 구분하는 데 도움이 될 것입니다.
침도요법과 celecoxib은 서로 다른 작용 기전에도 불구하고 많은 측정 결과에서 유사한 경향을 보였습니다. 이러한 수렴 현상은 몇 가지 이유로 설명될 수 있습니다. 첫째, 두 치료법 모두 RIC8A/p38 MAPK 축과 nuclear factor kappa B 신호 전달을 포함한 공통의 하위 경로에 작용할 수 있습니다. 둘째, 관찰된 유사성은 경로 특이적 효과라기보다 연골 보호의 공통된 특성을 반영하는 것일 수 있습니다. 셋째, 선택된 마커들이 염증 및 연골 대사의 공통 종점을 나타낼 수 있으므로, 서로 다른 상위 기전을 구별하기에는 불충분할 수 있습니다. 유사한 효능이 동일한 기전을 의미하는 것은 아니며, 두 중재법 모두 골관절염 병리 네트워크26,32,33의 공통 구성 요소에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 전사체 또는 단백질체 프로파일링과 같은 비편향적 접근 방식은 치료법 특이적인 분자 서명을 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다.
침도요법과 सेले콕시브(celecoxib)의 유사한 효과는 임상적 관련성을 가질 수 있습니다. 침도요법은 장기적인 약물 사용과 관련된 일부 부작용을 피하면서 관절 주변의 기계적 요인을 해결하는 비약물적 치료 옵션을 제공할 수 있습니다. 하지만 토끼 모델이 인간의 무릎 골관절염(KOA)의 복잡성을 완전히 반영하지 못하므로, 이러한 해석에는 주의가 필요합니다. 이러한 전임상 결과가 더 광범위한 임상 적용을 뒷받침하기 위해서는 추가적인 중개 연구 및 임상 연구가 필요합니다.
몇 가지 한계점을 인정해야 합니다. 첫째, circPDE4B와 RIC8A/p38 MAPK 축 사이의 연관성을 기능 상실 또는 기능 획득 실험을 통해 검증하지 않았습니다. 둘째, 토끼 모델과 4주의 치료 기간은 인간 질환 및 장기적 결과에 대한 결론을 도출하는 데 한계가 있습니다. 셋째, 분자 분석에 상대적으로 적은 수의 동물 하위 집단을 사용하여 그룹 간의 미세한 차이를 검출하는 데 제약이 있었을 수 있습니다. 넷째, 선택된 마커 패널이 치료 특이적인 상위 메커니즘을 구분하지 못했을 가능성이 있습니다. 마지막으로, 침도요법(acupotomy)과 celecoxib에 대한 유사한 반응은 두 중재 방법이 수렴 경로 또는 독립적 경로를 통해 작용하는지 확인하기 위한 추가 조사가 필요합니다.
결론
침도요법은 KOA 토끼 모델에서 관절 부종, 염증성 사이토카인 수치, 연골 퇴행 및 이화 작용 마커 발현을 감소시켰습니다. 이러한 효과는 상대적인 circPDE4B 발현의 변화 및 RIC8A/p38 MAPK 신호 전달 축의 조절과 연관이 있었습니다. 본 연구 결과는 상관관계이므로, circPDE4B가 침도요법의 치료 효과를 직접적으로 매개하는지 확인하기 위한 추가적인 메커니즘 연구가 필요합니다.
공개 사항
저자들은 본 논문에 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 상충되는 재정적 이해관계나 개인적 관계가 없음을 밝힙니다.
감사의 글
본 연구는 중국 국가자연과학원(grant no. 81774436), 안후이성 임상 의료 연구 전환 프로젝트(grant no. 202427b10020136), 안후이성 교육부 과학 연구 프로젝트(grant no. 2023AH050824), 안후이 보건 연구 프로그램(grant no. AHWJ2023A30123) 및 안후이 중의학회 계승 및 혁신 연구 프로젝트(grant no. 2024ZYYXH153)의 지원을 받아 수행되었습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3% 과산화수소 | Fuzhou Maixin Biotech | SP kit-A3 | 면역조직화학 염색 중 내인성 peroxidase 활성을 차단함. |
| 4% 파라포름알데히드 | Biosharp | BL539A | 탈회 및 조직학적 처리 전 연골 조직을 고정함. |
| 아세트산 | Merck | A6283 | 70% 1% 염산 조제에 사용됨 |
| 접착 밴드 | Zhejiang Renkang | RK-8802 | 침도요법 후 사용됨. |
| Aggrecan 항체 | Proteintech | 13880-1-AP | 연골 단백질 추출물에서 aggrecan을 검출하는 데 사용되는 1차 항체. |
| 무수 에탄올 | Sinopharm Chemical Reagent | 10009228 | 조직학적 처리 중 조직 탈수 및 절편 재수화에 사용됨. |
| BCA 단백질 분석 키트 | Thermo Fisher Scientific | A55860 | 단백질 농도를 결정하는 데 사용됨. |
| Celecoxib | Biochempartner | BCP02156 | 경구 투여되는 대조 약물 치료제. |
| 원심분리기 | Anhui Jiawen Instruments | JW-3021HR | 원심 분리를 통해 조직 용해물 및 균질액을 맑게 하는 데 사용됨. |
| 클로로포름 | Nanjing Reagent | 67-66-3 | 총 RNA 추출 중 상 분리에 사용됨. |
| 시트르산 완충액, pH 6.0 | ZSGB-BIO | ZLI-9065 | 면역조직화학 염색 전 열 유도 항원 회복에 사용됨. |
| 크라이오튜브 | NEST Biotechnology | 607001 | 냉동 시료 보관에 사용됨 |
| DAB 기질 | Fuzhou Maixin Biotech | Kit-5230 | HRP 표지 면역조직화학 신호를 시각화하는 데 사용되는 발색 기질. |
| DEPC 처리수 | Generay Biotech | D1007 | RNA 용해 및 분자 생물학 절차에 사용되는 RNase-free water. |
| 일회용 침도요법 바늘, 0.35 mm × 25 mm | Ma'anshan Bond Medical Equipment | GB3525R | 침도요법 및 가짜 침도요법 절차에 사용되는 멸균 바늘-칼. |
| EDTA | biosharp | BL617A | 연골 포함 조직의 탈회 용액 조제에 사용됨. |
| 강화 화학발광 기질 | Thermo 340958 | 340958 | Western blot 밴드를 시각화하는 데 사용됨. |
| 에오신 용액 | Zhuhai Beso | BA4022 | 헤마톡실린-에오신 염색에 사용되는 대조 염색액. |
| Fast Green 용액 | Solarbio | G1371 | Safranin O–Fast Green 염색에 사용되는 대조 염색액. |
| GAPDH 항체 | Zsbio | TA-08 | Western blot 로딩 컨트롤로 사용되나 현재 목록에는 없음. |
| 겔 이미지 시스템 | Shanghai Peiqing Technology | JS-1070P | 화학발광 Western blot 이미지를 캡처함. |
| 유리 현미경 슬라이드 | CITOTEST | 188105 | 절편 부착에 사용됨 |
| Goat anti-mouse IgG, HRP-접합 | ZSGB-BIO | ZB-2305 | 마우스 1차 항체용 HRP-접합 2차 항체. |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP-접합 | ZSGB-BIO | ZB-2301 | 토끼 1차 항체용 HRP-접합 2차 항체. |
| 염소 혈청 | ZSGB-BIO | ZLI-9056 | 면역조직화학 염색 중 비특이적 항체 결합을 차단함. |
| GraphPad Prism, 버전 10 | GraphPad Software | Not applicable | 통계 분석 및 그래프 작성에 사용됨. |
| 헤마톡실린 용액 | Zhuhai Beso | BA4041 | 헤마톡실린-에오신 염색 및 면역조직화학 대조 염색에 사용되는 핵 염색액. |
| 균질기 | Witeg | SGCR-5-553-722 | ELISA 및 분자 분석을 위해 연골 조직을 균질화함. |
| 염산 | Merck | 7607 | 70% 1% 염산 조제에 사용됨 |
| Image Lab 소프트웨어 | Bio-Rad | Not applicable | Western blot 밴드의 밀도 분석에 사용됨. |
| Image-Pro Plus, 버전 6.0 | Media Cybernetics | Not applicable | Safranin O 염색 강도의 반정량 분석에 사용됨. |
| 이소프로판올 | Sinopharm Chemical Reagent | SCR40007960 | 총 RNA 추출 중 RNA를 침전시키는 데 사용됨. |
| 광학 현미경 | Olympus | CX41 | 염색된 연골 절편을 관찰하고 촬영하는 데 사용됨. |
| 의료용 마커 | edding | 497985 | 치료 지점을 표시하는 데 사용됨 |
| 메탄올 | Shanghai Suyi | 20180427 | PVDF 막을 활성화하는 데 사용됨 |
| 마이크로톰 | Leica | RM2016 | 파라핀 매몰 조직을 5 µm 두께의 절편으로 자름. |
| MMP-13 항체 | Bioss | bs-0575R | matrix metalloproteinase-13을 검출하는 데 사용되는 1차 항체. |
| MMP-3 항체 | Bioss | bs-43017R | matrix metalloproteinase-3를 검출하는 데 사용되는 1차 항체. |
| 중성 수지 | Wuxi Jiangyuan | ZLI-9516 | 염색된 조직 절편의 영구 표본 제작에 사용되는 봉입제. |
| 뉴질랜드 화이트 토끼 (수컷, 6개월령, 체중 2.0–2.5 kg) | Nanjing Pukou District Laifu Breeding Farm | SCXK (Su) 2024-0007 | 무릎 골관절염 모델링 및 치료 평가에 사용된 실험 동물. |
| 23번 메스 날 | Caisson | SCX08-100PC | 시료 수집 중에 사용됨. |
| 무지방 탈지분유 | Gene | 9999S | 차단 시약으로 사용됨. |
| p38 MAPK 항체 | Bioss | bs-0637R | total p38 MAPK를 검출하는 데 사용되는 1차 항체. |
| 파라핀 왁스 | Thermo | 8330 | 조직 매몰에 사용됨 |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | 조직 균질화, 세척 및 시약 조제에 사용됨. |
| 페니실린 | Jilin Huamu Animal Health Products | Not applicable | 수술 후 40,000 U/kg/day로 사용됨 |
| 펜토바르비탈 나트륨 | Beijing Chemical Reagents | 61222 | 마취용으로 3%, 30 mg/kg로 사용됨. |
| 인산 완충 식염수 | beyotime | ST448 | 면역조직화학 염색 중 조직 균질화 및 세척에 사용됨. |
| 생리 식염수 | servicevio | G4702 | celecoxib 현탁액 조제에 사용됨 |
| PMSF | Beyotime | ST506 | 단백질 추출 중 용해 버퍼에 첨가되는 단백질 분해 효소 억제제. |
| p-NF-κB 항체 | Santa | sc-136548 | 면역조직화학 분석에서 p- NF-κB를 검출하는 데 사용되는 1차 항체. |
| p-p38 MAPK 항체 | Bioss | bs-5476R | 인산화된 p38 MAPK를 검출하는 데 사용되는 1차 항체. |
| PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047A | 게놈 DNA 제거 및 RNA의 cDNA 역전사에 사용됨. |
| PVDF 막 | Millipore | IPVH00010 | Western blotting 중 단백질 전이에 사용되는 막. |
| Rabbit IL-1β ELISA 키트 | Jiyinmei | JYM0011Rb | 분석 시료 내 토끼 interleukin-1β의 양을 측정함. |
| Rabbit IL-6 ELISA 키트 | Jiyinmei | JYM0006Rb | 분석 시료 내 토끼 interleukin-6의 양을 측정함. |
| Rabbit TNF-α ELISA 키트 | Jiyinmei | JYM0003Rb | 분석 시료 내 토끼 tumor necrosis factor-α의 양을 측정함. |
| 실시간 PCR 시스템 | Thermo Fisher Scientific | PIKOREAL 96 | 형광 기반 정량적 PCR 증폭을 수행함. |
| RIC8A 항체 | Bioss | bs-11355R | RIC8A를 검출하는 데 사용되는 1차 항체. |
| RIPA 용해 버퍼 | Beyotime | P0013B | 연골 조직에서 총 단백질을 추출함. |
| Safranin O 용액 | Solarbio | G1371 | Safranin O–Fast Green 조직학 염색에서 연골 프로테오글리칸을 염색함. |
| SDS-PAGE 시약 또는 precast 겔 | Solarbio | S8010 | 겔 농도 또는 제품 포함. |
| SOX9 항체 | Bioss | bs-4177R | SOX9를 검출하는 데 사용되는 1차 항체. |
| 분광광도계 | Nanjing Wuyi Technology | OD1000+ | RNA 농도와 순도를 측정함. |
| 멸균 거즈 | Zhende | V505463 | 바늘 제거 후 압박에 사용됨. |
| SYBR Green Master Mix | Novoprotein | E096-01B | 정량적 PCR에 사용되는 형광 시약. |
| Tris 완충 식염수 | Solarbio | T8060 | Western blotting용 세척 및 차단 버퍼 조제에 사용됨. |
| TRIzol 시약 | Life Technologies | 15596018 | 총 RNA 추출에 사용되는 페놀–구아니딘 시약. |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | Tris 완충 식염수 및 인산 완충 식염수 세척액에 첨가되는 비이온성 계면활성제. |
| Weigert 철 헤마톡실린 용액 | Merck | 1.15973 | Safranin O–Fast Green 염색에 사용됨. |
| 자일렌 | Sinopharm Chemical Reagent | 10023428 | 탈파라핀 및 조직 투명화에 사용됨. |
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