방법 논문

헥사메틸디실록산 촉진 확산 및 이온 선택성 전극 측정을 이용한 마우스 모델의 혈청, 뼈 및 치아 내 불소 정량 분석

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DOI:

10.3791/71488

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2026년 8월 28일

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1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

이 논문에서

요약

본 프로토콜에서는 헥사메틸디실록산(HMDS)을 이용한 확산 접시 준비 방법과, 이후 이온 선택성 전극 측정을 통해 마우스의 혈청, 뼈 및 치아 내 불소 이온 질량을 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 생물학적 시료 내의 불소 축적도를 평가하기 위해 검정 곡선을 기반으로 하는 민감한 접근 방식을 제공합니다.

초록

생체 조직 내 불소 농도를 정량화하는 것은 불소 노출, 대사 및 독성을 이해하는 데 필수적입니다. 본 프로토콜은 헥사메틸디실록산(HMDS) 촉진 확산 후 이온 선택성 전극(ISE) 분석을 사용하여 혈청, 뼈 및 치아의 불소 이온 질량을 측정하는 민감하고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 통제된 불소 처리에 노출된 마우스로부터 혈청, 대퇴골 및 하악 절치를 포함한 생체 시료를 수집합니다. 뼈와 치아 시료는 회화, 분쇄 및 수화 과정을 거치며, 혈청은 직접 처리합니다. 각 시료를 초순수가 담긴 확산 접시에 옮기고, 불소 트랩 역할을 하는 수산화나트륨 액적이 부착된 페트롤륨 라인 덮개로 밀봉합니다. HMDS로 포화된 황산을 주입하여 불소의 방출과 확산을 시작하며, 이를 통해 유리된 불소 이온이 트랩에 정량적으로 포집됩니다. 밤샘 확산 후, 불소 트랩 액적들을 하나의 시료로 합치고, 필요한 pH 범위로 산성화하며, ISE 측정을 위해 정의된 부피로 조정합니다. 알려진 불소 질량으로 준비된 교정 확산 접시를 통해 정량을 위한 표준 곡선을 생성하며, 품질 관리 시료로 전극의 안정성을 검증합니다. 0 또는 125 ppm 불소에 노출된 청소년 및 성체 마우스의 대표적인 결과는 혈청, 뼈 및 치아 전체에서 연령 및 용량 의존적인 불소 농도 차이를 검출하는 본 방법의 능력을 보여줍니다. 본 프로토콜은 다양한 생체 매질 내의 불소를 정량화하기 위한 견고한 교정 기반 접근 방식을 제공하며, 마우스 모델에서의 불소 노출, 조직 침착 및 독성학적 결과를 조사하는 연구에 적합합니다. 이 방법의 주요 장점은 확산 과정이 방출된 모든 불소를 100 µL 미만의 측정 가능한 시료 부피로 농축시키기 때문에, 개별 마우스 절치에서 얻은 3–5 mg의 회분과 같이 극소량의 시료에서도 불소를 정확하게 정량할 수 있다는 점입니다.

서론

불소는 자연적으로 발생하는 음이온이며, 적정 수준의 불소는 치아 우식증 예방에 효과적입니다1,2,3,4,5. 미국(U.S.)에서는 치아 우식증 발생률을 낮추고 구강 건강을 증진하기 위한 공중 보건 전략으로 0.7 ppm 농도의 지역사회 수돗물 불소화 사업을 시행해 왔습니다6. 그러나 과도한 불소를 장기간 섭취하면 여러 조직에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 고농도의 불소 노출은 법랑질 형성을 방해하고7,8,9, 골 형성을 변화시키며10, 골격의 무결성을 손상시킵니다11.

세포 수준에서 불소 노출은 산화 스트레스12, 소포체 스트레스13, 유전자 발현을 변화시키는 후성유전학적 변형14, 그리고 법랑질 형성 세포의 세포 사멸15,16,17,18을 포함한 여러 대사 장애를 유도합니다. 전 세계적으로 지하수의 높은 불소 농도(>1.5 ppm)는 심각한 건강 문제를 야기합니다. 최근의 예측 모델링 연구에 따르면, 전 세계적으로 약 1억 8천만 명의 사람들이 과도한 불소 노출의 영향을 받을 가능성이 있으며, 특히 아시아와 아프리카에서 가장 큰 피해가 발생하는 것으로 추정되었습니다1. 식수 외에도 불소 노출은 식품(예: 해산물; ~1.9 ppm), 음료(예: 차; 0.5–6 ppm19), 그리고 치약과 같은 치과 제품20 (1,000–1,500 ppm)을 통해 발생합니다.

따라서 불소 노출, 대사 및 조직 침착을 이해하는 것은 불소의 치료적 이점과 잠재적인 독성학적 결과를 모두 평가하는 데 필수적입니다. 소변, 혈청, 뼈 및 치아를 포함한 생물학적 시료 내 불소의 정확한 정량 분석은 이 연구의 핵심 요소입니다. 그러나 불소의 화학적 성질과 칼슘이 풍부한 매질에 대한 강한 친화력으로 인해 측정 과정에서 분석적 어려움이 따릅니다. 체내 불소의 약 99%는 뼈와 치아 같은 무기질 조직에 존재합니다21. 이러한 과제를 해결하기 위해 이온 선택성 전극(ISE) 전위차 측정법, 이온 크로마토그래피, 비색법, 적정법, 그리고 핵 또는 활성화 기반 분석법을 포함한 다양한 분석 기술이 개발되었습니다22. 이 중에서 hexamethyldisiloxane(HMDS) 촉진 확산 기술과 불소 선택성 전극 측정법을 결합한 방식은 감도, 재현성 및 다양한 시료 유형과의 호환성 덕분에 생물학적 매질 분석에서 가장 신뢰할 수 있고 널리 사용되는 접근법 중 하나로 부상했습니다23,24,25,26,27,28,29.

다양한 분석법이 존재함에도 불구하고, 각 접근 방식은 실험적 또는 임상적 연구에서의 사용을 제한할 수 있는 한계점을 가지고 있습니다. 이온 크로마토그래피는 높은 민감도와 선택성을 제공하지만, 특수 장비와 광범위한 시료 전처리가 필요합니다30,31. SPADNS (sodium 2‑(parasulfophenylazo)‑1,8-dihydroxynaphthalene-3,6‑disulfonate) 법과 같은 비색 분석법은 간단하고 저렴하지만, 탁도 및 내인성 발색단의 간섭을 받기 쉬워 복잡한 생물학적 시료에서의 신뢰성이 제한적입니다22,32,33. 적정법은 비용 효율적이고 간단하지만, 대부분의 생물학적 표본에서 미량의 불소 검출에 필요한 민감도가 부족합니다34. 핵 또는 활성화 기반 기술은 탁월한 민감도를 제공하지만, 원자로 또는 가속기 기반 중성자원 접근이 필요하므로 일상적인 실험실 사용으로는 비실용적입니다35. 이와 대조적으로, HMDS 촉진 확산 후 ISE 측정법은 연조직과 무기질화 조직 모두에서 불소의 완전한 유리를 보장하는 동시에 민감도, 비용 및 접근성 사이의 실용적인 균형을 제공합니다. 이는 조직 확보가 제한적이고 생쥐 절치와 같은 무기질 구조에서 치아당 3–5 mg의 회분만이 생성되는 소동물 관련 연구에서 특히 유리합니다.

확산-ISE 방법은 방출된 모든 불소(fluoride)를 작고 정의된 부피로 농축할 수 있어 극소량의 시료에서도 정확한 정량이 가능합니다. 이러한 특성 덕분에 이 방법은 독성동태학 연구, 용량-반응 실험 및 발달 단계별 불소 대사 조사에 매우 적합합니다. 소형 설치류, 특히 C57BL/6J 마우스는 불소의 영향을 연구하기 위한 동물 모델로 널리 사용되어 왔습니다7,9,12,29,36.

본 프로토콜에서 저자들은 HMDS 촉진 확산 기술과 불소 선택성 전극 측정을 적용하여, 고농도 불소(125 ppm)에 노출된 마우스와 처리하지 않은 대조군으로부터 수집한 혈청, 뼈 및 치아 내의 불소량을 정량화합니다. 또한, 저자들은 청소년기(처치 시작 시 6주령)와 성숙기(처치 시작 시 18주령) 마우스의 불소 축적량을 비교하여 불소 대사 및 조직 침착의 연령별 차이를 평가합니다. 설치류의 절치(incisors)는 지속적으로 맹출하며 약 7주령까지 맹출과 교합 마모 사이의 정상 상태 균형을 이루기 때문에, 하악 절치를 대표적인 치아 조직으로 선정하였습니다. 이러한 지속적인 성장 패턴은 법랑질 발달의 일관되고 접근 가능한 구배를 제공하므로, 마우스 절치는 법랑질 형성 및 치아 불소증 연구를 위해 널리 사용되고 검증된 모델이 됩니다.

프로토콜

본 프로토콜에 기술된 모든 절차는 국제 실험동물 관리 및 평가 인증 협회(AAALAC)의 인증을 받은 Nova Southeastern University의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 승인한 척추동물 사용 가이드라인 및 규정(프로토콜 번호 2023.02.MSuz1)에 따라 수행되었습니다. 모든 동물 실험은 실험동물 관리 및 사용 가이드와 미국 수의학 협회(AVMA)의 동물 안락사 가이드라인을 준수하였습니다. 본 연구에 사용된 모든 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 동물 및 마우스 모델에서의 불화나트륨 준비 및 투여

  1. 동물: 수컷 C57BL/6J 마우스를 처리 시작 시점을 기준으로 청소년기(6주령)와 성숙기(18주령)의 두 연령군으로 배정합니다.
    1. 각 그룹에 불소 제거 탈이온수(0 ppm F⁻) 또는 불화나트륨 보충 음용수(125 ppm F⁻)를 6주의 노출 기간 동안 제공합니다.
    2. 각 연령 및 처리 조건에 5마리의 동물을 포함합니다(N = 5/그룹).
    3. 노출 기간이 종료되면 혈청, 대퇴골 및 하악 절치를 채취하고, 수집된 모든 시료를 후속 분석을 위해 준비합니다.
      ​참고: 시료: 회분 처리된 뼈, 회분 처리된 치아 및 혈청과 같이 가공된 물질을 의미합니다.
  2. 동물 사육 및 식이: 마우스를 표준 실험실 조건에서 사육하며 먹이와 물을 ad libitum(자유롭게) 제공합니다.
    1. 배경 불소 수치를 최소화하기 위해 치아, 뼈 및 혈청 채취 1주 전부터 불소 제거 식이를 제공합니다.
  3. 불화나트륨 음용수
    1. 불소 보충 음용수를 조제하려면, 탈이온수에 불화나트륨(NaF)을 용해하여 원하는 불소 농도(예: 125 ppm F⁻)를 맞춥니다.
    2. 용액을 0.2 µm 진공 필터를 통해 멸균된 병에 여과합니다. 2일마다 신선한 용액을 조제합니다.
      주의: NaF는 섭취 시 독성이 있으며 피부 및 눈에 자극을 일으킬 수 있습니다. 실험복, 니트릴 장갑, 보안경을 착용한 상태로 흄 후드 내에서 취급하십시오.
  4. 불소 제거 대조군 용수의 경우, 탈이온수를 0.2 µm 진공 필터를 통해 멸균된 병에 여과합니다. 2일마다 신선한 물을 준비합니다.
  5. 불소 처리를 위해 원하는 기간 동안 불소 보충 또는 불소 제거 음용수를 ad libitum으로 제공합니다. 매일 수위를 모니터링하고 2일마다 병을 교체합니다.
  6. 노출 기간이 종료되면 이산화탄소(CO₂) 흡입 후 안락사(참수)를 통해 동물을 도살합니다. 안락사 절차는 AVMA 동물 안락사 가이드라인에 따라 수행되었으며, 기관 IACUC 프로토콜의 일부로 승인되었습니다.
    주의: CO2는 질식제입니다. 환기가 잘 되는 곳에서 절차를 수행하고 챔버가 제대로 작동하는지 확인하십시오. 직접적인 흡입 노출을 피하십시오.

2. 불소 측정을 위한 검체 준비

  1. 혈액 수집
    1. CO₂ 흡입으로 마우스를 안락사시키고, 1 mL 투베르쿨린 주사기를 사용하여 즉시 말단 심장 천자로 혈액을 수집한다. 혈액을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴다. 사용한 모든 바늘과 주사기는 기관 승인을 받은 날카로운 폐기물 전용 용기에 폐기한다.
      주의: 주사 바늘은 날카로우므로 찔림 사고가 발생할 수 있으니 주의하여 취급한다.
    2. 혈액을 실온에서 30분 동안 보관한 후, 2,000 × g에서 10분간 원심분리한다.
    3. 상층액(혈청)을 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 −80 °C에 보관한다.
      주의: 초저온 냉동고는 동상 위험이 있다. 튜브를 취급할 때는 단열 장갑을 착용하고 차가운 표면에 피부가 장시간 접촉되지 않도록 한다.
  2. 뼈
    1. 대퇴골 추출: 안락사 후 고관절 부위에서 뒷다리를 절제한다.
    2. 대퇴골에서 모든 연조직을 조심스럽게 제거한다. 조직을 탈이온수로 3회 세척한다. 추가 처리 전까지 뼈를 -80 °C에 보관한다. 제거된 연조직 및 오염된 모든 재료는 기관 생물학적 폐기물 처리 경로에 따라 폐기한다.
      참고: 70% 에탄올에 장기 보관하기 위해 조직을 2% 수크로스가 포함된 4% 파라포름알데히드에 12~16시간 동안 고정할 수 있다. 이 고정 과정은 이후의 불소 정량 분석 정확도에 영향을 주지 않는다.
    3. 뼈를 탈이온수로 충분히 헹군다. 보풀 없는 종이 타월로 과도한 수분을 닦아낸다.
    4. 증발이 가능하도록 뚜껑을 연 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 뼈를 옮기고, 60 °C 건조 오븐에서 12~16시간 동안 건조시킨다.
      주의: 건조 오븐에 의해 화상을 입을 수 있다. 시료를 취급할 때는 내열 장갑을 사용한다.
    5. 뼈의 회화: 건조된 뼈를 알루미나 도가니로 옮긴다. 도가니를 회화로(muffle furnace)에 넣고 150 °C/h의 속도로 600 °C까지 가열한 다음, 6시간 동안 유지한다. 도가니를 꺼내기 전 회화로의 온도가 200 °C 미만으로 내려갈 때까지 기다린다. 잔여 뼈 파편이나 오염된 소모품은 기관 생물학적 폐기물 처리 경로에 따라 폐기한다.
      주의: 회화로와 도가니는 극도로 높은 온도에 도달하여 심각한 화상 위험이 있다. 도가니를 취급하기 전 항상 회화로를 충분히 식힌다. 도가니를 꺼낼 때는 실험복, 보안경, 내열 장갑을 착용하고, 뜨거운 표면에 직접 닿지 않도록 긴 집게를 사용한다.
      중요 단계: 불완전한 회화는 후속 분석 결과에 영향을 줄 수 있다. 진행하기 전에 뼈 재료가 완전히 산화된 상태인지 확인한다. 잔류 탄소는 이후의 측정값에 간섭을 일으킬 수 있다.
      ​참고: 적절하게 회화된 뼈는 균일한 연회색에서 흰색으로 보여야 한다. 더 어두운 입자, 특히 검은색이나 숯 같은 잔여물이 보이면 불완전 연소를 의미한다. 변색이 있는 경우, 유기물이 완전히 제거될 수 있도록 회화 시간을 연장한다.
    6. 회화된 뼈의 보관: 회화 직후 뼈를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴다. 튜브를 Parafilm으로 밀봉하여 사용 전까지 진공 데시케이터에 보관한다.
  3. 치아
    1. 하악 절치 추출: 턱관절 높이에서 수평으로 절개하여 하악골을 상악골로부터 분리한다.
    2. 정중시상면 절개를 수행하여 상악골과 하악골을 각각 좌우 반으로 나눈다.
    3. 조직을 탈이온수로 3회 세척하고 하악 절치를 조심스럽게 추출한다. 추출한 절치는 추가 사용 전까지 -80 °C에 보관한다. 추출된 연조직 및 오염된 소모품은 기관 생물학적 폐기물 처리 경로에 따라 폐기한다.
      주의: 턱관절 및 정중시상면 절개 시 부상을 방지하기 위해 날카로운 해부 도구를 주의해서 사용한다. 장갑, 실험복, 보안경을 포함한 적절한 개인 보호구(PPE)를 착용한다.
      참고: 70% 에탄올에 장기 보관하기 위해 조직을 2% 수크로스가 포함된 4% 파라포름알데히드에 12~16시간 동안 고정할 수 있다. 이 고정 과정은 이후의 불소 정량 분석 정확도에 영향을 주지 않는다.
    4. 치아 회화 준비: 치아를 탈이온수로 충분히 헹구고 1% 과산화수소(H₂O₂) 용액에 12~16시간 동안 담가둔다. 사용한 과산화수소 용액은 유해 화학 폐기물로 처리한다.
    5. 탈이온수로 다시 헹구고 보풀 없는 티슈로 짧게 물기를 닦아낸 후, 뚜껑을 연 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴다. 튜브를 60 °C 건조 오븐에서 12~16시간 동안 건조시킨다.
      주의: 과산화수소는 산화제이며 피부와 눈에 자극을 줄 수 있다. 실험복, 니트릴 장갑, 보안경을 착용하고 흄 후드 내에서 취급한다. 가연성 물질과의 접촉을 피한다.
    6. 치아의 회화: 건조된 치아를 알루미나 도가니로 옮기고, 회화로에서 150 °C/h의 승온 속도로 600 °C 유지 온도에서 20시간 동안 회화시킨다.
    7. 회화로의 온도가 200 °C 미만으로 내려간 후에만 도가니를 꺼낸다.
      주의: 회화로와 도가니는 극도로 높은 온도에 도달하여 심각한 화상 위험이 있다. 도가니를 취급하기 전 회화로를 200 °C 미만으로 식힌다. 도가니를 꺼낼 때는 실험복, 보안경, 내열 장갑을 착용하고, 뜨거운 표면에 직접 닿지 않도록 긴 집게를 사용한다.
      중요 단계: 완전한 산화가 이루어졌는지 확인한다. 잔류 탄소는 후속 분석에 간섭을 일으킨다.
      참고: 회화된 치아 재료는 균일한 연회색에서 흰색으로 보여야 한다. 검은색 잔여물이 남아 있으면 다시 회화시킨다.
    8. 회화된 치아 시료의 보관: 회화 직후 치아를 2 mL 라운드 바텀 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴다.
    9. 튜브를 Parafilm으로 밀봉하여 사용 전까지 진공 데시케이터에 보관한다.

3. HMDS 촉진 확산 디쉬의 준비

  1. 시약 및 재료
    1. 6 N 황산: 확산 접시를 준비하기 최소 이틀 전, 6 N 황산 스톡을 만들어 둡니다. N 황산.
      참고: 확산 디쉬(Diffusion dish): 처리된 생물학적 물질에서 방출된 성분들이 뚜껑에 부착된 화학적 트랩에 포집될 수 있도록 제어된 밀폐 환경을 조성하기 위해 설계된 밀폐 용기이다. 밀폐형 설계는 외부 공기와의 교환을 방지하며, 방출된 분석물이 이후 측정을 위해 트랩으로 유도되도록 보장한다.
    2. 1을 배치하십시오. 마그네틱 믹서 위에 마그네틱 스터 바가 들어 있는 L 플라스틱 비커를 놓고 416을 추가한다. mL의 초순수.
    3. 50을 사용하여 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 84를 천천히 첨가합니다. 36 mL의 N H₂SO₄ 지속적으로 교반하면서 물에 첨가하십시오. 용액이 가열될 것이므로, 실온까지 식히십시오.. 사용하지 않았거나 폐기된 황산 용액은 기관의 화학 폐기물 처리 체계에 따라 유해 화학 폐기물로 처리하십시오.
      주의: 황산은 부식성이 매우 강합니다. 산성 물질용 장갑, 실험복 및 보안경을 착용한 상태에서 흄 후드 내에서 취급하십시오. 피부나 눈에 접촉했을 경우, 즉시 다량의 물로 씻어내십시오.
    4. HMDS 포화 6 N 황산: 6 2N 황산으로 분별 깔때기에 넣고 15를 추가한다 mL 헥사메틸디실록산(HMDS).
    5. 마개와 콕이 단단히 닫혔는지 확인한 후, 분별 깔때기를 옆으로 뉘어 잡고 작은 HMDS 방울이 보일 때까지 강하게 흔들어 줍니다.
    6. 스토퍼를 열어 현상 가스를 배출시키고, 이 과정을 두 번 더 반복하십시오.
    7. 마개를 약간 열어둔 상태로 수 시간 동안 둡니다. 6이 들어 있는 분별 깔때기를 보관하십시오. 화학 흄 후드 내 스탠드에 HMDS로 포화된 황산을 둡니다. HMDS가 포함된 황산 및 오염된 물질은 유해 화학 폐기물로 처리하십시오.
      주의: HMDS는 가연성 물질이며 흡입 시 독성이 있습니다. 실험복, 장갑 및 보호 안경을 착용한 상태로 흄후드 내에서 취급하십시오. 점화원으로부터 멀리하십시오.
    8. 0.05 N 수산화나트륨: 1을 용해하십시오. 25g의 NaOH 펠릿 1M 농도로 조제하기 위해 초순수 mL를 추가합니다. N 표준 용액.
    9. 혼합물 2 1의 mL 38의 N NaOH 스톡 용액 0.05을 얻기 위해 초순수 ___ mL를 추가합니다. N NaOH 용액.
    10. 0.05를 분주하십시오. 1.5에 N NaOH를 넣는다 1회용 mL 마이크로 원심분리 튜브에 담아 뚜껑을 파라필름(Parafilm)으로 밀봉하고, CO2 유입을 최소화하기 위해 진공 데시케이터에 보관하십시오.₂ 흡수. 사용하지 않았거나 사용한 수산화나트륨 용액은 유해 화학 폐기물로 처리하십시오.
      주의: 수산화나트륨은 부식성이 매우 강하며 심한 화상을 입힐 수 있습니다. 실험복, 장갑, 보안경을 착용하십시오. 용액이 튀지 않도록 주의해서 취급하십시오.
    11. 0.2 N 아세트산: 575를 추가합니다. µL 빙초산을 초순수에 가하고 최종 부피가 50이 되도록 맞춥니다. 0.2를 제조하기 위한 mL N 아세트산. 아세트산 용액은 유해 화학 폐기물로 처리하십시오.
      주의: 아세트산은 부식성 물질이며 피부, 눈 및 호흡기에 자극을 줄 수 있습니다. 실험복, 장갑 및 보안경을 착용한 상태에서 화학 흄 후드 내에서 취급하십시오.
    12. 페트롤라툼(Petrolatum): 약 100g을 용해한다. 60℃의 바셀린(petrolatum) g °C 오븐에서 건조합니다. 액체 페트롤라툼(liquid petrolatum)을 10...으로 흡입합니다. mL 주사기에 넣고 식혀서 굳도록 둡니다. 페트롤라툼(Petrolatum)을 채운 주사기는 수주 동안 실온에서 보관할 수 있습니다.
    13. 페트리 접시: 60mm 크기를 사용하십시오. × 15 확산 접시 준비를 위한 mm 미처리 페트리 접시.
    14. 가열된 18-G 주사바늘을 사용하여 페트리 접시 뚜껑에 작은 구멍을 뚫습니다.
    15. 10-mil 붓을 사용하여 뚜껑의 내부 테두리를 페트롤라툼으로 끊김 없이 밀봉하십시오. 14G 뭉툭한 바늘(blunt needle)이 장착된 mL 시린지 G 바늘. 사용한 모든 바늘은 기관에서 승인된 날카로운 폐기물 전용 용기에 폐기하십시오.
      주의: 주사바늘은 날카로우며 찔림 사고를 유발할 수 있습니다. 주의하여 취급하고 승인된 의료용 폐기물 전용 용기에 폐기하십시오. 바늘을 가열할 때는 화상을 방지하기 위해 내열 장갑과 보호 안경을 착용하십시오.
    16. 확산 디쉬 보정용 NaF 표준 용액. 4.19를 용해하십시오. 1g NaF (플루오린화 나트륨) 100[단위]를 조제하기 위해 초순수(Ultrapure water) L를 사용합니다. mM 스톡 용액. 10mM을 준비하십시오. mM, 100 µM, 그리고 10 µM 100을 1:10로 순차 희석하여 스탁 용액을 조제합니다. mM 용액.
      참고: 1몰의 NaF는 19 g F⁻; 따라서, 1 µL 10개 중 µM NaF은 0.19를 함유하고 있습니다. ng F⁻ 그리고 1 µL 10개 중 190mM NaF 포함 ng F⁻.
      ​참고: 교정용 확산 접시: 알려진 질량의 불소 이온(F-)을 사용하여 교정 목적으로 특별히 사용되는 확산 접시¯).
  2. 검체별 확산 디스크 준비
    1. 혈청 확산 접시: 페트리 접시 바닥에 초순수 3 mL를 피펫으로 넣고 추가하십시오. 75 µL 혈청. 혈청으로 오염된 모든 물질은 기관의 생물학적 폐기물 처리 경로를 통해 폐기하십시오. 3.4단계를 계속 진행하십시오.
    2. 골 확산 접시
      1. 골분 분쇄: 마이크로 스패튤라를 사용하여 1.5mL 마이크로원심분리 튜브 내의 회화된 뼈를 고운 가루가 될 때까지 갈아줍니다. 분쇄된 골분의 후속 공정은 즉시 진행하십시오. 골분이 오염된 소모품은 기관의 화학 폐기물 처리 절차에 따라 폐기하십시오.
      2. 골재(bone ash)의 칭량 및 수화
        1. 판독값이 최소 0.1 mg인 분석 저울의 계량 팬 위에 빈 페트리 접시 바닥을 놓으십시오. mg.
        2. 분쇄된 골재를 2에서 옮기십시오. 정전기를 최소화하고 분말의 비산을 방지하기 위해 mL 마이크로원심분리 튜브의 내용물을 작은 자기제 접시(porcelain dish)로 옮깁니다.
        3. 마이크로 스패출러를 사용하여 약 5 골재(bone ash) ○○mg를 접시에 넣고 즉시 분말을 3...으로 덮습니다. 회분 분산을 방지하기 위해 분석 저울에서 접시를 제거하기 전 ultrapure water를 mL분 첨가하십시오.
        4. 각 골분 시료의 정확한 무게를 기록하십시오. 다음 단계로 계속하십시오. 3.4.
    3. 치아 확산 접시
      1. 회분 처리된 치아의 밀링
        1. 회화 처리된 앞니를 2번 튜브로 옮깁니다. mL 라운드 바텀 마이크로원심분리 튜브에 5를 추가합니다. 각 튜브에 mm 직경의 스테인리스강 비드를 넣습니다. 튜브를 닫고 Parafilm으로 뚜껑을 밀봉합니다.
        2. 회화된 절치를 비드 비터(bead beater)를 사용하여 2,500rpm에서 분쇄하십시오. 10분 동안 rpm(분당 회전수) 설정 s. 분쇄된 치아의 처리를 즉시 진행하십시오.
      2. 회분화된 치아의 무게 측정 및 수화
        1. 분석 저울의 계량 팬 위에 놓인 확산 접시 바닥에 스테인리스강 비드를 포함한 튜브의 내용물 전체를 붓습니다. 치아 재가 포함된 오염된 소모품은 기관의 화학 폐기물 처리 경로를 통해 폐기하십시오.
        2. 디쉬에서 스테인리스강 비드를 제거하고 치아 회분(통상 3~4 하악 절치당 mg).
        3. 즉시 3을 추가하십시오. 정전기 방전으로 인한 재의 비산을 방지하기 위해, 저울에서 접시를 내리기 전 치아 재가 잠길 정도로 초순수 ○○mL를 가합니다. 다음 단계로 진행하십시오. 3.4.
  3. 확산 디스크의 보정 및 품질 관리
    1. 검체 확산 디스크와 병행하여, 5~6점 보정을 위한 보정용 확산 디스크 두 세트와 공시료(blank)를 포함하여 동일한 구성의 품질 관리용 확산 디스크 한 세트를 준비하십시오.
      참고: 품질 관리 확산 디쉬: 보정용 확산 디쉬와 동일하게 준비하며, 전극의 안정성을 주기적으로 확인하고 일관된 측정 성능을 보장하기 위해 사용합니다.
    2. 피펫 3 11개 또는 13개의 페트리 접시 각각에 초순수를 mL 넣어주고, 예상되는 F 농도 범위를 포괄하도록 NaF 스톡 용액을 첨가합니다.¯ 검체 시료의 질량 범위. 다음 단계로 계속하십시오. 3.4. 확산 디쉬 조립 완료하기37.
  4. 확산 디쉬 조립 완료
    1. 불소 트랩 침전물을 형성하려면, 50 µl 0.05 N NaOH를 페트리 접시 뚜껑의 가장자리에서 충분히 떨어진 내벽에 세 방울 떨어뜨립니다.
      참고: 불소 트랩(F¯ 트랩(Trap): F를 포집하는 확산 접시의 구성 요소¯, 구체적으로는 수산화나트륨(NaOH)입니다.
    2. NaOH 방울이 흐트러지지 않도록 뚜껑을 뒤집어 접시 바닥 부분에 밀착시킨 후 페트롤라툼(petrolatum)으로 단단히 밀봉하십시오.
    3. 3 N HMDS 포화 황산 용액을 조제하려면, 6 N HMDS 포화 황산과 초순수를 동일한 부피로 혼합하십시오. 해당 용액은 보관이 불가능하므로 사용 직전에 새로 조제하십시오.
    4. 20G 바늘이 장착된 10mL 시린지를 사용하여, 준비된 3N HMDS 포화 황산을 확산 접시 하단의 물속으로 뚜껑의 구멍을 통해 3mL 주입하십시오. 시린지 바늘을 삽입하거나 뺄 때 황산이 뚜껑 내벽에 튀지 않도록 주의하십시오.
    5. HMDS 촉진 불소 확산: 주입구를 완전히 덮도록 페트롤라툼(petrolatum)을 도포하여 즉시 밀봉한 후, 확산 디시를 저속으로 설정된 가변 록커(variable rocker) 위에 놓습니다. 실온에서 하룻밤 동안 배양합니다.그림 1).

figure-protocol-1
그림 1: 불소 추출 및 포집을 위한 골 확산 디쉬의 모식도. 그림 1은 60 × 15 mm 처리되지 않은 페트리 디쉬에 조립된 골 확산 디쉬의 설계를 보여준다. 뚜껑에는 페트롤라툼 비드로 밀봉된 작은 주입 구멍이 있다. 뚜껑의 내면에는 확산 과정 동안 뚜껑에 매달려 불소 이온(F⁻) 트랩 역할을 하는 NaOH 세 방울이 배치되어 있다. 뚜껑은 페트롤라툼을 사용하여 디쉬 바닥과 기밀하게 밀봉된다. 페트리 디쉬의 바닥에는 초순수, hexamethyldisiloxane (HMDS) 포화 황산, 그리고 골분이 들어 있으며, 이들이 함께 불소 방출 및 후속 포집을 위한 반응 환경을 형성한다. 이 그림은 저자들이 Biorender를 사용하여 작성하였으며, CC BY 라이선스에 따라 라이선스가 부여되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. ISE를 이용한 불소 측정

  1. ISE 설정
    1. 이중 채널 불소 선택성 전극에 적절한 충전 용액을 채우고, 전위계에 연결한 후 전극 홀더에 전극을 고정한다.
    2. 처리하지 않은 페트리 접시를 전극의 감지 표면 아래 시저 잭(scissor jack) 위에 배치하여 감지 표면이 페트리 접시 바닥과 평행하도록 하고, 시저 잭의 테이블을 들어 올려 페트리 접시가 전극에 거의 닿도록 조절한다(그림 2).
  2. 측정용 시료 준비
    참고: 시료: 본 프로토콜에서 시료란 확산 후의 F¯ 트랩을 아세트산 및 물과 혼합하여 이온 선택성 전극(ISE)으로 측정한 최종 생성물만을 의미한다. 
    1. 시료의 pH를 5로 조정하기 위해, 배양 기간이 끝난 후 로커(rocker)에서 확산 접시를 꺼내고 페트롤라툼(petrolatum) 밀봉을 제거하여 뚜껑을 조심스럽게 들어 올린다. 세 개의 F¯ 트랩 방울이 흐트러지지 않도록 뚜껑을 평평한 표면에 뒤집어 놓는다.
    2. P20 피펫을 사용하여 한 방울에 0.2 N 아세트산 15–20 µL를 첨가한 다음, 피펫 팁을 바꾸지 않고 세 방울을 모두 하나의 방울로 합친다.
      참고: F¯ 농도가 높은 시료는 초기 pH가 낮은 경향이 있어, F¯ 함량이 적은 시료에 비해 pH를 5로 조정하는 데 필요한 0.2 N 아세트산의 양이 적다. 전극 전위를 기록한 후(단계 5.3) 남은 시료의 양이 매우 적으므로, 잔여 시료를 사용하여 지시지를 통해 pH를 확인한다.
    3. 시료의 부피를 조정하기 위해 P100 피펫을 75 µL로 설정하고, 공기가 유입되지 않도록 F¯ 트랩의 전체 부피를 흡입한 후 초순수를 사용하여 시료를 정확히 75 µL로 맞춘다.
    4. 불소 농도 계산을 위한 정확한 부피 확보를 위해 이 단계를 주의 깊게 수행한다. 시료를 피펫 팁에 유지한 상태에서 즉시 단계 4.3으로 진행한다.
  3. 검체, 교정 및 품질 관리 시료의 측정
    1. 시료의 전극 전위를 측정하기 위해, 불소 선택성 전극의 감지 표면과 페트리 접시 사이에 시료를 분취한다. 전극의 감지 표면 전체가 페트리 접시에 직접 닿지 않으면서 액체에 완전히 잠기도록 한다. 전위계가 안정화될 때까지 기다린 후 ISE에 표시되는 전위(mV)를 기록한다.
    2. 가장 낮은 F¯ 농도부터 시작하여 가장 높은 농도 순으로 첫 번째 교정 표준물질 세트를 순차적으로 측정하여 교정 표준 곡선을 결정한다.
      1. 전극 전위(mV)를 F¯(ng)의 로그 값에 대해 타점하여 교정 곡선을 작성한다(그림 3). 지수 회귀 분석을 적용하여 표준 곡선 방정식과 결정 계수(R2)를 구한다. R2가 0.99 이상인 경우에만 교정 곡선을 채택한다.
    3. 각 검체 시료를 측정하고 전극 전위(mV)를 기록한다.
    4. 전극의 안정성을 모니터링하고 잠재적인 분석 드리프트(drift)를 감지하기 위해, 각 분석 실행 동안 간헐적으로 품질 관리 시료를 측정한다.
      1. 품질 관리 시료 값을 해당 교정 시료와 직접 비교하여 약 5% 이내로 일치하는지 확인함으로써 시간에 따른 전극 성능의 안정성을 검증한다.
      2. 시료 취급 및 확산 과정 중 불소 오염이 없음을 확인하기 위해 공시료(blank) 확산 접시를 주기적으로 측정한다.
  4. 표준 곡선 방정식을 사용하여 각 검체 시료 내 F¯(ng)의 질량을 계산한다. 그다음 이 질량을 확산 접시에 첨가한 혈청의 부피(µL) 또는 뼈나 치아 재의 질량(mg)으로 나눈다.
    1. 뼈 재의 F¯ 농도(ng/mg) 계산 예시
      1. 확산 접시에 첨가된 뼈 재 질량: 5.1 mg ; 75 µL 검체 시료의 전극 전위: –31.6 mV
      2. 단계 1: 교정 방정식을 사용하여 불소 질량 계산
        1. F⁻ 질량 (ng) = 3505.4 x e(-0.043x-31.6)
        2. F⁻ 질량 (ng) = 13,641 ng
      3. 단계 2: 뼈 재의 불소 농도 계산
        1. F⁻ 농도 =  13,641 ng  /  5.1  mg
        2. F⁻ 농도 =  2,675 ng / mg (ppm)

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그림 2: ISE 측정 설정의 모식도.그림 2는 이중 채널 이온 선택성 전극(ISE)을 이용한 불소 이온 측정에 사용된 구성을 보여줍니다. 전극에 대비하여 높이를 정밀하게 조절할 수 있도록 페트리 접시를 시저 잭(scissor jack) 위에 배치합니다. ISE는 전위계에 연결되며, 감지 표면이 페트리 접시의 평면과 평행하도록 방향을 맞추어 약 1–2 mm의 거리를 유지합니다. 간격이 설정되면, 소량의 시료(75 µL)를 감지 표면과 페트리 접시 사이의 틈에 피펫팅하여, 측정 중에 시료가 전극의 감지 영역을 완전히 덮도록 합니다. 이 그림은 저자들이 Biorender를 사용하여 제작하였으며, CC BY 라이선스 하에 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-3
그림 3: 치아 시료 내 불소 이온 질량 정량을 위한 검정 곡선 및 해당 검정 표. 상단 패널: 치아 시료 내 불소 이온 질량을 결정하는 데 사용된 검정 곡선의 예시. x축은 전극 전위(mV, 선형 스케일)를 나타내며, y축은 그에 대응하는 불소 이온 질량(ng F⁻, 로그 스케일)을 나타낸다. 측정된 검정 지점은 실선으로 표시되었으며, 피팅된 지수 회귀선은 점선으로 표시되었다. 삽입된 상자에는 표준 곡선 방정식과 결정 계수(R2 = 0.99)가 표시되어 있다. 하단 패널: 검정 곡선을 생성하는 데 사용된 수치 데이터가 포함된 표. 첫 번째 행은 검정 시료에 대해 기록된 5개의 전극 전위(mV)를 나열한다. 두 번째 행은 각 검정 시료에 대응하는 불소 이온 질량(ng F⁻)을 제공한다. 세 번째 행은 검정 확산 디쉬에 첨가된 10 mM NaF 표준 용액의 부피(µL)를 나열하며, 이 첨가된 불소 이온 질량은 확산 후 각 검정 시료에 포획된 질량과 동일하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

생체 시료 내 불소(F-) 농도 측정을 위한 본 프로토콜의 적용 사례를 보여주기 위해, 제어된 불소 처리 조건에 노출된 마우스에서 수집한 혈청, 뼈 및 하악 절치 시료로 검체를 생성하였습니다. 수컷 C57BL/6J 마우스를 청소년기(6주령)와 성체기(18주령)의 두 연령 그룹으로 나누고, 6주간의 노출 기간 동안 불소가 없는 탈이온수(0 ppm F⁻) 또는 불화나트륨이 첨가된 식수(125 ppm F⁻)를 제공하였습니다. 각 연령 및 처리 조건마다 5마리의 동물을 포함하였습니다. 노출 기간이 종료된 후 혈청, 대퇴골 및 하악 절치를 채취하였으며, 프로토콜에 따라 검체를 준비하고 분석하였습니다. 혈청, 뼈 및 치아에서 측정된 대표적인 불소 농도를 아래에 요약하였습니다.

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그림 4혈청, 대퇴골 및 하악 절치에서 측정된 불소 농도. 수컷 C57BL/6J 생쥐를 청소년기(6주령, 빈 막대)와 성숙기(18주령, 채워진 막대)의 두 연령군으로 나누어, 불소가 없는 탈이온수(0 ppm F)를 제공하거나⁻) 또는 불소나트륨이 첨가된 음용수(125 ppm F⁻) 6주간의 노출 기간 동안 처리하였습니다. 노출 기간이 종료된 후, 동일한 처리군으로부터 (A) 혈청, (B) 대퇴골, (C) 하악 절치에서 불소 수치를 측정하였습니다. 검출 한계 미만의 혈청 값(<(0.02 ppm)는 시각화를 위해 도식화하였으나 통계 분석에서는 제외하였다. 데이터는 평균값으로 나타내었다. ± 표준 편차(SD) 청소년 집단과 성인 집단 간의 비교는 다중 비교를 위한 Bonferroni-Dunn 교정을 적용한 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 수행되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01 (그룹당 N = 5). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

혈청 내 불소 농도
0 ppm 불소로 처리한 청소년군과 성체군 모두에서 혈청 불소 농도는 이온 선택성 전극의 검출 한계 미만(<0.02 ppm)으로 나타났다. 125 ppm 처리군의 경우, 혈청 불소 농도는 청소년군에서 0.3 ± 0.2 ppm으로, 성체군에서는 0.7 ± 0.2 ppm으로 증가하였다 (p = 0.06). 125 ppm 처리 청소년군과 성체군 간의 비교는 다중 비교를 위한 Bonferroni–Dunn 보정을 적용한 Mann–Whitney U 검정을 통해 수행되었다. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/그룹). 0 ppm 처리군은 통계 분석에서 제외되었다. (그림 4A, 표 1).

대퇴골 내 불소 농도
0‑ppm 처리군에서 대퇴골 불소 농도는 성체 동물(896 ± 55 ppm)에 비해 청소년기 동물(292 ± 39 ppm)에서 유의하게 낮았습니다 (p < 0.01). 반대로, 125‑ppm 처리군에서는 청소년기 동물의 불소 농도(4,108 ± 482 ppm)가 성체 동물(2,966 ± 612 ppm)보다 유의하게 높았습니다 (p = 0.04). 청소년기 그룹과 성체 그룹 간의 비교는 다중 비교를 위한 Bonferroni–Dunn 보정을 적용한 Mann–Whitney U 검정을 사용하여 수행되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/group). (그림 4B, 표 1). 그림 5A는 각 연령대별로 0‑ppm 처리 대비 125‑ppm 처리 시 대퇴골 불소 농도의 배수 변화를 보여줍니다. 청소년기 동물은 125 ppm에서 불소 수치가 14배 증가한 반면, 성체 생쥐는 3배 증가를 보였습니다.

하악 절치의 불소 농도
0 ppm 그룹에서 하악 절치의 불소 농도는 청소년기 동물(35 ± 4 ppm)이 성체 동물(123 ± 23 ppm)에 비해 유의하게 낮았습니다 (p = 0.03). 125 ppm 처리군에서 절치의 불소 농도는 청소년기 동물의 경우 5641 ± 955 ppm으로, 성체 동물의 경우 4392 ± 1694 ppm으로 증가했습니다. 청소년기 그룹과 성체 그룹 간의 비교는 다중 비교를 위한 Bonferroni–Dunn 보정을 적용한 Mann–Whitney U 테스트를 사용하여 수행되었습니다. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/그룹). (그림 4C, 표 1). 125 ppm에서의 절대적 불소 농도는 연령 그룹 간에 유의미한 차이가 없었으나, 0 ppm에서 125 ppm으로의 배수 변화(fold-change)는 성체 마우스(36배 증가)보다 청소년기 마우스(161배 증가)에서 유의하게 더 컸습니다 (그림 5B).

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그림 5: 청소년기 쥐는 성체 쥐보다 뼈와 절치 내 불소 축적의 배수 증가량이 더 크다. 0 ppm에서 125 ppm 불소 처리 시 청소년기 쥐(빈 막대)와 성체 쥐(채워진 막대)의 불소 농도 배수 변화. (A) 동일 처리군의 대퇴골 및 (B) 하악 절치. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다. 청소년기 그룹과 성체 그룹 간의 비교는 unpaired t-test를 사용하여 수행되었다. * p < 0.05, (N = 5/group). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

시료혈청대퇴골하악 절치
연령대청소년성숙한청소년성숙한청소년성숙한
처치군0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.72711114909
평균< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
표준 편차해당 내용이 제공되지 않았습니다. 번역할 원문 텍스트를 입력해 주세요.0.2해당 없음0.239482556123955231694

표 1: 혈청, 대퇴골 및 하악 절치에서의 개별 불소 측정치. 표 1은 0 ppm 또는 125 ppm의 불소에 노출된 청소년기 및 성체 마우스의 혈청, 대퇴골 및 하악 절치 표본에서 측정된 개별 불소 농도(ppm F⁻)를 나열한 것입니다. 각 조직 유형에 대해 데이터는 청소년기 0 ppm, 청소년기 125 ppm, 성체 0 ppm, 성체 125 ppm의 네 가지 처리 그룹에 해당하는 열로 제시됩니다. 각 열에는 기록된 5개의 개별 값(N = 5)과 그 뒤에 계산된 평균 및 표준편차(SD)가 포함되어 있습니다. 청소년기 0 ppm 혈청 그룹의 경우, 모든 기록된 값은 이온 선택성 전극의 검출 한계(<0.02 ppm) 미만이었습니다. 이 표는 그림 4에 제시된 요약 값과 통계적 비교의 근거가 되는 가공되지 않은 수치 데이터를 제공합니다.

토론

불소 측정은 란타넘 불화물(LaF₃) 결정 막이 포함된 불소 선택성 이온 선택 전극(ISE)을 사용하여 수행하였다38,39. 이 막은 매우 안정적인 La–F 결합을 형성하며, 그 결과 다른 할로겐화물보다 불소 이온에 대해 강한 선택성을 가진다. 확립된 전기화학 문헌 및 제조업체 사양에 따르면, LaF₃ 막은 염화물에 대해 매우 낮은 선택성 계수를 나타내며, 이는 본 프로토콜에서 사용된 조건하에서 염화물 이온이 측정 가능한 간섭을 일으키지 않음을 의미한다. 염화물은 치아와 뼈에 자연적으로 존재하지만, 그 활성은 전극 전위에 영향을 주지 않으며, 기록된 신호는 구체적으로 불소 활성만을 반영한다. 0.02 ppm의 하한 검출 한계는 Orion 불소 선택 전극에 대해 제조업체가 검증한 최소 정량 가능 농도에 해당한다. 이 한계는 전극이 안정적인 Nernstian 응답과 검정 곡선과의 선형 관계를 유지하는 최저 불소 농도를 나타낸다. 검출 한계는 전극 막의 특성에 의해 정의되고 제조업체에 의해 검증되었으므로 본 프로토콜을 위한 추가적인 실험적 결정은 필요하지 않았다. 다만, 상한 검출 범위와 관련하여, 저자들은 50 µL NaOH 트랩 내 불소 질량이 약 38,000 ng을 초과할 경우 전극 응답이 비선형적으로 나타나는 것을 관찰하였으며, 이는 매우 높은 불소 부하량에서는 검정 곡선을 더 이상 신뢰할 수 없음을 나타낸다. 이러한 비선형성은 ISE 자체의 고유한 상한선이라기보다, 주어진 실험 조건하에서 전극의 최적 이온 강도 및 활성 범위를 초과했기 때문일 가능성이 크다. 이 임계값 이상의 불소 질량이 포함될 것으로 예상되는 샘플의 경우, 전극의 선형 동적 범위 내에서 측정이 유지되도록 NaOH 트랩 부피를 늘리는 것이 권장된다.

불소 함량이 유난히 높은 샘플에 프로토콜을 적용할 때 이 점을 고려해야 합니다. 확산 단계에서 샘플 전체 부피가 소모되기 때문에, 생물학적 샘플에 대해 중복 측정 및 스파이크 회수(spike‑and‑recovery) 실험을 수행할 수 없었습니다. 분석의 정확도와 정밀도를 보장하기 위해, 기지의 불소 농도가 포함된 품질 관리(QC) 표준물을 모든 측정 시리즈에 포함하였습니다. 이러한 QC 표준물은 실험 샘플과 동일하게 처리 및 측정되었습니다. 모든 분석 과정에서 QC 표준물의 측정된 불소 농도는 예상 값의 5% 이내로 일정하게 유지되었습니다. 10~20개의 검체 샘플로 구성된 각 시리즈에 대해 5~6개의 교정 샘플로 이루어진 두 개의 독립적인 세트를 검체 샘플과 병행하여 준비하였으며, 매 측정 세션 전에 교정 곡선을 기록하였습니다. 교정 범위는 검체 유형, 확산 접시에 첨가된 물질의 질량, 동물의 처리군 및 연령에 따라 달라지는 검체 샘플의 예상 불소 질량에 근접하도록 각 분석마다 조정되었습니다. 혈청 측정의 경우, 교정 표준물은 검체 내 약 0.06–1.20 ppm의 불소 농도에 해당하였습니다. 뼈 및 치아 측정의 경우, 교정 표준물은 검체 내 약 19–7,600 ppm의 불소 농도에 해당하였습니다.

본 프로토콜은 hexamethyldisiloxane 촉진 확산 후 ISE 분석을 이용하여 혈청, 뼈 및 치아 내 불소 이온 질량을 정량화하는 민감하고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 이 방법은 다양한 생물학적 매질에서 방출된 불소를 안정적으로 포착하며, 통제된 노출 이후의 불소 축적량을 정량적으로 평가할 수 있게 합니다. 청소년기 및 성체 마우스의 대표적인 결과는 조직 전반에 걸쳐 불소 침착의 뚜렷한 연령 및 용량 의존적 차이를 보여주며, 이는 in vivo 불소 대사와 독성 동태학 연구에 있어 본 접근 방식의 유용성을 강조합니다.

이 프로토콜의 주요 장점은 불소 방출 반응과 불소 포집 환경을 물리적으로 분리하는 확산 접시(diffusion dish)를 사용한다는 점입니다. 페트롤라툼(petrolatum)으로 밀봉된 설계는 대기와의 교환을 최소화하며, 덮개 위에 놓인 수산화나트륨 액적에 의해 방출된 불소 이온이 효율적으로 포집되도록 보장합니다. HMDS로 포화된 황산은 뼈나 치아와 같이 고도로 석회화된 구조를 포함한 광물화 조직으로부터 불소가 방출되도록 강력하고 일관된 구동력을 제공합니다. 이후 확산 조건이 일치하는 표준물질로 보정한 ISE 측정법을 통해 넓은 동적 범위에서 정확한 정량이 가능합니다. 이 방법의 또 다른 장점은 매우 작은 생물학적 시료 내의 불소량을 정량할 수 있다는 것입니다. 마우스의 광물화 조직, 특히 하악 절치(mandibular incisors)는 치아당 회분(ash)이 3–5 mg에 불과합니다. 기존의 분석 방법들은 신뢰할 수 있는 검출을 위해 더 많은 시료 질량이나 더 높은 불소 함량이 필요한 경우가 많습니다. 반면, 확산 기반 설계는 전체 시료에서 방출된 모든 불소를 작고 정의된 부피 내로 농축시키므로, 절대적인 불소 질량이 낮은 매우 작은 시료에서도 정확한 정량이 가능합니다. 이러한 특징은 소형 동물 연구, 조직 가용성이 제한적인 경우 또는 미세 해부된 광물화 구조 연구에 특히 유용합니다.

본 방법의 주요 한계점은 본 연구에서 사용된 ISE의 검출 한계(0.02 ppm)입니다. 불소가 없는 대조군 동물의 혈청 샘플은 빈번하게 이 임계값보다 낮게 나타나, 극도로 낮은 불소 농도의 정량이 불가능했습니다. 검출 한계 근처 또는 그 이하의 미량 농도를 측정할 때는 가능하다면 확산 접시에 추가하는 시료의 질량이나 부피를 늘리거나, 대체 분석 기술이 필요할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 하룻밤 동안의 확산 과정과 부식성 시약의 세심한 취급이 필요하므로, 대량의 샘플을 처리하는 연구에서는 처리량이 제한될 수 있습니다. ISE는 전체적인 불소의 민감한 정량을 제공하지만, 조직 내의 공간적 분포는 평가할 수 없습니다. 미세 규모에서 거시 규모까지 불소 분포를 시각화하고 매핑하기 위해 에너지 분산형 X선 분광법을 결합한 주사 전자 현미경(SEM-EDX) 또는 입자 유도 감마선 방출(PIGE)과 같은 보완적인 접근 방식을 통합할 수 있습니다. 이러한 이미지 기반 방식은 무기질화 조직 또는 연조직 내의 국소적인 불소 축적 평가를 가능하게 하여, ISE 측정값을 보완하고 조직 내 불소 함량에 대한 보다 포괄적인 평가를 제공합니다.

본 프로토콜에서 불소 확산 및 측정의 정확도와 신뢰도에 영향을 줄 수 있는 몇 가지 반복적인 기술적 요인들이 있으며, 캘리브레이션 준비, 확산 접시 밀봉, pH 제어, 전극 성능 및 시료 취급이 종합적으로 데이터 품질을 결정한다는 점이 본 관찰 결과에서 강조되었습니다. 비선형 캘리브레이션 곡선(R2 < 0.99) 또는 조직 시료 측정값이 예상 범위를 벗어난 경우, 확산 접시에 첨가한 NaF 스톡 용액 부피의 계산 착오나 검정 표준물질 조제 과정에서의 피펫팅 오류가 원인일 수 있습니다. 권장 조치: 각 분석 시마다 최소 두 세트의 독립적인 검정 시료를 준비하여, 하나의 검정 곡선이 예상 범위를 벗어날 경우 백업 세트를 사용할 수 있도록 합니다. 확산 접시의 밀봉이 불완전하면 확산 과정 중 불소 손실이 발생하여 측정값이 인위적으로 낮게 나올 수 있습니다. 이는 일반적으로 확산 접시 뚜껑 테두리에 바셀린(petrolatum)을 충분히 도포하지 않았을 때 발생합니다.. 권장 조치: 확산 접시 뚜껑의 가장자리를 따라 바세린(petrolatum jelly)을 충분히 바른 후, 완전히 밀봉되도록 단단히 누릅니다. NaOH 트랩에 아세트산 용액을 첨가할 때 피펫팅 오류가 발생하면 시료의 pH가 최적 범위인 pH 5.0을 벗어날 수 있으며, 이는 불소 회수율의 부정확함으로 이어질 수 있습니다. 권장 조치: pH 시험지로 각 시료의 pH를 확인하고, pH 5 범위를 벗어나는 시료는 폐기하십시오. 검정 시료 또한 불소 선택성 전극의 유효 측정 범위를 벗어날 수 있습니다. 0.02 ppm 미만의 농도는 전극의 검출 한계 미만입니다. 권장 조치: 0.02 ppm 미만의 불소 함유 검정 시료는 사용하지 마십시오. 반대로, 불소 농도가 지나치게 높은 검정 시료는 용액의 이온 강도를 변화시켜 전극의 비선형 응답을 유발할 수 있습니다. 권장 조치: 프로젝트 시작 시, 사용 중인 특정 전극의 선형 작동 범위를 결정하기 위해 넓은 불소 농도 범위의 검정 표준 용액을 준비하십시오. 조직 시료가 이 선형 범위를 초과하는 경우, 조직의 질량을 줄이거나 NaOH 트랩의 부피를 늘리고, pH 5를 유지하도록 이에 맞게 아세트산 부피를 조정하십시오. 0.02–1 ppm 범위에서 선형 검정 곡선을 얻기 어려운 경우: 일반적인 원인은 전극의 노후화입니다. 오래된 불소 선택성 전극은 매우 낮은 불소 농도에서 감도가 떨어집니다. 권장 조치: 불소 선택성 전극을 교체하십시오. 전위차계 읽기 값이 불안정한 경우(신호 표류 또는 도약)는 일반적으로 전극의 감지 표면이 시료 용액에 완전히 잠기지 않았을 때 발생합니다. 권장 조치: 감지 표면이 액체 시료에 완전히 덮이도록 전극을 낮추십시오.

전반적으로, 본 프로토콜은 다양한 생물학적 매질 내의 불소 함량을 정량화하기 위한 견고한 검정 기반 접근법을 제공하며, 마우스 모델에서 불소 노출, 조직 침착 및 독성학적 결과를 조사하는 연구에 매우 적합합니다.

공개 사항

저자들은 이해관계의 충돌이 없음을 밝힙니다.

감사의 글

본 출판물에 보고된 연구는 일본학술진흥회; JSPS 해외연구원 펠로우십 202560528 (S.Y.), 상파울루 주 연구지원재단 (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.), 그리고 미국 국립보건원 국립치과 및 두개안면연구소; R01DE027648 (M.S.) 및 K02DE029531 (M.S.)의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
빙초산Sigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
알루미나 도가니애드밸류 테크놀로지외경 12 mm × 25 mm H, AL-6212AL-6212
분석용 저울VWRVWR 124B2, d = 0.1 mg—
비드 비터(Bead Beater)벤치마크BeadBug 6—
뭉툭한 팁 주사기 바늘아마존산업용 둔단 바늘, 14 G × 0.5인치X001TT8KX1
이산화탄소AirGas——
화학 흄후드Mott Manufacturing모델 7421040—
D(+)-자당Thermo Scientific생화학을 위한 99.7%177142500
전극 충전액Thermo ScientificOrion IonPlus 충전액900061
에틸 알코올 용액Koptec140 Proof2401
냉동고, −80 °CThermo ScientificRevco RDE 시리즈—
내열 장갑Fisher ScientificBel-Art Clavies 생물학적 위험물 오토클레이브용 장갑H13201
헥사메틸디실록산 (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
과산화수소VWRJ.T. Baker, 30%2204-01
이온 선택성 전극Thermo ScientificOrion 불소 이온 선택 전극(ISE), 2채널9609BNWP
마그네틱 믹서VWR360 교반기—
마이크로 스파출라아마존왁스 카빙 스파튤라 #7A, 스테인리스 스틸—
마이크로원심분리기Eppendorf5427R5404000131
회화로Thermo ScientificThermolyne 소형 벤치탑 머플 가열로, 1.3 L, FB1315MFB1315M
오븐Boekel ScientificBoekel RapidFISH240200
PBS 내 파라포름알데히드 용액Thermo ScientificPBS 내 4% 파라포름알데히드J19943-K2
페트리 접시VWR60 × 15 mm, 미처리25384-092
페트롤라툼Thermo Scientific정제 백색 페트롤라툼417090010
pH 지시 종이Fisher ScientificpH-Fix 4.5–10.092120.3
자기 접시Fisher ScientificFisherbrand 도가니, 5 mL, 높이 20 mm, 하이 폼(High Form)FB-965-B
전위차계Thermo ScientificOrion Dual Star pH/ISE 미터2115102
클램프가 장착된 링 스탠드VWR링 클램프, 15 cm470104-526
설치류 사료Bio-ServF1515, AIN-76A, ½ 펠렛F1515
시저 잭아마존실험실용 시저 잭—
분별 깔때기Fisher ScientificEisco, 붕규산 유리, 2 LS89285
염화나트륨Fisher ScientificACS 인증, 결정성S271-1
플루오르화나트륨Fisher ScientificACS 인증, 분말S299-100
수산화나트륨Fisher Scientific흰색 펠렛BP359-500
스테인리스 스틸 비드Fisher ScientificScientific Industries, 5 mm, 100개입SI-CS05
황산Fisher ScientificACS 등급A300-500
TISAB IIThermo ScientificOrion IonPlus 응용 솔루션940909
진공 데시케이터Fisher ScientificBel-Art Space Saver 진공 데시케이터, 10인치F42010-0000
진공 여과기Fisher Scientific플로우 보틀탑 필터, PES, 90 mm, 0.2 µm597-4520
가변형 로커 (Variable Rocker)중급 과학 (MidSci)LabDoctor / Benchmark Scientific—

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