실크 섬유 해면을 이용한 광학 영상을 위한 3D 세포 배양 기반 하이브리드 생물분석 플랫폼

요약

이 논문은 유동 배양을 지원하기 위해 유동 배양을 지원하기 위해 4T1-iRFP720 유방암 세포의 실크 스캐폴드 생산 및 배양을 위한 간단하고 접근 가능하며 재현 가능한 방법론을 설명합니다. 세포 성장과 이동은 생체 내 광학 영상 기기를 주요 비침습적 측정 도구로 사용하여 개념 증명으로 평가되었습니다.

초록

우리는 세포 특성의 전임상 평가를 위해 설계된 혁신적인 생물분석 하이브리드 플랫폼을 제시합니다. 이 시스템은 인공 세포외 기질 위에서 성장한 3차원(3D) 세포 배양과 크로마토그래피에서 영감을 받은 배열 구성을 결합합니다. 구조 단백질인 실크 피브로인으로 만들어진 해면은 생체 모방 세포외 기질이자 정지 상태 역할을 합니다. 실크 피브로인 스펀지는 원실 섬유에서 내재된 세리신 단백질을 제거한 후 용해와 투석을 거쳐 피브로인 용액을 정제하고, 유기 용매에 용해한 뒤, 이어서 염석 주조를 통해 500–800 μm의 제어된 다공성/기공 크기를 가진 실크 기반 스펀지를 만드는 다단계 공정을 통해 자체 생산되었습니다. 유전자 변형 유방암 세포주 4T1-iRFP720과 4T1-wt(비형광 대조)는 펌프를 통한 연속 배지 흐름을 이용해 실크 스캐폴드 내에서 배양하였으며, 이들의 세포 성장과 특성을 광학 영상 기법(생체 내 광학 영상 기기)으로 비침습적으로 분석하였습니다. 크로마토그래피 시스템의 주요 장점(자동화, 재현성)과 첨단 3D 세포 배양의 생물학적 중요성을 결합함으로써, 이 플랫폼은 조직과 유사한 구조와 형태학의 시험관 내 모델링을 가능하게 하면서 동적 세포 행동 모니터링을 용이하게 합니다. 동시에 의료 영상 기술의 적용은 세포 이동과 성장 등 다양한 요소를 실시간으로 장시간 모니터링할 수 있게 합니다. 이 접근법은 층류 유사 시스템에서 거시적 규모에서 세포 행동을 연구하는 데 상당한 잠재력을 제공합니다. 시험 관 내 모델의 생리학적 관련성을 향상시킴으로써, 이 방법은 생체 내 연구와의 번역 격차를 메우는 데 도움을 줄 수 있으며, 동물 실험의 'reduce, replace, refine(3R)' 프레임워크와도 일치합니다.

서론

살아있는 조직에서 세포의 이동과 성장은 3차원적이고 이질적인 세포외기질(ECM) 내에서 발생하며, 간질액 흐름과 세포 간 상호작용과 같은 생물리적·생화학적 신호에 의해 유도됩니다. 이 인자들은 세포 극성, 기계전도, 그리고 조정된 움직임을 조절하여 조직 복구와 암 침투 등 주요 생물학적 과정을 뒷받침합니다 1,2,3,4.

중요함에도 불구하고, 스크래치 및 트랜스웰 검사와 같은 대부분의 시험관 내 이동 분석은 평평하고 정적인 기판 위의 단일 세포 이동을 평가합니다. 이 2D 접근법은 간단하고 비용 효율적이지만, 생체 미세환경의 구조적·동적 특성을 제대로 재현하지 못합니다 ^5,6. 이 한계는 암 전이의 맥락에서 특히 중요해지는데, 종양 세포가 기계적·화학적으로 다양한 조직 매트릭스를 통해 집단적으로 이동하는 경우입니다 ^3,7,8. 2D 스크래치 분석은 수행이 쉽기 때문에 여전히 인기가 있지만, ECM의 복잡성이나 유체^{흐름 6}의 효과를 반영하지는 못합니다. 트랜스웰 기반 접근법은 정량적 판독을 제공하지만, 고정된 종점에서만 제공되어 이동의 연속적 관찰을 방지합니다 ^6,9.

최근 연구들은 간질적 흐름이 전이 가능성을 증가시키는 반면, ECM의 강성과 조성은 상피-간엽 전이와 집단 이동을 촉진한다는 것을 보여주었다 ^4,10. 스포로이드와 오가노이드와 같은 더 발전된 3D 시스템은 네이티브 ECM 환경을 더 잘 근사합니다; 그러나 이들의 사용은 종종 변동성, 제한된 실험 접근성, 표준화된 분석의 어려움에 의해 제한된다^11,12. 마이크로유체 플랫폼은 기계적 및 유체 조건에 대한 우수한 제어를 제공하지만, 특수 제작 방법과 장비에 의존하기 때문에 광범위한 사용이 제한됩니다^. 따라서 이러한 통합 신호를 통제되고 접근 가능하며 비침습적이고 비용 효율적인 방식으로 시험관 내에서 재현하는 것은 여전히 큰 도전 과제입니다 ^5,14.

이러한 도전 과제를 해결하고 기존 2D 분석과 복잡한 생체 내 모델 간의 간극을 메우기 위해, 우리는 실크 섬유소 해면 스캐폴드를 기반으로 한 간단한 흐름 기반 3D 세포 플랫폼을 개발했습니다. 이 시스템은 ECM과 유사한 비계로 기계 특성을 조절하는 실크 스펀지를 사용합니다. 실크는 부드러운 관류를 가능하게 하고 생리학적으로 중요한 간질^{성 흐름을} 지원하는 다공성 구조 때문에 선택되었습니다. 생체 적합성과 생의학 및 조직공학에서의 확고한 사용은 이 분야에 적합한 재료입니다. 최근 발표된 자료는 비계의 환경 지속 가능성과 재활용 잠재력을 더욱 입증했습니다¹⁶. 또 다른 연구에서는 양전자 방출 단층촬영(PPT)과 같은 다양한 영상 방식에 대한 적응성을 추가로 보여주^{었습니다.} 이 이전 연구는 동일한 플랫폼 개념을 바탕으로 생 체 내 광학 영상 기반 구성을 단순화한 방법론 설명의 기초가 되었습니다. 이 연구들은 이 시스템이 다중 모달 영상 기반 엔지니어링 조직 구조물 평가 가능성을 입증하며, 다양한 암세포 모델 전반에 걸쳐 시험 관 내 배양 및 생체 관련 측정값을 통합하는 다목적 실험 플랫폼으로서의 사용을 뒷받침합니다.

개념 증명으로, 우리는 두 가지 저전단 스트레스 흐름 조건 하에 비계 내에서 iRFP720 표지된 4T1 삼중음성 유방암 세포를 5일간 배양했습니다. 비침습적 생체 광학 영상 모니터링은 정적 대조군과 비교했을 때 유동 방향 성장 패턴과 세포 집단 역학의 유의미한 변화를 발견했습니다. 공학적 단순성과 재현성을 강조함으로써, 이 모델은 2D 검사와 생체 내 연구 사이의 실질적인 다리를 제공하며, 연구자들이 거시적 규모에서 비침습적으로 생리학적으로 관련성 있으면서도 접근 가능한 형식으로 흐름 매개 세포 특성을 조사할 수 있게 합니다. 파괴적 종점 분석에 의존하거나 표준화된 시딩 기준이 부족했던 이전 방법론과 달리, 이 프로토콜은 스캐폴드 생산을 최적화하고 이어서 세포 시딩과 영상화를 위한 체계적인 프레임워크를 도입합니다. 이 접근법은 실험적 견고성을 높이고 3D 행렬 내 집단 세포 역학에 대한 보다 포괄적이고 종단적인 관점을 제공하여 기존 성장 및 이동 모니터링 방법에 비해 상당한 개선을 의미합니다.

프로토콜

첫 번째 섹션은 이전 출판 연구를 바탕으로 실크 섬유 섬유인 비계 준비 과정을 개괄합니다.¹⁶. 이후 섹션에서는 세포 시딩 밀도 최적화, 유동 통합, 세포 이동 및 성장 모니터링을 위한 광학 영상 통합에 대해 설명합니다. 본 연구는 확립된 마우스 유방암 세포주(4T1-wt 및 4T1-iRFP720)만을 사용하여 인간 참가자, 환자 샘플, 1차 조직, 또는 살아있는 동물을 포함하지 않았습니다. 기관 및 국가 지침에 따라 윤리적 승인은 필요하지 않았습니다. 워크플로우의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 실크 피브로인 스펀지 제조

1. 고치 청소와 끈 제거.
   1. 안전메스로 누에( Bombyx mori L. )의 고치를 자르세요.
   2. 유충을 제거하고 표준 해부 바늘을 사용해 유충 구간을 직접 둘러싼 가장 안쪽 고치층을 추출합니다.
   3. 비커에 1.6L 이중 증류수(ddH₂O)를 채우세요.
   4. 자석 교반봉을 넣고 저으면서 물을 끓이게 하세요; 비커를 알루미늄 호일로 덮어 가열 속도를 높이고 물 손실을 줄이세요.
   5. 수온이 약 70 °C에 도달하면 Na_2CO3 3.4g을 추가하세요.
   6. 혼합물이 끓기 시작하면 준비된 고치 4g을 용액에 넣고 유리봉으로 저어줍니다.
   7. 고치를 30분간 끓이고, 10분마다 유리봉으로 저어 적절히 노출되도록 하세요.
   8. 용액에서 실크를 제거하고 수돗물로 여러 번 헹구어 남은 세리신을 제거합니다.
   9. 과도한 물을 짜내고 실크 섬유를 준비된 알루미늄 호일 접시 위에 펴 놓으세요.
   10. 실크 섬유를 50°C에서 예열한 오븐에서 완전히 건조할 때까지 (약 18시간) 건조합니다.
2. 해체 및 투석
   1. 다음 단계에서는 절대 에탄올과 무수_CaCl2 를 사용하세요. 용해 기진은 CaCl₂ 1부, 에탄올 2부, ddH₂O 8부로 구성됩니다. 건조 디검 실크와 용해체 매트릭스의 비율은 1:10 [w/w]입니다.
   2. 건조된 실크를 무게로 재고, 용해 매트릭스에 적합한 성분 양을 계산합니다.
   3. 저어주는 바가 장착된 둥근 바닥 플라스크에 해당 양의_CaCl2 를 채웁니다.
   4. 필요한 에탄올과 ddH_2O를 측정하고 혼합하세요.
   5. 저으면서 에탄올-ddH₂O 혼합물을 CaCl₂ 에 넣으세요.
   6. 역류 장치를 설치하고 혼합물을 오일 목욕에서 100 °C까지 가열하여_CaCl2 가 녹아 혼합물을 끓이게 합니다.
   7. 혼합물이 끓기 시작하면 말린 실크를 넣고 45분간 리플럭스 가열합니다.
   8. 15cm 길이의 3.5 kDa 셀룰로오스 투석관을 물로 여러 번 헹구어 수분을 보풀고, 한쪽 끝을 밀봉 클립으로 유리봉에 감아 고정하세요.
   9. 끓인 후에는 뜨거운 실크 용액을 튜브에 옮기고, 반대쪽 끝을 클립으로 밀봉하여 액체와 밀봉 클립 사이에 2–3cm 간격을 두고, 공기 차단 없이 밀봉합니다.
   10. 채워진 투석관을 ddH_2O가 채워진 2L 비커에 넣고, 실온에서 72시간 동안 투석하며, 효과적인 정수를 위해 하루 두 번 물을 갈아줍니다.
   11. 용액을 4500 × g 에서 실온에서 10분간 원심분리합니다.
   12. 상청액을 펠릿을 방해하지 않고 원심분리관에 부드럽게 붓고, 튜브를 -20 °C에서 보관합니다.
       참고: 원심분리기 튜브를 용량의 절반 이하로 채우고 수평으로 냉동하세요.
3. 냉소건조
   1. 진공 펌프를 20분간 예열한 후 제조사 지침에 따라 동열기를 작동시키세요.
   2. 냉동된 원심분리기 튜브를 냉동고에서 바로 꺼내 둥근 바닥 플라스크에 넣으세요.
   3. 플라스크를 동연제에 연결하고 24시간 동안 동결 건조하세요.
   4. 추가 사용 전까지는 동결 건조된 실크 피브로인을 실온의 건조한 곳에 보관하세요.
4. 용매 주조 및 입자 침출
   1. 흡기 후드 아래 소변 샘플 용기에 필요한 양의 동성 건조 실크를 1,1,1,1,3,3,3,3-헥사플루오로이소프로판올(HFIP)에 첨가하면, 최종 부피 30mL의 16% [w/v] 용액을 얻고 뚜껑으로 용기를 닫습니다.
      주의: HFIP는 흡입, 섭취 또는 피부를 통해 흡수될 경우 부식성이 강하고 해롭습니다; 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용한 채 연기통에서 용매를 다루고, 피부, 눈, 증기와의 접촉을 피하세요. 유출 시 흡수성 물질을 사용해 액체를 수집하고 영향을 받은 부위를 청소하세요. 오염된 물질을 지정된 유해 폐기물 용기로 옮기세요.
   2. 용기를 단단히 밀봉한 후 70rpm으로 궤도 셰이커에 18시간 동안 올려 실크가 녹도록 하세요.
   3. 다양한 메시를 사용해 NaCl을 체로 체로 내고 500–800 μm 비율을 따로 설정했습니다.
   4. 페트리 접시(직경 9cm, 바닥 지름 8.5cm)에 체로 체로 낸 소금 100g(500–800 μm 분열)을 채우면 높이 1.2cm가 됩니다. 표면이 고르게 평평한지 확인하세요.
   5. 준비된 실크 용액 25.5mL를 소금 층(스펀지 기공 형성을 위한 포로겐)에 부드럽게 부어줍니다.
   6. 페트리 접시에 뚜껑을 덮고 70rpm으로 궤도 셰이커에 10분간 올려 실크 용액이 소금층에 균일하게 침투되도록 하세요.
   7. 페트리 접시를 37°C에서 뚜껑을 닫고 1시간 동안 부화시키세요; 그 후 37°C에서 덮개를 벗은 페트리 접시를 추가로 18시간 더 부화시킵니다.
   8. 베타 시트 형성을 유도하기 위해 실크 복합재를 메탄올이 담긴 비커에 20분간 담갔다가 꺼내 50°C(약 1시간) 오븐에 건조합니다.
      주의: 메탄올은 매우 독성이 강합니다; 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 연기구 내에서 다루고, 피부 접촉과 증기 노출을 피하세요. 유출 시 흡수성 물질을 사용해 액체를 수집하고 영향을 받은 부위를 청소하세요. 오염된 물질을 지정된 유독성 폐기물 용기로 옮기세요.
   9. 실크 복합재를 따뜻한 수돗물이 담긴 비커에 최소 3시간 담그고, 20–30분마다 물을 교환하여 단단한 부분이 남지 않고 부드럽고 스펀지 같은 질감을 얻을 때까지 포로젠 NaCl을 제거합니다.
   10. 실크 스펀지는 4°C에서 소독 및 단기 보존을 위해 70% 에탄올에 보관하세요.
       참고: HFIP 함유 용액은 할로겐화 용매 폐기물로 수집되었으며, 메탄올 폐기물은 기관 화학 안전 지침에 따라 비할로겐 유기 용매 폐기물로 별도로 처리되었습니다. 사용 후 오염 제거를 위해 HFIP 또는 메탄올에 노출된 용기와 작업면은 호환 가능한 용매로 헹구고 세제 용액으로 세척했습니다. 초기 세척과 오염된 소비품은 화학 유해 폐기물로 수집되었습니다.

2. 비단 비계 준비 및 평형

1. 6mm 직경의 생검 펀치를 사용해 6mm 직경과 12mm 높이의 원통형 스캐폴드를 얻습니다.
   참고: 준비된 실크 피브로인 스펀지 스캐폴드는 70% 에탄올에 4°C에서 최대 4개월간 보관할 수 있습니다; 장기 보관의 경우, 정기적으로 신선한 에탄올로 교체하는 것이 권장됩니다. 평형 스캐폴드는 4°C의 세포 배양 배지에 최대 1개월간 보관할 수 있습니다.
2. 샘플을 70% 에탄올이 담긴 원심분리관에 넣어 소독하세요.
3. 오염을 방지하기 위해 인증된 생물학적 안전 캐비닛에서 다음 단계를 수행하세요.
4. 핀셋으로 스펀지를 누르면서 피펫으로 에탄올을 흡입하세요.
5. 스펀지를 10–20mL 보충제가 포함된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640 배지가 담긴 페트리 접시에 넣어 완전히 담가세요.
6. 매체를 세 번 교환하며 각 교환 사이에 약간의 흔들림을 가하세요.
7. 세 번째 세척 후에는 새 매체를 넣고 뚜껑을 단단히 닫은 뒤 파라핀 필름으로 감싸세요.
8. 스펀지는 세포 배양에 사용하기 전에 최소 1주간 4°C에서 냉장고에 보관하세요. 이 기간 동안 미디어를 4–5번 교환하세요.
   참고: 잔류 에탄올은 세포독성이 있어 세포 부착과 생존력을 저하시키므로 에탄올을 완전히 제거해야 합니다.

3. 배경 측정 및 영상 최적화

1. 빈 광학 투명 여과관과 씨앗이 없는 실크 스캐폴드가 포함된 광학 투명 여과관을 생체 내 광학 영상으로 운반합니다.
   참고: 영상은 2D 후형형광 모드의 생체 내 광학 영상을 사용하여 수행되었습니다.
2. 서로 다른 필터 쌍(여기: 675 nm, 745 nm; 방출: 720 nm, 800 nm), 노출 시간(4–60초), f-스톱 수(1–8), 시야각(13.5–22.5 cm), 다양한 램프 레벨(저 및 고) 이미징을 수행합니다.
3. 세포 시드 스캐폴드를 사용하기 전에 동일한 조건에서 두 플랫폼을 이미징하여 자가형광을 평가합니다.
4. 이미지 전용 설정에서는 수컷 루어 락 인렛을 컷오프 암컷 루어 락 커넥터로 교체하여 수컷 루어 락 커넥터에서 발생하는 고강도 자가형광 인디팩트를 제거하세요. 모든 실험에서 재료가 동일할 경우, 이 단계는 단 한 번만 필요합니다.
    

4. 세포 현탁액 준비 및 실크 섬유형 스캐폴드에 시딩하는

참고: 이후 모든 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 멸균 환경에서 수행해야 하며, 이 절차들은 생세포와 세포 포함 샘플을 다루는 것을 포함합니다.

1. 4T1 야생형(4T1-wt) 및 4T1-iRFP720 쥐 삼중음성 유방암세포를 정기적으로 관찰하여 오염 여부와 iRFP720 발현의 안정성을 확인하라.
2. RPMI-1640 배지에 10% 태아 송아지 혈청, 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충한 상태에서 5%_CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 RPMI-1640 배지에 4T1-wt 및 4T1-iRFP720 마우스 삼중음성 유방암 세포를 유지합니다.
3. 약 80% 합류 지점에서 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 표준 무균 세포 배양 절차를 따르는 통과 세포.
4. 모든 비교 실험에서 4T1-wt와 4T1-iRFP720 세포에 대해 동일한 통과 번호와 배양 조건을 사용하세요.
5. 세포 시딩 밀도는 5 × 10 4에서 5 × 10⁷ cells/mL 범위(200 μL당 1 × 10 4에서 1 × 10⁷ 세포 범위에 해당합니다). 영상 분석을 위해 다음 농도를 준비하여 다양한 세포 밀도에서 신호 강도를 평가하고 최적의 농도를 결정합니다: 5 × 10⁴, 3.38 × 10⁵, 6.25 ×^{10 5}, 1.25 × 10⁶, 2.5 ×^{10 6}, 3.75 × 10⁶, 5 × 10⁶, 1.25 × 10⁷, 2.5 × 10⁷, 그리고 5 × 10⁷ 세포/mL.
6. 4T1-wt 세포와 4T1-iRFP720 세포와 동일한 농도 범위의 해당 현탁액을 준비하여 비형광 대조군으로 사용할 것입니다.
7. 섹션 2에서 준비한 개별 비계를 멸균 처리되지 않은 페트리 접시에 배치하세요.
   참고: 플라스틱 표면에 부착되는 세포를 최소화하고 실크 스캐폴드에 부착을 촉진하기 위해 처리되지 않은 페트리 접시를 사용하세요.
8. 각 비계 주변과 비계에서 피펫을 사용해 과도한 매질을 제거하며, 구조가 변형되지 않도록 주의하세요.
9. 각 비계의 상단 표면에 적절한 셀 현탁액 200 μL를 직접 피펫으로 주입하여 전체 부피가 비계에 흡수되도록 합니다.
10. 세포 부착을 위해 접시를 방해하지 않고 37°C의 가습 인큐베이터에서 4시간 동안 배양합니다.
11. 4시간 후, 각 세포 시드 스캐폴드를 24웰 플레이트의 웰에 조심스럽게 옮기고, 1mL의 예열된 완전 배지를 넣습니다.
12. 5%_CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤(16–24시간) 배양합니다.

5. 프릿을 이용한 보정 플랫폼 조립

참고: 생물학적 안전 캐비닛에서 모든 조립 단계는 멸균 장갑, 멸균 핀셋, 멸균 도구를 사용하여 수행하세요.

1. 멸균 핀셋을 사용해 24웰 플레이트에서 세포 씨앗이 쌓인 실크 비계를 제거하고, 각 비계를 부드럽게 지지하여 압축을 방지하세요.
2. 멸균 컬럼 푸시봉을 사용해 광학 투명 고상 추출관 하단에 세포 시드 스캐폴드 하나를 삽입합니다.
3. 푸시로드를 사용해 무균 폴리에틸렌 프릿 하나를 비계 바로 위에 놓습니다.
   참고: 폴리에틸렌 프릿은 신호 최적화 시에만 사용하세요. 폴리에틸렌 프릿의 기공 크기가 셀 직경보다 작아 세포 이동이나 다른 세포 간 접촉을 방지합니다. 이로 인해 신호 분리가 명확하게 이루어져 각 신호에 대응하는 정확한 셀 농도를 식별할 수 있습니다.
4. 스태킹 순서를 반복하여 한 개의 스캐폴드 뒤에 한 개의 프릿을 추가하여 다섯 개의 세포 시드 스캐폴드와 다섯 개의 프릿이 삽입될 때까지 반복합니다.
5. 여과 튜브 바닥을 멸균 암컷 루어 락 커넥터로 닫으세요.
6. 추출관 상단을 멸균 수컷 루어 락 커넥터로 닫으세요.

6. 프릿을 이용한 보정 플랫폼을 이용한 생체 광학 영상 기기에 의한 신호 최적화 (시스템 검증을 위한 한 번만 사용)

1. 형광 세포를 광표백으로부터 보호하기 위해 보정을 위한 세포 시드 플랫폼을 생체 내 광학 영상실로 운반합니다.
2. 기관 안전 및 운영 절차에 따라 생체 내 광학 영상을 준비하세요.
3. 조립된 세포 시드 플랫폼을 영상 스테이지에 올려놓습니다.
4. 675 nm 여기와 720 nm 방출을 이용해 2D 에피형광 이미지를 획득하고, 노출 시간, 비닝 팩터, f-넘버 등 영상 매개변수를 최적화하여 선형 검출 범위 내에서 최대 신호 강도를 달성할 수 있습니다( 보완 그림 1 및 보충 그림 2 참조).
5. 비형광 기준 대조군으로 4T1-wt 세포를 시딩한 스캐폴드를 포함한 최소 하나의 광학 투명 추출관을 포함하여 비형광 참조 대조군으로 포함하세요.
6. 형광 강도의 정량적 비교를 가능하게 하기 위해 동일한 채취 설정을 사용하여 모든 샘플의 이미지를 획득하세요( 보완 그림 3 및 보충 그림 4 참조).
7. 생 체 내 광학 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 형광 신호를 정량화하고, 포화 없이 최대 신호를 제공하는 최적의 세포 시딩 밀도(즉, 스캐폴드당 5개 × 10개⁶개 셀)를 결정합니다( 보충 그림 5 참조).
   참고: 최종 생체 내 광학 영상 시스템 설정은 시스템의 선형 동적 범위 내에서 신호 획득을 보장하고, 스캐폴드 용량 포화를 피하며, 실험 및 제어 조건 전반에 걸쳐 안정적인 신호 대 배경 비율을 유지하기 위해 최적화 실험을 기반으로 선정되었습니다. 최적화된 설정을 바탕으로, 모든 실험용 생물반응기에는 6^{개의 6셀} 5개× 개를 설치하세요. 다음 설정으로 2D 후형형광 모드에서 영상을 수행하세요: 여기: 675 nm (대역폭 30 nm); 방출량: 720 nm (대역폭 20 nm), 노출 시간: 10초, 비닝 계수: 8, f-수: 8.

7. 실험용 플랫폼 조립 (프리트 없음)

1. 신호 최적화 후, 결정된 최적 셀 밀도(예: 5 ×^{10 6} 셀/200 μL, 4절 참조)로 실험용 스캐폴드를 시딩합니다.
2. 세포 소통을 가능하게 하기 위해 폴리에틸렌 프릿이 없는 4개의 빈 실크 스펀지 총 5개를 사용하여 실험 플랫폼을 조립합니다.
3. 여과 튜브 상단을 멸균 수컷 루어 락 커넥터로 밀봉하세요.
4. 정적 또는 동적 배양 조건에 맞게 배양 시스템을 구성하세요
   1. 정적 배양: 하단 포트를 멸균된 암컷 루어 락 커넥터로 밀봉하세요. 그 후 시스템은 헐거운 뚜껑이 있는 원심분리기 튜브에 넣습니다.
      참고: 수컷 루어 락에는 개구부가 있어 오염 위험을 최소화하면서 가스 교환이 가능합니다. 이 방식에서는 미디어를 하루에 한 번 후드에서 수동으로 교환합니다.
   2. 동적 배양: 하단 포트를 멸균 튜브에 연결하고, 입구 라인을 상단 포트의 남성 루어락에 연결하여 관류 배양을 가능하게 합니다. 연동 펌프 시스템을 사용하여 매체를 지속적으로 공급하고 제거하세요(보완 그림 6).

8. 플랫폼 내 역동적인 문화

1. 펌프와 관련 튜빙을 최대 유량으로 70% 에탄올로 10분간 세척하여 소독을 시작하세요.
2. 펌프와 튜빙을 멸균 완전 배지로 최소 10분간 헹구어 잔류 에탄올을 제거하세요. 새로운 배지를 교체하고 사용 전 완전한 시스템 평형을 위해 추가로 10분 더 관류를 진행하세요.
   참고: 세포 시딩을 하기 전에 모든 성분이 배지로 완전히 채워지고 기포가 없는지 확인하세요.
3. 조립된 반응기의 수컷 루어 락 입구(상단)를 무균 튜빙과 루어 락 커넥터를 사용해 펌프의 출구 라인에 연결합니다.
4. 펌프 입구를 완전 매체가 담긴 무균 저장소에 연결하세요.
5. 반응기 출구(하단)를 매체 저장소에 연결하여 재순환 관류 루프를 설정하세요. 이 구성은 폐쇄 루프 시스템을 유지하면서 비계를 통해 매질을 연속적으로 주입할 수 있게 합니다.
   참고: 이 프로토콜에서는 순환 구성을 사용하여 관류가 수행되며, 매질이 저장소와 원자로 사이를 지속적으로 순환합니다. 이 방법은 중간 소비를 최소화하면서 지속적인 흐름을 유지할 수 있습니다.
6. 펌프에서 목표 유량을 목표 벽 전단 응력(예: 1 dyn/cm² 및 4 dyn/cm²)을 설정하며, 푸아수이 유량¹⁹ 가정에 기반한 채널 내부 반경( = 3 mm)을 사용한다:
   
   여기서 τ는 벽 전단 응력(dyn/cm²), Q는 체적 유량(cm³/s)이며, 이는 RPMI-1640 매질의 유체 점도(0.958 × 10-3 N·s/^{m 2}, 37 °C)입니다²⁰. 실제 시스템은 다공성 실크 스캐폴드를 포함하고 있어 이상화된 기하학과는 다르지만, 계산된 값은 유동 조건 간 재현 가능한 비교를 가능하게 하는 표준화된 운영 기준으로 사용되었습니다. 해당 유량은 분당 0.133 mL와 분당 0.531 mL였으며, 배양 관류 조건으로 사용되었습니다.
7. 관류를 시작하고 누출, 기포 형성, 안정적인 흐름을 모니터링하세요.
8. 이동 억제제 또는 시험 화합물(예: 쿠커비타신 E(CuCuE))을 0.05 μmol/L 완전 배지 내 관류 또는 무관류(대조군)로 시작하고, 전체 세팅을 5%_CO2 가습 인큐베이터에서 최대 5일간 37°C에서 유지합니다. 따라서 펌프 입구를 해당 시험 화합물을 포함한 완전 매체가 포함된 무균 저장소에 연결하고, 이전에 사용한 것과 유사한 설정으로 펌프를 시작하세요.
   참고: 정의된 매체 플러싱 단계를 수행하여 펌프와 튜빙에서 에탄올을 완전히 제거하세요. 셀 시드 반응기에 연결하기 전에 세척 후 초기 배지를 버리고, 시스템이 신선한 배지로 완전히 채워지고 기포가 없도록 하세요.

9. 실험 플랫폼의 형광 영상

1. 펌프를 멈추고, 모든 튜브를 분리하면서 무균 상태를 유지하세요.
2. SPE 튜브 하단을 암컷 루어 락 커넥터로 밀봉하고, 시스템 전체를 멸균된 50mL 원심분리관에 넣은 뒤 튜브를 단단히 닫아야 합니다.
3. 시스템을 생물안전 캐비닛으로 옮겨 모든 후속 단계를 계속하세요. 후드 내부에서는 수컷 루어 락 커넥터를 잘라진 암 루어 락 커넥터로 교체하여 시스템을 완전히 닫아야 합니다.
4. 밀봉된 시스템을 멸균된 50mL 원심분리관에 다시 넣고 튜브를 안전하게 닫아 운반하세요.
   참고: 실험실 조건에 따라 시스템이 꽉 조여져 있을 때는 영상 촬영을 위해 흐름을 멈출 필요가 없습니다. 그러나 주어진 실험 환경에서는 이것이 불가능했습니다.
5. 밀폐된 원자로를 광표백으로부터 보호하기 위해 빛이 차단된 어두운 상자 안의 생체 내 광학 영상 시스템실로 운반합니다.
6. 반응기를 적절한 홀더에 생 체 광학 영상 시스템 단계에 배치합니다.
7. 이전에 최적화된 매개변수(예: 여기 675 nm, 방출 720 nm, 노출 시간 10초, 비닝 8, f넘버 8)를 사용하여 2D 후반형광 이미지를 획득합니다.
8. 각 영상 세션마다 4T1-wt 시드 스캐폴드, 비시드 스캐폴드, 그리고 빈 원자로 제어 장치를 포함하세요.
9. 생 체 내 광학 영상 분석을 이용해 형광 신호를 정량화합니다.
10. 대조군과 처리군의 정량적 결과를 그래프로 작성하고, 테스트 화합물이 측정된 결과에 미치는 영향을 시각화하기 위해 비교 그래프를 생성합니다.

10. 실험 플랫폼의 이미지 분석

1. 0일차, 3일차, 5일차에 형광 이미지를 획득하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용해 분석합니다.
2. 각 이미지에 대해 분석 전에 공간 보정을 수행하세요. 선 도구를 사용해 실험 플랫폼의 알려진 물리적 길이를 픽셀 단위로 측정하고, Analyze > Set Scale 을 통해 해당 실제 거리(85 mm)를 입력하여 픽셀 대 길이 변환을 정의합니다.
3. 보정 후에는 자유 선택 도구를 사용해 관심 영역(ROI)을 수동으로 표시하여 형광 면적을 정량화합니다.
4. 사용자 편향을 최소화하기 위해, 배경에 대한 형광 신호 강도에 기반한 일관된 시각적 기준을 사용하여 ROI를 구분합니다. 모든 분석을 동일한 환경에서 수행하고, 가능하면 단일 훈련된 운영자가 분석을 수행하도록 하십시오.
5. 형광 신호를 생체 내 광학 영상 분석 소프트웨어 이미지에서 어두운 배경과 명확히 구별되는 밝은 영역으로 식별하고, 이 신호를 사용해 일관된 수동 분할을 안내합니다.
6. Analyze > Measure를 사용하여 선택한 지역을 측정하고, 각 시점별 지역 값을 기록하세요. 이 과정을 모든 실험군의 모든 이미지에 대해 반복합니다.
7. 스프레드시트 소프트웨어를 사용해 각 샘플의 해당 0일차 값으로 면적 측정값을 정규화하여 초기 크기 차이를 반영하고, 결과를 기준선 대비 접힘 변화(Day 0 = 1)로 표현합니다.

11. 통계 분석

1. 모든 실험을 최소 3부로 수행하세요.
2. 모든 실험을 최소 세 번(n = 3) 반복하고, 평균값과 표준편차(SD)를 산출하세요.
3. 2원 ANOVA를 사용한 후 α = 0.05의 Tukey's 다중 비교 검정을 사용하여 통계적 유의성을 결정합니다.

결과

이 프로토콜은 생리학적으로 중요한 3D 환경에서 세포 성장과 움직임을 거시적으로 관찰할 수 있는 사용자 친화적이고 저비용 플랫폼을 설명합니다. 이 방법은 실크 피브로인 스펀지를 ECM 모방으로 사용하며, 조절된 간질적 흐름을 통합하여 동적 조직 상태를 모델링합니다. 실크 스펀지 및 스캐폴드 제작부터 세포 시딩, 실험 플랫폼 조립에 이르기까지의 단계별 절차에 대한 도식적 개요가 그림 1에 나와 있습니다.

초기에는 실크 피브로인 비계를 생산해야 했고, 에탄올에 오랫동안 보관할 수 있었습니다. 실크, 특히 실크 피브로인은 조직공학 분야에서 중요한 역할을 하고^{있습니다.} 높은 강도, 우수한 생체 적합성, 조절 가능한 생분해성, 낮은 염색 반응 위험과 같은 독보적인 특성 덕분에, 실크 피브로인은 연구 및 의학 분야에서 다양한 용도로 도...

토론

이 프로토콜에서 설명된 실크 스펀지 생산 공정은 표준화되어 있어^{이전 연구에서} 보고된 대로 재현 가능한 비계 제작을 보장합니다. 염층 높이/양, 실크 용액 부피, 메탄올 배양 등 완전히 표준화된 조건에서 스펀지를 생산하는 것은 균일하고 비교 가능한 스펀지를 얻기 위해 매우 중요합니다. 생산된 해면은 앞서 발표된 품질 관리 프로토콜 기준을 따라야^합니다. 단기적으로, 스펀지는 침대 높이 12mm, 기공 크기 500–800 μm, 직경 6mm 샘플의 건조 중량 10–15 mg, 하드 탑의 부재, SEM을 사용해 결정된 균일한 다공성 구조 등의 기준을 충족해야 합니다. 스펀지의 기공 크기를 표준화하기 위해, 유럽 약전(European Pharmacopeia)에 따라 크기 배제 망을 사용해 포로젠을 체로 걸러내어 500–800 μm 사이의 분량만 받았습니다. 검증을 위해 SEM 이미지가 처리되고...

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol (HFIP)	Sigma-Aldrich	8.04515	주의: 위험. 동결건조 실크의 용해에 사용
24웰 플레이트	Cellstar, Greiner Bio-One	662102	배양 중 세포 씨앗 스캐폴드의 저장
4T1-iRFP720 마우스 삼중 음성 유방암 세포	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), University of Vienna	N/A	세포 배양 실험; 4T1-iRFP720은 부모 4T1(ATCC: CRL-2539)에서 내부적으로 유도됨
4T1-wt 마우스 삼중 음성 유방암 세포	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), University of Vienna	ATCC: CRL-2539	세포 배양 실험
Bruker Alpha Compact FTIR with Platinum-ATR Sampling Module	Bruker	A220/D-01	FT-IR 분석
Calcium chloride, anhydrous, ≥93% reagent grade	Sigma-Aldrich	902179	용해 매트릭스 준비용
세포 배양 플라스크, T25	Cellstar, Greiner Bio-One	690175	소모품; 세포 배양용
세포 배양 플라스크, T75	Cellstar, Greiner Bio-One	658175	소모품; 세포 배양용
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	5805000010	원심분리에 의한 샘플 분리용
콤비 스토퍼(여성 Luer-lock 커넥터)	Braun Melsungen AG	4495101	플랫폼 조립용
Cucurbitacin E	Sigma-Aldrich	SML0577	세포 이동 억제제
피부 생검 펀처, ø 6 mm	Dahlhausen	1190001006	원통형 스폰지 스캐폴드 취득용
다이어리시스 튜브(3.5 kDa, 셀룰로스)	Spectra/Por by Spectrum Labs	SPEC132724	실크 피브로인 용액의 다이어리시스용
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	세포 유지용
Ethanol, absolute	Merck	1.07017	용해 매트릭스 준비용
Excel	Microsoft	v2604	데이터 정리, 기본 계산 및 플로팅
Fetal calf serum (FCS) heat inactivated	Biowest	S181H-500	세포 배양 배지 보충제
Fiji (former ImageJ)	Open source (https://imagej.net/software/fiji/)	N/A	이미지 처리 및 분석
GraphPad Prism	GraphPad Software	v8.2.1	통계 분석 및 그래프 생성
HPLC pump Hitachi L-7120 LaChrom	Merck	K-5244	조립된 플랫폼에서의 동적 배양 조건용
IVIS 200 Spectrum CT system	PerkinElmer	128201	CT 기능을 갖춘 광학 이미징 시스템
IVIS Living Image Software	PerkinElmer	v4.5.2	IVIS 이미징 데이터의 획득, 시각화 및 정량 분석용 소프트웨어
JEOL JSM-6510 스캐닝 전자 현미경	JEOL GmbH	JSM-6510	SEM 이미지
L-glutamine, 200 mM 용액, 세포 배양 적합(L-Glu)	Sigma-Aldrich	G7513	세포 배양 배지 보충제
Lyophilizer Alpha 2-4 LD Plus	Martin Christ	101542	실크 피브로인 동결건조용
수컷 Luer-lock 커넥터	Supelco (Sigma-Aldrich)	57020-U	샘플 저장소용 어댑터
Methanol, ≥99.9 %, HPLC Gradient Grade	Carl Roth	7342.1	주의: 독성. 실크 복합체에서 베타 시트 형성 유도
광학적으로 투명한 Solid Phase Extraction (SPE) 튜브 무색상	Sigma Aldrich	57240-U	플랫폼 조립용
OPUS 분광 소프트웨어	Bruker	v7.5	FT-IR 분석
Orbital and Linear Shaker MI0103002	Four E'S Scientific	MI0103002	균일 분포/혼합
Parafilm PM996	Sigma-Aldrich	P7793	접시 및 용기를 밀봉/감쌀 때 사용(예: 냉장)
Penicillin-Streptomycin, liquid, suitable for cell culture (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	세포 배양 배지 보충제
페트리 접시, 9 cm	VWR	391-0598	소금 침대 스폰지 주조용; 실크 스캐폴드에 종자 씨앗용
1 mL SPE 튜브용 폴리에틸렌 프릿	Supelco (Sigma Aldrich)	57244	플랫폼 조립용
RPMI-1640 배지, 세포 배양 적합	Sigma-Aldrich	R0883	보충된 배지는 실크 스폰지