FFPE 마우스 샘플에서 두개안면 조직의 발달 중인 다중화 형광 mRNA 현장 하이브리드화

요약

기존의 현장 잡종화는 복잡한 구조, 높은 배경, 제한된 탐침 특이성 및 민감성 때문에 두개안면 조직에서 mRNA를 시각화하는 데 어려움을 겪습니다. 이 프로토콜은 FFPE 마우스 배아 두개안면 조직에서 다중 mRNA 표적을 민감하고 특이적으로 검출하기 위한 다중화 형광 RNA in situ 하이브리다이제이션 방법을 설명하며, 이전의 한계를 극복합니다.

초록

두개안면 발달은 복잡한 조직 구조 내에서 상호작용하여 정상 조직 구조와 기능을 형성하고 유지하는 다양하고 특화된 세포 집단의 조정된 활동에 의존합니다. 이 세포들이 서로 그리고 국소 미세환경과 어떻게 소통하는지 이해하는 것은 이들의 형성과 항상성을 조절하는 분자 메커니즘을 정의하는 데 필수적입니다. 이러한 과정의 교란은 선천성 두개안면 질환, 예를 들어 치아 무형성, 구개열, 구순열을 유발할 수 있으며, 이는 단독으로 또는 증후군성 질환의 일부로 발생할 수 있습니다. RT-PCR과 같은 정량적 기법은 높은 감도와 동적 범위를 제공하지만, 균질화된 조직에서 RNA를 추출해야 하므로 공간적·세포적 맥락이 상실되는데, 이는 전사체의 세포 기원을 밝혀낼 수 없는 이질적인 두개안면 조직에서 특히 중요한 한계입니다. 다중화 형광 RNA in situ 하이브리다이제이션은 조직 구조를 유지하면서 여러 mRNA 전사체를 민감하고 특이적으로 검출함으로써 이러한 한계를 극복합니다. 이 첨단 접근법은 세포 수준에서 유전자 발현을 정밀하게 위치시킬 수 있게 하여, 두개안면 생물학에서 발달 과정과 질병 기전의 공간적 조절에 대한 귀중한 통찰을 제공합니다.

서론

실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)은 높은 감도와 넓은 동적 범위 덕분에 유전자 발현 분석의 골드 스탠다드입니다; 그러나 균질화된 조직에서 RNA를 추출해야 하므로 공간적·세포적 맥락이 상실^된다. 이 한계는 특히 배아 발달 중 두개안면 조직과 같은 이질적인 조직에서 문제인데, 이때 검출된 전사체의 세포 출처를 해결할 수 없습니다. 1968년 조셉 갤과 메리 루 파듀가 개척한 RNA in situ 하이브리다이제이션(ISH) 기술은 이 한계를 극복하여 mRNA 발현을 온전한 조직 구조 내에서 위치시킬 수 있게 합니다². 그럼에도 불구하고 기존 RNA ISH는 기술적으로 까다롭고 RNA의 무결성을 유지하기 위해 최적의 조직 고정과 샘플 준비에 크게 의존합니다. 이러한 문제는 고도로 석회화된 조직에서 더욱 심화되며, 이들은 강한 화학물질이나 장시간 처리가 필요한 탈석화 절차가 필요해 RNA 분해를 초래합니다. 따라서 복잡한 세포 유형의 혼합물로 이루어진 두개안면 조직의 RNA ISH는 세심한 최적화와 기술적 전문성이 필요하며, 시간이 많이 소요되고 최적 염색 품질이 낮을 위험이 큽니다. mRNA 발현을 시각화하는 어려움은 매우 복잡한 구조와 조성을 가진 치아 조직에서 더욱 두드러집니다. 치아는 법랑질, 상아질, 시멘질, 주변 뼈와 같은 광물질화된 성분과 치수, 치주 인대 같은 부드러운 조직으로 구성되어 있습니다. 이 조직들은 치^{아 발달}에 중요한 역할을 하는 다양한 세포 유형으로 구성되어 있습니다. 이러한 기능들은 신뢰할 수 있는 신호 검출을 보장하기 위해 신중한 표준화가 필요합니다. 따라서 이 프로토콜은 치아 형성의 발달 및 출생 후 단계에서 유전자 발현을 조사하는 데 특히 적합합니다.

공간 RNA 검출을 위한 다중 형광 제자리 하이브리다이제이션(FISH) 기반 기법이 존재하며, 여기에는 프로브 기반 증폭 RNA FISH 5,6,7,8,9, 하이브리다이제이션 연쇄 반응 FISH⁶, 단일 분자 RNA FISH¹⁰, 교환 반응에 의한 신호 증폭 FISH 5, 그리고 MERFISH ¹¹ 및 seqFISH¹²와 같은 고다중화 FISH 플랫폼이 포함됩니다.¹³. 이 중 다중 형광 RNA ISH ^7,8,9는 이중 Z-프로브 설계에서 단일 RNA 분자를 감지하는 데 높은 감도로 널리 사용되며, 이 설계에서는 인접한 두 프로브가 신호 증폭을 시작하기 위해 표적 서열에 하이브리다이즈되어야 합니다. 이 이중 인식 설계는 특이성을 크게 향상시키고 표적 신호에서 벗어난 신호를 줄입니다. 이 방법은 2–4개의 타겟을 다중적으로 검출할 수 있으며(유사한 기법을 사용하면 최대 12개 이상의 타겟까지 확장), 조직 형태를 보존하고, 포르말린 고정 파라핀 내장(FFPE)^7,8,9, 신선하게 동결된 조직, 그리고 선택된 석회화 조직과 호환되어 두개안면 및 치아 발달에서 발견되는 복잡한 샘플에 적합합니다. 이 방법은 표준화되어 있고 재현 가능하며, 잘 확립된 프로브 라이브러리의 지원을 받고, 광범위하게 검증되어 다양한 실험실에서 접근 가능하고 신뢰할 수 있는 결과를 보장합니다.

다중화 형광 RNA ISH는 동일한 전사체의 서로 다른 영역을 표적으로 하는 여러 프로브와 향상된 신호 증폭을 결합하여 저품도 또는 부분적으로 퇴화된 mRNA에서도 매우 민감하고 특이적인 검출을 가능하게 합니다^14,15. 다중화 형광 RNA ISH는 탈석화된^{뼈 샘플에} 성공적으로 적용되었으며, 복잡한 두개안면 조직에서의 사용이 이전에 보고된 바 있습니다 ^7,8,9; 그러나 이 맥락에서의 적용을 상세히 설명하는 단계별 프로토콜은 아직 보고되지 않았습니다.

두개안면 구조는 골세포, 쇄골세포, 골세포, 아멜로모스트, 치세포, 섬유아세포, 줄기세포, 면역세포, 혈관류, 감각 뉴런 등 다양한 세포 유형을 가진 복잡한 조직 구조로 구성되며, 이들의 공간적으로 조정된 상호작용은 조직 형성, 기능, 재생, 면역학적 보호에 필수적입니다⁴. 따라서 이 조직들에서 국소화된 유전자 발현을 연구하는 것이 매우 중요하며, 다중화 형광 RNA ISH는 이러한 분석의 선도적 접근법을 나타냅니다.

본 연구에서는 RNAscope 프로브와 기술을 기반으로 한 다중화 형광 RNA ISH가 복잡한 두개안면 조직을 연구하는 데 어떻게 적용될 수 있는지 설명했습니다(그림 1). 더 나아가, RNA 무결성을 보존하고 고품질의 공간적으로 해상도된 유전자 발현 분석을 가능하게 하는 최적화된 FFPE 절편 워크플로우를 구축했습니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 미국 국립보건원(NIH), 국립아동보건 및 인간발달연구소(NIH) 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 동물 연구 프로토콜 #24-031에 의해 승인되었습니다.

1. 타이밍 교미 및 배아 조직 채취

1. 시간 정해진 교미를 설정하세요.
   1. 늦은 오후에 건강하고 가임이 가능한 수컷과 암컷 Mus musculus를 짝지어 보세요. 다음 날 아침, 질 플러그가 있는지 확인하세요. 플러그가 관찰되는 날을 배아 일(E) 0.5로 지정합니다.
2. 임신한 암컷을 안락사시키세요.
   1. 원하는 발달 단계에서, 동물 관리 지침에 따라 CO₂ 흡입 후 자궁경부 탈구를 통해 임신한 암컷 쥐를 안락사시킵니다.
   2. 쥐를 멸균된 흡수면 위에 등을 대고 눕히세요. 복부 부위는 절개 부위를 따라 70% 에탄올로 소독하세요.
3. 자궁 뿔을 노출시키고 분리하세요.
   1. 멸균 수술용 가위로 복부 중앙 절개를 한 후, 미세수술용 가위로 복막벽을 열어 자궁 뿔을 노출시킵니다.
   2. 둔탁한 겸자를 사용해 자궁 사슬을 부드럽게 바깥쪽으로 밀어내세요. 자궁 조직을 근단을 따라 방출하고, 난관과 정중 자궁 뿔 부착부를 절단하여 배아를 분리합니다.
4. 전체 배아를 이식하세요.
   1. 즉시 배아가 포함된 자궁 사슬을 얼음처럼 차갑고 멸균된 1× PBS(pH 7.4)가 들어 있는 10cm 페트리 접시로 옮깁니다.
5. 개별 배아를 해부하세요.
   1. 각 배아를 주변 자궁, 양수, 융모막으로부터 조심스럽게 분리하세요.
   2. 세척된 배아를 얼음처럼 차갑고 멸균된 PBS가 포함된 신선한 10cm 접시로 옮깁니다.
6. 쥐 배아 머리를 해부하세요.
   1. 멸균된 수술용 칼을 사용해 머리를 해부한 뒤, 해부된 머리를 얼음처럼 차가운 PBS에 한 번 씻어낸 후 추가 처리를 합니다.
      참고: 동물 프로토콜에 따라 신생아 마우스를 원하는 발달 단계에서 수집하여 해부하세요.

2. 조직의 고정 및 처리

1. 휴지를 고쳐.
   1. 해부한 조직을 즉시 10% 중성 완충 포르말린에 담근 후 상온에서 셰이커에 하룻밤 고정하세요.
      참고: RNA의 적절한 보존은 현장 잡종화 분석의 성공에 매우 중요합니다. 수많은 연구에서 표준 접근법인 10% 중성 완충 포르말린에 조직 샘플을 고정하여 조직의 크기와 연령에 따라 6시간에서 48시간 정도 고정하는 것이 RNA 보존에 있어 신뢰할 수 있는 결과를 낸다는 것을 보여주었습니다^{16, 17, 18, 19}. 초기 배아 단계(E12.5 이하)에서는 고정제의 침투가 빠르므로, 과도한 고정을 방지하기 위해 고정 시간을 그에 맞게 줄여야 합니다. 배아 17.5일(E17.5) 이후부터는 머리에 피부가 물리적인 장벽 역할을 하기 때문에 고정제의 침투 효율이 떨어질 수 있습니다. 따라서 고정액이 효율적으로 침투할 수 있도록 머리 전체에서 피부를 제거해야 합니다. 탈석화는 0.5% 메탄올 프리 포름알데히드를 함유한 0.5M EDTA(pH 8.0)에서 4°C⁷에서 수행할 수 있습니다. 탈석화 기간은 빠른 마이크로CT 스캔으로 모니터링할 수 있으며, 광화 정도와 특정 조직 유형에 따라 조절할 수 있습니다; E18.5 배아의 경우 보통 24–48시간이 충분합니다.
2. 조직을 헹구고 가공하세요.
   1. 고정제를 제거하고 PBS로 샘플을 헹구세요. 조직을 70% 에탄올로 옮겨 4°C에서 저장하여 추가 처리(1–4주)를 기다립니다²⁰. 제조사 지침에 따라 자동 조직 처리기를 사용하여 조직 탈수, 제거, 파라핀 침투를 수행합니다.
      참고: 일반적인 조직 처리 프로토콜은 다음과 같습니다: 70% 에탄올 30분, 이어서 95% 에탄올 30분(2회), 100% 에탄올 30분(3회) 탈수 치료; 자일렌에 1시간(3회)을 제거한 후, 60°C에서 파라핀 왁스로 1시간(3회)침투한 후 파라핀 조직 블록에 박힙니다.
3. 조직을 삽입하세요.
   1. 머리를 파라핀에 박고, 실험 요구에 따라 코로나 시상면에 샘플을 배치하세요.
   2. 내장된 블록을 파라핀 블록 콜드플레이트로 옮겨 왁스가 약 30분 정도 굳도록 하고, 블록 크기에 따라 타이밍을 조절합니다.
4. FFPE 블록을 보관하세요.
   1. 파라핀이 완전히 굳을 때까지 기다려 주세요. 몰드에서 블록을 꺼내 라벨이 붙은 밀폐 용기나 지퍼백에 넣고, 4°C에서 보관하다가 분할할 준비가 됩니다.
      참고: 잘 보존된 RNA를 가진 FFPE 블록은 절개 수술 전 수년간 보관할 수 있으며 조직 무결성을 해치지 않습니다.

3. 다중화 형광 RNA ISH 처리를 위한 FFPE 조직 처리

1. RNase가 없는 작업 공간을 준비하세요.
   1. 모든 작업면과 기구를 70% 에탄올로 소독하세요. RNase 제염 용액으로 표면, 도구, 장갑을 처리하여 RNA 분해를 최소화하세요.
   2. 마이크로토놈을 설치하고 새 블레이드를 장착하세요. 간극 각도를 10°로 설정하세요. 사용 전에 핀셋과 브러시를 RNase 제염 용액으로 처리하세요.
      참고: 정확한 조직 절개를 위해서는 항상 새 칼날을 사용해야 합니다. 블레이드 각도는 단면의 품질, 조직의 완전성, 두께의 균일성, 형태학적 특징의 보존에 큰 영향을 미칩니다.
2. 물욕을 준비해.
   1. 부유수 목욕에 초순수한 실험실 등급 물로 채우세요.
   2. 배아 단계와 조직 특성에 따라 온도를 40–43 °C 사이로 조절할 수 있습니다.
3. FFPE 블록을 다듬고 장착하세요.
   1. 박힌 조직 주변의 과도한 파라핀을 다듬어내세요. FFPE 블록을 얼음 위에 식힌 후 미세토름 콜드 스테이지에 장착하세요.
4. 관심 지역으로 다듬어.
   1. 파라핀 블록 면을 미세토름 블레이드와 정렬하고 12 μm 간격으로 다듬어 관상 절개에서 관심 부위(예: 어금니나 앞니 인접 부위)가 나타날 때까지 진행합니다.
   2. 블록과 블레이드를 대칭적이고 적절한 방향으로 배치하여 전체 머리 관상이나 시상체 부위를 조정합니다.
5. 조직을 절개하세요.
   1. 관심 영역에 도달하면 5–7 μm 단면을 절단합니다. 조각들을 물탕에 떠서 부드러운 이완과 평평함을 제공한 후 슬라이드로 옮기세요.
6. 단편을 장착하고 건조하세요.
   1. 이 단편들을 양전하를 띤 유리 슬라이드에 장착하세요. 슬라이드를 광학 현미경으로 검사하여 올바른 방향과 조직의 완전성을 확인하세요.
   2. 다중화 형광 RNA ISH 분석을 수행하기 전에 슬라이드 워머에서 40°C에서 하룻밤 건조합니다.

4. 1일차: 탈파라핀화 및 수분 재

1. 슬라이드를 구워라.
   1. 슬라이드를 FFPE 단면으로 60°C에서 1시간 동안 구워주세요.
      참고: 슬라이드를 즉시 사용하지 않을 경우, 실온(RT)에서 건조제와 함께 1주에서 4주간 보관하세요. 장기간 저장은 RNA 분해를 초래할 수 있습니다.
2. 슬라이드를 균형 잡으세요.
   1. FFPE 조직 슬라이드를 실온(RT)에서 10분간 평형으로 둡니다.
3. 파라핀을 제거하고 재수화하세요.
   1. 슬라이드를 자일렌 또는 자일렌 대체물에 5–10분간 부드럽게 저어 RT에서 담가세요. 이 과정을 한 번 반복하여 파라핀이 완전히 제거되도록 하세요.
      참고: 자일렌 작업은 화학 연기 후드에서 수행해야 합니다. 저독성 자일렌 대체물이 사용될 경우, 화학 연기 후드 외부에서도 사용할 수 있습니다.
   2. 슬라이드를 100% 에탄올로 옮기고 RT에서 2분간 배양합니다. 잔류 자일렌을 제거하기 위해 한 번 반복합니다. 절반을 70% 에탄올에 2분간 재수화하세요.
   3. 절반을 PBS로 세 번 세척하세요. 그 후 PBS를 한 방울씩 추가해 섹션을 완전히 덮고 바로 다음 단계로 넘어가세요.

5. FFPE 조직 절편에서 다중화 형광 RNA ISH

참고: 본 연구는 제조사의 지침에 따라 RNAscope 기술²¹을 사용하여 FFPE 조직 절편에 다중화 형광 RNA ISH를 수행하였습니다.

1. 1일차: 전처리 및 프로브 하이브리다이제이션
   1. 소수성 장벽을 그려라.
      1. 장벽펜을 사용해 각 조직 단위에 소수성 장벽을 그립니다. 슬라이드를 실온(RT)에서 약 10분간 자연 건조시킵니다.
      2. 조직 절편은 항상 PBS로 덮어 건조를 방지하세요.
         참고: 보풀 없는 물티슈(렌즈 티슈)를 사용해 슬라이드를 조직 주변에 말리면서 조직을 촉촉하게 유지하세요. 장벽 펜 잉크가 조직 조각과 접촉하지 않도록 하세요.
   2. 사전 치료를 수행하세요.
      1. 각 구간을 완전히 덮도록 맞춤형 전처리 시약을 적용하세요. 슬라이드를 40°C에서 30분간 하이브리드 오븐 안에 넣은 가습 챔버에서 부양합니다.
         참고: 드로퍼 병에 담긴 모든 시약의 경우, 장벽 내 구간을 완전히 덮을 만큼 충분한 방울을 추가하세요. 사용 전에 모든 시약을 반드시 RT로 가져가야 합니다.
   3. 부위를 씻어내세요.
      1. 절편을 PBS로 여러 번 헹구고, 신선한 PBS에 2분간 RT에서 배양하세요.
         참고: 5mL 전이피펫을 사용해 각 슬라이드를 개별적으로 PBS로 세척하세요. 2분 세척 중에는 해당 구역을 PBS로 완전히 덮어두도록 하세요.
   4. 내인성 과산화효소 활성을 억제합니다.
      1. 각 절면마다 3% 과산화수소를 발라하고 RT에서 10분간 배큐하여 내인성 과산화효소 활성을 차단합니다.
   5. 세척을 반복하세요.
      1. 슬라이드를 PBS에서 RT에서 2분간 세척하고, 두 번 반복하세요.
   6. 탐사선 준비해.
      1. 프로브를 40°C에서 10분간 예열하세요. 사용 전에 프로브를 RT로 식히세요.
   7. 프로브 혼합물을 준비해.
      1. C1 프로브는 1× 작동 용액으로 제공됩니다; 이걸 직접 사용하세요.
      2. 반면, C2, C3, C4 프로브는 50× 농축액으로 제공됩니다; 이 프로브들을 C1 프로브 용액으로 희석하세요. C1 프로브를 사용하지 않는다면, 제조사에서 제공한 탐침 희석제로 C2, C3, 또는 C4 프로브를 희석하세요.
   8. 프로브를 하이브리드화하세요.
      1. 각 조직 절편마다 30–40 μL의 프로브 혼합물을 적용하여 완전한 덮개를 확보하세요. 하이브리드제이션 오븐의 가습 챔버에서 40°C에서 슬라이드를 2시간 부양합니다.
         참고: RNAscope 기법을 배울 때는 테스트 실행 시 음성과 양성 대조군 프로브를 모두 포함하는 것이 권장됩니다. 이 방법은 검사법을 검증하고 절차의 품질을 확인하는 데 도움을 줍니다. 참고할 수 있는 잠재적 제한점은 일부 제조사에서 제공한 양성 대조 프로브가 관심 조직에서 발현되지 않을 수 있다는 점입니다. 이를 해결하기 위해 세포 유형별 특이적 탐침을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Col1a1 은 결합 조직에 대한 신뢰할 수 있는 양성 대조군입니다. Col1a1 (또는 발현이 높은 다른 유전자)에 대한 염색은 샘플 내 RNA 보존과 조직 형태를 평가하기 위한 첫 단계로 수행할 수 있습니다. 기술에 익숙해지면, 음적 대조군은 일반적으로 프로브 없이 슬라이드를 처리하고 다른 모든 용액으로 처리하여 수행합니다. 이 방법은 모든 검출 채널의 배경 신호에 관한 중요한 정보를 제공합니다. 표준 멀티플렉스 V2 키트는 최대 네 개의 서로 다른 프로브를 동시에 염색하고 이미징할 수 있게 합니다. 이전 전사체학 연구를 통해 유전자 발현 수준이 확립되면, 발현이 낮은 유전자를 Cy5와 Cy7 채널에 할당하는 것이 권장됩니다. 발현이 높은 유전자는 최적의 검출을 위해 GFP 및 RFP 채널에 배치해야 합니다. 탐침이 고발현 유전자를 표적으로 하지 않는 경우, GFP 채널은 사용하지 않아야 합니다. 이로 인해 GFP 채널이 RFP 채널에서 배경 뺄셈의 기준 역할을 하여, 저발현 표적에 대한 신호 탐지 정확도를 향상시킵니다.
   9. 세척 버퍼로 세척하세요.
      참고: 시판 중인 20× 워시 버퍼는 사용 전에 RNase 무첨가 물로 1×로 희석되었습니다.
      1. 키트에 제공된 1× 워시 버퍼로 슬라이드를 RT에서 2분간 세척하세요. 두 번 반복하세요.
   10. 5배 식염수-시트레이트나트륨(SSC) 완충액에 배양합니다.
       참고: 상업적으로 판매되는 20× SSC 버퍼(3 M NaCl, 0.3M 시트레이트 나트륨, pH 7.0)는 사용 전에 RNase 무첨가 물로 5×로 희석되었습니다.
       1. 세척 후에는 RT에서 5× SSC 완충 부위에 하룻밤 배큐하세요.
2. 2일차: 신호 증폭, 형광 표지 부착 및 장착
   1. 슬라이드를 세탁하세요.
      1. 슬라이드를 1번에 세척하고× 워시 버퍼를 실온(RT)에서 2분간 사용하세요. 두 번 반복하세요.
   2. 증폭 단계를 수행하세요.
      1. 각 절면에 증폭 시약 1을 적용하고 40°C에서 30분간 가습 챔버에서 배양합니다.
      2. 1번에 두 번 헹구고× RT에서 2분간 세척 버퍼를 사용하세요.
      3. 증폭 2 시약을 적용하고 40°C에서 30분간 배양합니다.
      4. 1번에 두 번 헹구고× RT에서 2분간 세척 버퍼를 사용하세요.
      5. 증폭 3 시약을 적용하고 40 °C에서 15분간 배양합니다.
         참고: 어떤 채널(프로브)을 개발하든 세 가지 증폭 단계 모두 필요합니다.
      6. 1번에 두 번 헹구고× RT에서 2분간 세척 버퍼를 사용하세요.
   3. 말냉이 과산화효소(HRP)와 형광포어를 개발합니다.
      1. 필요한 형광체 부피(일반적으로 슬라이드당 100–200 μL)를 계산하고 오팔 형광체 재고를 희석합니다.
         참고: 형광체의 권장 희석 범위는 1:300에서 1:1500입니다. 이 실험들에서 오팔 폴라리스 780(플루로포어 시약)은 항체 희석제에 1:500으로 희석되었고, 나머지 모든 염료는 TSA 버퍼에 1:1000으로 희석되었습니다. 가능한 한 슬라이드에 빛 노출을 최소화하세요.
      2. HRP-C1 시약을 바르고 40°C에서 15분간 배큐합니다.
      3. 1번에 두 번 헹구고× RT에서 2분간 세척 버퍼를 사용하세요.
      4. 각 구획마다 오팔 염료(예: 오팔 570 또는 오팔 690)를 30–40 μL씩 바릅니다. 40°C에서 30분간 배양하세요.
      5. 1번에 두 번 헹구고× RT에서 2분간 세척 버퍼를 사용하세요.
      6. HRP 차단제를 바르고 40°C에서 15분간 배큐하세요.
      7. 1번에 두 번 헹구고× RT에서 2분간 세척 버퍼를 사용하세요.
      8. HRP-C2 또는 HRP-C3 시약을 적용하고 40°C에서 15분간 배양합니다.
      9. 1번에 두 번 헹구고× RT에서 2분간 세척 버퍼를 사용하세요.
      10. 두 번째 오팔 염료 30–40 μL을 40°C에서 30분간 배양합니다.
      11. 1번에 두 번 헹구고× RT에서 2분간 세척 버퍼를 사용하세요.
      12. HRP 차단제를 바르고 40°C에서 15분간 배큐하세요.
      13. 1번에 두 번 헹구고× RT에서 2분간 세척 버퍼를 사용하세요.
      14. HRP-C3 또는 HRP-C4 시약을 적용하고 40°C에서 15분간 배큐합니다.
      15. 1번에 두 번 헹구고× RT에서 2분간 세척 버퍼를 사용하세요.
   4. 티라마이드 신호 증폭-디곡시제닌(TSA-DIG) 및 형광체 표지(해당 시 포함)를 수행합니다.
      1. 각 절면당 희석된 TSA-DIG 시약 30–40 μL을 적용하고 RT에서 30분간 배양합니다.
      2. 1번에 두 번 헹구고× RT에서 2분간 세척 버퍼를 사용하세요.
      3. 차단 시약을 바르고 40°C에서 15분간 배양합니다.
      4. 1번에 두 번 헹구고× RT에서 2분간 세척 버퍼를 사용하세요.
      5. 희석된 형광체 시약 30–40 μL를 적용하고 40 °C에서 30분간 배양합니다.
      6. 1번에 두 번 헹구고× RT에서 2분간 세척 버퍼를 사용하세요.
   5. 대염색 및 마승 작업을 수행하세요.
      1. 4′6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 바르고 어두운 곳에서 RT에서 5분간 배양하세요.
      2. DAPI를 세척한 후 즉시 안티페이드 마운턴트로 섹션을 장착하고, 커버슬립을 부드럽게 바르며, 기포가 갇히지 않도록 하세요. 휴지 커버와 적절히 맞는 커버슬립 크기를 선택하세요.
      3. 슬라이드를 어두운 환경에서 RT에서 2시간 건조한 후, 장기 보관을 위해 4°C로 보관하세요.
         참고: 형광은 적절한 페이드 방지 장착과 함께 어두운 곳에서 4°C에 보관하면 최대 1년까지 보존할 수 있습니다.
   6. 영상 촬영을 하세요.
      1. LED 조명과 필터를 갖춘 다중 채널 형광 현미경을 사용하여 분광 분리를 수행합니다(그림 2A). 여기 및 방출 파장은 다음과 같이 사용한다: DAPI (353/465 nm), FITC (495/519 nm), Cy3 (548 / 561 nm), Cy5 (650 / 673 nm), Cy7 (747/773 nm). 특정 필터는 스펙트럼 중첩을 최소화하고 청색, 녹색, 주황색, 적외선, 근적외선 신호를 구별합니다.
      2. 샘플 간 동일한 노출 및 조명 설정을 사용하여 모든 이미지를 획득하여 일관성을 확보하고 신뢰할 수 있는 비교 분석을 가능하게 합니다.

결과

기술된 프로토콜(그림 1)을 사용하여 Zeiss 현미경 플랫폼에서 마우스 전체 머리 촬영을 통해 다중화 형광 mRNA ISH 전사체 검출을 시연합니다(그림 2B). 특정 이미지 뷰는 사이드 탭(노란색 박스)을 통해 선택할 수 있으며, 채널 탭(빨간색 박스)을 통해 여러 채널을 동시에 시각화할 수 있습니다. 라이브 이미지의 밝기, 감마, 대비는 디스플레이 탭(녹색 박스) 내 컨트롤로 직접 조절하여 중요한 기능의 가시성을 최적화할 수 있습니다.

또한 다중화 유전자 패널로 처리하여 Sfrp2, Dspp, Dkk1 을 검출한 야생형 신생아 머리의 시상 절편 전사체를 시각화합니다(그림 2C). 고배율 영상은 하악 앞니와 주...

토론

현장 하이브리다이제이션은 40년 넘게 유전자 발현 연구의 기초 도구로 사용되어 왔으며, 지속적으로 발전해 왔습니다. 하지만 기존의 ISH 접근법은 종종 감도가 낮고 배경 신호가 높으며, 길고 노동 집약적인 절차로 인해 제한을 받습니다. 이러한 제약은 특히 복잡한 두개안면 조직에서 정밀 공간 해상도와 저풍도 전사체 검출이 필수적인 경우, 이들의 광범위한 적용을 제한했습니다. 다중화 형광 RNA ISH는 독특한 프로브 설계와 신호 증폭 전략을 통해 이러한 많은 도전을 극복하는데, 이는 비특이적 배경 신호를 최소화하면서 표적 특이적 신호를 선택적으로 증폭합니다^. 그 결과, 이 접근법은 신호 대 잡음비를 크게 개선하고 단일 세포 또는 심지어 아세포 수준에서 전사체의 고해상도 위치 확인을 가능하게 합니다.

다중화 형광 RNA ISH는 매우 민감하고 특이적인 기법으로, 온...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1× PBS	서모 피셔	10010023	Use  작업 흐름 중 워시를 수행하기 위해
20번, SSC	서모 피셔	J60839. K2	1급성을 만들 때 사용하세요; 워시 버퍼
50 mL 원뿔 튜브(Ambion) RNAse 자유	서모 피셔	AM12502	샘플을 다양한 용액에 보관하는 데 사용하세요
고급 궤도 셰이커	VWR	6683-470	인큐베이션 중 고정액에서 조직을 흔들 때 사용하세요
알코올 70%, 피셔브랜드, 히스토프렙	피셔 사이언티브	HC-1000-1GL	작업 공간을 청소하고 소독하는 데 사용하세요
항체 희석제	아코야 바이오사이언스	ARD1001EA	TSA-DIG용 희석제
자동 진공 조직 처리	라이카 바이오시스템	ASP300S	샘플의 투명화, 탈수, 재수화 및 왁스 침투에 사용됩니다
커버 유리 두께 1.5, 25 mm x 25 mm	코닝	2850-25	Visium HD 워크플로우에서 슬라이드 장착에 사용
맞춤형 전처리 시약	ACD, 바이오-테크네	300040	조직 투과성과 표적 접근성을 최적화하기 위해
EDTA	밀리포어 시그마	03690	광물 조직의 탈석화에 사용됩니다
에탄올 100%	에어로베이스 그룹	6505001050000	가공 중 자일라인을 제거하고 샘플을 재수화하는 데 사용하세요
히스토코어 워터 배스	라이카 바이오시스템	HIS2326	40-43 & deg; C는 FFPE 단면의 주름을 제거하기 위해 nbsp;
HybEZ 가습지	ACD, 바이오-테크네	310015	HybEZ 오븐 내부에서 습도를 유지하고 하이브리다이제이션 중 조직 조각이 건조되는 것을 방지하기 위해 사용하세요
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