방법 논문

마우스 뇌 영역의 형태학적 관찰 및 RNA-단백질 통합 추출을 위한 뇌반구 분리 프로토콜

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DOI:

10.3791/71465

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2026년 9월 1일

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1College of Medical Laboratory, Dalian Medical University, 2The Transvascular Implant Instrument Research Institute, 3The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 4College of Basic Medical Sciences of Dalian Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 마우스의 뇌를 이등분하는 방법을 다룹니다. 한쪽 반구는 형태학적 염색에 사용하고, 다른 쪽 반구는 RNA 및 단백질 추출에 사용합니다. 이러한 전략은 동물 사용량을 줄여 3R 원칙을 준수하며, 개체 간 변이를 최소화합니다.

초록

일상적인 신경과학 연구에서 형태학적 염색과 핵산/단백질 분자 분석은 일반적으로 서로 다른 실험 동물을 필요로 하며, 이는 동물 사용량을 증가시켜 동물 복지의 3R 원칙과 상충됩니다. 본 프로토콜은 단일 동물로부터 형태학적 분석과 분자 분석을 동시에 수행할 수 있도록 하는 마우스 뇌 조직 할당 워크플로우를 구축합니다. 0.9% saline으로 경심장 관류를 수행한 후, 뇌를 두 개의 반구로 이분합니다. 한쪽 반구는 면역조직화학 및 면역형광 염색을 위해 4% paraformaldehyde로 고정하며, sucrose-ethylene glycol-polyvinylpyrrolidone (PVP) 용액에 보관된 절편은 최대 7년 동안 신뢰할 수 있는 염색 품질을 유지합니다. 반대쪽 반구는 RNA와 단백질의 동시 추출을 위해 -80 °C에서 냉동 보존하며, 추출 수율은 후속 qPCR 및 Western Blot 분석에 충분합니다. 9–10 mg의 내후각피질 펀치 샘플로 테스트한 결과, 이 방법은 RNA 또는 단백질을 개별적으로 추출했을 때보다 수율은 낮았으나, 회수된 생체 분자는 분자 검출에 적절한 수준을 유지했습니다. 이 워크플로우는 동물 사용량을 줄이고, 쌍을 이룬 형태학적 분석과 분자 분석 사이의 개체 간 차이를 제거합니다. 이는 마우스 뇌의 특정 하위 영역에 대한 다차원적 프로파일링을 위한 실행 가능한 조직 준비 방법을 제공합니다.

서론

최근 수십 년 동안 신경과학 연구가 급격히 확대되면서 인간의 뇌 생리학, 신경 질환의 발병 및 치료제 개발을 규제하는 핵심 메커니즘들이 밝혀졌습니다. 동물 모델은 신경 발달, 생리적 기능 및 병리적 과정을 탐구할 수 있는 제어 가능하고 재현 가능한 플랫폼을 제공하므로 신경과학 연구에 있어 여전히 필수적입니다. 마우스 피험자를 대상으로 한 실험적 조작과 조직학적 관찰을 통해 연구자들은 뉴런 신호 전달, 신경 회로 형성 및 신경-행동 간의 연관성을 특성화할 수 있습니다. 이러한 기술적 진보와 병행하여 동물 실험 윤리가 중심적인 관심사가 되었습니다. 3R 원칙(Replacement-대체, Reduction-감소, Refinement-개선)은 이제 모든 동물 연구에서 세계적으로 인정되는 표준이 되었으며1,2, 연구자가 신뢰할 수 있는 실험 결과물을 유지하면서 동물 사용을 최소화할 것을 요구합니다.

조건부 녹아웃 시스템과 같은 혁신적인 도구들은 생쥐 뇌의 특정 하위 영역 내에서 정밀한 유전자 조작을 가능하게 합니다3. 이러한 발전은 학습, 기억 및 기분을 조절하는 해마의 CA1, CA3 및 DG와 같은 미세 규모의 뇌 구획에 대한 집중적인 연구를 촉진했습니다4. 이러한 작은 뇌 영역의 고차원 기능을 해독하기 위해서는 형태학적, 전사적 및 단백질 수준의 측정치가 조율되어야 합니다. 불행히도, 이러한 영역의 희박한 조직 부피는 병렬적인 다중 지표 검출에 있어 주요한 기술적 장애물이 됩니다.

형태학적 염색, RNA 정량 분석 및 단백질 면역 검출은 신경과학 분야에서 일상적으로 사용되는 세 가지 핵심 분석 방법입니다. 전통적인 연구 설계에서는 이 세 가지 유형의 테스트를 완료하기 위해 세 그룹의 서로 다른 마우스 코호트가 필요합니다. 이러한 방식은 동물 사용량을 급격히 증가시키며, 개체 간의 상당한 생물학적 변이를 유발하여 조직학적 데이터셋과 분자적 데이터셋 간의 비교 가능성을 약화시킵니다. 단일 동물로부터 일치하는 형태학적 및 분자적 신호를 획득하는 통합된 워크플로우는 이러한 두 가지 결정적인 한계를 크게 해결하고, 3R 원칙의 Reduction(감소) 원칙을 더 잘 준수할 수 있게 할 것입니다.

본 연구에서는 마우스 뇌 조직을 위한 재현 가능한 뇌 반구 분리 프로토콜을 보고합니다. 전신 식염수 관류 후, 전체 뇌를 두 개의 반구로 나눕니다. 한쪽 반구는 형태학적 검사를 위해 고정하고, 반대쪽 반구는 RNA와 단백질의 동시 공동 추출을 위해 냉동 보존합니다. sucrose-ethylene glycol-polyvinylpyrrolidone (PVP) 보호 버퍼에서 고정 및 보관된 조직은 최대 7년 동안 면역조직화학 및 면역형광 염색을 위한 안정적이고 고품질의 염색 신호를 유지합니다. 우리는 해마나 전전두엽 피질과 같이 일반적으로 연구되는 영역보다 가벼운 조직인 9–10 mg의 작은 내후각 피질 펀치 샘플을 사용하여 이 방법을 검증했습니다. 이러한 미세 조직 샘플의 성공적인 검출은 시상하부나 편도체와 같은 더 작은 뇌 하위 영역 또한 이 워크플로우에 적용 가능함을 시사합니다. 본 프로토콜은 단일 목적의 전문 추출 키트보다 낮은 RNA 및 단백질 농도를 생성하지만, 분리된 생체 분자는 표준 하위 단계인 qPCR 및 Western blot 분석을 지원하기에 충분한 품질을 갖추고 있습니다. 이 워크플로우는 동물 사용량을 줄이고, 쌍을 이룬 형태학적 및 분자 분석 간의 개체 간 차이를 제거합니다. 이는 이산적인 마우스 뇌 하위 영역의 다차원 프로파일링을 위한 실행 가능한 조직 준비 방법을 제공합니다.

프로토콜

윤리 성명서

본 연구에서 수행된 모든 동물 실험은 중화인민공화국 다롄 의과대학교의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다(랫드 실험 승인 번호 AEE18026, 마우스 실험 승인 번호 AEE24261). 모든 실험 프로토콜은 실험동물 윤리 지침에 따라 수행되었으며, 동물 실험의 3R 원칙(Reduction, Replacement, Refinement)을 완전히 준수하였습니다. 전체 실험 과정 동안 동물의 고통과 스트레스를 효과적으로 완화하기 위해 엄격한 조치가 취해졌습니다. 또한, 통계 분석 결과의 신뢰성과 타당성을 보장하는 데 필요한 최소한의 수로 실험동물 수를 제한하였습니다. 본 프로토콜에 사용된 시약, 소모품 및 장비의 전체 목록은 재료 표를 참조하십시오.

1. 실험 동물 준비 및 경심장 관류 수술

  1. 마취 및 수술 전 준비
    1. 본 프로토콜에는 특정 병원체 제거(SPF) 등급의 성체 수컷 Sprague-Dawley 랫드 또는 C57BL/6 마우스를 사용하십시오. 동물은 온도 조절(22 ± 2 °C) 환경에서 12시간 명/암 주기로 사육하십시오. 멸균된 사료와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 제공하십시오.
    2. 마취를 유도하기 위해 랫드의 경우 80 mg/kg, 마우스의 경우 50 mg/kg의 용량으로 sodium pentobarbital을 복강 내 주사하십시오(그림 1 참조).
  2. 경심장 관류 절차
    1. 마취된 동물을 수술 보드 위에 앙와위로 고정하십시오.
    2. 직가위를 사용하여 검상돌기부터 치골결합까지 정중선을 따라 복벽을 절개하십시오. 심장이 완전히 노출되도록 양측 흉벽 외측을 절개하십시오.
    3. 얼음처럼 차가운 0.9% 생리식염수로 동물을 관류하십시오. 유량은 랫드의 경우 10–15분 동안 100–150 mL, 마우스의 경우 5–8분 동안 20–30 mL의 일정 속도를 유지하십시오.
  3. 뇌 적출 및 뇌반구 분리
    1. 관류가 완료되면 대형 수술 가위로 동물의 머리를 절단하십시오. 두개골이 노출되도록 정중선을 따라 두피를 절개하십시오.
    2. 멸균 스패튤라를 사용하여 두개강에서 뇌를 조심스럽게 들어 올리십시오. 전체 뇌를 얼음 위에 놓인 멸균 페트리 접시에 신속하게 옮기십시오.
    3. 멸균된 RNase-free 면도날을 사용하여 시상봉합선을 따라 뇌를 좌우 뇌반구로 대칭되게 나누십시오.
    4. 좌측 뇌반구를 고정을 위해 10 mL의 얼음처럼 차가운 4% paraformaldehyde 용액이 담긴 15 mL 원심분리 튜브로 즉시 옮기십시오. 우측 뇌반구는 라벨이 부착된 RNase-free 냉동 보존 튜브에 옮겨 액체 질소로 급속 냉동한 후, RNA 및 단백질 추출 시까지 -80 °C에서 보관하십시오.

2. 뇌 조직 고정, 절편 제작 및 장기 보관

  1. 고정 및 탈수
    1. 좌뇌 반구를 4% paraformaldehyde 용액에 완전히 담그고 4 °C에서 24시간 동안 조직을 고정합니다. 고정이 완료되면 뇌 반구를 30% sucrose 용액이 들어 있는 15 mL 원심분리 튜브로 옮겨 4 °C에서 조직을 탈수합니다.
    2. 뇌 조직이 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 24시간마다 30% sucrose 용액을 교체합니다.
  2. 동결 절편 제작
    1. 탈수된 뇌 반구를 sucrose 용액에서 꺼내 멸균 필터지로 과잉 액체를 부드럽게 닦아냅니다.
    2. optimal cutting temperature (OCT) 매립제를 사용하여 뇌 반구를 크라이오스탯 시료 스테이지에 고정합니다.
    3. 크라이오스탯을 사용하여 30 µm 두께로 뇌의 관상면 연속 절편을 제작합니다. 연속된 절편들을 멸균된 0.01 M PBS가 담긴 24-well 플레이트에 수집합니다.
  3. 뇌 절편의 장기 보관
    1. 뇌 절편 동결 보호 보존액을 미리 준비합니다: 0.01 M PBS 100 mL에 PVP400 2 g, sucrose 60 g, ethylene glycol 60 mL를 첨가합니다. 모든 성분이 완전히 녹을 때까지 실온에서 용액을 교반한 후, 사용 전까지 4 °C에서 보관합니다.

3. TRIzol을 이용한 RNA 추출

  1. 조직 균질화 및 상 분리
    1. 초미세 균질기를 사용하여 1 mL의 TRIzol 시약에서 내후각 피질 조직을 균질화하고, 균질물을 얼음 위에서 15분 동안 배양한다. 4 °C에서 8,000 × g로 5분 동안 원심분리한다.
    2. 200 µL의 클로로포름을 첨가하고 10초 동안 볼텍싱한다. 4 °C에서 5,600 × g로 15분 동안 원심분리한다. 그 후 상층의 수성상을 RNase-free 튜브로 옮긴다. 500 µL의 이소프로판올을 첨가하고 -20 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 RNA를 침전시킨다. 다시 원심분리한다.
  2. RNA 침전, 세척 및 품질 평가
    1. 상층액을 제거하고 1 mL의 75% 에탄올로 RNA 펠렛을 세척한다. 4 °C에서 5,600 × g로 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 제거하고 펠렛을 10분 동안 자연 건조시킨 후, 20 µL의 DEPC 처리수로 10분 동안 RNA를 용해시킨다.
    2. 분광광도계를 사용하여 RNA 농도와 순도(A260/A280)를 측정한다. 추가 분석 시까지 RNA를 -80 °C에 보관한다.

4. Minute 키트를 이용한 총 단백질 추출

  1. 조직 용해 및 균질화
    1. 스핀 컬럼과 수집 튜브를 얼음 위에서 미리 냉각합니다. 초미세 균질기를 사용하여 100 µL의 세포 용해 버퍼에서 조직을 균질화합니다. 균질기를 100 µL의 세포 용해 버퍼로 추가 헹군 후 용해물을 합칩니다.
  2. 단백질 회수 및 정량
    1. 균질물을 스핀 컬럼으로 옮기고 상온에서 2분 동안 배양합니다.
    2. 11,000–14,300 × g에서 2분 동안 원심분리합니다.
    3. 원심분리 직후 수집 튜브를 얼음 위에 두고 스핀 컬럼은 폐기합니다. BCA 분석법을 사용하여 단백질 농도를 결정합니다.

5. 내후각 피질(9–10 mg)에서의 RNA 및 단백질 동시 추출

  1. 실험 전 준비 및 시약 준비
    1. 모든 추출 단계에 DNA/RNA/단백질 키트를 사용한다. 인증된 RNase-free 및 DNase-free 소모품만 사용한다(그림 2 참조).
    2. 용해 버퍼(lysis buffer)를 사용 직전에 준비한다: 키트에 제공된 용해 버퍼에 단백질 분해효소 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)을 1:100 비율로 희석하여 첨가한다.
  2. 조직 용해 및 상 분리
    1. -80 °C 보관 중인 동결된 우뇌 반구를 꺼내 얼음 위에 둔다. 멸균된 RNase-free 펀치를 사용하여 표적 뇌 영역에서 9–10 mg의 조직을 채취한다.
    2. 가시적인 조직 파편이 남지 않을 때까지 전기 조직 균질기(electric tissue homogenizer)를 사용하여 얼음 위에서 조직을 완전히 균질화한다. 완전한 용해를 위해 균질물을 얼음 위에서 10 min 동안 배양한다.
    3. 균질물에 키트 제공 분리 시약을 200 µL 첨가한다. 튜브를 30 s 동안 강하게 볼텍싱(vortex)하고 실온에서 3 min 동안 배양한다. 4 °C에서 8,000 × g로 15 min 동안 원심분리하여 완전히 상 분리를 유도한다.
  3. RNA 정제 및 용출
    1. RNase-free 파이펫 팁을 사용하여 상층의 수성층(aqueous phase)을 조심스럽게 수집한다. 수집된 수성층을 새로운 1.5 mL RNase-free 튜브로 옮긴다. 수집된 수성층에 동일한 부피의 100% 에탄올을 첨가하고 혼합한다.
    2. 혼합액 700 µL를 키트에 제공된 RNA 정제 컬럼으로 옮긴다. 실온에서 5,600 × g로 1 min 동안 원심분리한다.
    3. 컬럼에 키트 제공 RNA 세척 버퍼 1(RNA wash buffer 1) 500 µL를 첨가한다. 실온에서 5,600 × g로 1 min 동안 원심분리한다.
    4. 이어서 컬럼에 키트 제공 RNA 세척 버퍼 2(RNA wash buffer 2) 500 µL를 첨가하고 다시 원심분리한다. 컬럼 막에서 잔류 에탄올을 완전히 제거하기 위해 빈 컬럼을 실온에서 8,000 × g로 2 min 동안 원심분리한다.
    5. 컬럼을 새로운 RNase-free 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. RNase-free water(60 °C로 예열됨) 30–50 µL를 컬럼 막 중앙에 직접 첨가한다. 컬럼을 실온에서 2 min 동안 배양한다. RNA를 용출시키기 위해 실온에서 8,000 × g로 1 min 동안 원심분리한다.
  4. 단백질 침전 및 용해
    1. RNA 추출을 위해 수성층을 제거한 후, 원래 튜브에 남은 유기층(organic phase)과 중간층(interphase)에 이소프로판올 750 µL를 첨가한다. 단백질을 침전시키기 위해 혼합물을 -20 °C에서 30 min 동안 배양한다.
    2. 4 °C에서 8,000 × g로 10 min 동안 원심분리한다. 상층액은 버리고 튜브 바닥의 단백질 펠릿(protein pellet)을 보존한다.
    3. 단백질 펠릿에 95% 에탄올 1 mL를 첨가한다. 튜브를 짧게 볼텍싱하여 펠릿을 세척한다. 4 °C에서 8,000 × g로 5 min 동안 원심분리하고 상층액을 버린다. 이 세척 단계를 2회 더 반복한다.
    4. 펠릿이 반투명해지고 잔류 에탄올이 보이지 않을 때까지 실온에서 5–10 min 동안 단백질 펠릿을 공기 건조한다.
    5. 건조된 펠릿에 5–10% SDS 용액 50–100 µL를 첨가한다. 튜브를 1 min 동안 강하게 볼텍싱하고, 단백질을 완전히 용해시키기 위해 얼음 위에서 10 min 동안 배양한다. 4 °C에서 8,000 × g로 5 min 동안 원심분리한다. 상층액을 최종 단백질 추출물로 수집한다.

6. 면역조직화학(IHC) 염색

  1. 절편 전처리 및 내성 효소 불활성화
    1. -20 °C 극저온 보호제 보관소에서 뇌 절편을 꺼냅니다. 유리 니들을 사용하여 절편을 0.01 M PBS (pH 7.4)가 들어 있는 24-웰 플레이트로 옮깁니다.
    2. 쉐이커 위에서 실온 상태로 0.01 M PBS를 이용하여 절편을 3회 세척하며, 각 세척당 5분씩 소요합니다.
    3. 내성 peroxidase 활성을 불활성화하기 위해 3% 과산화수소 peroxidase 차단제와 함께 실온에서 10분 동안 절편을 배양합니다. 차단 후 세척 단계를 반복합니다.
  2. 투과화 및 비특이적 차단
    1. 세포막 투과화를 위해 쉐이커 위에서 실온 상태로 0.5% Triton X-100에 30분 동안 절편을 배양합니다. 세척 단계를 반복합니다.
    2. 4% bovine serum albumin에 절편을 실온에서 30분 동안 배양한 후, 비특이적 염색 억제제와 함께 실온에서 추가로 30분 동안 배양합니다.
  3. 1차 및 2차 항체 배양
    1. 1% BSA 용액에 1차 항체를 다음과 같이 최적화된 비율로 희석합니다: doublecortin (DCX, 1:4000), neuronal nuclear antigen (NeuN, 1:3000), ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1, 1:2000), 및 glial fibrillary acidic protein (GFAP, 1:2000).
    2. 희석된 1차 항체 용액 200 µL를 각 웰에 첨가하여 절편이 완전히 잠기도록 합니다.
    3. 비오틴 표지 2차 항체 200 µL를 각 웰에 첨가합니다. 실온에서 30분 동안 절편을 배양합니다.
    4. 0.01 M PBS로 절편을 3회 세척하며, 각 세척당 5분씩 소요합니다. 스트렙타비딘-peroxidase 접합체 300 µL를 각 웰에 첨가합니다. 실온에서 30분 동안 절편을 배양합니다. 배양 후 세척 단계를 반복합니다.
  4. 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) 발색 현상 및 커버슬립 부착
    1. DAB 작동 용액 200 µL를 각 웰에 첨가합니다. 광학 현미경 하에서 발색 반응을 모니터링합니다.
    2. 유리 니들을 사용하여 절편을 젤라틴 코팅된 유리 슬라이드 위에 마운팅합니다. 실온에서 슬라이드를 완전히 공기 건조시킵니다.
    3. 단계별 에탄올 시리즈(50%, 70%, 90%, 95%, 100%, 100% 에탄올, 각 5분씩)를 통해 슬라이드를 탈수시킨 후, 자일렌으로 2회(각 5분씩) 투명화 과정을 거칩니다.

7. 면역형광(IF) 염색

  1. 절편 전처리 및 투과화
    1. -20 °C 동결보존액 저장소에서 뇌 절편을 꺼냅니다. 절편을 0.01 M PBS (pH 7.4)가 담긴 24-well 플레이트로 옮깁니다.
    2. 쉐이커 위에서 실온으로 0.01 M PBS를 사용하여 절편을 3회 세척합니다(회당 5분).
    3. 쉐이커 위에서 실온으로 0.5% Triton X-100에 절편을 30분 동안 배양합니다.
    4. 투과화 후 0.01 M PBS를 사용하여 절편을 3회 세척합니다(회당 10분).
  2. 블로킹 및 1차 항체 배양
    1. 가습 챔버 내 실온에서 4% BSA와 비특이적 염색 억제제가 포함된 블로킹 용액에 절편을 1시간 동안 배양합니다.
    2. 블로킹 용액을 흡입하여 제거합니다. 1차 항체를 1% BSA 용액에 최적 농도로 희석하고, 희석된 1차 항체 용액 300 µL를 각 웰에 넣습니다. 가습된 차광 챔버에서 4 °C로 절편을 하룻밤 동안 배양합니다.
  3. 2차 항체 배양
    1. 다음 날, 어두운 곳에서 실온으로 1시간 동안 절편을 다시 가온합니다. 1차 항체 용액을 회수하고, 어두운 곳의 쉐이커에서 0.01 M PBS로 절편을 3회 세척합니다(회당 10분).
    2. 형광체-접합 2차 항체를 제조사가 권장하는 희석 배수로 1% BSA 용액에 희석합니다. 2차 항체 용액 300 µL를 각 웰에 넣습니다. 어두운 곳에서 실온으로 절편을 1~2시간 동안 배양합니다.
    3. 어두운 곳에서 0.01 M PBS로 절편을 5회 세척합니다(회당 5분).

8. 정량적 실시간 PCR (qPCR) 분석

  1. RNA gDNA 제거 및 역전사
    1. 역전사 키트를 사용하여 역전사를 수행하여 cDNA를 합성하며, 20 µL 반응 시스템당 1 µg의 총 RNA를 사용한다. 제조사에서 권장하는 열 순환 프로그램을 사용한다: 25 °C에서 5분, 50 °C에서 15분, 85 °C에서 5분, 4 °C에서 유지.
    2. 합성된 cDNA를 RNase-free water로 1:5 비율로 희석한다. qPCR 증폭 전까지 cDNA를 -20 °C에 보관한다.
  2. qPCR 시스템 준비 및 증폭
    1. 전용 RNase-free PCR 후드 내의 얼음 위에서 qPCR 반응 시스템을 준비한다. 20 µL 반응 시스템의 구성은 다음과 같다: qPCR Master Mix 10 µL, forward primer (10 µM) 0.4 µL, reverse primer (10 µM) 0.4 µL, 희석된 cDNA 템플릿 2 µL, RNase-free water 7.2 µL.
    2. 다음 프로그램을 사용하여 qPCR 증폭을 수행한다: 초기 변성 95 °C에서 30초; 95 °C에서 10초 및 60 °C에서 30초를 40회 반복; 이후 60 °C에서 95 °C까지 5초마다 0.5 °C씩 증가시키며 해리 곡선 분석을 수행한다.

9. 웨스턴 블롯(Western blot)

  1. 단백질 정량 및 시료 준비
    1. BCA assay 결과에 따라 5–10% SDS 용액을 사용하여 단백질 추출물을 동일한 농도로 희석한다.
  2. SDS-PAGE 전기영동 및 단백질 전이
    1. 표준 분자생물학 프로토콜에 따라 10% SDS-PAGE 분리 겔(separating gel)과 5% 스태킹 겔(stacking gel)을 준비한다.
    2. 웰당 20 µg의 총 단백질을 겔에 로딩한다. 농도 구배 로딩 실험의 경우, 웰당 15 µg, 30 µg, 45 µg의 단백질을 로딩한다.
    3. 단백질 마커가 분리 겔에 진입할 때까지 80 V에서 30분 동안 전기영동을 수행한 후, 브로모페놀 블루(bromophenol blue) 염료가 겔 바닥에 도달할 때까지 120 V로 전압을 높여 60–90분 동안 수행한다.
    4. 다음 순서(음극에서 양극 방향)로 전이 샌드위치를 조립한다: 스펀지, 여과지, 겔, PVDF membrane, 여과지, 스펀지. 겔과 막 사이에 기포가 남지 않도록 주의한다.
    5. 얼음 수조에서 300 mA 정전류로 90분 동안 습식 전이(wet transfer)를 수행한다.
  3. 막 블로킹 및 항체 반응
    1. 전이가 완료된 후 PVDF membrane을 TBST 버퍼로 짧게 헹군다. 비특이적 결합 부위를 차단하기 위해 5% BSA에서 2시간 동안 실온의 쉐이커 위에서 반응시킨다.
    2. 1차 항체를 최적화된 농도로 5% BSA 용액에 희석한다. 1차 항체 용액이 들어있는 막을 4 °C에서 하룻밤 동안 쉐이커 위에서 반응시킨다.
    3. 다음 날 쉐이커 위에서 TBST 버퍼로 10분씩 3회 세척한다.
    4. HRP-결합 2차 항체를 제조사 권장 희석 배수로 5% 무지방 우유 용액에 희석한다. 2차 항체 용액이 들어있는 막을 실온의 쉐이커 위에서 2시간 동안 반응시킨다.
    5. 2차 항체 반응 후 TBST 버퍼로 10분씩 3회 세척한다. 암소에서 ECL 기질 용액과 함께 1–2분 동안 반응시킨다.

결과

RNA 농도 측정, 아가로스 겔 전기영동 및 qPCR

보여준 바와 같이, DNA/RNA/protein 키트를 사용하여 내후각 피질(9–10 mg) 펀치에서 총 RNA와 단백질을 공동 추출하였습니다. TRIzol(RNA) 또는 단백질 추출 키트로 처리한 병렬 시료를 대조군으로 사용하였습니다. 이 프로토콜을 통해 235 ± 12 ng µL⁻1의 RNA를 얻었으며, 이는 TRIzol보다 36 % 적은 양이었습니다 (p < 0.05) (Figure 3A). 그럼에도 불구하고, 아가로스 겔 분석 결과 뚜렷한 28S 및 18S rRNA 밴드와 5S 신호가 나타나 RNA가 온전함을 확인하였습니다 (Figure 3B). CD86, IL-1β, TNF-α 및 IL-6에 대한 qPCR 결과 단일하며 대칭적인 해리 곡선이 나타났으며 (Figure 3C), 해당 그룹에서 더 낮은 Ct 값이 관찰되었습니다 (Figure 3D). 하지만 이러한 차이가 개선된 RNA 품질을 반영하는지 아니면 추출 효율에 의한 것인지 결정하기 위해서는 RNA 무결성 분석을 포함한 추가 연구가 필요합니다. RNA 수율은 TRIzol 추출 시보다 낮았으나, 뚜렷한 28S 및 18S rRNA 밴드와 특이적인 qPCR 증폭 곡선은 추출된 RNA가 후속 qPCR 분석을 수행하기에 충분한 품질임을 나타냅니다.

단백질 농도 평가, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석

RNA 데이터와 일치하게, 이중 추출 프로토콜은 단백질 키트보다 낮은 총 단백질 농도를 나타냈습니다 (p < 0.05). 그럼에도 불구하고, Western blot 분석 결과 조사된 모든 표적에서 현저하게 더 강한 면역 반응 밴드가 확인되었습니다 (그림 4A). RNA 정량 결과와 마찬가지로, RNA-단백질 공동 추출 프로토콜은 전용 단일 목적 단백질 키트보다 적은 양의 총 단백질을 회수하며, 이는 CBB 전체 단백질 염색을 통해 확인할 수 있습니다 (그림 4B–C). 하우스키핑 단백질인 β-Tubulin은 두 추출 방법 모두에서 유사한 신호 강도로 명확하고 안정적인 밴드를 보여주었습니다. 저발현 ULK 단백질 또한 공동 추출된 샘플에서 성공적으로 검출되었습니다. 특히, PSD-95, p-ERK 및 p-NFκB p65의 밴드 신호는 단일 단백질 추출 키트 대비 공동 추출군에서 현저하게 더 강했습니다. 15 µg에서 45 µg까지 단백질을 연속적으로 로딩했을 때, 두 그룹 모두에서 검출된 모든 표적에 대해 용량 의존적인 밴드 기울기가 생성되었습니다. 종합적으로, 이중 추출 워크플로우의 총 단백질 수율은 더 낮지만, 단백질 품질은 표준 Western blot 분석에 충분하며, 전반적인 검출 성능은 기존의 단일 단백질 추출 키트에 비해 열등하지 않습니다.

면역조직화학 및 면역형광법

0.5–7년 동안 보관된 뇌 절편의 면역조직화학 염색 결과, 형태와 섬유가 온전하게 유지된 DCX⁺ 신생 뉴런, AVP⁺ 분비 세포 및 MAP2/NeuN⁺ 뉴런의 강력한 표지가 확인되었습니다(그림 5A). 5–7년 된 절편의 면역형광 염색에서는 GFAP⁺ 성상교세포, Iba-1⁺ 미세아교세포 및 FosB⁺ 활성 뉴런이 명확하게 나타났습니다(그림 5B). 0.5–7년 동안 보관된 대표 절편들은 테스트된 조건 하에서 검출 가능한 면역조직화학 및 면역형광 신호를 유지했습니다. 따라서, 해당 보존액은 조직의 무결성과 항원성을 유지하여 신뢰할 수 있는 장기 보관을 가능하게 합니다.

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그림 1: 뇌의 형태학적 및 분자적 검출을 위한 뇌 반구 분리 통합 워크플로우. 이 모식도는 설치류의 경심장 식염수 관류, 분리된 전뇌의 정중선 이분, IHC/IF 염색을 위한 좌측 반구의 고정 및 동결 절편 제작, 그리고 이후의 동시 RNA-단백질 공동 추출, qPCR 및 Western blot 분석을 위한 대측 반구의 동결 보존을 포함한 전체 실험 파이프라인을 보여줍니다. 모든 마우스 삽화는 Jimeng AI로 생성되었습니다. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

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그림 2: 냉동된 설치류 뇌 조직으로부터 RNA와 단백질을 동시에 공동 추출하는 워크플로우. 다이어그램은 냉동된 뇌 반구로부터의 표적 조직 펀칭, 조직 용해 및 3상 분리, qPCR을 위한 RNA 정제 및 용출, 그리고 Western blot 검출을 위한 시료 준비 과정인 단백질 침전, 세척 및 용해를 포함하는 순차적 단계를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 마이크로 스케일 쥐 내후각 피질 샘플을 이용한 RNA 수율, RNA 무결성 및 qPCR 호환성 평가. (A) 동시 추출 키트와 TRIzol 방법을 통해 얻은 정량 RNA 농도(평균 ± SEM). (B) 두 추출 그룹 모두에서 온전한 28S 및 18S rRNA 밴드를 보여주는 아가로스 겔 전기영동 결과. (C) 단일 용융 곡선을 통해 표적 염증 유전자와 참조 유전자인 GAPDH의 특이적 증폭을 확인하였다. (D) 두 추출 방법에서 동일한 RNA 입력량으로 검출한 염증 유전자의 Ct 값. *p < 0.05, **p < 0.01 vs TRIzol 그룹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: RNA/단백질 공동 추출 프로토콜로 회수된 단백질의 Western blot 분석. (A) 시냅스 및 신호 전달 단백질의 농도 의존적 밴드 신호를 보여주는 구배 단백질 로딩 (15/30/45 µg). (B) 로딩 기준으로 CBB 총 단백질 염색을 이용한 ULK1 고분자량 단백질 검출. (C) 두 가지 추출 워크플로우 간 표적 단백질의 동일 로딩 Western blot 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 0.5–7년 동안 보존된 부유 뇌 절편의 면역조직화학 및 면역형광 염색. (A) 200× 및 400× 배율로 촬영한 명시야 면역조직화학 염색 현미경 사진. DCX 및 AVP 염색은 마우스 조직 샘플에서, MAP2 및 NeuN 염색은 쥐 조직 샘플에서 수행되었다. (B) 쥐 조직 샘플에서 얻은 대표적인 면역형광 이미지. GFAP는 성상교세포를, IBA-1은 미세아교세포를 표지하며, FOSB는 신경 세포 활동을 나타낸다. 이 패널에 표시된 모든 면역형광 염색 실험은 신경 마커 발현 및 세포 국소화를 평가하기 위해 쥐 샘플을 사용하여 수행되었으며, 현미경 사진은 200× 배율이다.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

마우스 연구에서 형태학적 분석과 핵산/단백질 분석은 서로 다른 준비 절차가 필요하기 때문에 종종 별도의 동물 샘플을 요구합니다. 이는 동물 사용량을 증가시키고 개체 간 생물학적 변이를 유발하여, 조직학적 데이터와 분자적 데이터 간의 비교 가능성을 떨어뜨릴 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 동일한 동물로부터 조직학적 및 분자적 데이터를 모두 얻을 수 있는 워크플로우를 개발하였습니다.

이 워크플로우의 핵심 설계는 0.9% saline으로 경심장 관류를 수행한 후 뇌 조직을 반구별로 할당하는 것입니다5,6. 한쪽 반구는 면역조직화학 및 면역형광 염색을 위해 4% paraformaldehyde로 고정하며, 반대쪽 반구는 이후의 RNA-단백질 동시 추출, qPCR 및 Western blotting을 위해 −80 °C에서 보관합니다. 그러나 선택된 분석 결과가 두 대뇌 반구 간에 완전히 비교 가능하지 않을 수 있습니다. 설치류의 뇌에서 구조적 및 기능적 외측화가 기록된 바 있으며, 이러한 반구 간 차이는 서로 반대쪽에서 분석을 수행할 때 가변성을 유발할 수 있습니다7,8. 따라서 연구자는 연구 목적에 따라 동일한 대뇌 반구에서 일관되게 조직을 선택해야 합니다.

이 방법의 주요 장점은 고정된 부유 뇌 절편을 장기간 보존할 수 있다는 점입니다. 30% sucrose로 탈수시킨 후, 30 µm 두께의 관상면 절편을 sucrose-ethylene glycol-PVP 보존액에 보관합니다. 이전 연구들에 따르면 sucrose-ethylene glycol-PVP 동결보호제 용액은 장기 보관 중 조직의 형태와 항원성을 유지하는 데 도움이 됩니다9,10. 그러나 수년에 걸친 보관 기간을 평가한 연구는 거의 없습니다. 본 연구실의 데이터는 이러한 발견을 확장하여, 테스트 조건 하에서 최대 7년 동안 보관된 대표 절편들이 검출 가능한 면역조직화학 및 면역형광 신호를 유지했음을 보여줍니다. 이러한 관찰 결과는 회고적 분석 및 추적 실험을 위해 부유 뇌 절편을 수년간 보관하는 것이 가능하다는 점을 뒷받침합니다.

특히, 이 워크플로우는 하나의 냉동 뇌 반구에서 RNA-단백질을 동시에 공동 추출할 수 있다는 또 다른 핵심적인 장점을 제공합니다. 이러한 공동 추출 프로토콜은 기존의 단일 표적 추출 방법보다 RNA 및 단백질의 회수량이 약간 적지만, 얻어진 생체 시료는 여전히 강력한 qPCR 및 Western blot 검출에 충분한 양입니다. 결정적으로, 공동 추출을 통해 동일한 조직 샘플에서 전사체와 단백질의 풍부도를 정량화할 수 있으며, 이는 서로 다른 표본 처리로 인해 발생하는 생물학적 변이를 제거하여 매우 일관성 있고 통합적인 분자 프로파일링을 가능하게 합니다11,12. 또한, 이 접근 방식은 약 9–10 mg의 적은 조직 질량만 필요하므로, 샘플 확보가 제한적인 특정 뇌 영역의 하위 집단을 분석하는 데 매우 적합합니다.

이러한 상당한 장점에도 불구하고, 이 방법에는 인정해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, RNA 및 단백질 수율이 상대적으로 낮아 대규모 단백질 정제나 고심도 RNA 시퀀싱과 같이 다량의 핵산 또는 단백질이 필요한 실험에는 적용이 제한될 수 있습니다. 둘째, 절편의 장기 보관이 최대 7년까지 가능하지만, 장기간에 걸쳐 일부 불안정한 항원이나 핵산의 점진적인 분해가 일어날 수 있으며, 이는 염색 강도나 분자 검출 감도를 저하시킬 수 있습니다. 셋째, 본 방법은 현재 마우스 뇌 조직에 최적화되어 있으며, 조직 구성과 구조적 특성이 종과 장기마다 다르기 때문에 다른 조직이나 다른 동물 모델에 적용하려면 수정이 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 5–10% SDS는 질량 분석, 효소 활성 분석, 단백질-단백질 상호작용 연구13,14 및 기타 SDS에 민감한 응용 분야를 방해할 수 있습니다. 따라서 추가적인 계면활성제 제거 또는 완충액 교체 과정이 필요할 수 있습니다.

결론적으로, 이러한 반구 할당 워크플로우는 동일한 동물에서 형태학적 및 분자적 분석을 쌍으로 수행할 수 있게 하며, 동시에 동물 사용량과 개체 간 변이를 줄여줍니다. 이 워크플로우는 특히 조직 가용성이 제한적인 상황에서 조직학적 및 분자적 분석을 쌍으로 수행해야 하는 연구에 유용할 것입니다. 또한, 장기간의 섹션 보관 능력을 통해 회고적 분석과 표준화된 시료 아카이빙이 가능하며, 소규모 뇌 영역 샘플을 사용함으로써 영역 특이적 연구를 지원합니다. 주요 한계점으로는 RNA 및 단백질 수율이 낮고, 잠재적인 반구 비대칭성이 존재하며, 마우스 뇌 조직으로 제한된다는 점과 SDS 민감성 응용 분야와의 호환성이 낮다는 점이 있습니다. 향후 연구에서는 생체 분자 회수율을 최적화하고, 다른 조직 및 종에서 이 워크플로우를 검증하며, 추가적인 분자 표적의 장기 안정성을 평가해야 합니다.

공개 사항

저자들은 본 논문에 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 알려진 재정적 이해관계나 개인적 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

This work was supported by grants from the Education Department of Liaoning Province (General Research Project JYTMS20230571) and Dalian Medical University’s 2023 “Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Health and Wellness” initiative (H0.2XY2023KY10), both awarded to Prof. CQ Liu; and by the 2025 Liaoning Province Undergraduate Innovation & Entrepreneurship Training Program(S202510161061) and Dalian Medical University’s Undergraduate Innovative Talent Training and Teaching Reform Fund (112307010209), both awarded to YK Li.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL RNase-free 마이크로원심분리 튜브AxygenMCT-150-C-S조직 펀치 수집 및 RNA/단백질 추출 분획.
15 mL 원추형 원심분리관바이오필름CFT010150고정, 자당 탈수 및 용액 보관.
24-웰 세포 배양 플레이트NEST702001부유 뇌 절편의 수집, 염색 및 장기 보관.
30% 설탕 용액실험실에서 조제됨제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.동결 절편 제작 전 고정된 뇌 반구의 동결 보호.
4% 파라포름알데히드 용액BiosharpBL539A형태학적 분석용으로 지정된 뇌 반구의 침전 고정.
5× 단백질 로딩 버퍼Beyotime BiotechnologyDL101SDS-PAGE를 위한 단백질 시료 준비.
아가로스Solarbio카테고리: A8201아가로스 겔 전기영동을 이용한 RNA 무결성 평가.
Anti-doublecortin 항체Abcamab18723더블코르틴 면역조직화학 염색을 위한 1차 항체.
Anti-ERK 항체BeyotimeAB2014전체 ERK 웨스턴 블로팅을 위한 1차 항체.
Anti-GFAP 항체Abcamab10062글리아 섬유성 산성 단백질 면역형광 염색용 1차 항체.
Anti-Iba1 항체WakoNCNP24이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1 면역형광 염색용 1차 항체.
Anti-NeuN 항체MilliporeA60신경세포 핵 항원 염색을 위한 1차 항체.
항-NF-κB p65 항체HUABIOET1603-12NF-κB용 1차 항체κp65 웨스턴 블로팅
항-인산화 ERK 항체BeyotimeET1610-13인산화된 ERK 웨스턴 블로팅용 1차 항체.
Anti-PSD95 항체HUABIOET1602-20PSD95 웨스턴 블로팅용 1차 항체.
Anti-ULK1 항체HUABIOET1704-63ULK1 웨스턴 블로팅용 1차 항체.
항-β$\alpha$-튜불린 항체ABclonalAC021웨스턴 블로팅을 위한 로딩 컨트롤 1차 항체.
항퇴색 형광 마운팅 매질BeyotimeP0126-5면역형광 염색된 절편용 봉입제.
비오틴-스트렙타비딘 퍼옥시다제 검출 키트Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.KIT-9720DAB 면역조직화학 염색을 위한 2차 검출 시스템.
소 혈청 알부민Qiansheng Biotech Co., Ltd.QO3000면역염색 및 웨스턴 블로팅용 블로킹 버퍼.
C57BL/6 마우스Liaoning Changsheng Biotechology Co., LTD4주령 C57BL/6 마우스마우스 뇌 조직 수집을 위한 실험 동물(포함된 경우).
화학발광 영상 시스템Clinx Science Instruments Co., Ltd.ChemiScope 6200 Touch웨스턴 블롯 화학발광 신호 검출.
공초점 레이저 주사 현미경Leica Microsystems CMS GmbHSN: 591974면역형광 염색 절편의 이미지 획득.
동결보호제 보존액실험실에서 조제됨제공된 원문 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.부유 뇌 절편의 장기 보관 방법 −20 °C.
크라이오스탯 (Cryostat)LeicaCM1950~의 준비 30 μm 뇌 관상면 절편.
DAB 발색 기질 키트시그마SLBP7387V면역조직화학염색을 위한 발색 현색.
DAPI 핵 염색 용액쿨라버(Coolaber)SL7100면역형광 염색을 위한 핵 대조염색.
디지털 광학 현미경Ningbo Yongxin Optics Co., Ltd.모델 NE910+FL-900DAB 발색 과정 모니터링 및 명시야 염색 절편 이미징.
DNase IVazymeR223-01역전사 전 잔류 게놈 DNA 제거.
Donkey anti-rabbit IgG, 488-결합Thermo Fisher ScientificA21206면역형광 염색을 위한 형광 2차 항체.
당나귀 항-토끼 IgG, 594-접합Abcamab150076면역형광법을 위한 형광 2차 항체.
E.Z.N.A. DNA/RNA/단백질 키트Omega Bio-TekD3892-01
전기영동 전원 공급 장치Bio-Rad1645050아가로스 겔 전기영동 및 SDS-PAGE용 전원 공급 장치.
에틸렌글리콜Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.10009828동결보존액의 성분.
겔 이미징 시스템Clinx Science Instruments Co., Ltd.ChemiScope 6200 TouchRNA 품질 평가를 위한 아가로스 겔 이미징.
젤라틴 코팅 유리 슬라이드CITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO.,LTD참조: 10127105P 부품 번호: 80312-2101DAB 염색된 부유 뇌 절편의 마운팅.
이미지 분석 소프트웨어미국 국립보건원ImageJ/FijiWestern blot 밴드의 밀도 분석 및 이미지 처리.
이소프로판올Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.80109218유기/계면 분획에서의 단백질 침전.
냉장 마이크로원심분리기Yancheng Kaite Laboratory Instrument Co., Ltd.TGL16MRNA/단백질 추출 및 세척 단계 중의 원심분리.
Minute Protein Extraction Kit발명하다MS-026
중성 발삼 봉입제 Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., 중국 상하이카탈로그 번호 S30509, CAS 96949-21-2탈수 처리된 DAB 염색 절편의 커버슬립 부착.
OCT 매립제사쿠라4583고정된 뇌 반구를 동결 절편 제작하기 위한 매립제.
광학 qPCR 플레이트 또는 튜브AxygenPCR-0208-CqPCR 증폭용 반응 용기.
파라필름(Parafilm)amcorPM996장기 섹션 보관을 위한 멀티웰 플레이트 밀봉.
펜토바르비탈 나트륨Hualan Bio57-33-0심장 관류 전 마취제.
페트리 접시BiosharpBS-90-D얼음 위에서의 뇌 취급 및 뇌반구 분리.
페놀/구아니디늄 RNA 추출 시약스파클레이드(Sparklade)AC0101-BRNA 추출 대조 실험용 비교 시약.
인산화효소 억제제 칵테일APExBIOK1015-100단백질 추출 중 인산화 상태의 보존.
인산완충생리식염수BiosharpBL601A세척 완충액, 수크로스 용액 용매 및 동결보호제 용매.
폴리비닐리덴 플루오라이드 막MilliporeIPVH08100웨스턴 블롯 전사를 위한 막.
폴리비닐피롤리돈 K40시그마9003-39-8동결보호제 보존액의 성분.
프로테아제 억제제 칵테일BeyotimeP1045조직 용해 과정 중 단백질 분해 방지.
단백질 추출 키트발명하다MS-026총 단백질 추출 대조 실험용 비교 키트.
실시간 PCR 시스템AmolarrayMA6000정량 PCR 증폭 및 융해 곡선 분석.
소듐 도데실 황산염BioFroxx3250GR500단백질 펠렛 용해 및 SDS-PAGE 시료 준비.
멸균 면도날BiosharpBS-RB-11얼음 위에서 뇌 반구 분리 및 조직 트리밍.
스트렙타비딘-퍼옥시다제 결합체Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.KIT-9720DAB 면역조직화학염색을 위한 신호 증폭/검출 시약.
자당후시(Hushi)57-50-1동결보호 용액 및 동결보호제 보존 용액.
SYBR qPCR 마스터 믹스VazymeQ711-02정량 PCR 증폭.
이송 장치Bio-Rad1703930SDS-PAGE 겔에서 멤브레인으로의 단백질 습식 전이(Wet transfer).
Tween 20 함유 Tris 완충 식염수실험실에서 조제됨해당 사항 없음웨스턴 블롯 막 세척 완충액.
Triton X-100Sinopharm9002-93-1면역염색을 위한 뇌 절편의 투과화.
TrizolSparkladeAC0101-B
초고감도 SP 면역조직화학 염색 검출 키트 (마우스/토끼 1차 항체용)Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.KIT-9720DAB 면역조직화학염색을 위한 2차 항체/검출 시약.
Wistar 랫드Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD280-320 g, 수컷쥐 뇌 조직 수집을 위한 실험 동물(포함된 경우).
자일렌Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.10023418커버글라스 봉입 전 DAB 염색 슬라이드의 투명화.
중성 발삼 봉입제 Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., 중국 상하이카탈로그 번호 S30509, CAS 96949-21-2탈수된 DAB 염색 절편의 커버스립 덮기.
스트렙타비딘-퍼옥시다아제 접합체Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.KIT-9720DAB 면역조직화학염색을 위한 신호 증폭/검출 시약.
Triton X-100Sinopharm9002-93-1면역 염색을 위한 뇌 절편의 투과화.
초고감도 SP 면역조직화학 염색 검출 키트 (마우스/토끼 1차 항체용)Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.KIT-9720DAB 면역조직화학염색을 위한 2차 항체/검출 시약.
자일렌Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.10023418커버글라스 봉입 전 DAB 염색 슬라이드의 투명화.

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