이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

녹색 형광 단백질로 표지된 삼중음성 유방암 세포의 항체 유도 대식세포 식작용에 대한 타임랩스 이미징

164 조회수

⸱

DOI:

10.3791/71461

⸱

2026년 8월 14일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 말초혈액단핵구 유래 대식세포와 자동 현미경을 사용하여, 녹색 형광 단백질로 라벨링된 삼중음성 유방암 세포의 항체 의존적 대식세포 포식 작용을 시각화하는 타임랩스 살아있는 세포 이미징 방법을 설명합니다.

초록

항체 의존성 세포 식세포 작용(Antibody-dependent cellular phagocytosis)은 대식세포가 항체로 옵소닌화된 암세포를 engulf 하는 주요 기전입니다. 본 프로토콜은 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein)로 표지되고 CD24를 발현하는 삼중 음성 유방암 세포에 대한 항체 의존성 대식세포 식세포 작용을 시각화하기 위한 타임랩스 살아있는 세포 이미징 방법을 설명합니다. 대식세포는 인간 말초혈액 단핵구에서 유래하여 대식세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony–stimulating factor)로 분화시키고, 인터페론 감마(interferon gamma)와 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 사용하여 염증성 표현형으로 분극화하여 생성합니다. 암세포는 정의된 작동세포 대 표적세포 비율(effector-to-target ratio)로 대식세포와 공동 배양하기 전에 anti-CD24 단클론 항체로 옵소닌화합니다. 식세포 작용 과정은 생리적 조건을 유지하기 위한 환경 제어 장치가 장착된 자동 현미경을 사용하여 16 h 동안 기록합니다. 이미징은 명시야 및 형광 채널을 사용하여 수행되며, 이를 통해 암세포를 식별하고 대식세포에 의한 내부화를 모니터링할 수 있습니다. 대표적인 타임랩스 이미지는 시간이 경과함에 따라 형광 암세포가 점진적으로 engulf 되는 모습을 보여줍니다. 정량적 평가를 위해 동일한 공동 배양 조건 하에서 병행 엔드포인트 분석(endpoint assay)을 수행하며, 이때 이미징 전에 내부화되지 않은 암세포를 제거하여 식세포 작용 이벤트를 정확하게 측정할 수 있도록 합니다. 이 방법은 in vitro에서 항체 주도 대식세포 식세포 작용을 시각화하기 위한 표준화되고 재현 가능한 접근 방식을 제공합니다. 특히 타임랩스 이미징과 엔드포인트 기반 정량화를 통합함으로써 식세포 작용의 역학과 규모에 대한 상호 보완적인 평가가 가능합니다. 본 프로토콜은 제어된 in vitro 환경에서 치료용 항체 및 대식세포 표적 암 면역 요법의 평가를 지원합니다.

서론

유방암은 전 세계 여성에게서 가장 빈번하게 진단되는 악성 종양으로, 연간 약 230만 건의 신규 사례가 발생합니다1. 이 질환은 임상적으로 이질적이며, 호르몬 수용체인 에스트로겐 수용체(ER) 및 프로게스테론 수용체(PR)의 상태와 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2) 온코진의 발현 여부에 따라 최소 네 가지의 주요 분자 아형으로 분류됩니다2. 루미날 A(Luminal A) 종양은 HER2 과발현 없이 ER 및/또는 PR을 발현하며(ER/PR+ 및 HER2−), 루미날 B(Luminal B) 종양은 ER/PR과 HER2를 공동 발현합니다(ER/PR+ 및 HER2+). HER2+ 종양은 호르몬 수용체 상태와 무관하게 높은 HER2 발현이 특징이며, 삼중음성 유방암(TNBC)은 세 가지 마커 모두의 발현이 결여되어 있습니다(ER−, PR−, HER2−)2,3. 이러한 아형들 중 TNBC는 임상적으로 가장 다루기 어려운 형태이며, 전체 유방암의 약 15%~20%를 차지합니다. TNBC 환자는 기존 화학요법에 대한 반응이 낮고 효과적인 표적 치료제가 없기 때문에, 가장 공격적인 질환 경과를 보이며 예후가 가장 나쁘고 5년 전체 생존율이 가장 짧습니다3,4. 또한, TNBC는 내장 전이, 특히 진단 후 5년 이내의 폐 전이 성향이 매우 높으며, 진행성 또는 전이성 삼중음성 유방암(mTNBC) 환자의 중앙 생존 기간은 2년을 넘는 경우가 드뭅니다5,6. 이러한 통계는 TNBC를 위한 새로운 치료 전략에 대한 절실하고 미충족된 필요성을 강조합니다.

종양 미세환경(TME)은 유방암의 진행과 면역 회피에 중추적인 역할을 합니다. 종양 관련 대식세포(TAM)는 TME 내에서 가장 풍부한 면역 세포 중 하나이며, 최근 선천적 항종양 면역의 핵심 매개체로 인식되었습니다7,8,9. 과거에는 TAM을 염증 촉진성 “M1” 상태와 종양 촉진성 “M2” 상태로 구분하였으나, 이러한 이분법적 모델은 대식세포 이질성의 실제 범위를 포착하지 못합니다. 대신, TAM은 TME 내의 다양한 생화학적 신호에 반응하여 진화하는 역동적인 기능적 스펙트럼을 형성합니다. 이러한 복잡한 환경 속에서 암세포는 다양한 면역 회피 전략, 특히 “나를 먹지 마세요(don’t eat me)” 신호의 과발현을 통해 대식세포의 활성을 적극적으로 저해합니다. CD47/SIRPα 축은 이러한 맥락에서 처음으로 확인된 선천 면역 관문이었으며6,10, 최근에는 CD24가 새롭고 강력한 항식작용 신호로 등장했습니다11,12. CD24는 glycosylphosphatidylinositol 결합을 통해 세포막에 고정된, 작고 당화가 심한 뮤신형 당단백질입니다13. 이는 생리적 조건에서 다양한 면역 세포 계통에서 발현되지만, 유방암, 난소암, 췌장암 및 대장암을 포함한 고형암에서 빈번하게 과발현됩니다14. 종양 세포에서 CD24는 대식세포에 발현된 억제 수용체인 sialic acid–binding immunoglobulin-like lectin 10(Siglec-10)과 결합합니다. 이 상호작용은 Siglec-10의 세포질 꼬리에 있는 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM) 도메인의 인산화를 유발하며, 이는 하위 식작용 신호를 억제하는 SHP-1 및 SHP-2 인산가수분해효소를 활성화합니다11. 단클론 항체로 CD24/Siglec-10 상호작용을 차단하면 대식세포에 의한 CD24 발현 인간 종양의 식작용이 강력하게 증진되는 것으로 나타났습니다. 저희의 최근 연구 또한 유방암 세포에서 CD24a를 녹아웃시키면 마우스 삼중음성 유방암 모델에서 대식세포 식작용에 대한 감수성이 증가함을 보여주었습니다9.

항체 의존성 세포 포식 작용(ADCP)은 항체가 대식세포로 하여금 종양 세포를 포식하도록 유도하는 핵심 메커니즘입니다15,16. 항체가 종양 발현 항원에 결합하면, 항체의 Fc 영역이 대식세포의 Fcγ 수용체(FcγRs)와 결합하여 세포 내 신호 전달 폭포를 유발하며, 이는 최종적으로 세포골격 재배열, 포식 컵 형성 및 표적 세포의 engulfment로 이어집니다17.

본 연구에서 우리는 유방암 세포에 대한 항체 유도 대식세포 식균 작용을 측정하기 위한 타임랩스 살아있는 세포 이미징 프로토콜을 개발하고 검증하였습니다. 이 방법은 건강한 인간 공여자의 말초혈액 단핵세포(PBMC) 유래 대식세포를 사용하며, 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)로 분화시킨 후 리포폴리사카라이드(LPS)와 인터페론 감마(IFN-γ)로 자극합니다. 유세포 분석 결과, 자극 후 CD11b⁺ 집단 내에서 CD80의 상향 조절이 확인되었으며(그림 1), 이는 고전적 활성화 표현형을 뒷받침합니다. 이러한 활성화 상태는 강력한 항체 매개 식균 능력을 부여하여 항체 의존성 세포 식균 작용(ADCP)을 평가하는 데 매우 적합합니다. GFP가 태깅된 CD24 양성 유방암 세포가 표적 세포로 사용되며, 공동 배양 전 치료용 항-CD24 단클론 항체로 옵소닌화됩니다. 식균 이벤트는 제어된 환경 조건 하에서 자동 현미경을 사용하여 16시간 동안 기록됩니다. 동적 시각화와 병행하여 정량적 평가를 가능하게 하기 위해, 동일한 공동 배양 조건에서 별도의 엔드포인트 분석을 수행하여 내부화되지 않은 표적 세포를 제거한 후 식균 작용을 엄격하게 측정합니다. 이 프로토콜은 항-CD24 항체에 의해 매개되는 ADCP를 평가하기 위한 표준화되고 재현 가능하며 시각적으로 정보가 풍부한 플랫폼을 제공합니다. 중요한 점은, 타임랩스 이미징과 상보적인 엔드포인트 기반 정량화 전략의 통합을 통해 식균 속도론과 크기를 동시에 평가할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 다른 대식세포 표적 면역치료 타겟을 조사하는 데 응용될 수 있습니다. 본 프로토콜은 암세포 표면 항원에 대한 치료용 단클론 항체에 의해 매개되는 ADCP를 평가하는 데 가장 적합합니다. 이는 후보 항체의 비교 스크리닝, 용량-반응 특성 분석, 그리고 "don't-eat-me" 신호 차단(예: CD47–SIRPα)의 효과를 포함한 Fc–FcγR 결합의 기전 연구에 매우 적합합니다. 또한, 이 분석법은 일차 인간 대식세포를 사용하므로 임상 개발 전 공여자 간 변이 평가가 필요한 중개 연구에도 적절합니다.

대식세포 분석을 위한 유세포 분석법을 이용한 말초혈액 단핵구 분리 모식도.
그림 1. 말초혈액 단핵구 유래 IFN-γ/LPS 자극 대식세포의 생성 및 유세포 분석 검증. 상단 패널: 모든 시약을 20°C ± 2°C로 사전 평형시킨 후, Ficoll 용액을 사용하여 20°C에서 400 × g로 30분 동안 밀도 구배 원심분리를 수행하여 건강한 공여자로부터 말초혈액 단핵구(PBMCs)를 분리합니다. 분리된 PBMCs는 대식세포 분화를 유도하기 위해 100 ng/mL macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)가 첨가된 ImmunoCult-SF 배지에서 7일 동안 배양하며(Day 0–7), Day 5에 배지를 보충합니다. Day 8에 분화된 대식세포를 100 ng/mL IFN-γ와 1 µg/mL LPS로 48시간 동안 자극합니다(Day 8–10). 이후 세포를 유세포 분석으로 분석합니다. 하단 패널: 대식세포의 유세포 분석. 세포를 CD11b-FITC, CD80-PE, CD206-PerCP-Cy5.5로 구성된 표면 패널로 염색한 후, 사멸 세포 제거를 위해 데이터 획득 전 DAPI를 추가합니다. 게이팅 전략: 먼저 생존 세포(DAPI⁻)를 게이팅하고, CD11b-FITC 대 FSC-A 플롯에서 CD11b⁺를 식별하여 대식세포 정체성을 확인합니다. 이후 생존한 CD11b⁺ 이벤트를 CD80 대 CD206 도트 플롯에서 분석하여 IFN-γ/LPS 자극에 의해 유도된 CD80⁺CD206⁻ 집단을 확인합니다. 오른쪽: CD11b-FITC 대 FSC-A의 대표 도트 플롯으로, 게이팅된 세포의 99.8%가 CD11b⁺임을 보여주어 대식세포 정체성을 확인합니다. 왼쪽: CD11b⁺ 세포의 대부분이 CD80⁺CD206⁻ 게이트(Q1: 95.2%) 내에 분포하며, 이는 적용된 자극 조건 하에서 예상되는 전염증성 표현형을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

이 기술을 적용할 때 사용자는 몇 가지 제약 사항을 고려해야 합니다. 첫째, PBMC 유래 대식세포의 공여체 간 가변성은 포식 작용 결과에 상당한 편차를 유발할 수 있으므로, 여러 명의 공여체(n ≥ 3)를 사용하고 통합 결과와 함께 개별 공여체 데이터를 보고할 것을 권장합니다. 둘째, 2D 공동 배양 방식은 종양 미세환경을 그대로 재현하지 못하므로, 임상적 추론을 내리기 전에 3D 또는 in vivo 모델에서 결과를 검증해야 합니다. 셋째, 16시간의 이미징 창은 초기 포식 사건을 포착하지만, 항원 제시나 2차 면역 활성화와 같은 장기적인 과정은 반영하지 않습니다. 따라서 실시간 이미징과 최종 시점 정량을 병행하여 사용하면 ADCP 측정의 해석 가능성과 재현성을 모두 높이는 상호 보완적인 체계를 구축할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

본 프로토콜에는 건강한 기증자의 혈액 샘플에서 유래한 일차 대식세포가 사용됩니다. 샘플의 수집 및 처리는 중국 의과대학교 기관생명윤리위원회(IRB)의 가이드라인에 따라 수행되었습니다.

1. PBMC 유래 대식세포의 준비

참고: 인간 혈액과 관련된 모든 절차는 기관 IRB(예: CMUH IRB)의 승인 하에 수행하십시오. 혈액 채취 전 건강한 기증자로부터 고지된 동의를 얻으십시오.

주의: 모든 인혈 제품은 보편적 주의 원칙에 따라 생물안전등급 2(Biosafety Level 2) 조건에서 취급하십시오.

  1. 혈액 채취
    1. 건강한 공여자로부터 10 mL 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 코팅 vacutainer 튜브에 전혈을 채취한다.
  2. 혈액 희석
    1. 전혈을 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS; Ca2⁺-/Mg2⁺-free)와 1:1 비율로 희석한다(예: 혈액 10 mL + PBS 10 mL).
    2. 튜브를 3~5회 반전시켜 혼합한다.
      참고: PBS는 사용 전까지 얼음 위에 보관한다. 낮은 온도는 처리 과정 중 세포 생존력을 유지하는 데 도움이 된다.
  3. 밀도 구배 층 형성
    1. 원추형 튜브에 희석된 혈액을 Ficoll–Paque PLUS 위에 2:1 부피 비율(v/v)로 조심스럽게 층을 쌓는다(예: 15 mL 튜브에 Ficoll 4 mL 위에 혈액 8 mL, 또는 50 mL 튜브에 15 mL 위에 30 mL).
    2. 층을 쌓기 전, 희석된 혈액과 Ficoll–Paque PLUS를 모두 20°C ± 2°C로 평형화한다.
    3. 사용 전 최소 30분 전에 4°C 보관소에서 Ficoll–Paque PLUS를 꺼내거나, 20°C ± 2°C 항온수조에서 짧게 가온한다.
    4. Ficoll 밀도는 20°C ± 2°C에 맞춰 보정되어 있으므로 차가운 시약을 사용하지 마십시오. 온도가 벗어나면 분리 효율과 PBMC 수율이 저하된다.
      참고: 튜브를 45° 각도로 기울이고 혈액을 벽면을 따라 천천히 피펫팅하여 경계면을 명확하게 유지한다. Ficoll 층이 흐트러지지 않도록 주의한다.
  4. 원심분리
    1. 브레이크를 끈 상태에서 20°C, 400 × g로 30분간 원심분리한다(그림 1).
      참고: 브레이크를 사용하면 밀도 구배가 파괴되어 PBMC 수율이 감소한다.
  5. PBMC 수집
    1. 세롤로지컬 피펫을 사용하여 상단의 혈장 층이나 하단의 Ficoll 층을 건드리지 않고, 버피 코트(buffy coat) 층(혈장과 Ficoll 층 사이의 하얀색 경계면)만을 조심스럽게 흡입한다.
    2. 수집한 층을 새로운 50 mL 원추형 튜브로 옮긴다.
  6. PBMC 세척
    1. 50 mL 원추형 튜브에 PBS를 추가하여 총 부피를 25 mL로 맞춘다.
    2. 적절한 원심분리와 균형 유지를 위해 50 mL 튜브를 사용한다.
    3. 300 × g로 10분간 원심분리한다.
  7. 적혈구 용해
    1. 상층액을 제거한다.
    2. 펠릿이 완전히 분산되고 보이는 덩어리가 없을 때까지 세롤로지컬 피펫으로 부드럽게 파이펫팅하여 5 mL 적혈구(RBC) 용해 완충액에 재부유시킨다.
    3. 실온에서 5분간 배양한다.
      주의: 균일한 용해를 위해 완전한 분산이 필요하지만, PBMC에 손상을 줄 수 있는 격렬한 피펫팅이나 볼텍싱은 피한다. 적혈구 용해 완충액에 5분 이상 노출되면 PBMC 생존력이 저하될 수 있으므로 배양 시간을 초과하지 마십시오.
  8. PBMC 펠릿 형성
    1. 500 × g로 5분간 원심분리하여 PBMC를 펠릿화하고 용해된 적혈구 잔해를 제거한다.
  9. 최종 재부유
    1. 상층액을 제거한다.
    2. 펠릿을 5 mL ImmunoCult-SF 대식세포 배지에 재부유시킨다.
      참고: 표준 조건에서 전혈 10 mL는 일반적으로 1.5–2.0 × 107 개의 PBMC를 생성한다.

2. 대식세포 분화 (0~7일 차)

참고: 부착을 통해 단핵구 유래 분화 대식세포를 선택하려면 조직 배양(TC) 처리가 되지 않은 페트리 접시를 사용하십시오. 부착되지 않은 림프구는 이후 배양 과정에서 세척되어 제거됩니다.

  1. 0일차: 세포 파종
    1. 세포 수를 측정하고 1 × 107 PBMCs를 비-TC 처리된 10 cm Petri dish에 파종합니다.
    2. 100 ng/mL M-CSF가 보충된 ImmunoCult-SF macrophage medium(사용 직전 complete medium에 M-CSF stock을 직접 첨가하고 부드럽게 뒤집어 섞어 준비)을 사용하여 총 부피를 10 mL로 맞춥니다.
      참고: 공여자별 PBMC 수율 차이에 따라 1 × 106 cells/mL의 파종 밀도를 기준으로 프로토콜 규모를 비례적으로 조정할 수 있습니다.
  2. 배양 및 모니터링
    1. 가습 인큐베이터에서 37°C, 5% CO₂ 조건으로 배양합니다.
    2. 매일 부유하는 단핵구 클러스터의 형성 및 부착 세포의 출현 여부를 모니터링합니다.
      참고: 분화가 진행됨에 따라 단핵구의 크기가 점차 커지며 클러스터를 형성합니다. 일부 단핵구는 플레이트에 부착되기 시작합니다. 이 단계에서는 별도의 조치가 필요하지 않습니다.
  3. 5일차: 배지 보충
    1. 부착된 대식세포가 흐트러지지 않도록 주의하며, 100 ng/mL M-CSF가 보충된 신선한 ImmunoCult-SF macrophage medium 5 mL를 디쉬에 조심스럽게 첨가합니다.
    2. 추가로 2일 더 배양을 계속합니다(7일차까지).
      주의: 기계적 충격은 분화 효율과 세포 수율에 영향을 미칠 수 있으므로, 부착된 대식세포가 흐트러지지 않도록 디쉬 벽면을 따라 신선한 배지를 조심스럽게 첨가하십시오.
      참고: 대식세포 분화를 돕는 autocrine/paracrine 인자들을 보존하기 위해 배지를 교체하지 마십시오.
  4. 7일차: 형태학적 평가
    1. 도립 현미경 하에서 대식세포 분화 효율을 검사합니다.
    2. 부착 세포는 크고 평평하며 불규칙한 모양에 위족(pseudopodia)이 관찰되는 전형적인 대식세포 형태를 나타냅니다.
    3. 7일차에 잘 분화된 대식세포가 관찰되어야 합니다.
      주의: 7일차의 형태학적 평가는 후속 유세포 분석 검증을 위한 중요한 전제 조건입니다. 잘 분화된 대식세포가 현미경으로 명확히 관찰되어야 하며, 대식세포 형태를 가진 부착 세포의 비율이 높을수록 분화 효율이 높음을 의미합니다(특징적인 형태를 가진 부착 대식세포가 약 70%의 confluency를 보일 때 성공적인 분화로 간주합니다). 부착 정도가 낮거나, 주로 둥근 세포가 관찰되거나, 형태학적 분화가 미흡한 배양물은 신뢰할 수 있는 유세포 분석 결과를 얻기 어려우므로 자극 및 염색 단계로 진행해서는 안 됩니다.

3. 대식세포 분극화 (8~10일차)

  1. 조건화 배지의 수집 및 정제
    1. 8일 차에, 부착된 대식세포가 흐트러지지 않도록 배양 접시에서 15 mL의 배지를 조심스럽게 흡입하여 멸균된 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.
    2. 수집한 배지를 400 × g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 파편을 침전시킵니다.
    3. 정제된 상층액을 다음 단계를 위해 보관합니다.
  2. 인터페론 감마(IFN-γ) 및 리포폴리사카라이드(LPS) 자극
    1. 정제된 15 mL 상층액을 새로운 멸균 튜브로 옮기고 100 ng/mL IFN-γ와 1 µg/mL LPS를 첨가합니다.
    2. 기포가 발생하지 않도록 파이펫으로 부드럽게 5~10회 상하 혼합하여 사이토카인이 균일하게 분포되도록 합니다.
    3. 사이토카인이 첨가된 15 mL 배지 전체를 원래의 배양 접시로 되돌려주며, 이때 부착된 대식세포가 흐트러지지 않도록 접시의 안쪽 벽을 따라 부드럽게 파이펫팅합니다.
    4. 37°C, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양합니다(8일 차에서 10일 차).
      참고: 자가분비/근접분비 인자를 보존하기 위해 조건화(기존) 배지를 사용합니다. IFN-γ와 LPS의 조합은 대식세포를 염증 유발 표현형으로 분극화하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜에서 사용된 IFN-γ (100 ng/mL) 및 LPS (1 µg/mL) 자극 조건 하에서, 대식세포는 활성화된 염증 유발 상태와 일치하는 신장된 엽상가족(lamellipodia)을 포함한 특징적인 형태학적 변화와 CD11b 및 CD80 발현을 나타냅니다.
      주의: LPS는 노출 시 염증 반응을 일으킬 수 있는 생성 활성 엔도톡신이므로, 적절한 실험실 안전 절차에 따라 취급하십시오.

4. 유세포 분석법을 통한 IFN-γ 및 LPS 자극 대식세포의 염증성 표현형 마커 확인

  1. 세포 회수
    1. 표현형 분석을 위해 10일 차에 분극화된 대식세포의 일부를 회수한다.
    2. PBS에 10 mM EDTA를 첨가하고 37°C에서 10–15분 동안 배양한다.
    3. 부드럽게 피펫팅하여 세포를 분리한다.
      참고: 세포가 계속 부착되어 있는 경우, 37°C에서 EDTA 배양 시간을 30분 더 연장한 후 부드러운 피펫팅을 반복한다. 세포 생존율과 표면 마커의 무결성을 유지하기 위해 격렬한 피펫팅이나 기계적 스크래핑은 피한다.
  2. 항체 염색 설정
    1. CD11b(범-대식세포 계열 마커), CD80(염증성 마커) 및 CD206(염증성 표현형 식별을 위한 음성 배제 마커로 사용되는 항염증성 마커)에 대한 형광체 결합 항체로 세포를 염색한다.
  3. 염색 절차
    1. 분리된 대식세포 5 × 105개를 차가운 PBS 100 µL가 담긴 유세포 분석 튜브로 옮긴다.
    2. CD11b-FITC, CD80-PE 및 CD206-PerCP-Cy5.5 항체를 각각 최종 농도 1 µg/mL가 되도록 첨가한다.
    3. 부드럽게 피펫팅하여 세포 현탁액을 혼합한다.
    4. 빛을 차단한 상태로 얼음 위에서 1시간 동안 배양한다.
    5. 시료를 4°C에서 300 × g로 1분 동안 원심 분리한다.
    6. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거한다.
    7. 차가운 PBS 0.5 mL를 첨가하여 세포 펠릿을 세척한다.
    8. 시료를 4°C에서 300 × g로 1분 동안 원심 분리한다.
    9. 상층액을 버린다.
    10. 세포 펠릿을 차가운 PBS 200 µL에 다시 현탁한다.
    11. DAPI를 최종 농도 1 µg/mL가 되도록 첨가한다.
      참고: 적절한 아이소타입 컨트롤과 생존 염색 시약(예: DAPI 또는 Viobility 405/452 Fixable Dye)을 포함시킨다.
  4. 유세포 분석
    1. 유세포 분석기를 사용하여 염색된 시료를 획득한다.
    2. 대식세포 집단에서 CD11b 및 CD80의 발현을 확인한다.
    3. 염증성 표현형과 일치하는 마커 발현을 확인한 후에만 식세포 작용 분석을 진행한다.
  5. 유세포 분석 획득 및 설정
    1. 기기 설정
      1. 다음 채널을 사용하여 유세포 분석기를 구성한다: Pacific Blue/V450 (DAPI), FITC (CD11b), PE (CD80), PerCP-Cy5.5 (CD206).
      2. 정의된 부모 게이트 내에서 시료당 10,000개의 이벤트를 수집하도록 획득 파라미터를 설정한다.
    2. 임계값 및 게인 교정
      1. x축에 FSC를, y축에 하나의 형광체 채널을 표시하는 4개의 닷 플롯을 연다.
      2. 각 형광체에 맞춘 해당 아이소타입 컨트롤 항체로 염색된 세포를 준비한다.
      3. 아이소타입 컨트롤 시료를 획득한다.
      4. 로그 스케일에서 아이소타입 컨트롤 집단이 101 아래에 위치하도록 각 채널의 게인을 조절한다.
      5. 이 임계값을 사용하여 배경 신호 수준을 정의한다.
        참고: 배경 신호와 특이적 신호 사이의 신뢰할 수 있는 분리를 설정하기 위해 101에서 101·5 범위의 로그 스케일을 사용한다.
    3. 보정(Compensation)
      1. 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브에 보정 비드 한 방울을 넣는다.
      2. 해당 형광체 결합 항체를 최종 농도 1 µg/mL가 되도록 첨가한다.
      3. 빛을 차단한 상태로 얼음 위에서 30분 동안 배양한다.
      4. 400 × g에서 1분 동안 원심 분리한다.
      5. 상층액을 버린다.
      6. 비드를 차가운 PBS 200 µL에 다시 현탁한다.
      7. 단일 색상 컨트롤을 획득한다.
      8. 스펙트럼 보정을 적용하여 형광체 스필오버(spillover)를 교정한다.
    4. 게이팅 전략
      1. 생존 세포 선택
        1. y축에 Pacific Blue/V450 (DAPI)를, x축에 FSC를 표시한다.
        2. 생존 세포를 선택하기 위해 DAPI 음성 이벤트(101 미만)에 게이트를 설정한다.
      2. 대식세포 식별
        1. 생존 세포 집단을 부모 게이트로 설정한다.
        2. y축에 FITC (CD11b)를, x축에 FSC를 표시한다.
        3. CD11b⁺ 이벤트(101 초과)에 게이트를 설정한다.
      3. 염증성 표현형 식별
        1. CD11b⁺ 집단을 부모 게이트로 설정한다.
        2. y축에 PE (CD80)를, x축에 PerCP-Cy5.5 (CD206)를 표시한다.
        3. 양쪽 축의 101.5 지점에서 사분면 게이팅을 적용한다.
        4. 좌상단 사분면(Q1)에서 CD80⁺CD206⁻ 세포를 식별한다.
  6. 판정 기준
    1. CD11b⁺ 부모 게이트 내 세포의 ≥90%가 CD80⁺CD206⁻임을 확인한다.
    2. 이 임계값에 도달했을 때만 식세포 작용 분석을 진행한다.
    3. 시료가 이 기준을 충족하지 못한 경우 PBMC 분리, M-CSF 분화 및 IFN-γ/LPS 자극 과정을 반복한다.

5. 항체 의존성 포식 작용 분석

참고: 분석 설정 전에 암세포에서 GFP가 안정적으로 발현되는지 확인하십시오. 분석 전 타겟 세포의 CD24 발현을 확인하십시오. 최적의 성능을 위해 CD24 양성률이 50%–100%인 암세포를 사용하십시오. 본 프로토콜에 사용된 MDA-MB-468 세포는 100% CD24 양성을 나타냅니다.

  1. 대식세포 파종
    1. 단계 4에서 검증된 대로, IFN-γ 및 LPS로 자극된 대식세포를 2 × 10^6 cells/well 밀도로 분주하십시오.5 24-웰 조직 배양 플레이트의 웰당 세포 수.
    2. 플레이트를 다음 조건에서 배양하십시오. 37°C 세포 부착을 위해 5% CO₂ 조건의 정적인 상태에서 12~16시간 동안 배양한다(그림 2A).
      참고: 다음 단계로 진행하기 전에 대식세포가 단단히 부착되었는지 확인하십시오. 부착 상태가 불량한 대식세포는 이미징 과정에서 떨어져 나가 결과에 혼선을 줄 수 있습니다.
  2. 암세포 준비
    1. CD24 양성 GFP 표지 유방암 세포(MDA-MB-468)를 70%~80% 밀도로 배양하십시오.
    2. 배양액을 흡입하여 제거하십시오.
    3. 세포 단층을 PBS로 한 번 세척하십시오.
  3. 암세포의 분리
    1. 배양 접시에 PBS에 희석한 10 mM EDTA를 첨가하십시오.
    2. 세포를 다음 조건에서 배양하십시오. 37°C 5~10분 동안.
    3. 부드럽게 피펫팅하여 세포를 떼어내어 세포가 완전히 분리되도록 합니다.
      참고: 세포 분리를 위해 트립신을 사용하지 마십시오. 효소 소화는 세포 표면에서 CD24를 절단하여 항체 결합을 저해할 수 있습니다.
  4. 암세포의 수집 및 계수
    1. 분리된 세포를 원심분리관에 수집하십시오.
    2. 세포를 300 × g에서 5분 동안 원심분리하십시오.
    3. 상층액을 제거하십시오.
    4. 세포 펠릿을 완전 RPMI 배지에 다시 현탁하십시오.
    5. 생존 세포 수를 측정하십시오.
  5. 암세포의 항체 옵소닌화
    1. 암세포를 2 × 10 밀도로 재부유하십시오.5 0.5 mL의 완전 RPMI 배지 내 cells/mL.
    2. 최종 농도가 다음이 되도록 항-CD24 단클론 항체를 첨가하십시오. 1 µg/mL.
    3. 항체의 균일한 분포를 위해 세포 현탁액을 부드럽게 피펫팅하여 혼합하십시오.
    4. 세포를 다음 조건에서 배양하십시오. 37°C 정지 상태에서 30분 동안.
      참고: 항체 의존성 식세포 작용의 음성 대조군으로 동일한 농도의 이소형 일치 IgG 대조군을 포함하십시오.
  6. 공동 배양 준비
    1. 옵소닌화 후 세포를 세척하지 마십시오.
    2. 세포 표면의 항체 코팅을 유지하기 위해 즉시 공동 배양으로 진행하십시오.
  7. 공동 배양 설정
    1. 1 × 10을 추가하십시오5 대식세포가 포함된 각 웰에 항체로 옵소닌화된 GFP 표지 유방암 세포를 첨가합니다.
    2. 효과세포 대 표적세포 비율을 2:1로 유지하십시오.
      참고: 실험 설계에 따라 작동세포 대 표적세포 비율을 조정하십시오. 세포 간 접촉 빈도를 높이고 식세포 작용 사건의 검출력을 강화하려면, 설명된 2:1 비율보다 더 높은 대식세포 대 암세포 비율(예: 3:1 또는 5:1)을 사용하십시오.

이미징 실험에서 대식세포와 GFP 표지 세포 간 상호작용의 타임랩스 도식.
그림 2항체 의존성 세포 포식 작용의 타임랩스 이미징. (A) 공배양 시스템 및 타임랩스 이미징 설정의 모식도. 이미징 파라미터는 10배 대물렌즈의 위상차 및 GFP 채널을 사용하여, 총 16시간(97프레임)의 획득 시간 동안 10분 간격으로 설정되었다. (B) 1시간부터 16시간까지의 대표 타임랩스 이미지로, 시간에 따른 대식세포의 GFP 양성 암세포 내재화를 특징으로 하는 식세포 작용 사건을 보여준다. 노란색 점선 원은 대표적인 식세포 작용 사건을 강조한다. 위상차 채널에서 포식된 암세포는 대식세포 세포질 내의 위상 밝은 세포 내 구조로 나타난다(흰색 화살표). GFP 채널에서 대식세포 내에 국소화된 형광은 내재화를 확인시켜 준다. (C) 0, 1, 4, 16시간에서의 대표적인 식세포 작용 사건의 확대도로, 대식세포에 의한 GFP 표지 암세포 포식의 순차적 과정을 보여준다. 이미지 시퀀스는 대식세포 매개 식세포 작용 사건이 명확하게 시각화된 것을 바탕으로 대표 사례로 선택되었다. 흰색 화살표는 표적 세포와 상호작용하여 이를 내재화하는 대식세포를 나타낸다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

6. 타임랩스 이미징 (자동화된 살아있는 세포 이미징 시스템)

참고: 분석 전 Lionheart 자동 라이브 셀 이미징 시스템과 Gen5 자동 라이브 셀 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미징 프로토콜을 설정하십시오. 정확한 설정, 최적의 성능 및 안전한 사용을 위해 이미징 시스템을 작동하기 전 적절한 교육을 받으십시오.

  1. 기기 준비
    1. 이미징 시작 최소 1시간 전에 이미징 시스템, 환경 제어 모듈 및 CO₂ 가스 공급 장치를 켭니다.
    2. 자동 라이브 셀 이미징 소프트웨어에서 환경 제어 패널을 여십시오.
    3. 온도를 다음으로 설정하십시오: 37°C 그리고 CO₂ 농도를 5%로 설정합니다.
    4. 챔버 온도가 ± 범위 내에서 안정화되는지 확인하십시오. 0.2°C 플레이트를 로딩하기 전, 5.0% ± 0.1%의 CO₂ 조건에서 유지합니다.
  2. 플레이트 설정
    1. 24웰 플레이트를 이미징 시스템의 이미징 챔버에 넣습니다.
  3. 초기 설정
    1. 자동 실시간 세포 이미징 소프트웨어의 작업 관리자를 여십시오.
    2. [이미저 수동 모드]를 선택하십시오.
    3. [지금 캡처]를 클릭하여 이미징 매개변수를 초기화하십시오.
    4. 10배율 대물렌즈를 선택하십시오.
    5. 필터 설정으로 마이크로플레이트를 선택하십시오.
    6. 자동 라이브 셀 이미징 소프트웨어의 플레이트 라이브러리에서 24-웰 플레이트를 선택하십시오.
  4. 초점 및 이미지 설정
    1. 위상차 채널을 선택하십시오.
    2. 대표 웰(예: A1)을 선택하십시오.
    3. 타임랩스 획득 전 자동 초점을 활성화하십시오.
    4. 카메라 아이콘을 사용하여 이미지를 캡처하십시오.
    5. 세포 형태와 초점 품질을 확인하십시오.
    6. [프로세스/분석]으로 이동하십시오.
    7. 실험을 설정하려면 [이미지 세트에서 실험 생성]을 선택하십시오.
  5. 타임랩스 획득 파라미터
    1. [절차] 설정 패널을 여십시오.
    2. 온도를 다음으로 설정하십시오. 37°C 그리고 $\text{CO}_2$ 농도를 5%로 유지하십시오.
    3. [Start Kinetic] 항목에서 실행 시간을 16:00:00으로 설정하십시오.
    4. 이미징 간격을 0:10:00으로 설정하십시오.
    5. 총 리드 수를 97로 설정하십시오.
    6. 초기 식세포 작용 이벤트를 포착하는 동안 시간적 해상도와 광독성의 균형을 맞추기 위해 10~15분의 이미징 간격을 사용하십시오.
  6. 이미징 채널 구성
    1. 채널 1을 위상차로 설정하십시오.
    2. 채널 2를 GFP (Ex 469/35, Em 525/39)로 설정하십시오.
    3. 최적의 시야와 해상도를 위해 10배 대물렌즈를 선택하십시오.
    4. 조명, 통합 시간 및 게인을 [자동]으로 설정하거나 수동으로 조정하십시오.
    5. 신호 포화를 방지하기 위해 일반적인 GFP 노출 시간인 100–300ms를 사용하십시오.
    6. 모든 웰에 동일한 이미징 설정을 적용하십시오.
  7. 영상 촬영 위치 설정
    1. [비컨 정의] 메뉴를 여십시오.
    2. Z-스택 획득 기능을 비활성화하십시오.
    3. 몽타주 획득을 비활성화하십시오.
    4. 단일 초점 평면에서 이미징을 수행하십시오.
    5. 현미경 아이콘을 사용하여 각 웰 내에서 서로 겹치지 않는 대표 영역을 선택함으로써 이미징 위치를 수동으로 정의하십시오.
    6. 모든 시점에서 동일한 영상 촬영 위치를 유지하십시오.
    7. 웰당 최소 4~6개의 시야를 선택하십시오.
  8. 타임랩스 획득
    1. [재생]을 클릭하여 자동 타임랩스 이미징을 시작하십시오.
  9. 데이터 내보내기 및 시각화
    1. 획득 후 저장된 실험 파일을 여십시오.
    2. 영상 촬영 위치를 선택하십시오.
    3. 타임랩스 데이터를 MP4 형식으로 내보내십시오.
    4. [프로세스 도구]를 여십시오.
    5. 시각화를 개선하고 대표적인 식세포 작용 사건을 식별하기 위해 필요한 경우 [이미지 디컨볼루션(Image Deconvolution)]을 적용하십시오.
      참고: 타임랩스 이미징은 정성적 시각화 용도로만 사용하십시오. 포식되지 않은 GFP 양성 암세포가 대식세포와 겹치거나 일시적으로 결합하여 위양성 신호가 나타날 수 있습니다. 정량적 분석은 별도의 최종 시점 분석(endpoint assay)을 통해 수행하십시오.

7. 최종 시점 식세포 작용 정량화

  1. 내부화되지 않은 세포의 제거
    1. 동일한 공동 배양 조건에서 분석을 수행합니다.
    2. 4 h 후에 실험을 종료합니다.
    3. 배양액을 제거합니다.
    4. PBS에 10 mM EDTA를 첨가합니다.
    5. 37°C에서 5 min 동안 배양합니다.
    6. PBS로 부드럽게 세척하여 내부화되지 않은 GFP 양성 세포를 제거합니다.
    7. 신선한 대식세포 배지를 첨가합니다.
  2. 정량화를 위한 이미지 획득
    1. 위상차 및 GFP 채널을 사용하여 이미지를 획득합니다.
    2. 웰당 최소 4–6개의 시야(field of view)를 캡처합니다.
    3. 조건당 최소 3개의 웰을 분석합니다.
  3. 식세포 작용 사건의 정의
    1. 세포 경계 내에 완전히 둘러싸인 GFP 양성 신호를 포함하는 대식세포를 식별합니다.
  4. 이미지 분석
    1. ImageJ 소프트웨어에서 이미지를 엽니다.
    2. Cell Counter 플러그인을 사용합니다.
    3. 전체 대식세포 수를 셉니다.
    4. 내부화된 GFP 양성 세포를 포함하는 대식세포 수를 셉니다.
  5. 식세포 작용 지수 계산
    1. 다음과 같이 계산합니다: 식세포 작용 지수 공식; 전체 대식세포 대비 포식된 GFP 양성 세포의 비율; 방정식.
    2. 눈가림법(blinded manner)으로 분석을 수행합니다.
    3. 최소 3회의 독립적인 실험을 통해 반복합니다.
  6. 데이터 제시
    1. 대표적인 타임랩스 이미지를 시간 순서대로 제시합니다 (그림 2B 및 그림 2C).
    2. 대표적인 최종 시점(endpoint) 이미지를 제시합니다 (그림 3A 및 그림 3B).

식세포 작용 분석: 대식세포 공배양, anti-CD24 mAb; 현미경 이미지, 데이터 차트 비교.
그림 3종점 분석을 이용한 항체 의존성 대식세포 식세포 작용의 정량화. (A) GFP로 표지된 유방암 세포와 4시간 동안 공동 배양한 후, EDTA 처리를 통해 포식되지 않은 세포를 제거한 대식세포의 대표적인 위상차 및 GFP 형광 이미지. 대식세포와 내부로 섭취된 GFP 양성 표적을 식별하기 위해 위상차 채널과 GFP 채널을 병합하였다. ImageJ의 Cell Counter 플러그인을 사용하여 대식세포(카운터 0)와 GFP 양성 포식 대식세포(카운터 1)의 수를 측정하였다. IgG 대조군 조건에서는 포식 현상이 관찰되지 않은 반면, anti-CD24 단클론 항체 처리 시 대식세포 내에서 명확한 GFP 양성 신호가 관찰되어 활발한 포식 작용이 일어났음을 나타냈다. 스케일 바 = 200 µm(B) 식세포 작용 지수의 정량화. 식세포 작용 지수는 전체 대식세포 집단 대비 GFP 양성 세포를 내포한 대식세포의 백분율로 정의됨. Anti-CD24 단클론 항체는 IgG 대조군에 비해 식세포 작용 지수를 유의하게 증가시킴(0.00 ± 0.00% vs. 18.76 ± 4.01%, 평균 ± 표준편차; 그룹당 n = 6개 시야; ***p < 0.001, Welch의 비쌍체 t-검정). 데이터는 최소 3회 이상의 독립적인 실험을 대표한다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

PBMC로부터 대식세포의 성공적인 생성 및 분극화는 형태학적 평가와 유세포 분석을 통해 확인되었습니다(그림 1). 밀도 구배 원심분리로 분리한 PBMC를 M-CSF가 첨가된 배지에서 배양한 결과, 7일 차에 대식세포 특유의 형태를 가진 부착 세포가 생성되었습니다. IFN-γ와 LPS로 자극한 후, 세포들은 적용된 조건 하에서 활성화와 일치하는 표현형을 나타냈습니다. 유세포 분석 결과, 게이팅된 세포의 99.8%가 CD11b 양성으로 나타나 대식세포로 효율적으로 분화되었음을 확인하였습니다(그림 1). CD11b 양성 세포 중 대다수가 CD80⁺CD206⁻ 사분면에 위치(95.2%)하여, 지정된 자극 조건 하에서 성공적으로 분극화되었음을 나타냈습니다. 이러한 결과는 본 프로토콜이 예상되는 마커 발현 프로필을 가진 대식세포를 안정적으로 생성함을 입증합니다.

타임랩스 이미징을 통해...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 프로토콜의 여러 단계는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. 첫째, PBMC 분리의 품질과 순도는 대식세포의 수율과 분화 효율에 직접적인 영향을 미칩니다. 희석된 혈액을 Ficoll 밀도 구배 위에 조심스럽게 층적하고 브레이크를 끈 상태로 원심분리하는 것이 버피코트(buffy coat) 인터페이스를 보존하는 데 필수적입니다. RBC 용해가 불완전하거나 용해 버퍼에서의 배양 시간이 과도하면 PBMC의 생존율이 저하됩니다. 둘째, 식세포 작용 분석 전에 유세포 분석을 통해 전염증성 대식세포 분극화를 확인해야 합니다. CD80을 상향 조절하지 못한 대식세포는 식세포 능력이 감소하여 anti-CD24 항체 매개 효과의 해석에 혼란을 줄 수 있습니다. 셋째, 암세포의 탈착 방법이 중요합니다. 효소적 소화로 인해 세포 표면에서 CD24가 절단되어 항체 결합 효율이 감소할 수 있으므로 트립신 처리는 피해야 합니다. EDTA 기반의 탈착 방식은 표면 항체의 무결성을 보존하므로 이를 권장합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자들은 이해 상충이 없음을 밝힙니다.

감사의 글

본 연구는 대만 교육부(MOE)의 고등교육 새싹 프로젝트(Higher Education Sprout Project) 프레임워크 내 중점 분야 연구 센터 프로그램의 지원을 받아 중국 의과대학교 암 생물학 및 정밀 치료 센터(Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University)의 후원으로 수행되었습니다(CBPTC-PROJ-5-2).

연구비 지원과 학술적 지원을 제공해주신 암생물학 및 정밀치료 센터(Cancer Biology and Precision Therapeutics Center)에 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 스톡 용액Sigma-Aldrich(또는 동등 제품)E7889 (또는 이에 상응하는 제품)세포 분리를 위한 PBS 내 10 mM EDTA 작업 용액 제조에 사용됨
24-웰 조직 배양 플레이트 (TC 처리됨)Corning (또는 동등 제품)3524식세포 작용 분석 시 대식세포와 암세포의 공배양에 사용됨
항인간 CD206 항체 (유세포 분석법)BioLegend (또는 이에 상응하는 제품)321122 (또는 해당 동등 제품)대안적 대식세포 표현형 마커
항인간 CD24 단클론 항체Thermo Fisher Scientific (또는 이에 상응하는 제품)MA1-91384 (또는 그에 상응하는 제품)항체 의존적 식세포 작용을 위해 암세포를 옵소닌화하는 데 사용됨
환경 제어 챔버가 장착된 자동화 라이브 셀 이미징 시스템(예: Lionheart FX)Agilent Technologies (또는 그와 동등한 제품)BioTek Lionheart FX 자동 현미경제어된 온도 및 환경 하에서 장기간의 타임랩스 이미징을 가능하게 합니다. 2 조건
자동 라이브 셀 이미징을 위한 이미징 소프트웨어 (예: Gen5)Agilent Technologies (또는 동등 제품)제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 입력해 주세요.타임랩스 이미징 데이터의 획득 및 분석에 사용됨
원심분리기 (스윙 버킷 로터)Thermo Fisher Scientific (또는 동등 제품)TX-1000 로터가 장착된 Multifuge X4R Pro (또는 동등 제품)PBMC 분리 및 세포 세척 단계에 사용됨
2 인큐베이터 (37°C)°C, 5% 2)Thermo Fisher Scientific (또는 동등 제품)Forma 직접 가열 방식 2 배양기 (또는 그에 상응하는 장비)세포 배양을 위한 생리학적 조건 유지
2 레귤레이터가 장착된 가스 공급 장치Agilent Technologies (또는 동등 제품)해당 없음준비물 2 인큐베이터 및 이미징 시스템의 환경 제어를 위해
원심분리관 (15 mL 및 50 mL)Corning (또는 그에 상응하는 제품)352070 (또는 동등 제품)PBMC 분리, 세척 및 원심분리 단계에 사용됨
EDTA 코팅 혈액 수집관(vacutainers)BD Biosciences (또는 그에 상응하는 제품)367863 (또는 이에 상응하는 것)기증자로부터 전혈 샘플을 채취하는 데 사용됨
Ficoll-Paque PLUSCytiva (또는 이에 상응하는 제품)17144003 (또는 그에 상응하는 제품)PBMC 분리를 위한 밀도 구배 매질
유세포 분석기 (예: FACSCanto II)BD Biosciences (또는 이에 상응하는 제품)BD FACSCanto II 대식세포의 표현형 분석에 사용됨
보정 비드 (유세포 분석법)Biolegend (또는 동등 제품)424602단색 보정 컨트롤용으로 사용됨
FITC 표지 인간 CD11b 항체 (유세포 분석용)BioLegend (또는 그에 상응하는 제품)101205 (또는 그에 상응하는 제품)대식세포 식별에 사용되는 마커
PE 표지 항인간 CD80 항체 (유세포 분석법)BioLegend (또는 동등 제품)375410 (또는 이에 상응하는 제품)활성화된 대식세포 표현형과 관련된 마커
GFP 발현 유방암 세포주 (MDA-MB-468)ATCC (또는 그에 상응하는 기관)HTB-132 (또는 동등 제품)식세포 작용 분석에 사용되는 표적 세포; GFP를 통해 시각화 가능
ImmunoCult-SF 대식세포 배지STEMCELL Technologies (또는 그와 동등한 제품)10961 (또는 이에 상응하는 것)대식세포 분화에 사용되는 무혈청 배지
Dulbecco’듀롱킨 변형 이글 배지(DMEM)Thermo Fisher Scientific (또는 이에 상응하는 제품)12100046암세포의 배양 및 재부유에 사용됨
동형 대조군 항체 (IgG)Bio X Cell (또는 그와 동등한 제품)BE0297 (또는 이에 상응하는 제품)항체 의존성 식세포 작용 분석을 위한 음성 대조군
리포폴리사카라이드 (LPS)Sigma-Aldrich (또는 그에 준하는 제품)L2630 (또는 그에 상응하는 제품)IFN-γ와 병용하여 대식세포를 활성화하는 데 사용되는 자극제γ
재조합 인간 인터페론 감마 (IFN-γ)STEMCELL Technologies (또는 이에 상응하는 제품)78020 (또는 동등 제품)대식세포 활성화에 사용되는 사이토카인
재조합 인간 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF)STEMCELL Technologies (또는 이에 상응하는 제품)78057 (또는 이에 상응하는 제품)대식세포 분화에 사용되는 성장 인자
파스퇴르 피펫 또는 세롤로지컬 피펫Jetbiofil (또는 그와 동등한 제품)GSP010010 (또는 이에 상응하는 제품)PBMC 분리 및 세포 배양 중 액체 핸들링에 사용됨
PBS (Ca²⁺-free)2+-/Mg2+-free)Thermo Fisher Scientific (또는 이에 상응하는 제품)BP399-500 (또는 이에 상응하는 제품)세포 세척 및 희석 단계에 사용되는 완충액
페트리 접시 (100 mm, 비처리)–(조직 배양 처리된)Corning (또는 동등 제품)430591부착 선택을 통한 대식세포 분화에 사용됨
적혈구(RBC) 용해 버퍼BioLegend (또는 그에 상응하는 제품)420301 (또는 그에 상응하는 제품)PBMC 분리 과정 중 적혈구를 제거하는 데 사용됨
Viobility 405/452 Fixable DyeMiltenyi Biotec (또는 이에 상응하는 제품)130-130-404 (또는 이에 상응하는 제품)유세포 분석 중 세포 생존율을 평가하는 데 사용됨
DAPISigma-Aldrich (또는 동등 제품)D9542 (또는 이에 상응하는 제품)유세포 분석에서 사멸 세포 배제를 위해 사용됨

참고문헌

  1. Sung H, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249.
  2. Perou CM, et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 2000;406(6797):747-752.
  3. Foulkes WD, Smith IE, Reis-Filho JS. Triple-negative breast cancer. N Engl J Med. 363(20):1938-1948.
  4. Dent R, et al. Triple-negative breast cancer: Clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 2007;13(15 Pt 1):4429-4434.
  5. Lin NU, et al. Sites of distant recurrence and clinical outcomes in patients with metastatic triple-negative breast cancer: High incidence of central nervous system metastases. Cancer. 2008;113(10):2638-2645.
  6. Bianchini G, De Angelis C, Licata L, Gianni L. Treatment landscape of triple-negative breast cancer - expanded options, evolving needs. Nat Rev Clin Oncol. 2022;19(2):91-113.
  7. Lecoultre M, Dutoit V, Walker PR. Phagocytic function of tumor-associated macrophages as a key determinant of tumor progression control: A review. J Immunother Cancer. 2020;8(2).
  8. Mantovani A, Allavena P, Marchesi F, Garlanda C. Macrophages as tools and targets in cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(11):799-820.
  9. Chan SH, Lin CY, Tseng HJ, Wang LH. Cd24a knockout results in an enhanced macrophage- and cd8⁺ t cell-mediated anti-tumor immune responses in tumor microenvironment in a murine triple-negative breast cancer model. J Biomed Sci. 2025;32(1):73.
  10. Majeti R, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 2009;138(2):286-299.
  11. Barkal AA, et al. CD24 signalling through macrophage siglec-10 is a target for cancer immunotherapy. Nature. 2019;572(7769):392-396.
  12. Wang X, et al. CD24-siglec axis is an innate immune checkpoint against metaflammation and metabolic disorder. Cell Metab. 2022;34(8):1088-1103.e1086.
  13. Chan SH, et al. Identification of the novel role of CD24 as an oncogenesis regulator and therapeutic target for triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 2019;18(1):147-161.
  14. Huang S, Zhang X, Wei Y, Xiao Y. Checkpoint CD24 function on tumor and immunotherapy. Front Immunol. 2024;15:1367959.
  15. Weiskopf K, Weissman IL. Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer. MAbs. 2015;7(2):303-310.
  16. Cao X, et al. Promoting antibody-dependent cellular phagocytosis for effective macrophage-based cancer immunotherapy. Sci Adv. 2022;8(11):eabl9171.
  17. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev Immunol. 1999;17:593-623.
  18. Flannagan RS, Jaumouille V, Grinstein S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 2012;7:61-98.
  19. Denardo DG, Ruffell B. Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy. Nat Rev Immunol. 2019;19(6):369-382.
  20. Horsthemke M, Wilden J, Bachg AC, Hanley PJ. Time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages. J Vis Exp. 2018;(140). doi:10.3791/57566.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

CD24

이 논문이 게재되었습니다

동영상 곧 제공

문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.