두피침술과 운동을 병행하면 뇌졸중 후 경직성 쥐에서 PI3K/Akt 활성화를 유도하고 시냅스 가소성을 향상시킵니다

요약

본 연구는 뇌졸중 후 사지 경직의 쥐 모델에서 두피 침술과 운동을 결합했을 때 운동 피질 시냅스 가소성에 미치는 영향을 조사하고, PI3K/Akt 경로 활동과 치료 효과 간의 연관성을 탐구하는 것을 목표로 합니다.

초록

뇌졸중 후 경직(PSS)에 대한 효과적인 치료법은 제한적이며, 두피 침술과 운동(SAE)을 병행하여 PSS를 완화하는 기전은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 이 연구는 PSS를 가진 쥐에서 SAE의 효과를 조사하고, SAE가 PI3K/Akt 경로를 통해 시냅스 가소성을 조절하는지 여부를 탐구하였습니다. 중뇌동맥 폐색(MCAO) 쥐 모델을 구축하였고, 쥐들은 무작위로 다섯 그룹(Blank, Sham, MCAO, SAE, Baclofen)에 배정되었습니다. 모든 개입은 7일 연속으로 시행되었습니다. 신경 기능, 뇌 경색량, 조직병리학, 시냅스 초구조 및 관련 단백질 발현을 평가하였다. MCAO 그룹과 비교했을 때, SAE는 신경학적 결손을 개선하고, 근육 과긴장증 감소, 경색 부피 감소, 신경 손상 완화, 시냅스 수를 증가시키고, 시냅스 형태를 개선했습니다. SAE는 또한 교세포주 유래 신경영양인자(GDNF), 인산화된 PI3K(p-PI3K), 인산화된 Akt(p-AKT), 그리고 시냅토피신(SYN), 시냅스 후 밀도 단백질 95(PSD-95), 성장 관련 단백질 43(GAP-43)을 상향 조절하였습니다. 면역형광 염색 결과, SAE 치료 후 운동 피질에서 SYN과 p-Akt의 발현이 증가함을 시사하였다. 이 결과는 SAE가 GDNF의 상향 조절을 통한 PI3K/Akt 신호 활성화와 상관관계가 있어 시냅스 가소성을 개선하고 PSS 증상을 완화할 수 있음을 시사합니다. 이 연구는 PSS를 가진 쥐에서 SAE의 효과를 조사하고, SAE 개입, PI3K/Akt 경로 활성, 시냅스 가소성 간의 잠재적 연관성을 탐구하였습니다.

서론

뇌경색은 전 세계적으로 주요 사망 및 장애 원인으로 남아 있습니다. 허혈과 저산소증은 뉴런을 손상시키고, 운동 회로의 흥분-억제 균형을 깨뜨리며, 운동 기능 장애를 초래합니다^. 뇌졸중 후 경직은 근육 긴장도 증가와 관절 가동성 감소로 나타나며, 이는 일상 생활 활동에 지장을 주고 돌봄 제공자의 부담을 증가시킵니다². 바클로펜과 같은 항경련제는 일시적인 증상 완화를 제공할 수 있지만, 장기간 사용하면 약물 내성과 부작용이 발생할 수 있으며, 신경 기능 손상을 회복시키지 못합니다³. 기존 운동 재활은 효과가 느리게 나타나고 치료 기간이 길다는 점도 제한적입니다. 따라서 더 안전하고 효과적인 치료 전략이 시급히 필요하며, 그 기전의 기전은 추가 조사가 필요합니다. 신경가소성은 뇌졸중 후 기능 회복의 중심 메커니즘이며, 시냅스 재형성, 축삭 재생, 신경 생존을 포함합니다^. 허혈성 뇌졸중 후에는 경색 중심부의 뉴런이 급격히 사라지고, 국소 염증 반응이 허혈 반낭의 조직 손상을 악화시킵니다; 이 두 과정이 함께 작용하여 뇌 손상을 유발합니다 ^5,6. 신경가소성의 핵심 요소인 시냅스 가소성은 시냅스 관련 단백질, 예를 들어 시냅토피신(SYN), 성장 관련 단백질 43(GAP-43), 그리고 시냅스 후 밀도 단백질 95(PSD-95^)7,8,9를 통해 평가할 수 있습니다.

신경영양 인자는 시냅스 가소성의 분자적 기반을 제공합니다. 교세포주 유래 신경영양인자(GDNF)는 신경세포의 생존과 수리를 촉진하고, 염증을 억제하며, 시냅스 미세환경을 개선하기 때문에 특히 중요합니다¹⁰. GDNF는 Ret 수용체에 결합함으로써 PI3K/Akt를 활성화할 수^{있습니다.} PI3K/Akt 연쇄 반응은 신경계에서 생존을 촉진하는 주요 경로이며, 활성화되면 세포자멸사를 억제하고 시냅스 재형성에 필요한 단백질 합성을 지원한다^12,13. 두피 침술과 운동(SAE)은 두피 침술 자극과 능동적 운동 훈련을 결합한 통합 재활 전략입니다. 이 방법의 전반적인 목표는 동시에 중추 신경 활동을 조절하고 작업 관련 운동 회복을 촉진하여 근육 과긴장을 줄이고 뇌졸중 후 기능적 결과를 개선하는 것입니다. SAE는 중국에서 뇌졸중 후 경직(PSS) 치료에 널리 사용됩니다. 이 결합 접근법의 근거는 두피 침술이 피질 흥분성과 뇌 관류를 조절할 수 있는 반면, 운동 치료는 기능 회복과 시냅스 재형성을 촉진하는 활동 의존적 운동 훈련을 제공하기 때문입니다. 운동 치료만을 병행하는 것과 비교하면, 이전 임상 증거에 따르면 두피 지점의 두피 침술과 운동 치료가 사지 경직을 더 줄이고 뇌졸중 후 사지 경련 환자에서 운동 기능과 일상생활 활동을 개선하는 것으로 나타났습니다¹⁴.

최근 체계적 문헌고찰과 메타분석에서는 운동형 두피침술 또는 관련 두피침술-운동 병행 중재가 단일 성분 또는 순차적 중재보다 경직, 운동 기능, 균형 및 일상 생활 활동에서 더 큰 개선을 제공한다는 점을 시사하며, 동시 신경조절과 운동 훈련의 잠재적 이점을 지지합니다¹⁵. 전임상 연구들은 SAE 또는 관련 운동형 두피침술 프로토콜이 5-HT₂A 수용체 매개 척추 KCC2 재활성화를 통해 뇌 혈류를 개선하고 경직을 완화할 수 있음을 보여주었다^16,17. 최근 연구는 침술이 PI3K/Akt 신호를 통해 신경가소성을 촉진한다고 추가로 제안합니다^. 따라서 SAE는 뇌졸중 후 신경 가소성, 운동 회복, 경직 감소의 조절이 주요 치료 목표인 실험 및 임상적 맥락에 특히 적합할 수 있습니다. 그러나 SAE, GDNF/PI3K/Akt의 신호 전달, 그리고 시냅스 가소성 간의 PSS 완화 잠재적 연관성은 아직 잘 이해되지 않았습니다. 본 연구는 SAE가 신경학적 결손과 근육 경직에 미치는 영향을 평가하고, 개입 후 GDNF 발현, PI3K/Akt 경로 활동, 시냅스 가소성 관련 단백질의 변화를 특성화하기 위해 PSS의 쥐 모델을 확립하였습니다. 이 연구는 SAE가 PSS에 적합한 재활 전략인지 판단하고 그 잠재적 작용 기전을 명확히 하는 데 실험적 증거를 제공할 수 있습니다.

프로토콜

모든 절차는 창춘중의대학 동물윤리위원회(승인번호 20251038)의 승인을 받았으며, 동물 연구: 생체 내 실험 보고(ARRIVE 2.0) 지침과 NIH 실험동물 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 모든 재료 는 재료표에 표시되어 있습니다.

실험적 절차
실험 동물과 그룹 분류
중국 창춘 관청구의 홍다 동물 육종 농장에서 80마리의 특정 병원체가 없는(SPF) 성체 수컷 스프레이그–도울리 쥐(220–250g)를 구입하였습니다. 동물들은 창춘 중의대학 실험동물센터에 22–25°C, 상대습도 50–60%, 12시간의 밝고 어둠 주기를 유지하며 자유롭게 먹이와 물을 이용할 수 있는 환경에서 수용되었습니다. 적응 1주일 후, 쥐들은 무작위로 빈 그룹(n = 12), 샴 그룹(n = 12), 모델 예비군(n = 56)에 배정되었습니다. 빈 그룹은 정상 미처리 대조군으로 포함되어 건강한 쥐에서 행동 수행, 조직병리학적 특징, 분자 표지 발현에 대한 기초값을 제공하였습니다. 샴 그룹은 MCAO 그룹과 동일한 마취 및 외과적 노출을 받았으나, 동맥 폐색은 시행되지 않았다; 따라서 이 그룹은 마취와 외과적 조작의 잠재적 효과에 대한 대조군 역할을 했습니다. 블랭크와 샴 그룹을 모두 포함함으로써 허혈성 손상의 영향이 수술 자체와 관련된 것과는 구별될 수 있었다.

모델 예비군은 MCAO 모델링을 받았습니다. 수술 후 첫 3일은 모델 유도 기간으로 정의되었습니다. 이 기간 동안 56마리 중 8마리가 사망하여 사망률은 14.29%에 달했고, 모델링이 실패해 12마리는 제외되었습니다. 모델 확립에 성공한 나머지 36마리의 쥐는 무작위 숫자 표를 사용해 MCAO, SAE, 바클로펜 그룹에 무작위로 배정되었으며, 각 그룹에는 12마리씩 배정되었습니다. 그룹 개입은 다음과 같았습니다: (I) 빈 그룹: 일상적인 급식 제공만 하고 개입은 없었다. (II) 샴 그룹: 결찰이나 필라멘트 삽입 없이 총경동맥, 내외경동맥, 미주신경의 외과적 노출. (III) MCAO 그룹: MCAO는 복막 내 마취 하에 3% 펜토바르비탈나트륨을 투여하였으며, 이후 치료는 없었습니다. (IV) SAE 그룹: MCAO 모델링과 검증에 성공한 후, 쥐들은 운동과 함께 두피 침술을 받았습니다. 1.5%–2.0% 용량의 아이소플루란 흡입 마취는 짧은 주사 삽입 단계에만 사용되었습니다. 러닝머신 훈련은 의식이 완전히 회복되고 자발적인 보행 능력이 회복된 후에야 시작되었다. 침술은 GV20과 양측 EX-HN1에서 시행되었습니다. 바늘은 1mm 깊이로 삽입되어 러닝머신 훈련 기간 동안 유지되었습니다. 표준화된 30분 바늘 고정/훈련 기간은 러닝머신 훈련 기간으로 정의되었으며, 10분 동안 6m/분, 이어서 0° 경사에서 분당 12m/분 20분으로 구성되었습니다. 중재는 7일 연속으로 하루 한 번 시행되었습니다. (V) 바클로펜 그룹: MCAO 모델링과 검증에 성공한 후, 쥐들은 7일 연속 하루 0.4 mg/kg의 위내 가비지로 바클로펜을 투여받았습니다.

MCAO 모델의 설립
쥐 MCAO 모델은 수정된 광간 섬유 방법¹⁹를 사용하여 확립되었습니다. 12시간 금식과 물 박탈 후, 쥐들은 복막 내 3% 펜토바르비탈나트륨 주사로 마취하고 누운 자세로 눕혔습니다. 피부 소독 후, 오른쪽 총경동맥(CCA)과 인접한 신경 및 근육을 노출시키기 위해 경추 중앙 절개를 하였습니다. 외경동맥(ECA)을 확인하여 결찰했으며, 내경동맥(ICA)을 분리하였습니다. 근위 중추측근과 중추측근부에 인자결대가 삽입되었고, 원위 근위부근부는 임시로 압박되었습니다. 그 후 클램프 근위부의 CCA에 작은 동맥 절개술이 시행되었습니다. 0.26mm 나일론 필라멘트를 삽입하고 ICA를 통해 18–20mm 전진하여 중뇌동맥의 기원을 막았습니다. 이후 ICA와 CCA를 결찰하고 절개 부위를 봉합했습니다. 수술 후 쥐들은 회복 기간 동안 따뜻하게 유지되었고, 감염을 막기 위해 페니실린(40,000 U) 복막 내 주사를 맞았습니다. 샴 그룹에서는 필라멘트 삽입 없이 혈관 노출만 시행되었고; 상처 봉합 및 수술 후 관리는 MCAO 그룹과 동일하였다. 성공적인 모델 구축은 수술 후 3일 시점의 Zea Longa 점수 2≥¹⁹ 점과 수정된 Ashworth 척도(MAS) 근긴장 점수 1점≥²⁰점으로 정의되었습니다.

인터버전 방법
두피 침술과 운동 개입을 결합합니다
이전 연구에 따르면 MCAO 쥐에서 신경학적 결손은 수술 후 3일째에 최고조에 달하고 10일 이내에 높게 유지되며, 말초 근육 저항은 6일째부터 9일째까지 점차 증가하는 것으로^나타났습니다. 따라서 치료 3일째부터 시작하여 자연 회복의 영향을 최소화하기 위해 7일 연속으로 하루 한 번 계속 진행하였습니다. 모델링 전, SAE 그룹에 배정된 쥐들은 5분당 3일간 적응형 러닝머신 훈련을 10분/²²일에 걸쳐 받았다. 이 적응 훈련은 쥐들이 러닝머신 달리기에 익숙해지도록 하고, 정식 개입 기간 동안 몸부림치기, 넘어짐, 달리기를 거부하거나 멈추는 가능성을 줄이는 데 사용되었습니다. 적응 훈련과 공식 개입 과정에서 러닝머신 관련 비정상 사건은 지속적인 저항, 달리기 레인에서 떨어짐, 1분 이상 달리기 거부, 러닝머신 훈련 중 1분 이상 멈추는 것으로 정의되었습니다. 이러한 사건들은 관찰 시 실험 기록에 기록되었습니다. 짧은 망설임이나 일시적인 멈춤은 부드럽게 재개할 수 있다면 제외로 이어지지 않았습니다. 데이터는 반복적인 낙상, 지속적인 달리기 거부, 심한 고통으로 인해 지정된 일일 러닝머신 세션을 완료하지 못한 경우에만 제외되었습니다. 3일째 모델 검증에 성공한 후, SAE 개입은 7일 연속 하루 한 번 시행되었습니다.

각 치료 세션마다 쥐에게 1.5%–2.0% 이소플루란으로 마취를 투여했습니다. 마취는 바늘 삽입 직후 중단되었습니다. 실험 실무에서는 쥐가 이소플루란 금단 후 약 1–2분 이내에 완전한 의식을 회복하는 경우가 많았습니다. 쥐가 마취된 상태에서는 러닝머신 훈련이 시작되지 않았습니다. 2020년 중국 침술-뜸협동협회가 발표한 '실험동물 흔적 경혈의 명명법 및 국소화'에 따라 숙련된 동물 침술사들이 경혈을 찾았습니다. GV20은 두개골 중앙선에서 앞뒤 천문을 연결하는 선의 중점으로 정의되었습니다. 양측 EX-HN1 포인트는 GV20 옆으로 2mm 떨어진 곳에 위치했다. 0.25mm× 13mm 크기의 일회용 바늘이 수직으로 깊이 1mm까지 삽입되어 표준화된 30분 러닝머신 훈련 기간 내내 유지되었습니다. 바늘은 이동을 방지하기 위해 통기성 의료용 테이프로 고정되었고, 시술의 일관성을 위해 두개골 관통은 촉진으로 배제되었다. 러닝머신 훈련 전, 비정상적인 달리기 행동이 있을 경우 잠시 멈추는 시간, 그리고 훈련 종료 직후 바늘 위치와 테이프 고정 상태를 점검하였습니다. 또한, 러닝머신 훈련 중 동물 행동과 관계없이 바늘 위치를 5분마다 육각적으로 점검했습니다. 바늘 변위는 눈에 띄는 느슨함, 바늘 각도 변화, 부분 철수, 또는 러닝머신 달리기 중 완전히 이탈하는 것으로 정의되었습니다. 바늘 위치 손실 없이 약한 느슨한 부분이 발생하면, 러닝머신을 잠시 멈추는 동안 테이프를 부드럽게 보강했습니다. 주사바늘이 부분적으로 빠지거나 완전히 빠져나간 경우, 그 세션 동안 바늘을 다시 삽입하지 않았다; 쥐는 추가 바늘 조작 없이 남은 러닝머신 훈련을 완료했으며, 이 사건은 실험 기록에 기록되었습니다. 동물은 단 한 번의 바늘 변위 사건만으로 제외되지 않았으며, 러닝머신 훈련 불능이나 심각한 고통 징후가 동반된 경우는 예외였다.

표준화된 30분 바늘 고정/훈련 기간은 쥐가 이소플루란 마취에서 완전히 회복한 후 러닝머신 달리기를 시작할 때 시작되어, 러닝머신 훈련이 끝난 후 바늘을 제거하면 즉시 종료되었습니다. 이소플루란 중단 후 짧은 회복 기간은 표준화된 30분 훈련 기간에 포함되지 않았습니다. 회복 전에 바늘을 삽입했기 때문에, 실제 신체적 유치 시간은 러닝머신 훈련 30분 시간보다 약 1–2분 더 길었습니다. 이 정의는 SAE 그룹의 모든 쥐에 일관되게 적용되었습니다. 다음 기준을 충족하면 쥐가 러닝머신 훈련을 시작할 만큼 충분히 회복된 것으로 간주되었습니다: 의식의 완전한 회복, 독립적으로 서 있을 수 있는 능력, 평평한 표면에서 꾸준히 걷는 능력, 그리고 부드러운 외부 자극에 대한 정상적인 반응. 이 기준들은 러닝머신에 배치되기 전에 확인되었습니다.

바늘 고정 기간 동안 쥐들은 0° 경사로 러닝머신 운동을 수행했습니다: 분당 6m, 10분간 12m, 분당 20분. 연구 중 어느 시점에서도 전기 충격은 사용되지 않았습니다. 만약 쥐가 정식 훈련 중 1분 이상 달리기를 멈추거나 달리기를 거부하면, 러닝머신 벽을 가볍게 두드리는 등 부드럽고 비혐오적인 청각 자극을 사용하여 움직임을 유도했습니다. 이러한 유도 사용과 몸부림, 넘어짐, 멈추기, 달리기 거부, 바늘 이동 등의 행동은 관찰 시 실험 기록에 기록되었습니다. 이러한 사건들은 관찰 시 기술적으로 모니터링되고 실험 로그에 기록되었습니다. 운동 강도는 이전에 보고된 두피침술과 러닝머신 훈련을 결합한 프로토콜을 바탕으로 포괄적으로 조정되었다^16,23. SAE 중재는 7일 연속으로 하루 한 번 시행되었습니다(그림 1A).

바클로펜 개입
모델 검증에 성공한 후, 바클로펜 그룹의 쥐들은 0.4 mg/kg의 용량으로 위내 가바지로 바클로펜 용액을 투여받았습니다. 이 약물은 7일 연속으로 매일 오전 9시에 한 번 투여되었습니다.

결과는 확실합니다
일반 관찰
체중, 정신 상태, 음식과 물 섭취, 자발적 활동 등 모든 그룹에서 매일 전반적인 상태를 모니터링하였다.

신경 기능 및 근육 긴장도 평가
신경계 결손과 사지 경직은 Zea Longa 점수, 수정 신경 심각도 점수(mNSS), 수정 Ashworth 척도를 사용하여 모델 검증 후 1, 3, 5, 7일차에 평가되었습니다. 모든 시점에서의 행동 평가는 관찰 기간 내내 그룹 배정에 눈이 멀어진 두 명의 연구자가 독립적으로 수행하였습니다. 상세한 점수 기준이 제시되어 있습니다(표 1–3).

뇌경색량 측정
뇌경색량은 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 염색(TTC) 염색법을 사용하여 평가하였다. 7일간의 개입 후, 각 그룹에서 3마리의 쥐를 무작위로 선별하여 복강내 펜토바르비탈 나트륨 과다복용으로 안락사시키고, 신속한 절단 수술을 통해 전뇌 채취를 진행하였습니다. 뇌는 먼저 −20 °C에서 냉동된 후 두께 2mm의 코로나 조각으로 잘라졌다. 이 절편들은 2% TTC 용액에서 37°C에서 30분간 어두운 환경에서 배양한 후, 4% 파라포름알데히드 4°C에서 하룻밤 고정시켰습니다. 다음 날, 모든 구역이 디지털 카메라로 촬영되었습니다. 정상적인 뇌 조직은 짙은 붉은색으로 염색되었고, 경색된 조직은 연한 흰색으로 보였다. 경색 부위는 ImageJ로 정량화되었고, 경색량은 다음과 같은 공식으로 백분율로 표현되었습니다:

심경 부피 (%) = 경색 면적 / 뇌 전체 절면 면적 X 100%.   (1)

뇌 조직의 조직병리학적 검사
헤마톡실린-에오신(HE) 염색
헤마톡실린과 에오신 염색을 사용하여 경색 주위 피질의 조직병리학적 변화를 평가하였다. 7일간의 개입 후, 쥐들은 복막 내 펜토바르비탈 나트륨 과다 투여로 안락사되었다. 그 후 0.01 M 인산염 완충식염수(PBS)로 신속 심경관류를 시행하여 혈액을 제거하고, 이어서 고정을 위해 4% 파라포름알데히드 250mL를 차갑게 투여하였습니다. 전체 뇌를 채취하고, 경색 주위 피질 조직을 분리하여 4% 파라포름알데히드에 4°C에서 24시간 고정하였다. 조직은 파라핀으로 내장되어 5 μm 크기로 코로나로 절개되었습니다. 섹션은 슬라이드에 장착되어 60°C에서 30분간 베이킹한 후 자일렌 I–III에 탈파라핀(각각 10분씩)되었습니다. 그 후 HE 염색이 시행되었고, 이어서 탈수 및 제거가 이루어졌습니다. 마지막으로 중성 발삼으로 조각을 덮고, 니콘 광각 현미경으로 이미지를 촬영했습니다.

니슬 스테인
Nissl 염색은 경색 주위 부위의 신경 생존 및 Nissl 체체 밀도를 평가하는 데 사용되었습니다. 7일간의 개입 후, 쥐들은 안락사시키고 0.01 M PBS(37 °C)로 경심 관류를 한 뒤, 4% 파라포름알데히드 250 mL(4 °C)를 투여했습니다. 전체 뇌를 제거하고, 경색 주위 조직과 반대쪽 피질 조직을 박리하여 4% 파라포름알데히드에 4°C에서 하룻밤 고정하였습니다. 파라핀 임베딩 후 5 μm 절편이 준비되었습니다. 절편은 자일렌에서 10분간 탈파라핀화되고, 등급별 에탄올 용액(95%, 90%, 80%, 70%, 50%, 각 농도별 5분)으로 재수화되었으며, 니슬 작업 용액으로 상온에서 30분간 염색했습니다. 증류수로 짧게 헹군 후, 절간은 등급 에탄올로 탈수하고, 자일렌에 2분간 세척한 후 덮개를 부착했습니다. 이미지는 촬영되어 광학 현미경으로 분석되었습니다.

서부 블롯 분석 단백질 출현
서부 블로팅은 PI3K/Akt 신호 전달과 시냅스 가소성에 관여하는 단백질을 평가하기 위해 수행되었습니다. 7일간의 개입 후, 쥐들은 펜토바르비탈 나트륨 과다복용으로 안락사되었고, 경색 주위 운동 피질 조직을 채취하였다. 조직은 방사면역침전 분석법(RIPA) 용해 완충제에서 완전히 균질화되어 얼음 위에 올린 후 1610 × g , 4 °C에서 30분간 원심분리하여 총 단백질을 추출하였습니다. 단백질 농도는 상업용 비신코닉산(BCA) 단백질 분석 키트를 사용하여 정량화하였습니다. 동일한 양의 단백질(레인당 50 μg)을 나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리한 후 전기적으로 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 전달하였다. 막은 5% 소 혈청 알부민(BSA) 용액으로 실온에서 1시간 동안 차단하여 비특이적 결합을 제거한 후, 4°C에서 1차 항체와 함께 하룻밤 배양했습니다. Tris 완충 식염수와 Tween-20(TBST) 완충제로 세 차례 세척한 후, 막을 2차 항체(희석 비율 1:1000)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅했습니다. 단백질 밴드는 증강된 화학발광(ECL)을 사용해 시각화되었고, 밴드 강도는 ImageJ로 정량화하였습니다. 상대 단백질 발현은 표적 단백질과 내부 대조군의 비율로 계산되었습니다. 1차 항체는 다음과 같다: GAPDH (1:1000), PI3K (1:1000), 인산-PI3K (1:1000), Akt(1:1000), 인산-Akt(1:1000), GAP-43 (1:1000), SYN (1:1000), PSD-95 (1:1000), GDNF (1:1000).

시냅스 초구조 관측
투과 전자현미경(TEM)을 사용하여 시냅스 수와 구조적 완전성을 평가하였습니다. 7일간의 개입 후, 쥐들은 마취 후 4% 파라포름알데히드와 2.5% 글루타알데히드 혼합 고정제로 심경관류를 투여하였다. 경색 주위 피질 조직 블록(1mm × 1 mm × 1 mm)을 채취하여 2.5% 글루타알데히드에 2시간 고정한 후, 1% 오스뮴 테트록사이드로 1시간 고정하였습니다. 샘플은 등급별 에탄올 탈수, 에폭시 수지 임베딩, 초박형 절단(50nm 두께), 우라닐 아세테이트와 시트레이트 납 이중 염색을 통해 처리되었습니다. 시냅스 초구조는 투과 전자현미경으로 관찰되었습니다. 구조 평가를 위해 이미지는 8,000×에서 촬영되었고, 시냅스는 5,000×에서 측정되었습니다. 그룹당 세 개의 무작위 신경세포장을 분석하여 평균 시냅스 수를 계산하고, 데이터를 일방향 ANOVA로 비교하였습니다.

면역형광 이중 표지 분석
면역형광 이중 표지 염색을 통해 SYN과 p-Akt의 발현과 분포를 평가하였다. 7일간의 개입 후, 쥐들은 복막 내 펜토바르비탈 나트륨 과다복용으로 안락사되었고, 경막 주위 피질 조직을 신속히 박리하였다. 시료는 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 고정된 후 최적 절단 온도 화합물(OCT)에 박힌 후 두께 10μm 조각으로 절단되었습니다. 절편은 상온에서 1시간 동안 자연건조한 후 TBST 버퍼로 세 차례 세척하여 잔여 OCT 화합물을 제거했습니다. 절편들은 0.3% Triton X-100으로 실온에서 20분간 투과시키고, PBS로 헹군 후 5% BSA 용액으로 실온에서 1시간 동안 차단하였습니다. 암 조건에서 4°C에서 토끼 항-SYN(희석 1:200)과 토끼 항-p-Akt(희석 1:200) 1차 항체와 함께 절편을 하룻밤 배양하였다. 다음 날, 절편을 PBS로 세 번 세척하고, 2차 항체(희석 1:400)와 함께 실온에서 50분간 어두운 곳에서 배양하였습니다. TBST 버퍼로 6차례 세척한 후, 세포 핵은 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 작업 용액으로 실온에서 5분간 교환 염색되었다. 이미지는 형광 현미경을 사용하여 동일한 노출 및 배경 환경에서 획득하였습니다. 대표 이미지를 사용해 그룹 간 운동 피질의 SYN 및 p-Akt(p-Akt) 발현 패턴을 평가하였다.

통계 분석
통계 분석은 GraphPad Prism 10.1.2와 IBM SPSS Statistics 25를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 제시됩니다. Zea Longa 점수, 수정 신경학적 심각도 점수, 수정 Ashworth 척도를 포함한 여러 시점에서 수집된 행동 데이터는 그룹을 피험자 간 요인으로, 시간을 피험자 내 요인으로 하는 양측 반복 측정 ANOVA를 사용해 분석하였습니다. 주요 효과나 상호작용이 유의미하게 발견될 경우, 시닥의 다중 비교 검정이 사후 분석에 사용되었습니다. 다른 데이터는 일원 ANOVA를 사용한 후 Sidak의 다중 비교 검정을 통해 사후 비교를 수행하였습니다. 양측 p. < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 막대그래프에서는 해당 그림 전설에 정의된 별표로 통계적 유의성을 나타냅니다.

결과

SAE는 PSS 쥐의 신경 기능을 개선하고 근육 경직을 감소시킵니다
SAE가 뇌졸중 후 경직 후 쥐의 행동 기능 장애에 대한 치료 효과를 모델 검증 후 1, 3, 5, 7일째(n=12일)에 Zea Longa 점수, 수정 신경 심각도 점수, 수정 Ashworth 척도를 사용하여 평가하였다. Zea Longa 점수와 mNSS는 신경학적 결손 평가에 사용되었고, MAS 점수는 근긴장도/경직 평가에 사용되었습니다. 모델링 후, 블랭크와 샴 그룹의 쥐들은 꾸준한 체중 증가, 정상적인 행동, 그리고 활동 유지를 보였다. 반면, MCAO 그룹의 쥐들은 체중 감소, 무기력, 식단 감소, 왼쪽 팔다리 움직임 제한을 보였습니다. 치료 후 SAE군과 바클로펜군 모두 점차 체중을 회복하고 MCAO 그룹에 비해 행동 상태가 개선되었습니다(그림 2).

Ze...

토론

이전 임상 연구들은 두피 침술과 운동을 병행하면 뇌졸중 후 경직 환자의 경련성 증상을 완화하고 운동 기능과 일상 생활 활동량을 개선할 수 있음을 보여주었습니다(ADL)^14,24. 이러한 발견은 임상적 가치를 뒷받침합니다. 본 연구는 Zea Longa 점수, mNSS, MAS를 포함한 세 가지 행동 측정을 사용하여 쥐 모델에서 SAE의 치료적 이점을 추가로 확인했습니다. 반복된 행동 평가 결과, SAE는 시간이 지남에 따라 신경학적 결손과 근육 과긴장증 감소를 개선했으며, 모델 그룹보다 더 명확하고 조기 개선 추세를 보였습니다. 이러한 행동 개선은 SAE가 신경 수리와 운동 조절 모두에 실질적인 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 그러나 행동 개선만으로는 조직 수준이나 분자 기전의 근본적인 메커니즘을 밝혀낼 수 없습니다. 따라서 뇌경색량, 신경 손상, 시냅스 초구조, ...

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining solution	Beyotime	C0651	TTC staining
3MM Filter Paper	Whatman, UK	3030861	Western blot transfer
AKT Antibody	Affinity	AF0836	Primary antibody
Acetone	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10000418	Infiltration of electron microscopy specimens
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	Version 29.5 (64-bit), https://www.adobe.com/products/illustrator.html	64-bit version, used for graphic editing and scientific figure preparation
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	100092683	Deparaffinization of paraffin sections
Anti-fade mounting medium	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1020	coverslipping
BCA Protein Assay Kit	MDL	MD913053	Protein concentration determination
Bluishing solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	Hematoxylin staining
Chemiluminescence Imaging System	CLINX, China	ChemiScope6100	System Detect target protein
Concentrated normal goat serum	Boster Biological Technology	AR1009	serum blocking
DAPI	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1030	nuclear staining
Diamond Knife	Daitome	Ultra 45°	Slice ultrathin specimens
Differentiation solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	HE staining
Drying Oven	Tianjin Labory Instruments Equipment Co., Ltd.	GFL-230	Bake fixed tissue slices
EDTA (pH 9.0) antigen retrieval solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1052	Antigen retrieval
Electron microscopy fixative	ASPEN	AS1063	Fixation of electron microscopy specimens
Electrophoresis Power Supply	Longfang	LF-2000	Provide electrophoresis voltage
Embed 812 embedding medium	SPI	90529-77-4	Infiltration of electron microscopy specimens
EndNote X9	Clarivate Analytics (US) LLC	Version X9, https://endnote.com/	Used for reference management and academic citation formatting
Freezing Stage	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-L5	Freeze frozen tissue blocks
GAP-43 Antibody	Affinity	Df7766	Primary antibody
GAPDH Antibody	Affinity	AF7021	Primary antibody
GDNF Antibody	Biosynthesis	Bs-1024r	Primary antibody
Glacial acetic acid	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2138	Nissl staining
Glass Slides and Coverslips	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10212432C	Mount tissue sections
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Version 10.1.2 (324) for Windows 64-bit, https://www.graphpad.com/	64-bit version, used for statistical analysis and scientific plotting
Grinding machine	Beijing Herde	N.9548	Grind tissue samples
HE staining solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2103	HE staining
HRP-Conjugated Goat Anti-Mouse Secondary Antibody	Servicebio	C030205	Secondary Antibody
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody	SeraCare	5220-0336	Secondary antibody
Hydrogen peroxide (H2O2)	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C5101	preparation of TSA reagents
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	Version 25, 64-bit, https://www.ibm.com/products/spss-statistics	64-bit version, used for statistical data analysis and processing
Imaging System	Nikon, Japan	Nikon DS-U3	Capture microscopic images
Metal Bath	COYOTE	H203-H	Constant temperature incubation
Microwave Oven	Galanz Microwave Electrical Appliance Co., Ltd.	P70D20TL-P4	Antigen retrieval
NC Membrane (0.22 μm)	GVS, USA	ISEQ00010	Protein blot transfer
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10004160	dehydration and coverslipping
PBS buffer	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C0003	decolorization and washing
PI3K Antibody	Affinity	AF6241	Primary antibody
PSD-95 Antibody	Affinity	Af5283	Primary antibody
Pathological Microtome	Leica Instruments (Shanghai) Co., Ltd.	RM2016	Cut paraffin sections
Phospho-AKT Antibody	Affinity	Af0832	Primary antibody
Phospho-PI3K Antibody	Affinity	Af3241	Primary antibody
Pipette	Dragonlab	KE0003087/KA0056573	Quantitative liquid transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Beyotime	P1005	Protease inhibition
RIPA Lysis Buffer (Medium)	Beyotime	P0013C	Tissue lysis
Refrigerated Centrifuge	SEILOGEX, China	CF1524R	Low-speed sample separation
SDS-PAGE Electrophoresis System	Beyotime	MiniProGel™ Gel Casting, Electrophoresis and Western Blot Transfer System	Protein electrophoretic separation
SDS-PAGE Precast Gel Kit	MDL	MD911919	SDS-PAGE electrophoresis
SYN (Synapsin) Antibody	Biosynthesis	bs-3501R	Primary antibody
Shaker	Qilinbeier	TS-8	Sample oscillation washing
Tissue Dehydrator	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JJ-12J	Dehydrate paraffin tissue
Tissue Embedding Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-P5	Embed tissue in paraffin
Tissue Spreading Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	KD-P	Unfold paraffin slices
Toluidine blue staining solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2131	Nissl staining
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G2 20 TWIN	Observe ultrastructure
Tri-Color Pre-Stained Broad Range Protein Molecular Weight Marker (10–180 kDa)	Servicebio	G2091	SDS-PAGE electrophoresis
Tyramide-488	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C6002	TSA reagents
Tyramide-CY3	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C6003	TSA reagents
Ultramicrotome	Leica	Leica UC7	Cut ultrathin EM sections
Ultrasonic Cell Disruptor