RNA로서 게놈 편집자를 전달하는 것은 1차 포유류 세포와 세포주의 게놈을 변형하는 데 특히 강력한 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 유전체 편집기를 mRNA로 1차 포유류 세포와 세포주에 전달한 후, 표적 Illumina 시퀀싱과 분석을 통해 편집 결과를 정량화하는 것입니다.
이 논문에서
요약
초록
뉴클레아제, 염기 편집자, 프라임 편집자를 포함한 CRISPR 편집기는 질병을 유발하는 유전 변이를 효과적으로 교정하거나 표적 유전자를 교란할 수 있습니다. 편집 결과는 일반적으로 배양된 1차 세포, 환자 유래 세포, 또는 유전자 조작 세포주에서 유전적 변이의 영향을 연구하거나 동물 연구나 임상 번역을 시작하기 전 첫 단계로 평가됩니다. 합성 가이드 RNA와 함께 mRNA로 편집자를 포유류 세포에 전달하면 플라스미드 기반 접근법에 비해 편집 효율을 높이고 DNA 통합이나 표적 외 편집 등의 문제를 지속 발현에서 방지할 수 있습니다. 본 글에서는 시험관 내 전사(IVT)를 통해 게놈 편집 mRNA를 준비하는 워크플로우를 제시하며, 여기에는 공동 전사 캡핑과 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드, 전기공공 편집자 mRNA를 포함하여 RNA를 1차 인간 섬유아세포, 유도 다능성 줄기세포(iPSC), 림프모세포주(LCLs)로 유도하고, Illumina 플랫폼에서 표적 증폭자 시퀀싱을 한 후 CRISPResso2를 이용한 분석으로 편집 결과를 정량화하는 과정을 포함합니다. 이 워크플로우는 가이드 RNA, 전기천공 매개변수, 편집자 변이체의 정량적 벤치마킹을 가능하게 하며, 단세포 클로닝, 표현형 분석, 전임상 동물 연구, 치료적 개발 등 후속 응용을 지원합니다.
서론
원차 포유류 세포에서의 효율적인 유전체 편집은 유전 모델 생성과 후보 치료 전략의 전임상 평가를 지원합니다. 염기 편집과 프라임 편집을 포함한 CRISPR 기반 기술의 최근 발전은 이중 가닥 DNA 절단 없이 정밀한 뉴클레오타이드 변형을 가능하게 하여 편집 결과의 순도를 향상시킵니다 1,2. 이 기술들은 겸상적혈구병3와 낭포성 섬유증4로 이어지는 변이 교정 전략을 포함하여 질병 모델링 및 치료용 유전체 편집 연구에 성공적으로 적용되었습니다.
포유류 세포에 게놈 편집 성분을 전달하는 특히 효율적인 전략은 편집 효소를 암호화하는 시험관 내 전사(IVT) mRNA와 합성 가이드 RNA(gRNA)의 전기천공입니다. mRNA 전달은 유전체 편집기의 일시적 발현을 가능하게 하여 장기간 뉴클레아제 활성을 최소화하고 오프타겟 편집 이벤트 가능성을 줄입니다. IVT 기술의 발전으로 mRNA 합성의 효율성, 수율, 품질이 향상되었습니다 4,5,6. 플라스미드 DNA 템플릿과 PCR 유도 DNA 템플릿은 각각 시험관 내 전사에 흔히 사용되며, 각각 뚜렷한 장점과 한계를 가지고 있습니다. 이 프로토콜에서는 플라스미드 내 장기 다(A) 경로 전파와 관련된 문제를 피하기 위해 PCR 생성 템플릿이 선호되며, 이는 재조합과 길이 변동에 취약합니다. 그러나 이 프로토콜에서 설명한 PCR 템플릿을 사용하려면 120-뉴클레오타이드 폴리(A) 꼬리를 가진 고가의 역프라이머가 필요하며, 프라이머에 암호화되지 않은 서열에 대해 PCR은 박테리아 플라스미드 전파보다 오류가 더 클 수 있습니다. 대신 Elegen과 4basebio와 같은 상업용 제공업체가 고충도 DNA 템플릿을 제공하여 신뢰할 수 있으나 비용이 더 드는 전사 템플릿 생성 옵션을 제공합니다.
신중한 가이드 RNA 설계는 성공적인 게놈 편집 실험의 또 다른 중요한 요소입니다. 예측된 온타겟 효율과 최소한의 오프타겟 활성을 바탕으로 최적의 gRNA 서열을 식별하는 데 도움을 주기 위해 여러 계산 도구가 개발되었습니다. 널리 사용되는 플랫폼으로는 CHOPCHOP과 CRISPOR이 있으며, 이는 Cas 효소의 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 요구사항에 부합하는 가이드 서열을 식별하고, 높은 예측 활성과 특이성을 가진 후보 가이드를 우선순위로 정하는 점수 지표를 제공합니다 7,8. 가이드 RNA 설계의 기본 원리와 모범 사례는 CRISPR 문헌9, 10, 11, 12, 13에서 광범위하게 설명되어 있습니다.
전기천공은 지질 기반 형질염화에 일반적으로 저항성이 있는 세포 유형에서 높은 전달 효율을 달성할 수 있기 때문에 포유류 세포에 게놈 편집 시약을 전달하는 데 흔히 사용됩니다. 전기천공은 일시적으로 세포막을 투과시켜 mRNA와 gRNA와 같은 외인성 핵산이 세포질에 들어올 수 있게 합니다. 최적화된 전기천공 프로토콜은 1차 세포, 섬유아세포, 림프모세포 세포주, 유도 다능성 줄기세포 등 여러 포유류 세포 유형에 대해 개발되었습니다14. Lonza 4D 및 Amaxa 시스템과 같은 상업용 전기천공 플랫폼은 세포 유형별 프로그램과 시약을 제공하여 전달 효율을 높이면서도 세포 생존력을 유지하도록 설계되었습니다. Amaxa 96-웰 셔틀 플랫폼과 같은 고처리량 전기천공 시스템은 여러 실험 조건에서 확장 가능한 유전체 편집 실험을 가능하게 합니다. 네온 전기천공 시스템도 흔히 사용되지만 이 프로토콜의 중심은 아닙니다.
게놈 편집 구성 요소가 전달된 후, 편집 결과는 일반적으로 편집 부위 주변의 게놈 영역에 대한 타겟 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여 평가됩니다. 시퀀싱 라이브러리는 표적 유전자좌의 PCR 증폭을 통해 생성되며, 이후 인덱싱과 고처리량 시퀀싱이 이어집니다. 결과된 시퀀싱 리드는 유전체 편집 실험을 위해 설계된 특수 생물정보학 파이프라인을 통해 분석됩니다. 이 프로토콜에서는 편집 결과를 CRISPResso2라는 널리 사용되는 계산 플랫폼으로 정량화하여 데이터 시퀀싱을 통해 유전체 편집 결과를 상세히 분석할 수 있습니다15. CRISPResso2는 시퀀싱 리드를 참조 서열에 정렬하고, 전체 편집 효율, 삽입-결실 빈도(indel) 빈도, 정확한 뉴클레오타이드 치환, 목표 영역 전반의 편집 분포 등 편집 결과를 정량화합니다. 또한 이 소프트웨어는 실험 조건 간 비교와 편집 매개변수 최적화를 용이하게 하는 그래픽 시각화와 통계 요약도 제공합니다.
고품질 IVT mRNA 생산, 전기천공에 의한 최적화된 전달, 고해상도 시퀀싱 분석의 통합은 배양 세포에서 게놈 편집 전략을 평가하는 견고한 워크플로우를 제공합니다(그림 1). 이 접근법은 유전체 편집 전략을 생체 내 연구와 잠재적 치료적 응용으로 발전시키기 전에 편집 효율성, 특이성, 실험 매개변수를 반복적으로 최적화할 수 있게 합니다.
프로토콜
윤리 진술:
인간 유래 세포주를 이용한 모든 시술은 기관 지침과 승인된 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. PCR을 이용한 선형 DNA 템플릿 생성
주의: RNase 없는 소모품과 작업면을 사용하여 모든 RNA 단계를 수행하세요. 의도된 유전체 변형에 적합한 편집자를 선택할 때 나열된 mRNA 편집기와 그 다양한 변형을 고려하세요(표 1).
- 박테리아에서 추출한 플라스미드 DNA에 대해 미니프렙 또는 미디프렙 키트를 사용해 PCR 반응을 조립합니다. 50 μL PCR 반응당 20 ng의 플라스미드 DNA를 효소 NEBNext Ultra II Q5 마스터 믹스와 함께 사용하여 표 2에 설명된 대로 PCR을 조립합니다.
- 플라스미드의 비활성 T7 프로모터를 교정하는 전방 프라이머를 사용해 원형 전사를 방지합니다.
- 효율적인 전사와 mRNA 안정성을 지원하기 위해 120-nt poly(A)₁₂₀ 꼬리를 도입하는 역프라이머를 사용하세요.
- 우라실 대신 N1-메틸-슈두리딘을 사용하고 CleanCap AG를 포함하여 mRNA 번역을 개선하고 선천 면역 활성화를 감소시키세요 1,2,3,4(그림 1).
참고: 다른 뉴클레오타이드 유사체와 캡핑 시약도 있으나, 이들은 게놈 편집 mRNA에서 일관되게 높은 활성을 보여왔습니다. 나노입자 기반 전달은 적합한 대안이지만, 이 프로토콜에서는 다루지 않습니다.
- 코딩 영역 상류에 기능적 T7 프로모터를, 하류에 poly(A) 서열을 도입하는 프라이머를 사용하여 PCR로 30주기 동안 편집기 코딩 서열을 증폭합니다(표 2 및 표 3).
참고: IVT 템플릿의 뉴클레오타이드 서열은 표 4에 밑줄이 표시되어 있습니다. - PCR 산물을 검증하고 정제하세요
- 1% 아가로스 젤과 TE 완액액에 180V 전압에서 30분간 PCR 생성물 5 μL을 투여합니다. PCR 제품 정제로 진행하기 전에 약 4000-6500 bp(전사 편집자에 따라 다름)에서 단일 밴드의 존재를 확인하세요.
- PCR 정화 키트(재료표)를 사용하여 PCR 제품을 정제하세요.
참고: 여러 밴드가 발생하거나 PCR 제품 품질이 좋지 않은 경우, 열사이클링 조건을 최적화하세요(표 5 – 문제 해결 표). - 정제된 DNA를 형광 dsDNA 분석법으로 정량합니다. 큐비트 dsDNA 분석을 위해서는 키트에 포함된 796 μL 고감도 큐비트 작업 용액과 4 μL 염료를 혼합하여 버퍼-염료 마스터 믹스를 준비합니다.
- 별도의 튜브에서 버퍼 염료 마스터 믹스 198 μL과 저농도 표준 S1, 고농도 표준 S2 2 μL 및 샘플을 혼합합니다. 큐비트 형광측정기 장치에 따라 각 표준과 샘플을 삽입하여 재고 농도를 측정합니다.
참고: 샘플이 분석 범위 이상일 경우, 희석 준비가 필요할 수 있습니다.
2. mRNA를 전사합니다
- T7 RNA 중합효소, NTP, 공동 전사 캡핑을 위한 캡 유사체, 그리고 선천 면역 활성화1˒5˒6을 줄이기 위한 우리딘 대체물인 N1-메틸-슈두리딘 삼인산을 사용하여 얼음에서 IVT 반응을 준비합니다.
- 표 4에 따라 IVT 반응 혼합물을 준비합니다. 표 4에 제공된 주석이 달린 템플릿 순서를 사용하세요. 각 전사 반응을 최종 40 μL 부피로 조립합니다.
- 여러 실험을 위해 충분한 mRNA를 생성하기 위해 5–10개의 반응관을 준비하세요. 각 40 μL 반응은 약 100 μg의 mRNA를 생성합니다. 프라임 편집 전기천공에 1 μg의 mRNA와 염기 편집 전기천공에 3 μg의 mRNA를 사용하면, 이는 ~33–100회의 전기천공에 충분하다.
- RNA를 전사합니다
- 피펫팅으로 IVT 반응을 충분히 혼합하세요. 반응을 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- RNA를 정제하세요
- 1.5 mL 튜브로 옮기고, 전체 반응 부피의 절반과 같은 부피로 7.5 M 리튬 클로라이드(LiCl) 용액을 IVT 반응에 첨가하여 최종 LiCl 농도인 2.5 M를 얻습니다. 40 μL IVT 반응의 경우, 7.5 M LiCl 20 μL을 추가합니다. 부드럽게 피펫으로 잘 섞으세요.
- -20 °C에서 30분간 배양합니다. 샘플을 16,000 × g 온도에서 4 °C에서 15분간 원심분리합니다.
- 피펫으로 상원액을 제거하고 버리세요. 펠릿을 70% 에탄올 1mL로 4°C에서 세척합니다. 펠릿을 건드릴 필요는 없습니다. 원심분리기 16,000 g × 4 °C에서 5분간 가열합니다.
- 에탄올을 완전히 제거한 후 RNase가 없는 생물안전 캐비닛에서 1-2분간 자연 건조시킵니다. 펠릿을 과도하게 건조시키지 마세요. 그렇지 않으면 재현탁이 어려울 수 있습니다.
- RNA를 재현탁하고 정량화합니다
- RNA를 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁하세요. 처음에는 각 반응을 뉴클레아제가 없는 50 μL의 물에 재현탁하고, RNA 농도를 측정한 후 더 희석합니다. 나노드롭과 같은 형광 RNA 분석법을 사용하여 RNA를 정량합니다.
정지 지점: RNA 정량화 및 알리쿼트 후, mRNA 알리코트를 -80 °C에서 전기포레이션할 때까지 보관합니다. 반복되는 동결-해동 사이클을 피하세요; 각 알리코트는 사용 전에 한 번만 해동하세요. - 정제된 mRNA 수율이 40 μL IVT 반응당 약 100-400 μg임을 확인하세요. mRNA를 뉴클레아제가 없는 물로 2 μg·μL-1 로 희석한 후 알리오토를 추출하세요. 알리코트는 −80 °C에서 보관하세요.
참고: 반복되는 동결-해동 사이클은 피하세요. 일회용 알리코트를 준비하고 사용하지 않은 해동 재료는 버리세요. 12.5 μL 알리코트를 PCR 스트립에 담아 각 알리코트당 8–20회의 전기천공을 준비합니다.
- RNA를 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁하세요. 처음에는 각 반응을 뉴클레아제가 없는 50 μL의 물에 재현탁하고, RNA 농도를 측정한 후 더 희석합니다. 나노드롭과 같은 형광 RNA 분석법을 사용하여 RNA를 정량합니다.
- RNA 무결성 평가
- 아가로스 겔 전기영동 또는 자동 전기영동을 통해 RNA 크기와 무결성을 평가합니다(그림 2)
- 10,000배 희석된 SYBR 골드를 포함한 0.8% 아가로스 젤을 준비합니다. NEB ssRNA 마커와 같은 단일 가닥 RNA 사다리를 사용하세요.
- 2개의 RNA 젤 로딩 염료를 사용해 mRNA를 변성시키고, 샘플을 65 °C에서 10분간 가열한 후 샘플을 젤에 적재합니다.
- mRNA가 편집자에 따라 약 4000-6500 nt에서 우세 밴드로 나타나며, 번지는 최소화되거나 분자량이 적은 생성물임을 확인하세요. 상당한 분해, 번짐, 또는 여러 예상치 못한 띠가 나타나는 RNA 샘플은 폐기합니다.
3. 가이드 RNA의 설계 및 준비
참고: 목표 유전체 좌위 내에서 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열을 식별하고, 선택한 편집기와 의도된 유전체 변형과 호환되는 가이드 RNA를 선택하세요. CHOPCHOP, CRISPOR, CRISPRware, IDT Cas9 Checker, Benchling, VectorBuilder와 같은 가이드 RNA 설계 플랫폼을 사용하여 6,7,8,9,10,11,12,13의 유리한 활성 및 특이성을 가진 가이드 RNA를 우선순위로 지정할 수 있습니다.
- 가이드 RNA 설계 도구를 사용하여 선택한 뉴클레아제 변이체와 호환되는 PAM 부위를 표적 유전체 좌위 내에서 식별하며, NGN 호환 변이체도 포함됩니다.
- 예측 온타겟 활성이 높고 예측 오프타겟 활성이 낮은 가이드 RNA를 선택하세요. 가이드 RNA의 편집 창을 확인하세요.
- 기본 편집 또는 주요 편집 애플리케이션의 경우, 선택한 편집기의 최적 활동 창 내에 의도된 편집을 위치시키는 가이드 RNA를 선택하세요.
- 처음 3개 및 마지막 3개 뉴클레오타이드에 대해 2'-O-메틸 염기 유사체를 포함하는 sgRNA 또는 페그RNA를 주문하며, 가이드의 처음 3개와 마지막 2개 염기에는 3' 인산호로티오에이트 결합이 포함됩니다.
- 뉴클레아제가 없는 물 또는 TE 완충제(100μM)에 가이드 RNA를 재현탁합니다. 5 μL 알리코트를 준비하여 −80 °C에서 보관합니다. 사용 시에는 전기천공 완충제에서 해동 및 희석한 후 전기천공을 시행합니다.
4. 세포 배양 준비
참고: 전기천공 전에 현미경 및 생존성 검사로 세포 무결성을 평가하십시오.
- DMEM에서 10% FBS 4.5 g· 보완된 1차 섬유아세포 또는 HEK293T 세포를 배양합니다. L-1 포도당, 글루타맥스, 그리고 110 mg· L-1 피루브산나트륨. 멸균된 T75 플라스크(TC 표면)에 세포를 플라스크당 20% 수율로 도금합니다. 1번부터 20번까지의 셀을 유지하세요. 세포를 80% 수합도로 분리하고, 70-80% 수합도를 가진 세포를 사용해 전기천공을 하세요.
- mTeSR Plus 배지에서 다능성 줄기세포를 배양합니다. 셀을 젤트렉스가 코팅된 멸균 T75 플라스크에 각 플라스크당 20% 합율로 도판합니다. 매체 매체를 매일 교체하고 1번부터 20번 통과까지 세포를 유지하세요. 각 지문 후 24시간 동안 미디어에 CEPT 칵테일을 추가하세요. 세포를 80% 수합도로 분리하고, 70-80% 수합도를 가진 세포를 사용해 전기천공을 하세요.
- 세포가 전기천공에 적합한 밀도(일반적으로 70%–80% 수합)에 도달할 때까지 5% CO₂에서 37°C를 유지합니다.
- 세포 수가 적절하고 전기천공을 위해 수렴할 때 배지를 제거하세요.
- TrypLE 발현효소를 세포에 첨가하고(T75 플라스크는 1mL), 37°C에서 5분간 배양합니다. 셀을 플라스크에 부드럽게 피핑해 단일 셀 현탁액을 얻으세요. 3mL의 세포 배양지를 추가하여 해리를 멈추고, 큰 세포 덩어리가 없음을 확인한 후 카운트를 시작하세요.
- 세포를 1,000 × g에 5 분간 펠 릿 넣고, 15 mL Dulbecco's 인산염 완충 식염수(DPBS)로 한 번 세척한 후 다시 원심분리합니다.
- Nucleocounter NC-3000과 같은 자동 생존 측정법과 용액 13을 사용하여 세포 농도와 생존 가능성을 평가합니다. 뉴클레오카운터에서 측정하기 전에 세포 11.4 μL과 용액 13 0.6 μL을 혼합합니다. 세포 생존율이 최소 85%일 때만 전기천공을 진행하고, 이 임계값 이하의 샘플은 폐기하거나 재준비하십시오.
- 세포를 약 0.5 ×10 6–2 × 106 세포·mL-1 밀도로 DPBS에 재현탁합니다. 세포 수를 세고 혈구계나 세포 계수기를 사용해 생존 가능성을 평가하세요.
- 세포 생존율이 85%≥ 경우에만 진행하세요.
- 셀을 전기천공 완충 안에 다시 현탁하세요. 각 반응마다 5 μL 냉전기천공 완충제에 5 ×5 셀 2개를 재현탁합니다.
- 제조사 지침에 따라 보충액으로 전기천공 완충제를 즉시 준비하고, 완충제를 얼음 위에 보관하세요.
- 세포를 차갑게 유지하고 신속하게 진행하세요. 세포를 얼음 위에 보관한 후 즉시 전기천공 설치로 진행하세요.
5. 전기천공
참고: 다중 채널 피펫팅을 용이하게 하기 위해 편집 화물을 PCR 스트립 튜브에 준비하세요. 전기천공 후에는 세포를 CEPT 혼합물을 보충한 배지에 재현탁하여 세포 생존을 촉진합니다12.
- RNA 화물을 준비해.
- RNA 화물을 얼음 위에 저장하여 편집자 mRNA와 가이드 RNA를 전기천공 완충 내에서 결합하여 준비합니다.
- 염기 편집기와 뉴클레아제의 경우, 샘플당 1.5 μL(3 μg) mRNA, 0.5 μL(50 pmol) 가이드 RNA, 15 μL 전기천공 버퍼를 포함한 최종 전기천공 용액을 준비합니다.
- 프라임 에디터의 경우, 샘플당 0.5 μL(1 μg) mRNA, 1.5 μL (150 pmol) 가이드 RNA, 15 μL 전기천공 버퍼를 포함한 최종 전기천공 용액을 준비합니다.
- RNA 화물 용액을 1.2× 마스터 믹스로 준비하여 전송 및 샘플 취급 중 부피 손실을 보상합니다. 필요에 따라 각 대상 부위와 편집자 변이체별로 시약 부피와 비율을 최적화하세요.
- 셀, 화물, 전기공화를 분배하세요.
- 각 전기천공 웰에 셀 현탁액 5μL을 추가합니다.
- 전기천공 완충제 내 RNA 화물 17 μL를 세포 5 μL에 첨가합니다. 피펫팅으로 두 번 섞어 현탁액을 섞으세요.
주의: 세포와 RNA 화물을 결합한 후에는 RNase가 분비되어 편집자 mRNA를 빠르게 분해할 수 있으므로 신속히 진행해야 합니다. 세포와 RNA 화물을 혼합한 후 2분 이내에 전기천공을 완료하세요. - 선택한 셀 유형에 최적화된 전기천공 프로그램을 실행하세요 (표 6; 그림 2; 그림 3).
- 원발성 인간 피부 섬유아세포나 HEK293T세포의 경우, 완충 SF가 있는 Lonza 4D 전기천공 시스템을 사용하세요. 반응당 200,000개의 세포를 20 μL 전기천공 쿠벳에 추가하세요. 프로그램 CM-130 실행해. 즉시 80 μL 사전 가열된 DMEM + 10% FBS, 4.5 g· L-1 포도당, 4 mM L-글루타민, 그리고 110 mg· L-1 피루브산나트륨. 세포를 10분간 회수한 후 96웰 또는 24웰 플레이트로 희석합니다.
- 다능성 줄기세포의 경우, 완충 P3가 포함된 Lonza 4D 전기천공 시스템을 사용하세요. 반응당 200,000개의 세포를 20 μL 전기천공 큐벳에 추가하세요. 프로그램 DN-100 실행해. 즉시 80μL 미리 가열된 mTeSR Plus 배지를 추가하세요. 셀을 10분간 회수한 후 24웰 플레이트로 희석합니다.
- 플레이트 이식 후 매일 세포를 검사하여 세포 건강과 회복을 모니터링하세요.
6. 유전체 DNA 추출
참고: PCR 증폭 전에 유전체 DNA가 충분한 품질과 억제제가 없는지 확인하세요. DNA 품질은 시퀀싱 라이브러리 준비와 게놈 편집 결과의 정확한 정량에 영향을 줄 수 있습니다9,10,11.
- 세포를 세척하고 채취하세요.
- 전기천공 후 2-3일 후에 세포를 채취하세요. 세포를 DPBS로 한 번 세척한 후 즉시 유전체 DNA 추출을 진행하세요.
- 불완전 용해 완충액을 10 mL 1M 트리스-HCl(pH 8.0), 10% (wt/vol) 도데실 황산나트륨(SDS) 용액 5 mL, 그리고 무핵효소 물을 혼합하여 최종 부피 1L로 만듭니다. 불완전 용해 완충제는 상온에서 최대 6개월간 보관합니다.
- 완전 용해 완충액을 신선하게 준비하는데, 1:1,000(볼륨/볼륨) 희석액으로 단백질나제 K를 첨가하여 불완전 용해 완충액 한 부분에 추가합니다. 완전한 용해 완충제를 세포에 추가하여 용해를 시작하세요. 각 웰에 약 80,000개의 세포가 포함된 96웰 플레이트에 40 μL의 완전 용해 버퍼를 추가합니다. 샘플 손실을 일으킬 수 있으니 위아래로 피핑하지 마세요.
- 샘플을 소화하세요.
- 샘플을 37°C에서 60분간 배양하여 세포 용해와 단백질효소 K 소화를 완료합니다.
- 단백질분해효소 K.
- 용해액을 PCR 튜브나 96웰 PCR 플레이트로 옮깁니다. 샘플을 80°C에서 30분간 배양하여 단백질효소 K를 비활성화합니다.
- 리사테를 보관하세요.
정지 시점: PCR 증폭 전까지 용해액을 −20 °C에 보관합니다.
7. 편집 분석을 위한 표적 증폭자 시퀀싱
참고: 시퀀싱 전에 PCR 제품을 등몰량으로 모으세요. 샘플당 약 10,000회의 시퀀싱 리드가 일반적으로 대량 유전체 편집 결과를 정량화하기에 충분합니다.
- 유좌 특이적 프라이머를 설계하여 편집 부위에서 최소 25 bp 상류와 25 bp 이하에 걸쳐 약 300 bp 증폭자를 생성하도록 합니다(표 7).
- 표 8, 표 9에 제시된 조건에 따라 PCR1을 수행하여 표적 유전체 좌위를 증폭합니다.
- PCR1 제품을 템플릿으로 사용하여 고유한 샘플 인덱스를 추가할 수 있으며, 예를 들어 표 7 의 "예제 PCR 인덱싱 프라이머" 탭에 표시된 프라이머를 사용합니다. 표 8 과 표 9의 2번 탭에 표시된 PCR 조건을 사용 하세요.
- PCR1과 PCR2 제품을 1.5% 아가로스 겔에 검사하여 예상 크기에서 단일 밴드의 존재를 확인하세요.
- PCR2 산물을 등광 단위로 모으세요. 제조사 지침에 따라 AMPure XP 비드 대 샘플 비율 0.65:1로 풀린 PCR2 라이브러리를 청소하세요. 정제된 라이브러리를 뉴클레아제 무첨가물 30μL에 용출하고, 시퀀싱 전에 겔 전기영동으로 어댑터 다이머가 제거되었는지 확인합니다.
- 형광 측정 dsDNA 분석법을 사용해 최종 합산 라이브러리를 정량합니다. 모세관 전기영동을 통해 조각 크기 분포를 평가합니다.
- 일루미 MiSeq 기기의 단일 끝 300사이클 리드를 사용하여 라이브러리를 시퀀싱합니다. 최종 풀린 라이브러리를 4 nM으로 희석합니다. 5 μL 풀린 4 nM 라이브러리와 0.1 M NaOH 5 μL 및 피펫을 혼합하여 혼합합니다. 실온에서 5분간 배양하여 변성을 시킨 후, MiSeq 키트에 제공된 990μL의 냉각 HT 버퍼를 첨가하여 용액을 중화하고 20 pM으로 희석합니다. PhiX 통제율 15% 급증. 라이브러리를 Illumina MiSeq 카트리지에 로드하고 제조사 표준 실행 설정을 사용하여 단일 종료 300사이클 시퀀싱을 실행하세요. 샘플당 약 30,000 리드를 생성하는 것을 목표로 하지만, 샘플당 10,000 리드는 분석 편집에 충분합니다.12. MiSeq 시퀀싱은 Genewiz나 Quintara와 같은 일부 회사에서 샘플별로 수행할 수 있습니다.
8. 게놈 편집 결과 분석
참고: CRISPResso2 분석은 전체 편집 효율, 뉴클레오타이드 전환 빈도, 삽입/결실(인델) 빈도를 정량화할 수 있으며, 실험 조건 전반에 걸친 편집 결과를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다15.
- 시퀀싱 데이터를 탈다중화하고 FASTQ 파일을 유전체 좌위와 실험 조건에 따라 정리합니다.
- Github 저장소(https://github.com/pinellolab/crispresso2)에 제공된 지침에 따라 CRISPResso2를 설치하세요.
- 입력된 FASTQ 파일과 분석 매개변수를 명시하는 batch.txt 파일을 사용하여 CRISPResso2 배치 분석을 실행하세요(예시 표 7에 제공됨). 최소 읽음 품질 점수를 30으로 설정하세요. "w" 창 너비를 20으로 설정하세요. 사이토신 염기제 편집기를 사용할 경우, 일부 인델은 니크 부위 외에도 염기에서 편집된 뉴클레오티드를 중심으로 할 수 있습니다. 그럴 경우, 닉 사이트의 기본 중심 대신 'wc' 창 중심을 -10으로 조정해 이 인델을 가장 잘 포착하세요.
- 적절한 요약 출력 파일에서 뉴클레오타이드 변환 주파수, 삽입/삭제(인델) 주파수, 그리고 (해당되는 경우) HDR 또는 프라임 편집 주파수와 같은 정량적 출력을 추출합니다. 이 문서들은 보통 "CRISPRessoBatch_quantification_of_editing_frequency.txt"과 "Nucleotide_percentage_summary.txt"라는 이름의 파일에 있으며, Microsoft Excel이나 다른 스프레드시트 편집 소프트웨어에서 열 수 있습니다.
- 그림 3-4과 같이 하위 플롯팅과 데이터 해석을 위한 정량적 편집 값을 내보내세요. "alleles_frequency_table_around_sgRNA.pdf" 파일(그림 5에 보이는 것처럼)을 사용하여 대립유전자 편집 결과를 평가하세요.
결과
HEK3 대조 부위가 포함된 ABE8e 기본 편집기와 같이 쉽게 접근 가능한 테스트 부위를 갖춘 효율적인 편집기를 사용하면 실험에 사용된 세포에 적합한 전달 시스템이 있다면 90% 이상의 편집 효율을 얻을 수 있습니다. 편집 mRNA, 가이드 RNA, 표적 부위 또는 전달 조건에 문제가 있어 편집에 적합하지 않을 경우 편집 효율이 낮아질 수 있습니다. 더 다양한 PAM 서열에 접근하지만 결합이 약하거나 이상적인 편집 창 밖의 뉴클레오타이드에 편집자를 지정하는 Cas9 변형을 사용하면 편집 효율이 떨어질 수 있습니다. IVT로 생성된 성공적인 편집자 mRNA는 일반적으로 최소한의 번짐 또는 저분자량 분해 생성물이 있는 단일 우세 밴드로 나타나며, 이는 하위 전기천공에 적합한 높은 전사체 무결성을 나타냅니다(그림 2).
편집자 mRNA와 합성 가이드 RNA의 전기천공 후 대부분의 세포는 24–48시간 이내에 회복하며, 적절한 전기천공 프로그램으로 전형적인 형태를 유지합니다(그림 3–4). 전기천공 조건은 특정 셀 유형에 맞게 조절되어야 하며, 완충제에 따라 뚜렷한 차이가 있을 수 있습니다. 온라인 Lonza 지식 센터는 일반적인 세포 유형에 대한 버퍼 및 전기천공 코드 권고를 제공하며, Lonza는 세포주와 1차 세포별로 별도의 최적화 키트를 제공합니다. 버퍼의 실증적 비교는 효율적인 전달을 위한 최적의 조건을 파악하는 데 도움이 됩니다. 부적절한 프로그램은 아예 전달이 이루어지지 않거나 세포에 매우 독성이 있을 수 있습니다(세포 주기가 50% 이상 손실되거나 지속을 방해). 대표성 최적화 실험에서는 전기천공 조건에 따라 편집 결과에 상당한 차이가 나타났으며, 일부 프로그램은 높은 편집 효율을 보인 반면, 다른 프로그램은 편집 효율이 최소한으로 발생하여 각 세포 유형에 대한 경험적 최적화의 중요성을 강조했습니다(그림 3–4).
iPSC, 섬유아세포, LCLs 전반에 걸쳐 표적 증폭 시퀀싱과 CRISPResso2 분석을 통해 편집 효율과 부산물을 정량화합니다(그림 4). 여기 HEK3 시험 유전자좌의 아데닌 염기 편집이 나타나며(그림 4), 분석 샘플에서 낮은 인델 빈도로 의도된 뉴클레오타이드 전환이 이루어졌습니다. CRISPResso2 분석은 목표 유전자좌에서 편집된 대립유전자와 편집되지 않은 대립유전자를 시각화할 수 있게 하며, 의도된 뉴클레오타이드 전환, 인델 빈도 및 기타 편집 부산물의 정량화를 용이하게 하여 편집 결과를 포괄적으로 평가할 수 있게 합니다(그림 5). 편집 효율은 표적 부위에서 이 정확한 단일 염기치환 치환 빈도를 측정하여 정량화됩니다. HEK3 유전자좌는 잘 특성화된 편집 프로필과 실험 시스템 전반의 재현성을 가지고 있어 다양한 조건에서 기본 편집 성능을 견고하게 평가할 수 있어 모델 유좌로 사용됩니다. 새로운 편집 절차를 최적화할 때 이 가이드를 인간 세포에서 양성 대조군으로 테스트할 것을 권장합니다. 염기 편집은 일반적으로 염기 전환을 위해 낮은 인델 주파수로 농축되지만, 프라임 편집은 정밀 편집과 저주파 부산물의 혼합을 생성합니다 3,12. 편집 효율은 조건에 따라 달랐으며, 세포 유형과 전기천공 프로그램 간에 뚜렷한 차이가 관찰되었습니다(그림 3-4). 이러한 변이들은 세포 흡수, 생존력, DNA 수리 활동의 차이와 전기천공 매개변수가 전달 효율성에 미치는 영향을 반영하는 것으로 보입니다. 이 결과들은 일관되고 최대한의 편집 결과를 달성하기 위해 세포 유형별 전기천공 설정의 최적화가 중요함을 강조합니다.
그림 1. 시험관 내 전사를 통한 편집자 mRNA 준비.
편집자 mRNA 생성의 개략 개요. (1단계) 편집기 코딩 서열과 T7 프로모터를 포함하는 플라스미드 템플릿 준비. (2단계) 선형 DNA 템플릿을 생성하기 위한 PCR 증폭. (3단계) T7 RNA 중합효소를 이용한 시험관 내 전사를 통해 캡이 있는 mRNA를 합성합니다. (4단계) mRNA를 정제하여 주형 DNA, 효소, 자유 뉴클레오타이드를 제거하는 작업. 생성된 캡이 부착된 mRNA는 전기천공 또는 지질 나노입자를 통해 포유류 세포에 하류 전달에 적합합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 2. mRNA 겔 전기영동 예시 이미지
SYBR 금 염색을 사용한 1% 아가로스 겔에서 세 개의 게놈 편집기 mRNA에 대한 전기영동 영상을 수행했습니다. NEB의 ssRNA 사다리는 왼쪽에 표시되어 있으며, 크기별 마커가 길이로 표시되어 있습니다. 상당한 번짐이나 작은 띠가 없다는 점은 이 mRNA들이 적절한 품질을 가지고 있음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 3. 유도 다능성 줄기세포(iPSCs)에서 유전체 편집을 위한 전기천공 조건 최적화.
iPSC에서 다양한 전기천공 조건에서 얻어진 편집 효율이 나타났습니다. 세포는 여러 버퍼와 프로그램 조합(CB-150 버퍼 P4, CD-118 버퍼 P3, DN-100 버퍼 P3, DC-100 버퍼 P3 등 모두 론자 4D 뉴클로펙션 디바이스)에서 전기포링되었습니다. 편집은 네온 전기천공 장치를 사용하여 매개변수(1600 V, 20 ms, 1 펄스)를 사용하여 평가되었습니다. 편집 효율성은 편집된 유전자좌의 표적 시퀀싱 분석을 통해 정량화되었습니다. 샘플당 N=1. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 4. 섬유아세포에서 유전체 편집을 위한 전기천공 조건 최적화.
다양한 핵분화 프로그램을 이용한 전기천공 후 편집 효율. 섬유아세포는 여러 Lonza 뉴클레오펙터 프로그램(CA-137, CM-138, DS-150, EH-100, EN-150, EO-114, FF-113)을 사용해 전기천공되었으며, 편집 결과는 표적 시퀀싱으로 정량화되었다. 결과는 두 개의 복제(P2, P3)에 대한 결과가 나타난다. 편집자 전달이 없는 네거티브 컨트롤도 포함되어 있습니다. 전기천공 코드 비교는 전기천공 설정 간 편집 효율 차이를 강조하여 섬유아세포 게놈 편집을 위한 최적의 매개변수를 식별할 수 있게 합니다. 샘플당 N=1. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 5. 목표 유전자좌에서의 유전체 편집 결과의 특성 분석.
CRISPResso2에서 출력한 대립유전자 주파수 표로, 편집 후 고처리량 시퀀싱 분석을 통해 sgRNA 표적 영역 주변의 편집된 대립유전자와 편집되지 않은 대립유전자의 상대적 풍부도를 보여줍니다. 빨간색 주석은 염기 편집 창과 사용된 세포주에 존재하는 기존 이형접합 다형성을 나타냅니다. 가이드 RNA 스페이서 서열은 회색으로 밑줄이 그어져 있습니다. 점선으로 표시된 "예측 절단 위치"는 분석 배치 파일에서 창 중심 "wc"가 변경됨에 따라 SpCas9의 일반적인 "PAM -3" 위치와 비교해 이동됩니다(예시 표 8). 이는 실제로 예측된 절단 위치를 이동시키지는 않지만, 출력을 20 뉴클레오타이드 창 내에서 점선 주변의 인델이 평가된다는 것을 나타내며, 진짜 절단 부위에 중심이 있는 인델과 탈아미노화된 뉴클레오타이드에 중심이 있는 인델 모두를 포착합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
표 1. 이 연구에 사용된 편집자 및 시퀀스
열: 시험관 내 전사를 위해 AddGene에서 이용 가능한 게놈 편집기. 이 프로토콜에 설명된 시험관 내 전사가 가능한 플라스미드의 이름과 Addgene ID가 제공됩니다. 열 2: 본 연구에서 사용된 가이드 RNA 스페이서 서열. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
표 2. mRNA 플라스미드 템플릿 증폭을 위한 PCR 시약.
플라스미드 주형의 PCR 증폭을 통해 후속 응용을 위한 선형 DNA 생성에 사용되는 시약 및 반응 성분 목록, 그리고 순방향 및 역방향 전사 프라이머의 서열. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
표 3. mRNA 템플릿 증폭을 위한 PCR 사이클링 조건.
이 표는 플라스미드 DNA에서 mRNA 주형을 PCR 증폭하기 위해 하위 적용 전에 사용되는 열순환 조건을 나열합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
표 4. 시험 관 내 전사(IVT) 반응에 사용되는 시약들.
이 표는 선형 DNA 주형에서 편집 mRNA를 합성하기 위해 시험관 내 전사에 사용되는 시약과 반응 성분을 나열합니다. 예시 템플릿 시퀀스(ABE8e)는 색상으로 구분된 요소로 표시되어 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
표 5. 유전체 편집 워크플로우의 주요 단계를 위한 문제 해결 가이드입니다.
이 표는 시험관 내 전사(IVT)와 MiSeq 시퀀싱 분석을 통한 편집자 mRNA 준비 과정에서 발생할 수 있는 일반적인 기술적 문제를 요약합니다. 워크플로우의 각 단계마다 잠재적인 문제, 가능한 원인, 추천 해결책이 제공되어 편집 효율성을 최적화하고 편집 결과의 정확한 감지를 돕습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
표 6. 다양한 포유류 세포 유형에 맞는 최적의 전기천공 프로그램.
이 표는 편집자 mRNA를 효율적으로 전달하고 다양한 포유류 세포 유형으로 RNA를 유도하기 위해 사용되는 전기천공 프로그램 코드와 완충 조건을 나열합니다. 나열된 전기천공 매개변수는 세포 생존력을 유지하면서 유전체 편집 효율을 극대화하는 조건을 확인하기 위해 테스트되었습니다. 동일한 프로그램이 모든 세포주나 원시세포 출처에 적용되지 않을 수 있으므로, 편집이 처음에 실패할 경우 이 목록의 대안을 시험하는 것이 권장됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
표 7. 유전체 편집 결과 정량화를 위한 CRISPResso2 분석 매개변수.
첫 번째 탭에는 표적 유좌 증폭을 위해 사용되는 HTS1 프라이머 설계의 예시가 나와 있습니다. 두 번째 탭은 라이브러리 준비 중에 사용되는 색인 입문서의 예시를 제공합니다. 세 번째 탭은 시퀀싱 중 각 샘플에 고유한 인덱스를 할당하는 데 사용되는 인덱싱 배열의 예시를 보여줍니다. 네 번째 탭에는 CRISPResso2 분석을 위한 입력 배치 파일의 예시가 있으며, 다섯 번째 탭에는 CRISPResso2 분석 입력 배치 파일의 추가 예시가 있습니다. 윈도우 센터 "wc"는 염기 편집기에 맞게 조정되어 제거된 염기와 뉴클레아제 절단 또는 단결 부위에 중심에 있는 인델 탐지가 용이하게 되어 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
표 8. MiSeq 라이브러리 준비를 위한 PCR1(Tab 1) 및 PCR2(Tab 2) 시약.
이 표는 표 1(PCR1)에서 표적 유전체 유전체 좌위를 증폭하는 데 사용된 시약과 반응 성분을 나열하며, 표 2(PCR2)에서는 샘플 특이적 인덱스 서열과 일루미늄 시퀀싱 어댑터를 통합하여 MiSeq 분석을 위한 시퀀싱 준비 라이브러리를 생성하는 데 사용됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
표 9. MiSeq 라이브러리 준비를 위한 PCR1(Tab 1) 및 PCR2(Tab 2) 사이클링 조건.
이 표는 표 1(PCR1)에서 표적 유전체 영역을 증폭하는 데 사용되는 열순환 조건을, 표 2(PCR2)에서 샘플 특이적 인덱스 서열과 일루미늄 시퀀싱 어댑터를 통합하여 MiSeq 분석을 위한 시퀀싱 준비 라이브러리를 생성하는 데 사용되는 열순환 조건을 나열합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
토론
이 프로토콜은 편집기 mRNA와 합성 가이드 RNA의 전기천공을 이용한 유전체 편집 워크플로우를 제공합니다. mRNA로서의 전달은 플라스미드 전달에 비해 더 효율적인 편집을 제공하는 경향이 있으며, mRNA는 편집자 단백질이나 리보핵단백질에 비해 배치 간 더 단순하고 일관성이 높습니다. 이전 연구에서 염기편집기의 mRNA와 리보핵단백질 형태를 직접 비교했을 때, mRNA가 더 나은 편집 효율을 보인 것으로 나타났습니다. 플라스미드나 바이러스 전달 방식과 비교할 때, mRNA 기반 전달은 일시적 발현과 유전체 통합 위험을 줄이지만, 세포 유형에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다. 편집 효율 저하 외에도, 플라스미드 DNA를 게놈 편집에 사용하는 것은 표적 세포의 게놈에 무작위로 통합될 위험이 있으며, 편집자의 발현 시간이 길어지면서 오프타겟 편집 위험이 증가할 수 있습니다. 표적 증폭자 시퀀싱과 CRISPResso2의 결합은 편집 효율성과 모든 대립유전자 결과의 표준화된 정량화와 특성화를 가능하게 합니다.
성공을 위해서는 여러 가지 요소가 중요합니다. 이 프로토콜의 핵심 단계에는 엄격한 RNase 프리 취급을 통해 RNA 무결성을 유지하고, 최적의 가이드 RNA 선택, 각 세포 유형별 전기천공 조건을 신중하게 최적화하는 것이 포함됩니다. RNA 무결성과 신중한 RNase 조절은 결과에 큰 영향을 미치며, RNA 선택을 안내하는 것이 효율성과 부산물 프로필의 주요 결정 요인으로 남아 있습니다. 전기천공 설정은 세포 유형별 경험적 최적화가 필요하며, 높은 편집률을 내는 일부 프로그램도 독성을 유발할 수 있습니다. 편집 효율이 낮을 경우, 전기천공 매개변수, RNA 품질 또는 가이드 RNA 설계 최적화를 고려해야 합니다. 과도한 독성이 발생하면 전기천공 강도나 RNA 입력을 줄이면 세포 생존율이 향상될 수 있습니다. 추가 최적화 전략으로는 표적 세포 유형에 맞춘 대체 전기천공 버퍼와 프로그램 테스트, 또는 RNA 농도를 편집하거나 가이드 RNA 농도를 수정하는 방법이 포함됩니다. 이 워크플로우는 편집자를 벤치마킹하고 변형된 세포를 생성하는 실용적인 플랫폼을 제공하며, 이후 단일 세포 클로닝, 표현형 분석, 생체 내 연구, 또는 번역 개발 전에 진행할 수 있습니다. 이 워크플로우는 1차 세포에서 게놈 편집 전략을 평가하는 데 널리 적용되어, 유전체 맥락과 세포 유형 간에 편집 방식을 체계적으로 비교할 수 있게 합니다. 임상적으로 관련된 변이의 도입 또는 교정, 그리고 코딩 및 비코딩 조절 요소의 기능적 검증을 통해 질병 모델링을 지원합니다. 또한, 온타겟 효율성, 오프타겟 활동, 편집 내구성 평가 등 치료적 편집 접근법을 최적화할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 이 워크플로우는 또한 가이드 RNA와 편집 시스템의 선별 및 우선순위 지정, 전달 전략 평가, 정밀 의료 프레임워크 내에서 환자별 변이체 검사에도 활용될 수 있습니다. 이 연구는 기초 유전체 생물학, 중개 연구, 전임상 개발 사이의 다재다능한 다리 역할을 합니다. 이 방법의 한계는 전기천공 효율과 세포 생존성이 세포 종류에 따라 크게 다를 수 있어 경험적 최적화가 필요하다는 점입니다. 또한, 편집 결과는 가이드 RNA 설계와 순도, 그리고 목표 유전자좌의 접근성에 따라 달라질 수 있으며, 이는 서로 다른 실험 시스템 간 재현성을 제한할 수 있습니다. 이러한 제약에도 불구하고, 실험 매개변수와 가이드 설계의 신중한 최적화는 변동성을 줄여 다양한 세포 시스템 전반에 걸쳐 신뢰성 있고 재현 가능한 적용을 가능하게 합니다.
공개 사항
N.W.와 E.V.B.는 존스 홉킨스 대학교를 통해 유전체 편집 기술에 대한 특허를 출원했습니다. G.A.N.은 브로드 연구소와 존스 홉킨스 대학교를 통해 유전체 편집 기술과 관련된 특허를 출원했습니다.
저자 기여:
M.V., J.N.W., E.V.B, D.M.E., J.D., G.A.N.은 각각 별도의 섹션을 작성했습니다. M.V.는 최종 텍스트를 편집하고 편집했으며, 모든 저자들의 편집도 진행했습니다.
감사의 글
이 프로토콜과 관련된 유익한 논의를 해주신 베아트리즈 올라야 사스트레에게 감사드립니다. 이 연구는 영국 심장 재단의 빅 비트 챌린지 수여 CureHeart(상의 참조 번호)의 지원을 받았습니다. BBC/F/21/220106), 낭포성 섬유증 재단(수상 NEWBY23XX0), 미국 국립보건원(R00HL163805 및 G.A.N.에 DP2OD038783) 등이 있습니다. J.N.W.는 NIH 보조금 번호 T32 GM148383의 지원을 인정합니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1M Tris-HCl, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | R0491 | Agarose UltraPure 16500500 ThermoFisher 500g |
| AMPure XP SPRI Beads | Beckman Coulter | B23317 | A63880, AMPure XP Beads for DNA Cleanup, 5 mL, Beckman Coulter |
| ATP (100 mM) | New England Biolabs | N0450 | |
| CEPT Cocktail | Bio-Techne / Tocris | 7200 | |
| CleanCap AG Reagent | TriLink Biotechnologies | N-7113 | CleanCap AG 3′ OMe CleanScript IVT Kit, 125 x 20 µL rxns, |
| CTP (100 mM) | New England Biolabs | N0450 | |
| Custom DNA Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7024 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | D8537-100ML |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | DMEM High Glucose [4,500 mg/L] with [4.0 mM] L-Glutamine and [110 mg/L] Sodium Pyruvate, 500 mL |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| GTP (100 mM) | New England Biolabs | N0450 | |
| Illumina Indexing Primers | Illumina | FC-131-2001 | 10uM stocks |
| Illumina MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| Lithium Chloride RNA Precipitation Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9480 | |
| Lonza 4D Nucleofector System | Lonza | AAF-1002X | |
| ssRNA Ladder NEB | NEB | N0362S | 5ul/ reaction |
| MiSeq Reagent Kit v3 (300 cycles) | Illumina | MS-102-3002 | |
| N1-Methyl-Pseudouridine-5′-Triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544 | |
| Nuclease-Free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| NucleoCounter NC Slide A8 | ChemoMetec | 941-0008 | |
| NucleoCounter NC-3000 | ChemoMetec | NC-3000 | 10ul of cell solution and 0.4167 μL of DAPI solution |
| Solution 15, Hoechst 33342, 1 mL 910-3015 Chemometec | Chemometec | 910-3013 | 500 μg/ml ~ 0.9 mM ~ 0.05% |
| Nucleocuvette Strips | Lonza | V4XP-3032 | |
| P3 Primary Cell Nucleofector Solution | Lonza | V4XP-3032 | 1 x 0.675 mL P3 Primary Cell Nucleofector® Solution |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530L | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | EO0491 | Quantity: 1mL, >600 U/mL (~20 mg/mL) |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491 | 2,000 units/ml 100 units |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit RNA Broad Range Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q10211 | |
| Qubit™ Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | 5ul/ reaction |
| RNA Purification Kit | Zymo Research | R1017 | |
| RNase Away | Thermo Fisher Scientific | 1236B62 | |
| SDS, 10% solution | Thermo Fisher Scientific | 15553027 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| Synthetic sgRNA / pegRNA | Synthego / IDT | Custom | 2ug |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, 250 reactions | New England Biolabs | E2040L | |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 100 mL |
| TE buffer (Tris-EDTA) | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | TE, pH 8.0, RNase-free Thermo |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 1X |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Premium, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A5670701 | |
| mTSER PLUS | STEM cell Technologies | # 100-0276 | |
| Penicillin/Streptomycin Mixture 10,000 ug/mL, 100 mL, 4-pack | Quality Biological | 120-095-721 |
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재인쇄 및 허가
