방법 논문

신생아 패혈증을 위한 조산기 전환 모델

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DOI:

10.3791/71456

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2026년 7월 10일

 ,  ,  ,  , 
1Comparative Pediatrics, Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen, 2BRIDGE Translational Excellence Programme, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

조산아의 세균성 패혈증 모델은 필수적이지만, 기존 설치류 모델은 임상적 관련성이 부족합니다. 살아있는 포도상구균에 감염된 조산아 새끼 돼지를 사용하여 신생아 패혈증의 고도로 번역 모델이 개발되었습니다.

초록

조산아는 특히 세균 감염에 취약하며, 이는 과도한 염증과 장기 기능 장애 상태인 생명을 위협하는 패혈증으로 빠르게 진행될 수 있습니다. 질병 기전을 조사하고 치료 개발을 진전시키기 위해서는 신생아 패혈증의 복잡한 병태생리와 임상 증상을 재현하는 견고한 중개 동물 모델이 매우 필요합니다. 이 프로토콜은 출생 직후 또는 출생 3일째에 생 포도상구균 표피구균 을 동맥 내 주입하여 유도하는 신생아 패혈증의 임상적으로 적합한 조산아 새끼 돼지 모델을 제시합니다. 새끼 돼지는 제왕절개로 임신 90%에 분만되며, 신생아 중환자 치료 조건에서 돌봄을 받습니다. 여기에는 온도 및 산소 조절 인큐베이터와 정맥 영양 전달과 연속 혈액 채취가 가능한 내장형 탯줄 동맥 카테터가 포함됩니다. S. epidermidis 감염 후에는 새끼 돼지를 24시간에서 48시간 동안 관찰합니다. 패혈증의 발생률과 심각도는 박테리아의 양과 비정구 포도당 공급에 의해 조절될 수 있습니다. 더 많은 비경구 포도당 공급은 염증성 면역 반응을 가속화하여 임상 악화로 이어집니다. 치명적 패혈증 및 인도적 종점은 동맥 혈가스 지표(pH ≤ 7.1)와 무기력, 피부 변색, 빈호흡과 같은 혈역학적 저하의 임상 징후로 정의됩니다. 이 모델은 에너지 대사와 면역조절 중재가 신생아 감염 시 박테리아 제거, 전신 염증, 조직 손상에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 독특한 플랫폼을 제공합니다. 이는 신생아 패혈증 예방 및 치료를 위한 임상 전략에 큰 잠재력을 지니고 있습니다.

서론

신생아 감염은 전 세계적으로 사망률과 장기 이환율의 주요 원인이며, 특히 조산아뿐만 아니라 저체중 출생아 또는 산전 합병증이 있는 만삭아에서도 나타납니다 1,2. 비특이적 임상 징후, 미성숙하고 매우 변이가 심한 면역 반응, 감염과 비감염성 염증을 구분할 수 있는 민감하고 특이적인 바이오마커의 부족으로 인해 조기 진단은 여전히 어렵습니다 3,4. 그 결과, 임상의들은 종종 미생물학적 확증 전에 경험적 광범위 항생제 치료를 시작하는데, 이는 항생제 과사용, 초기 미생물 정착의 교란, 항생제 내성 발생에 기여합니다5.

신생아 패혈증은 감염에 대한 숙주 반응 조절 이상으로 인해 장기 기능 장애를 초래하는 생명을 위협하는 질환입니다. 감염과 패혈증은 별개의 생물학적 및 임상적 실체를 나타내지만, 신생아학 문헌에서는 이 용어들이 종종 혼용되어 사용됩니다. 임상적으로 신생아 패혈증은 일반적으로 조기 또는 후기 발병 패혈증(EOS, LOS)으로 분류되며, 각각 생후 72시간 전이나 후에 발생한다. EOS는 일반적으로 대장균이나 B 군 연쇄상구균과 같이 출생 시 전염되는 병원체에 의해 발생합니다. 반면, LOS는 비특이적 증상을 자주 보이고, 배양 음성일 수 있으며, 침습적 시술, 정경 영양, 장기 입원 등 위험 요인과 연관되어 있습니다. 가장 흔한 원인균으로는 응고효소 음성 포도상구균, 특히 포도상구균 표피균과 그람 음성 박테리아가 있으며, 곰팡이 및 다중미생물 감염도 발생한다 1,2,6. 원인과 관계없이 신생아 감염은 흔한 패혈증 표현형 1,2에 수렴할 수 있습니다. 중요한 점은, 조산아는 선천 및 적응 면역 모두에서 발달 미성숙을 보이고, 대사 저장량이 제한되어 감염 반응성에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다.

진단과 치료의 진전은 기존 실험 시스템의 한계로 인해 지연되고 있습니다. 시험관 내 접근법은 면역 경로의 기전적 연구를 가능하게 하지만, 복잡한 면역 반응의 통합된 생리학을 포착하지 못합니다. 설치류 모델은 신생아 면역 반응에 대한 유전학 및 분자 연구에 유용하지만, 면역 발생, 대사, 크기 8,9에서 인간과 상당히 다릅니다. 이러한 모델에서는 집중 모니터링, 반복 혈액 채취, 임상적으로 현실적인 지지적 또는 치료 치료 검사 기회가 제한적이기 때문에 패혈증의 임상 관리를 연구하기 어렵습니다.

특히 조산아 새끼 돼지와 같은 대형 동물 모델은 강력한 보완적 접근법을 제공합니다. 돼지는 면역 세포 집단, 패턴 인식 수용체 신호 전달, 대사 조절 등 인간과 해부학적, 생리적, 면역학적으로 매우 유사한 점을 가지고 있습니다 10,11,12,13,14. 중요하게도, 돼지는 성인 패혈증의 모델로 널리 사용된다13,15. 돼지의 물리적 규모는 임상적으로 적합한 기기, 지속적인 생리학적 모니터링, 반복적인 생체 샘플링, 그리고 경혈 영양, 수액 치료, 항생제, 호흡 보조와 같은 표준화된 집중 치료 중재를 사용할 수 있게 합니다. 실험적 감염은 또한 발달 미성숙의 맥락에서 연구할 수 있어, 임상 실무와 매우 유사한 조건에서 질병 궤적, 숙주 반응, 치료 효과를 조사할 수 있습니다.

이 논문은 유연한 번역 플랫폼으로 설계된 조산아 새끼 돼지 신생아 패혈증 모델을 설명합니다. 이 모델은 전신 세균 감염의 통제된 유도와 임상, 면역, 대사 반응의 종단적 평가를 가능하게 하여, 신생아 패혈증의 병태생리를 탐구하고 새로운 예방 및 치료 중재의 효능을 평가하는 데 활용될 수 있습니다.

프로토콜

상세한 모든 절차는 EU 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었으며, 덴마크 동물실험 검사국(허가 번호: 2020-15-0201-00520)의 승인을 받았습니다.

1. 출산과 관련된 절차

  1. 임신 90%에 조산 돼지를 분만하기 위해 선택적 제왕절개를 시행합니다(임신일 106–107).
    1. 상업용 특정 병원체 없는 농장에서 임신한 암퇘지(랜드레이스 × 라지 화이트, 세 번째 또는 네 번째 파리티)를 입수하세요.
      참고: 암퇘지는 수정일의 정확한 날짜를 알기 위해 인공 수정(× Duroc)을 통해 임신해야 합니다.
    2. 암퇘지를 하룻밤(최소 12시간) 단식시키고, 수술 전에 자유롭게 물을 마실 수 있게 하세요. 아트로핀(암민당 2 mL), 부토르판올(2 mL/100 kg 체중; 10 mg/mL), 졸레틸 50 베트(3.3 mL/100 kg 체중; 틸타민 25/mL 및 졸라제팜 25 mg/mL)를 포함한 혼합 약물을 근육 주사로 진정을 유도합니다.
    3. 진정 후 귀정맥 카테터를 삽입하고 프로포폴(10 mg/mL)으로 전신마취를 유도하며, 백 반사와 턱 긴장이 사라질 때까지 점차 조절합니다.
    4. 기도를 확보하기 위해 직접 후두경 검사로 기관내 삽관을 시행하세요. 제왕절개 내내 마취면을 유지하며, 보정된 증발기를 통해 100% 산소(분당 1–2 L/분)로 기화된 이소플루란을 투여합니다.
    5. 5%에서 시작하여 1.5–2.5%를 유지하며, 심박수와 말초 산소포화도를 기준으로 가장 낮은 유효 용량으로 농도를 점진합니다.
      참고: 무호흡이 발생하면 적절한 산소 공급을 위해 기계적 환기를 시작하세요.
    6. 암퇘지를 오른쪽 옆쪽 누운 자세로 위치시키세요. 수술 부위에 무균 준비를 시행하세요. 의도한 왼쪽 옆구리 절개선을 따라 피하 및 근육 침투를 통해 총 120 mL 리도카인(10 mg/mL)을 투여합니다.
    7. 자궁 뿔을 노출시키고 외부 노출하기 위해 메스를 사용해 왼쪽 옆구리 복강 절개술을 시행하세요. 자궁 뿔을 더 큰 곡률을 따라 절개하여 개별 새끼를 낳습니다.
    8. 탯줄을 절단하기 전에 탯줄을 새끼 돼지 쪽으로 2–3번 짜어 헤모글로빈 농도와 철분 저장을 증가시킵니다. 출혈을 막기 위해 A–Z라고 표시된 배꼽 클램프와 거즈를 함께 감싸고 탯줄을 절단하세요.
    9. 출산 직후에는 각 돼지를 폴리에틸렌 봉지에 넣고 머리를 드러내도록 하세요. 이 백은 열 손실을 최소화하여 저체온증 위험을 줄여줍니다.
    10. 목에 근육 주사로 독사프람 0.1 mL(20 mg/mL)와 플루마제닐 0.1 mL(0.1 mg/mL)를 투여합니다. 독사프람은 자발 호흡을 자극하는 반면, 벤조디아제핀 길항제인 플루마제닐은 제왕절개 중 암퇘지에게서 옮겨진 마취를 부분적으로 역전시킵니다.
    11. 새끼 돼지를 신생아 중환자실로 옮기세요.
  2. 소생술, 무작위 수술 및 카테터 삽입
    1. 신생아 중환자실로 이송할 때 각 돼지의 성별을 측정하고 결정하세요.
    2. 자발적으로 숨을 쉴 수 없는 새끼 돼지의 경우, 개별적으로 소생을 시행하세요. 독사프람 및/또는 플루마제닐 용량을 반복하고, 호흡을 안정시키기 위해 필요에 따라 양압 환기를 제공하세요.
    3. 새끼 돼지가 생리적으로 안정되고 산모 전이 마취로 마취된 상태이면, 무균 기법을 사용해 탯줄 동맥 카테터(4 Fr PVC 영양관)를 절단된 탯줄의 동맥 중 하나에 삽입합니다. 카테터 끝을 등쪽 대동맥 쪽으로 밀어주세요. 카테터를 봉합사로 피부에 고정하고, 주입 라인에 연결하여 경정 영양을 공급합니다.
      참고: 조산돼지의 경우, 간실질이 아닌 간실질 내에서 카테터 끝이 잘못된 위치 발생으로 인한 간괴사를 방지하기 위해 제대정맥에 동맥 내 투여가 표준으로 정해져있습니다.
    4. 새끼 돼지를 출생 체중과 성별별로 층화하고 무작위로 치료 그룹에 배정합니다.
  3. 주거 환경
    1. 각 새끼 돼지는 개별적으로 가열되고 패딩 처리된 인큐베이터에 조절된 환기가 있습니다.
    2. 출생 후 최대 12시간까지 저산소증 예방을 위해 1–2리터/분의 보조 산소를 제공하세요.
    3. 출산 후 처음 12시간 동안 직장 체온을 모니터링하세요. 필요에 따라 가열 조건을 조정하여 중심 온도를 38–39 °C(목표: 38.5 °C)로 유지합니다.
      참고: 출생 직후 카테터 삽입 시에는 짧은 저체온증이 예상됩니다.

2. 혈장 주입을 통한 수동 면역

참고: 돼지는 면역글로불린을 태반전으로 전달하지 않으므로, 24시간 이상 지속되는 실험에서는 자발적 감염을 방지하기 위해 부분 수동 면역을 제공해야 합니다.

  1. 제왕절개 후 모지의 모체혈을 멸균 헤파린 코팅 용기에 채취하세요. 멸균된 팔콘 튜브에서 혈액을 4°C, 2500 ×g, 2500 g에서 10분간 원심분리하고 한 번 반복합니다. 분리 후에는 혈장을 새로운 멸균 팔콘 튜브에 조심스럽게 수집하여 4 °C에서 보관하여 사용 후까지 보관하세요.
  2. 출생 후 12시간 이내에 8 mL/kg 용량의 혈장을 30분 연속 동맥 내 주입으로 펌프를 사용해 투여합니다.

3. 실험적 감염 유도

참고: 실험적 감염은 출생 후 3–4시간 또는 출생 후 3일째에 유도될 수 있습니다.

  1. 박테리아 현탁액 준비
    1. 냉동 상태의 S. epidermidis 기본 바이알(WT-1457, 15–25% 글리세롤)을 실온에서 해동합니다. 소용돌이가 잠시 (2–3초) 일어나 동질한 현탁을 얻습니다.
      참고: 감염성 병원체 위험군 분류에 따르면, S. epidermidis 는 WHO 위험군 1 미생물로 분류됩니다. WHO 위험군 1 미생물은 인간 질병을 일으킬 가능성이 낮으며 특별한 주의가 필요하지 않습니다.
    2. 멸균된 100mL 에를렌마이어 플라스크에 녹인 S. 표피 육수 5 μL와 함께 뇌심장 주입(BHI) 육수 20mL를 접종하여 하룻밤 배양을 준비합니다. 37°C에서 180rpm의 궤도 흔들림을 가중하여 ~16시간 동안 배양하여 배양이 정지기에 도달할 수 있도록 합니다. 동일한 조건에서 비접종 BHI 육수 방제를 포함하여 중간 무균성을 검증합니다.
    3. 멸균된 100 mL Erlenmeyer 플라스크에 200 μL 배양액(1:100 희석)을 접종하여 새로운 배양물을 준비합니다. 모든 새끼 돼지를 감염시킬 수 있을 만큼 충분한 배양물을 준비하세요(3.1.4 – 3.1.6 단계 계산 참조). 37°C에서 180rpm의 궤도 흔들림을 가하며 2.5시간 동안 배양하여 박테리아가 초기 로그 성장 단계에 도달할 때까지 합니다(보완 그림 1A).
    4. 목표 용량, 평균 체중, 새끼 돼지 수, 배양 밀도를 기준으로 모든 새끼 돼지를 감염시키는 데 필요한 총 배양량을 추정합니다.
    5. 배양액이 2.5시간 배양 후 600 nm(외경)에서 ≥1(보조 그림 1B)에 도달할 것으로 가정하고, OD의 전환율을 1 = 3 × 108 콜로니 형성 단위(CFU)/mL로 설정합니다.
    6. 손실을 반영하기 위해 15% 추가 거래량을 포함하세요. 추정 배양 부피는 다음 공식을 사용하여 계산합니다:
      V추정 치 = [목표 선량 (CFU/kg 체중) × 체중) × 체중 × N × 1.15] / 3 × 108 CFU/mL (1)
      여기서 다음과 같습니다:
      V추정치 = 예상 총 배양 부피(mL)
      BW = 새끼 돼지의 평균 체중(kg)
      N = 총 새끼 돼지 수
    7. 배화 후에는 배양 체의 OD를 결정합니다. 분광광도계의 선형 범위 내에 측정값이 유지되도록 시료를 필요에 따라 희석합니다.
    8. 목표 CFU 농도를 달성하는 데 필요한 최종 배양 부피를 다음과 같은 공식으로 계산합니다:
      V결승 = OD1 · V추정치 / 측정 OD (2)
      여기서 다음과 같습니다:
      V최종 = 최종 배양 필요한 부피(mL)
    9. 계산된 V파이널 을 50 mL 팔콘 튜브에 옮기고 3,000 × g 에서 실온에서 10분간 원심분리합니다.
    10. 상액을 조심스럽게 버리세요.
    11. 박테리아 펠릿을 3 x V파이널 무균 0.9% 생리식염수에 재현탁하여 동맥 내 투여(체중 3 mL/kg 3분간 투여)를 준비합니다. 해액에 골재가 없는지 확인하세요.
    12. 박테리아 현탁액이 포함된 50mL 주입 주사기를 준비하세요.
    13. 감염되지 않은 대조군을 위해 멸균 0.9% 생리식염수가 포함된 별도의 50mL 주입 주사기를 준비하세요.
  2. 감염 절차
    1. 각 돼지에게 세균 현탁액 또는 멸균 식염수를 탯줄 동맥 카테터를 통해 3분 동안 목표 용량을 투여하도록 설정한 펌프를 사용하세요. 연속된 새끼 돼지 사이에 5분 간격을 유지하세요.
    2. 감염 직후에는 카테터를 세척하고 전체 용량을 전달하기 위해 지속적으로 정경 영양 주입을 시작하세요.
    3. 박테리아 현탁액을 4°C에서 보관하여 용량을 확인하세요. 이후 이 배양을 희석하여 혈액 한천 플레이트에 제거하여 박테리아 밀도를 측정할 수 있습니다(8단계 참조)

4. 간경관 영양

  1. 실험 기간 내내 새끼 돼지에게 전경구 영양(TPN)을 제공하세요. 예를 들어, 신생아 새끼 돼지의 다량영양소 요구량에 맞게 개조된 Kabiven 1900 kcal과 같은 3개의 챔버 인간용 TPN 백을 사용하세요.
  2. 무균 조건에서 정경 영양액을 준비하세요.
    1. 포도당 챔버에서 300mL를 빼세요.
    2. 지질 챔버에서 70mL를 제거하세요.
    3. 포도당 챔버에 50% 포도당 155mL를 추가하세요.
    4. 포도당실에 214mL의 바민을 추가하세요.
    5. 포도당실에 멸균수 150mL를 추가하세요.
    6. 포도당 챔버에 0.1 mL의 헤파린(5000 IE/mL)을 추가합니다.
    7. 세 개의 챔버 내용물을 모두 충분히 섞으세요.
      참고: 이로 인해 표 1에 표시된 다량영양소 조성을 가진 정경 영양 용액이 만들어집니다. 대체 영양 요법이 감염 반응에 미치는 영향을 평가할 때 이 공식을 표준 대조군 식단으로 사용하세요.
    8. 사용 전까지 4°C에서 비경구 영양제를 보관하세요. 용액은 여러 번 준비하고, 준비 후 48시간 이상은 사용하지 마세요.
      참고: 이 모델은 돼지에게 구강 영양관을 부착하여 장내 영양 및 장 자극의 효과를 평가하도록 수정할 수 있습니다.
  3. 정경 영양 전달
    1. 50mL 멸균 주사기에 경구 영양제를 채우고, 주입 펌프를 사용해 동맥내 카테터를 통해 지속적으로 주입합니다.
    2. 주입 속도를 6 mL/kg/h로 설정하세요. 새끼 돼지들을 매일 재고, 업데이트된 체중에 맞춰 복용량을 조절하세요.
      참고: 장기 연구의 경우, 말초 부종(과수분)이 관찰되면 주입 속도를 4 mL/kg/h로 줄이십시오.
    3. 주사기가 다 떨어지지 않도록 주입 펌프를 정기적으로 모니터링하세요. 필요에 따라 주사기를 다시 채워.

5. 임상 모니터링

  1. 연구 기간 동안 새끼 돼지를 정기적으로 평가하여 조치가 필요한지 판단합니다. 박테리아 주입 후에는 계획된 안락사 전까지 경험 많은 인력이 1–2시간마다 동물을 모니터링해야 합니다.
    참고: 임상 악화, 즉 증상 없이 인도적 종말점으로 진행되는 과정은 30분에서 60분 이내에 빠르게 발생할 수 있습니다.
    1. 호흡 빈맥, 호흡곤란, 청색증, 고인 호흡 등 호흡과 관련된 증상을 관찰하세요.
      참고: 저산소증(산소포화도< 80%)의 경우, 산소 공급을 시작하거나 증가시켜야 합니다.
    2. 변색, 사지의 차가움, 모세혈관 충전 시간 연장, 빈맥, 서맥 등 순환과 관련된 증상을 관찰하세요.
    3. 활동과 관련된 증상, 예를 들어 무기력, 서 있거나 걷기 불가(출생 후 3일차부터 관련), 통증 자극에 대한 반응성 등을 관찰하세요.
    4. 피부의 에키키모시스나 점상 출혈과 같은 응고와 관련된 증상을 관찰하세요. 변색된 부위에 부드럽게 압력을 가하세요; 붉어짐이 하얗지 않으면 피부 출혈로 분류하세요.
  2. 임상 증상이 관찰되면 혈액 가스 측정을 수행하여 pH, 젖산, 산소 포화도, 이산화탄소 분압을 기준치 대비 평가합니다(6.3단계 참조).
    참고: 혈압, 심박수, 호흡수 등 지속적인 임상 모니터링이 사용될 수 있으나 이 실험에서 일상적으로 사용되지는 않습니다.

6. 혈액 채취

참고: 종방향 혈액 채취는 동맥 내 카테터 또는 경정맥 정맥 천자를 통해 새끼 돼지에게 시행할 수 있습니다. 총 샘플 혈액량은 추정 전체 혈액량(체중의 ~7%)의 7.5%를 초과해서는 안 됩니다. 모든 혈액 샘플링 절차는 지역 윤리 지침을 준수해야 합니다.

  1. 동맥 내 카테터 혈액 샘플링
    1. 깨끗하고 장갑 낀 손으로 조심스럽게 카테터 포트에 접근하세요. 개장 전에 접근 부위를 에탄올로 소독하세요. 주입 라인 오염을 피하세요.
    2. 최소 2mL의 혈액을 빼내어 따로 보관하세요. 이 양은 주입 라인에서 나온 경혈 영양분에 오염될 수 있습니다. 채취한 샘플의 멸균을 유지하세요.
    3. 분석을 위해 필요한 혈액량을 수집하세요. 예를 들어, 혈액학 분석용 혈액은 EDTA 코팅된 튜브에 채취되어야 하며, 혈액 가스 분석용 샘플은 헤파린 코팅된 주사기로 채취해야 합니다.
    4. 샘플링이 완료된 후, 처음에 뽑은 2mL의 혈액을 새끼 돼지에게 다시 주입하고, 카테터를 정경 영양 주입 라인에 조심스럽게 다시 연결합니다.
  2. 경정정맥 천공 혈액 샘플링
    1. 새끼 돼지를 인큐베이터에서 꺼내 목 부위를 노출시키기 위해 등을 누운 자세로 눕히세요. 돼지를 안전하게 묶어 움직임을 막고 경정맥에 안전하게 접근할 수 있도록 하세요.
      참고: 경정맥 정맥 천자는 출혈, 혈종 형성, 기도 손상 등 잠재적 위험과 관련이 있습니다. 이 시술을 시행할지 결정하는 것은 결과의 과학적 중요성과 신중히 저울질되어야 합니다.
    2. 경정맥의 대략적인 해부학적 위치를 파악하고 에탄올로 천자 부위를 소독하세요.
    3. Vacutainer 시스템을 사용해 경정맥 천자를 시행하고 필요한 혈액량을 수집하세요. 예를 들어, 0.2mL의 혈액을 채취하여 4°C에서 박테리아 도판을 만들 때까지 보관합니다.
    4. 정맥 천자 부위에 압력을 가해 지혈이 이루어질 때까지 유지하세요. 그 후 새끼 돼지를 인큐베이터로 돌려보내세요.
    5. 새끼 돼지의 출혈 재현 징후를 계속 관찰하세요. 심한 출혈이 발생하면 새끼 돼지를 안락사시키세요. 또한 피하 혈종 형성이나 기도 손상 가능한 내부 출혈 여부를 모니터링하세요.
  3. 혈액 가스 측정
    1. 헤파린화 주사기의 혈액 샘플에서 기포가 있는지 검사하세요. 기포가 있으면 주사기를 두드려 부드럽게 배출하거나 제거하여 가스 측정값을 변경하지 않도록 하세요.
    2. 샘플을 혈액 가스 분석기로 옮기고 제조사의 지침을 따르세요. 정확성을 유지하기 위해 샘플이 신속하게 처리되도록 하세요.

7. 패혈증 기준과 인도적 종점

  1. 패혈증을 나타내는 인도적 기준에 도달하면 돼지를 안락사시키세요.
    참고: 기타 병리나 병원성 손상에 대해서는 인도적 종단점에 관한 지역 윤리 지침을 참조하십시오.
    1. 혈액 pH를 패혈증의 주요 지표이자 주요 인도적 평가 지표로 사용하세요. 혈액 pH가 7.1≤ 즉시 새끼 돼지를 안락사시키세요. 혈액 pH 7.2≤ 새끼 돼지의 경우 15–30분마다 혈액 가스 측정을 반복하고 2차 인도적 종말 지표를 모니터링합니다.
    2. 2차 인도적 종점으로는, 혈액 pH와 관계없이 피그레터를 피그가 나타나면 안락사시킨다. 여기에는 부상혈증 또는 점상 출혈, 호흡 정지, 심한 무기력, 통증 자극에 대한 반응 부재(해부학적 겸자로 손가락 사이 공간을 살짝 꼬집은 후 철수 반사 없음 확인).
  2. 졸레틸 기반 혼합물(0.1 mL/kg)을 근육 주사로 마취합니다.
    참고: Zoletil 50 Vet(티레타민 125mg, 졸라제팜 125mg)를 6.25 mL 자일라진(20 mg/mL), 1.25 mL 케타민(100 mg/mL), 2.5 mL 부토르파놀(10 mg/mL)을 사용하여 10 mL로 재구성합니다. 최종 농도는 틸레타민, 졸라제팜, 자일라진, 케타민 각각 12.5 mg/mL, 부토르파놀 2.5 mg/mL입니다.
  3. 통증 자극에 대한 금단 반사가 없어 적절한 마취 깊이를 확인한다(7.1.2 단계 참조).
  4. 심장 내 주사로 펜토바르비탈 나트륨 과다복용(3 mL/kg; 400 mg/mL)을 시행합니다.
    참고: 안락사 전에 진공 시스템을 사용하여 심장 내 혈액 채취를 할 수 있습니다.

8. 박테리아 도금 및 정량화

  1. 실험 중 채취한 경정맥 천자 샘플과 안락사 시 채취된 심장 천자 샘플을 사용하여 혈액 박테리아 밀도를 정량화합니다.
    참고: 동맥 카테터에서 채취한 혈액은 초기 실험 감염에서 남은 박테리아가 남아 있어 정량 측정에 혼란을 줄 수 있으므로 사용하지 마십시오.
    1. 각 혈액 샘플에 대해 양 혈액 한천 플레이트를 준비하고, 바닥에 0, -1, -2, -3 사분면을 표시한 뒤, 동물 ID와 시점을 라벨로 붙입니다.
    2. 각 샘플에서 50 μL의 혈액을 사용하여, 10-1, 10-2, 10-3 을 10배로 희석하여 450 μL 멸균 PBS 1.5mL 마이크로 원심분리관에 넣습니다.
    3. 각 판에 지정된 사분면에 해당하는 희석액의 20 μL 방울 3개를 놓고, 접촉이나 이월을 피하고 에어로졸화를 방지하기 위해 방울을 간격으로 배치하세요.
    4. 플레이트는 37°C에서 하룻밤 배큐팅한 후, 4°C에서 보관하다가 카운트를 시작하세요.
    5. 희석된 모든 박테리아 군락을 세어 각 점당 약 10개의 군락을 포함합니다. 보통 흰색이고 원형이며 매끄러운 가장자리를 가진 S. epidermidis 군락만 포함하세요. 형태가 변한 군체는 샘플링과 같은 오염을 나타내므로 주의 깊게 검사하고 기록하세요. 다음 식으로 CFU/mL를 계산합니다:
      (CFU/mL) = [(콜로니 수 · 희석 인수) / (3 · 20 μL)] · [1000μL/mL] (3)

결과

출생 후 5일째까지 사육된 조산아 새끼 돼지에서 용량-반응 실험이 수행되었습니다(그림 1). 출생 후 3일째에 새끼 돼지들은 저용량 S. epidermidis 주입(109 CFU/kg, n = 9), 고용량 S. epidermidis 주입(5 × 1010 9 CFU/kg, n = 9), 또는 대조군으로 식염수(n = 3)를 투여하고 44시간 동안 모니터링하였습니다.

S. epidermidis 주입 후, 고용량 투여 돼지의 혈액 박테리아 부담은 저용량군에 비해 44시간 동안 더 높은 상태로 유지되었습니다(그림 2A, P < 0.05). 고용량군(3/9)의 새끼 돼지만이 패혈증을 발병했으며, 감염 후 약 12–15시간 후에 발병했습니다(그림 2B). 이와 일치하게, 높은 S. epidermidis 용량을 받은 새끼 돼지는 12시간 동안 혈중 pH가 낮아졌으며(그림 2C, P < 0.001), 이산화탄소 분압(pCO₂)이 현저히 증가했습니다(그림 2D, P < 0.01).

감염의 급성기(6시간) 동안 두 감염군 모두 식염수 대조군에 비해 염기 과잉 수치가 낮고 젖산 수치가 높았으며, 고용량 S. epidermidis 그룹에서는 12시간까지 더 뚜렷한 변화가 지속되었습니다(그림 2E, F, P < 0.01 – 0.05). 혈당 수치는 그룹 간에 차이가 없었다(그림 2G).

6시간 시점에 감염된 두 그룹 모두 감염되지 않은 대조군에 비해 강한 혈액 호중구 감소를 보였다(그림 3A, 두 그룹 모두 P< 0.001). 감염 진행 후반에는 두 감염군 모두에서 호중구 보충이 관찰되었으나, 저용량 S. epidermidis 그룹에서 더 많았다(그림 3A, P < 0.05). 두 감염 그룹 모두 실험 중에 혈소판 감소증이 발생했다; 그러나 고용량 S. epidermidis 그룹은 저용량 그룹과 비감염 대조군에 비해 혈소판 수치가 더 일찍 그리고 더 뚜렷하게 감소했습니다(그림 3B, P < 0.01–0.05). 감염 후 6시간과 12시간 동안 TNF-α, IL-6, IL-10의 혈장 수치가 대조군과 비교하여 양군 모두 상승했다(그림 3C, P < 0.001–0.05). 24시간 시점에 혈장 TNF-α 및 IL-10 수치는 고용량 S. epidermidis 그룹에서만 비감염 대조군과 비교해 높게 유지되었으며(P < 0.05), 44시간경에는 TNF-α 수치만 높게 유지되었습니다(P < 0.05).

안락사 시, 새끼 돼지가 인도적 종점에 도달하거나 감염 후 44시간 예정된 시점에 안락사될 때, 음성 급성 반응물의 혈장 농도와 장기 손상 지표가 측정되었습니다(그림 4A–G). 이 중 고용량 S. epidermidis 감염된 새끼 돼지에서는 콜레스테롤(음성 급성 반응물)만이 저용량 그룹에 비해 유의하게 낮았다(그림 4B, P < 0.05). 알라닌 아미노트랜스퍼라제와 아스파르트산 아미노트랜스퍼라제 등 간 손상 지표와 크레아티닌, 혈중 요소 질소 같은 신장 손상 지표의 평균 수준은 고용량 S. epidermidis 그룹에서 비감염 대조군보다 수치적으로 더 높았다(그림 4D–G).

figure-results-1
그림 1: 실험 설계. 조산 돼지는 임신 90%에 제왕절개로 출산되었습니다. 출생 후 3일째에 새끼 돼지는 109 또는 5 ×10 9 CFU/kg의 생 S. epidermidis 또는 대조군으로 생식식염수를 주입했습니다. 감염 후 새끼 돼지는 44시간 동안 모니터링되었으며, 지정된 시점에 종단적 혈액 샘플링이 수행되었습니다. Biorender.com 로 만든 피규어. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-2
그림 2: 생식염수(CON) 또는 살아있는 S. epidermidis 감염 후 조산아 돼지의 혈액 박테리아 부하, 생존율 및 혈중 가스 지표. (A) 감염 후 6, 24, 44시간에 채취된 혈액 샘플에서 S. epidermidis 밀도. (B) 감염 후 44시간 시점에 인도적 종점 또는 예정된 안락사까지의 생존 곡선. (C–G) 감염 후 0, 6, 12, 24, 44시간에 동맥 혈관 수치. 데이터는 평균 ± SD.(A), 생존 곡선(B), 또는 중앙값(실선)과 IQR(점선)(C–G)을 포함한 바이올린 점플롯으로 제시됩니다. 각 감염 그룹마다 n = 9; 감염되지 않은 대조군의 경우 n = 3. 데이터는 그룹 × 시간 상호작용(A, C–G) 또는 콕스 비례 위험 모델(B)을 포함한 선형 혼합 효과 모델을 사용하여 분석되었습니다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. 약어; CON = 통제; pCO2 =CO2의 부분압; SE = S. epidermidis. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 3: 생리식염수 주입(CON) 또는 생 체 S. epidermidis 감염 후 조산 돼지의 순환 염증 지표. (A, B) 감염 후 6, 12, 24, 44시간 시점의 순환 호중구 및 혈소판 수치. (C) 감염 후 6, 12, 24, 44시간 시점의 TNF-α, IL-6, IL-10 혈장 수치. 데이터는 중앙값(실선)과 IQR(점선)(A–C)을 포함한 바이올린 점점 플롯으로 제시됩니다. 각 감염 그룹마다 n = 9; 감염되지 않은 대조군의 경우 n = 3. 데이터는 그룹 × 시간 상호작용(A–C)을 포함한 선형 혼합 효과 모델을 사용하여 분석되었습니다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. 약어; CON = 통제; IL = 인터루킨; SE = S. epidermidis; TNF = 종양 괴사 인자. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-4
그림 4: 생리식염수(CON) 또는 생식 포 상피 감염(109 또는 5 × 109 CFU/kg ) 후 조산 돼지의 혈장 생화학적 지표. (A–G) 감염 후 44시간 기준 인도적 말단 또는 예정된 안락사 시점의 혈장 알부민, 콜레스테롤, ALP, ALAT, ASAT, 크레아티닌, BUN 수치. 데이터는 전체 범위(최소에서 최대까지) (A–G)를 보여주는 위스커 플롯으로 제시됩니다. 진한 보라색으로 표시된 개별 데이터 포인트는 패혈증에 걸린 새끼 돼지를 나타냅니다. 각 감염 그룹마다 n = 9; 감염되지 않은 대조군의 경우 n = 3. 데이터는 다중 선형 회귀 모델(A–G)을 사용하여 분석되었습니다. *P < 0.05. 약어; ALAT = 알라닌 아미노트랜스퍼라제; ALP = 알칼리성 인산타제; ASAT = 아스파르트산 아미노트랜스퍼라제; BUN = 혈중 요소 질소; CON = 통제; SE = S. epidermidis. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

총 금액집중
에너지7762kJ3525kJ/L
다량 영양소
아미노산92g42g/L
뚱뚱함66g30g/L
포도당221g100g/L
미량 영양소
아니64MMOL29mmol/L
K48MMOL22mmol/L
MG8MMOL4mmol/L
카4MMOL2mmol/L
PO418MMOL8mmol/L
SO48MMOL4mmol/L
클93MMOL42mmol/L
아세테이트78MMOL35mmol/L

표 1: 수정된 총 정경 영양 구성. 정경 영양 용액 내 에너지, 다량 영양소(아미노산, 지방, 포도당), 미량 영양소의 총량과 농도.

보충 그림 1: S. epidermidis WT-1457의 성장 속도학. 박테리아는 뇌심장 주입 육수에서 37°C에서 배양되었으며, 180rpm의 안보 진동을 가했다. 광 밀도는 시간에 따라 600 nm에서 측정되었습니다. 데이터는 로그 스케일(A)와 선형 스케일(B) 방식으로 표시되며(n = 3개의 독립 실험) 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

조산아 새끼 돼지의 표준화된 신생아 패혈증 모델은 신생아 미성숙이라는 임상적으로 중요한 조건에서 전신 세균 감염을 연구하기 위해 설계되었습니다. 이 모델은 임신 주수 조절, 소생술, 중환자실 지원, 감염 시기 측정, 종단 혈액 채취를 결합합니다. 이 접근법은 설치류 실험 시스템과 시험관 내 실험 시스템, 감염된 신생아에서 겪는 복잡한 생리학 간의 간극을 메우는 것을 목표로 합니다. 중요하게도, 이 모델은 인간 조산아16, 17, 18에서 관찰된 패혈증 민감성과 성별, 저체중, 임신주수의 알려진 연관성을 확인했습니다.

돼지는 면역 기능과 생리학에서 인간과 상당한 유사성을 가지고 있어 감염 연구에 매우 중요한 대형 동물 모델입니다. 백혈구 하위 집합, 패턴 인식 수용체 신호, 사이토카인 반응 등 선천 면역계의 핵심 구성 요소들은 돼지와 인간 사이에 밀접한 상관관계를 보입니다. 신생 돼지와 인간 간의 주요 면역학적 차이는 적응 면역 반응에 있습니다. 돼지 임신 중에는 면역글로불린 G(IgG)의 태반 전이가 없기 때문에, 신생 돼지는 이 점에서 순진하게 태어납니다19. 마찬가지로, 영아의 B 세포는 3개월에서 6개월 이전에 IgM에서 IgG로 아이소폼 전환을 겪지 않는 반면, 돼지 B세포는20개월 출생 직후 IgG 반응을 발휘할 수 있습니다.

이 모델 시스템에서는 출생 직후 적응적 면역 반응이 일어나기 전에 감염을 유도하고, 혈장 수혈을 통해 모체에 면역글로불린을 공급함으로써 이러한 차이를 완화합니다. 이 방법은 조산으로 인해 태반 IgG 전달이 중단되는 신생아와 유사한 순환 IgG 수치를생성합니다. 또한, 출생 시 비교적 큰 신체 크기(~800 g)는 신생아 쥐(~3 g)에 비해 모델을 더욱 강화합니다. 그 결과, 온도, 습도, 산소 긴장과 같은 환경적 영향은 인간 신생아가 경험하는 것과 더 유사합니다. 이 척도는 또한 신생아 설치류 모델에서는 불가능한 임상급 장비, 침습적 모니터링, 혈관 접근, 호흡 지원, 지속적인 생리학적 모니터링과 같은 지지 치료 기법의 사용을 가능하게 합니다. 구체적으로, 조산돼지 모델에서 혈관 접근은 탯줄 동맥 카테터를 통해 이루어집니다. 이는 임상 신생아학에서 사용되는 표준 정맥 주사 경로와는 대조되지만, 조산기 돼지의 해부학적 제약상 때문에 필요하다. 탯줄 정맥 카테터는 거의 정맥관을 자연스럽게 통과하지 않고 간 실질(간실질) 내에서 위치가 이상해지기 때문이다. 동맥 내 투여는 탯줄 정맥 부위 배치와 관련된 간 괴사 위험 없이 신뢰할 수 있고 재현 가능한 연속 주입 경로를 제공합니다. 마찬가지로, 동맥혈을 혈액 가스 분석을 위해 샘플링할 수 있습니다.

이 모델에서 전신 감염은 신생아 중환자실에서 늦게 발병하는 패혈증의 주요 원인인 S. epidermidis의 동맥 내 주입에 의해 유도됩니다 1,2. 그러나 신생아 패혈증을 일으키는 병원체는 다양하며, S. epidermidis와 같은 응고효소 음성 포도상구균은 E. coli 1,2와 같은 더 치명적인 병원체보다 덜 심각한 감염과 낮은 패혈증 위험을 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 모델은 저병원성을 사용하지만, 관찰된 임상 악화, 염증 활성화, 생리적 불안정성은 모두 신생아 패혈증의 주요 특징을 반영합니다. 본 연구의 비감염 대조군(n = 3)은 동일한 중환자실 조건에서 "건강한" 조산기 돼지의 생리학적 상태를 입증하는 기준선 기준 역할을 합니다. 이로 인해 설계 불균형이 발생하지만, 이 비교들은 감염에 대한 숙주 반응을 나타내기 위한 것입니다. 그림 2에서 보듯, S. epidermidis 용량 증가와 명확한 용량-반응 관계가 나타났으며,이는 생후 1일째에 감염된 돼지들에서 이전 발견과 일치합니다. 가장 높은 S. epidermidis 용량을 투여받은 새끼 돼지만이 인도적 종단점으로 악화하여 안락사가 필요했습니다. 그러나 두 감염군 모두 대사성 산증이 발생했으며, 호흡기 성분(pCO₂ 상승)은 고용량 S. epidermidis 그룹에서만 관찰되었습니다. 마찬가지로, 두 그룹 모두 감염 후 6시간 후에 뚜렷한 호중구 감소증을 보였고, 24시간 후에 호중구 보충이 있었으며, 이는 저용량 그룹에서 더 심각했습니다. 혈소판감소증도 두 그룹 모두에서 발견되었으며, 혈장 사이토카인과 장기 손상 지표가 증가했고, 가장 높은 S. epidermidis 용량을 받은 돼지의 반응이 더 뚜렷했습니다.

조산 돼지에서 S. epidermidis 감염은 출생 후 1일차에 신생아 패혈증의 부임상 증상(대사성 산증, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 염증)과 함께 무기력, 응고병증, 보체 섭취 증상을 유발합니다 17,22,23. 감염은 또한 에너지 대사에 전신적 교란을 일으키며, 특히 미토콘드리아 산화성 인산화 감소와 함께 신생아 패혈증 환자에서 보고된 것과 유사한 혈장 단백질체 및 대사체 변화를 일으킵니다(24,25,26). 또한, 조산(임신 90%)은만삭 17세에 태어난 새끼보다 패혈증에 걸릴 가능성이 훨씬 높습니다. 영양 구성은 임상적·면역학적 반응에도 영향을 미칩니다. 포도당 기반 TPN은 당분해 대사를 촉진하여 염증 촉진 면역 반응을 증폭시키고, 말초 조직의 질병 내성을 저하시킵니다24,26. 이러한 반응의 조합은 장기 손상과 패혈증표현형으로의 진행과 관련이 있습니다. 포도당 함량을 줄이거나 갈락토스, 포도당생성 아미노산, β-하이드록시부티산과 같은 대체 다량영양소로 대체하여 TPN 조성을 조절하면 염증 반응이 완화되고 조직의 질병 내성을 유지합니다. TPN을 통한 고혈당 보조도 고혈당(≈10–20 mM)을 유발합니다. 그러나 관찰된 당과 연관된 염증 반응이 혈당 상승에 의해 직접적으로 매개되는지는 여전히 명확하지 않습니다.

실험적 관찰은 감염 발생 후 출생일에 따라 임상 반응에 명확한 차이가 있음을 보여줍니다. 출생 직후 감염이 유도될 때 패혈증 발생 위험과 임상 증상의 심각도가 가장 높습니다. 출생 후 3일째 감염 유도는 패혈증 표현형이 경미해지고, 유도 후 첫 24시간 동안 질병 행동, 호흡기 및 대사성 산증이 나타나며, 장기 손상 지표가 높음에도 불구하고 임상 회복을 보입니다. 조기 유도와 후기 유도 사이의 이러한 차이의 기전은 현재 알려지지 않았으며, 현재 연구 중인 분야입니다. 그러나 조산 돼지의 비경적 영양 시작 후 혈당 항상성은 출산 후 첫 3일 동안 개선되어, 비슷한 포도당 섭취에도 불구하고 고혈당이 감소합니다. 전반적으로, 출생 후 감염일과 포도당 제공을 변화시키면 급성 중증 패혈증 또는 경미한 표현형 모두를 포착할 수 있습니다. 이러한 조정을 통해 특정 질병 표현형에 맞춘 표적 개입 시험이 가능해집니다. 이 모델의 임상적 적용 성은 신생아 순차적 장기 부전 평가(nSOFA)와 같은 확립된 패혈증 관련 신생아 평가 시스템과 연계함으로써 더욱 강화될 수 있습니다. 지속적인 동맥 혈압 모니터링과 심혈관 및 혈액학적 점수 산정에 필요한 즉각적인 혈소판 수치가 불가능해 본 연구에서는 실시간 nSOFA 기반 점수 체계가 도입되지 않았습니다. 프로토콜의 향후 개선에서는 질병 심각도를 더 잘 분류하기 위해 nSOFA 프레임워크를 적용할 수 있습니다.

번역적 강점에도 불구하고, 이 모델은 몇 가지 중요한 한계가 있습니다. 이 실험들은 자원 소모적이며, 제왕절개, 신생아 소생, 산후 거주, 조산 돼지 돌봄을 수행하는 전문 시설과 고도로 훈련된 인력이 필요합니다. 감염 실험은 동물 복지와 신뢰할 수 있는 데이터 수집을 보장하기 위해 두세 명의 경험 많은 직원이 지속적으로 직접 모니터링해야 하며, 장기 추적 관리는 비용이 증가합니다. 설치류 모델과 비교할 때, 종별 특이적 시약의 가용성은 특히 면역조직화학 및 유동세포분석에 더 제한적이지만, 적절한 검증 후 많은 인간 항체를 성공적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 돼지의 근친교배 특성은 새끼 내외의 생물학적 변이가 상당히 크기 때문에 감염 반응의 미미한 차이를 감지하기 위해 더 큰 집단 규모가 필요하다. 이러한 변동성은 실험적 복잡성을 높이지만, 임상 신생아 집단에서 관찰되는 이질성을 더 잘 반영하여 모델의 번역적 관련성을 높입니다. 결론적으로, 이 검증된 신생아 패혈증 프로토콜은 향후 신생아학 연구와 새로운 예방 및 치료 중재 시험에 유용한 도구가 될 것입니다.

공개 사항

저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 코펜하겐 대학교 비교소아과학 그룹 직원들의 지원을 받았으며, 노보 노르디스크 재단(NNF23OC0085457 및 NNF22OC0078747)의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
 0.1–10 μL pipette tips “Optifit”Sartorius790010
1 mL 일회용 주사기(살균됨)e-power150001S
1 mL 주사기와 25 G X 16 mm 바늘(살균됨)B. Braun Melsungen AG9161465V
1.5 mL 튜브Eppendorf30125215
10 mL 일회용 주사기(살균됨)e-power150010S
100 mL 엘렌마이어 플라스크Duran Wheaton Kimble212162403
1000 μL 피펫Sartorius 46880171
12 G “Intraflon 2” 바늘(살균됨)Vygon122.27
16 G X 40 mm “Microlance 3” 바늘(살균됨)Becton Dickinson300637
18 G X 40 mm “Microlance 3” 바늘(살균됨)Becton Dickinson303262
19 G X 40 mm “Sterican” 바늘(살균됨)B. Braun Melsungen AG466 5112
2 mL 일회용 주사기(살균됨)e-power150002S
2-0 70 cm 봉합사 “ Vicryl plus”(살균됨)Johnson & Johnson  VCP453
20 G X 25 mm “Microlance 3” 바늘(살균됨)Becton Dickinson304827
20 mL 일회용 주사기(살균됨)e-power150020S
20 μL 피펫Sartorius46886095
200 μL 피펫Sartorius39486615
20G Venflon "Pro" 1.1 x 32 mmBeckton Dickinson393255
21 G x 25 mm Vacutainer 혈액 채취 바늘(살균됨)Becton Dickinson301746
21 G X 40 mm “Sterican” 바늘(살균됨)B. Braun Melsungen AG4665643
22 G X 50 mm “Microlance 3” 바늘(살균됨)Becton Dickinson300094
23 G X 25 mm “Medoject” 바늘(살균됨)Chirana T. InjectaCH23100
25 G X 16 mm “Microlance 3” 바늘(살균됨)Beckton Dickinson300600
25 G X 25 mm “Sterican” 바늘(살균됨)B. Braun Melsungen AG9186158
25 mL 플라스틱 피펫(살균됨)LP Italian Spa162510
30 mL 일회용 주사기(살균됨)e-power150030S
4L 플라스틱 냉동 백Cater.LineABN-105004
5–350 μL pipette tips “Optifit”Sartorius790350
5 mL 일회용 주사기(살균됨)e-power150005S
5 mL 주사기(살균됨) B. Braun Melsungen AG4617053V
50–1200 μL pipette tips “Optifit”Sartorius791200
50 mL Luer Lock Original Perfusor 주사기 B. Braun Melsungen AG8728844F-06
50 mL 튜브(살균됨)Sarstedt AG and Co. KG62.547.254
82% 에탄올 + 0.5% 클로르헥시딘 소독 와이프Mediq527497
Atropine "ATROpin" 1 mg/mLAmgros741124
붕대 가위, 스테인리스강, 180 mmB. Braun Melsungen AGBC849R
혈액 가스 기계 ABL90Radiometer994-667 (서비스 매뉴얼)
브레인 하트 인퓨전 브로스(BHI/B)사내 생산N.A. 상업적으로 사용 가능한 등가 제품: Brain Heart Infusion Broth (Merck, Cat. No. 53286)
Butorphanol "Butomidor vet" 10 mg/mLVetViva Richter53 19 43
세포 배양기 “HeraCell 150i”Thermo Fisher Scientific51032719
원심분리기, Rotina 380 RHettich 1701
임상 화학 시스템 “Advia 2120i”Siemens Healthcare GmbH104

참고문헌

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