정액 노출 기간 동안 정자 운동성과 DNA 완전성의 시간 의존적 악화

요약

사정 후 정액 노출 기간이 장기간 발생하면 정자 DNA 단편화가 증가하고 운동성이 유의미하게 감소했습니다. 14개의 정상 샘플에서 DNA 단편화는 각각 1시간, 2시간, 4시간 동안 5.5%, 11.5%, 16.1% 증가했으며, 운동성은 감소했다. 이 연구 결과는 현장 정액 채취 및 처리의 지연을 최소화할 수 있음을 지지합니다.

초록

정자 DNA 단편화는 정자 질에 해로워 보조 생식 기술(ART) 주기에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있습니다. 정액 내 정자 DNA 단편화(SDF)를 시간에 따라 관찰하면 장기간 정액 노출이 정자 DNA 완전성에 미치는 영향에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 이 예비 연구에서는 정자 염색질 분산 분석법을 이용해 14개의 정상 정액 샘플을 대상으로 다양한 시점에서 SDF 검사를 수행하여 외부 정액 채취 조건을 시뮬레이션하였습니다. 검사 기간 동안 DNA 단편화 비율에 대한 통계적 분석 결과, 사정에서 정액 분석까지 정액이 장기간 정체되면 DNA 단편화가 유의미하게 증가하는 것으로 나타났습니다. 평균 정자 운동성은 1시간에서 7.4%, 2시간에 14.5%, 4시간에 18.7% 유의하게 감소했으며, 평균 SDF는 정액 채취 후 1시간 동안 5.5%, 2시간에 11.5%, 4시간 후 16.1% 유의하게 증가했습니다. 이러한 정자 질 저하는 특히 남성학 실험실 외부에서 정액 채취가 이루어질 경우 ART 주기를 위한 정자 준비 시 불임 클리닉의 프로토콜에 영향을 줄 수 있습니다. 실험실은 외부 정액 채취에 적합한 시간 기준을 설정하는 것을 고려할 수 있습니다.

서론

세계보건기구(WHO)는 전 세계 인구의 6명 중 1명, 즉 17.5%가 평생 어느 시점에서 불임을 경험한다고 밝혔습니다¹. 불임 사례의 약 20%는 남성 요인 불임 단독 진단을 받으며, 추가로 30–40%의 사례가 남성 요인을 2차 진단으로 가지고 있습니다². 건강한 남성에서도 농도, 운동성, 형태, 활력의 변동 등 정액 매개변수는 개인마다 크게 다를 수 있습니다^. 따라서 임상 환경에서 적절한 치료를 제공하기 위해서는 남성 생식력을 저해하는 구체적인 요인들을 이해하는 것이 중요합니다.

현재 진행 중인 연구 분야는 정자 DNA 무결성이 보조 생식 기술(ART) 주기 ^{4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}에 미치는 영향입니다. WHO 인간 정액 검사 및 처리 실험실 매뉴얼 5판에 따르면, 정자 DNA 단편화(SDF)는 배아 발달, 착상 및 임신 결과에 영향을 미칠 수 있다고 명시합니다¹⁴. Muriel 등은 SDF 분석을 수행했으며, SDF 증가가 ART 주기에서 수정율, 배아 질, 착상율 저하를 초래한다는 것을 발견했다¹⁰. 하지만 DNA 단편화의 원인에 대한 더 나은 이해가 필요합니다.

이전 연구들은 산화 스트레스가 정자 운동성 저하, 효소 생성 및 기능 저하, 그리고 가장 중요한 DNA 손상을 초래할 수 있다고 보고했습니다^. 이러한 DNA 손상에는 유전자 결실, 오번역, SDF 등이 포함될 수 있으나 이에 국한되지 않습니다. 현재 SDF 분석법은 정자 DNA 무결성을 평가하는 데 사용됩니다. 연구들은 냉동 보존, 배지 취급, 산화 스트레스를 SDF와 연관시키고 있지만, 사정부터 분석 ^4,5까지의 기간 동안 SDF에 대해서는 거의 알려진 바가 없습니다. ART^{주기 15}에서 정자 준비를 위한 가정 정자 채취가 증가함에 따라 이 시기는 정자 수명에서 매우 중요한 시기입니다. 코로나19 팬데믹 기간 동안 가정 수거는 환자와의 직접 접촉을 제한하고 편안함과 편리함을 높이기 때문에 점점 인기를 얻었습니다. 하지만 사정부터 가정 채취 분석까지 최적의 시간을 제시하는 구체적인 지침은 없습니다. 따라서 본 연구의 주요 목적은 정체 정액에서 SDF가 시간에 따라 변하는지 여부와 그러한 변화가 ART 샘플 취급과 관련이 있는지 이해하는 것이었습니다.

프로토콜

이 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며 대학병원 기관심사위원회(STUDY20201371)의 승인을 받았습니다. 연구에 참여한 모든 피험자로부터 사전 동의를 받았습니다. 오하이오 북동부의 한 학술 불임 센터에서 14개의 정액 샘플을 선별했습니다. 이 실험에서 분석된 모든 샘플은 우리 시설 현장에서 수집되었습니다. 정자 염색질 분산 검사는 제조사의 지침에 따라 정자 샘플에 대해 완전히 훈련된 남성 전문의가 수행하여 대인 간 차이를 최소화하였습니다. 이 키트를 사용하면, 온전하고 고정되지 않은 신선한 정자를 불활성 아가로스 마이크로젤에 미리 처리된 슬라이드에 담근 후 4°C에서 5분간 냉각하여 마이크로젤을 굳혔습니다. 초기 산성 처리를 통해 정자 세포 내 DNA를 분해하고 핵 단백질을 제거하기 위해 용해 완충액을 적용했습니다. 증류수로 세척한 후, 슬라이드는 등급 에탄올 용액에 탈수되어 공기 건조되었습니다. 키트에서 제공한 염색액으로 염색한 후 광학 현미경으로 관찰했을 때, 조각이 없는 정자는 핵핵 직경의 1/3보다 큰 분산 헤일로를 가진 핵핵을 보였고, 분해가 있는 정자는 코어 직경의 1/3 미만인 작은 헤일로나 후광이 없었습니다. DNA 단편화된 정자의 비율은 분해되고 손상된 정자의 수로 계산되어 백분율로 표현되었습니다. 총 300개의 정자가 슬라이드에 집계되었으며, 크거나 중간 정도 분산 후광을 가진 정자 또는 분산 후광이 없는 것으로 분류되었습니다. 이 집계는 기술적 변동성을 평가하기 위해 두 차례 재현되었고, 두 집계 모두 평균을 내었다. 키트의 진단 민감도와 특이도는 93%이며, 각 실험에는 양성 및 음성 대조군이 모두 포함되었습니다. 정액 샘플은 0, 1, 2, 4시간(0시간은 액화 기간 후 15분, 37°C)에 평가되었으며, 실온(22–25°C)에서 유지되었습니다.

각 샘플에 대해 0, 1, 2, 4시간에 추가로 운동성 분석이 수행되었습니다. 운동성 평가는 경험 많은 남성 전문의가 일회용 카운팅 챔버를 이용한 카운팅 프로토콜을 통해 수행했습니다. 격자당 300개의 운동성 정자가 집계되었고, 이 집계는 두 번 반복되었다. 두 번의 반복 집계를 바탕으로 운동성 정자의 평균 농도를 계산하였다.

각 시간대를 비교하기 위해 반복 측정 ANOVA를 사용하여 통계 분석이 수행되었습니다. 유의미한 전체 효과가 발견되었을 때, 사후 쌍별 비교를 위해 Tukey의 정직 유의적 차이(HSD) 검정을 적용했습니다. p 값 0.05< 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 재료에 대한 자세한 정보는 재료표에 요약되어 있습니다.

결과

장기간 정액 노출이 정자 운동성과 DNA 단편화에 미치는 영향을 평가하기 위해, 채취 후 네 시점에 걸쳐 총 14개의 정상동물정자 환자 샘플을 분석하였다. 분석된 샘플들은 WHO 5^{판 14}에 따라 정액 분석 매개변수에서 "정상"으로 간주되었습니다. 모든 샘플은 각 시점에서 분석 매개변수의 정확성을 최적화하기 위해 저희 생식 센터에서 현장에서 수집되었습니다. 환자의 평균 연령은 35.4세(24–45세)였습니다. 초기 정액 매개변수 결과는 정성 검사 결과 모든 샘플에서 평균 정액 양 3.7mL, 평균 농도가 4,220만 mL, 평균 운동성 46.9%, 평균 정상 형태 4%, 양성 백혈구 음성을 보였다(표 1).

시간이 지남에 따라 정자 운동성이 점진적으로 감소하는 것이 관찰되었습니다. 기준선(0시간)과 비교했을 때, 평균 정자 운동성은 1시간에서 7.4%(범위 3–16%), 2시간 기준 14.5%(범위 4–31%), 4시간에는 18.7%(범위 8–37%)가 감소했습니다. 정자 운동성은 시간이 지남에 따라 점진적으로 감소하여 기준선 58.6%에서 4시간 노출 후 42.5%로 감소했습니다(그림 1). 전반적으로 시점별 운동성 감소는 통계적으로 유의미했습니다(p = 0.0001585). 동시에, 정액 혈장에서 장기간 인큐베이킹을 하면 SDF가 유의미하게 증가했다. 평균 SDF는 기준선 15.6%에서 1시간에는 21.1%, 2시간 후 27.1%, 4시간에는 31.7%로 증가했습니다. 기준선과 비교했을 때, SDF는 1시간에서 5.5%포인트(범위 4–8%), 2시간에는 11.5%포인트(범위 8–16%), 4시간에는 16.1%포인트(범위 13–22%)가 증가했습니다. 이후 모든 시점에서 기준선과 비교해 통계적으로 유의한 SDF 증가가 관찰되었으며, 여기에는 1시간(p = 0.021129), 2시간(p < 0.00001), 4시간(p = 0.000018) 등이 포함됩니다(표 2).

데이터 이용 가능
분석에 사용된 환자 수준의 운동성 및 SDF 데이터는 보충표 S1에 제공되어 있습니다.

그림 1. 사정 후 정자 운동성 변화. 정자 운동성은 기저 시점과 정액 노출 1시간, 2시간, 4시간 후에 평가하였다. 운동성은 노출 시간이 늘어날수록 점차 감소했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

매개변수	평균입니다	표준편차
환자 연령	35.4 (범위, 24–45세)	6.22
정액 양	3.7 mL	2.18
집중	4,220만 /mL	33.45
운동성	46.9%	18.77
백혈구	음성 (전부 포함)	—
형태	4.0%	0.77

표 1: 연구 샘플의 기준 정액 특성. 정액 매개변수는 액화 후와 정자 DNA 단편화 및 운동성에 대한 시간 의존적 평가 전에 기록되었습니다.

시간	0 h	1시간	2시간	4시간
0시간*에서 평균 정자 운동성 감소	—	-7.4%	-14.5%	-18.7%
평균 SDF	15.6%	21.1%	27.1%	31.7%
표준편차	5.28%	5.27%	5.31%	4.80%
P값 대 0 h	—	p = 0.021129	p < 0.00001	p = 0.000018
*Tukey HSD 사후 비교를 포함한 반복 측정 ANOVA

표 2: 정자 DNA 단편화 및 운동성의 시간 의존적 변화. 정자 DNA 단편화와 운동성은 기저선과 정액 노출 후 1시간, 2시간, 4시간 후에 평가되었습니다. 값은 저자들이 보고한 대로 제시하며, 기준선과 통계적 비교가 이루어졌습니다.

보충 표 S1. 환자 수준의 정자 운동성 차이와 정자 DNA 단편화 지수 값. 값은 비율로 표현되며; 100을 곱하면 백분율로 변환됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

이 실험에 포함된 샘플에서 SDF는 시간이 지남에 따라 증가하는 반면, 운동성은 같은 기간 동안 감소했습니다. 이는 정액이 사정과 분석 또는 처리 사이에 정체액이 더 오래 정체될 경우 정자 DNA 완전성이 감소할 수 있음을 시사합니다. 분석 전 샘플이 정체 상태를 유지하는 시간을 늘리면 산화 스트레스와 관련된 조건에 노출되는 위험이 증가할 수 있습니다. 앞서 논의했듯이, 산화 스트레스는 정자 DNA 품질에 해로울 수 있으며, 높은 수준의 DNA 분열을 초래할 수 있습니다 ^6,8,13. 이 연구 결과는 ART 주기에서 정액 처리에 영향을 줄 수 있습니다.

첫째, 클리닉이 이 검사를 기존 정액 분석 매개변수에 추가하여 정자 DNA 품질을 확인하기 위해 ART 사이클에 사용하기 전에 하는 것이 가치가 있을 수 있습니다. 정자 질 최적화는 이전 연구에서 보고된 바와 같이 냉동 배아 수 증가, 염색체 정상 증가, 양성 임신 및 출생률 증가와 같은 결과 개선과 연관될 수 있습니다(¹⁶).

둘째, 이 결과들은 가정 정액 채취가 ART 결과에 미치는 영향에 대한 통찰을 제공합니다. COVID-19 팬데믹 기간 동안 많은 클리닉이 환자들에게 더 안전한 선택지로 가정 내 정액 수집을 활용하기 시작했습니다^{15, 17}. 진료소들이 이러한 변화를 시작하면서, 환자들은 코로나 노출을 줄일 뿐만 아니라 집에서 프라이버시로 채취를 할 수 있는 기회를 얻게 되었습니다. 하지만 우리의 연구 결과는 이러한 진료 변화가 정자 질과 잠재적으로 ART 결과와 관련된 트레이드오프를 포함할 수 있음을 시사합니다.

가정용 채취 키트에 관한 이전 연구들은 남성 요인 진단이 다양한 남성과 일반적으로 '정상' 정액 샘플을 생산하는 남성에 대해 정액 분석 결과에 큰 변동이 있음을 보여주었습니다¹⁸. 이러한 변동은 집에서 클리닉으로 이동하는 과정에서 정자가 정체되어 있기 때문일 수 있으며, 특히 일부 경우 정액 샘플을 하룻밤 사이에 운송할 때 그렇습니다. 다른 연구들도 정자 준비 후 5% CO2, 37°C에서 잠복 후 첫 3–4시간 동안 SDF가 급격히 증가한다는 결과를 뒷받침^{하며, 정}자 준비 후 정자 준비 후 가능한 한 빨리 정자를 사용해야 한다는 점을 시사합니다.

Kerdtawee 등은 정자 채취 위치가 정액 지표와 생식 결과에 미치는 영향에 대한 메타분석을 수행하였습니다. 가정에서 수집한 샘플과 클리닉에서 채취한 샘플 간에 유의미한 차이는 없었으나, 대부분 관찰 연구였던 연구들 사이에서 유의미한 이질성을 지적했다¹⁶. 중요한 점은, 이 연구들은 집에서 채취한 샘플을 언제 클리닉으로 반환해 분석해야 하는지에 대한 통제된 일정이 없었다는 것입니다. 그러나 이 연구에서 분석된 데이터는 여러 시점에 걸친 DNA 단편화의 통제된 분석을 가능하게 하여 실험 결과의 정밀도와 일관성을 높였습니다.

일부 환자에게는 가정 내 채취가 옵션일 수 있지만, SDF 발생률을 이해하는 것은 가정 채취가 ART 결과에 해로울 수 있는 환자를 식별하는 가이드라인 개발에 도움이 될 수 있습니다. Christoforaki 등의 체계적 문헌고찰 및 메타분석에 따르면, 정액 내 산화 감소 가능성이 남성 불임에 부정적인 영향을 미친다는 결과가 나타났다²¹. 분석된 매개변수에는 정자 농도, 개체 수, 운동성, 형태 등이 포함되며, 모두 높은 산화 감소 잠재력에 의해 부정적으로 영향을 받아 정자의 질이 산화 스트레스에 의해 영향을 받을 수 있음을 보여준다.

이 연구의 강점은 새로움으로, 장기간 정액에 노출될 때 시간에 따른 SDF 변화를 평가한 연구는 거의 없습니다. 이 연구는 기저 유정병리가 없는 비교적 동질적인 남성 그룹을 대상으로 통제된 환경에서 수행되었습니다. 그러나 이 연구는 14명의 환자 표본으로 제한되었습니다. 수집된 데이터 포인트와 결정적인 주석에 대한 신뢰도를 극대화하기 위해 추가 실험을 수행해야 합니다.

추가 연구는 SDF 비율에 영향을 줄 수 있는 변수들도 조사하여 정자 질 유지에 기여하는 요인들을 더 잘 이해해야 합니다. 고려해야 할 요소로는 정자 준비 과정에서 사용하는 매체 취급, 가정에서 클리닉으로 운송하는 온도 조건, 냉동 보존 방법, 남성 환자의 기저 질환 등이 있습니다. SDF에 기여하는 요인들에 대한 포괄적인 통찰을 얻는 것은 궁극적으로 클리닉이 지침을 최적화하고 ART를 받는 환자 치료 프로토콜을 수립할 때 더 나은 결정을 내릴 수 있게 할 것입니다.

관찰된 정자 질 저하는 장기간 정액에 노출될 때 운동성 감소와 DNA 단편화가 증가하는 명확한 시간 의존적 패턴을 보였다. 특히 보관 후 2–4시간 후 SDF가 30%를 초과하고 운동성이 기준선에 비해 거의 5분의 1 감소한 상태에서 가장 두드러진 악화가 발생했습니다. 이 결과는 사정과 정액 처리 사이의 지연이 정자의 기능적 완전성에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 시사하며, 보조 생식 기술 시술을 위해 외부에서 수집된 샘플의 운송 및 취급 시간을 최소화하는 것이 중요함을 지지합니다. 남성학 실험실은 특히 IUI나 IVF 준비 과정에서 외부 정액 채취 시 환자에게 허용 가능한 시간 기준을 설정하고 전달하는 것을 고려할 수 있습니다. 사정부터 정액 분석 및/또는 준비까지의 시간은 특히 ART를 위해 남성과 실험실에서 외부에서 채취될 경우 고려되어야 합니다.

이 연구의 표본 크기가 적다는 한계로 인해, 향후 연구에서는 비정상적인 정액 지표를 가진 남성 샘플을 포함한 더 넓은 범위의 정액 질 범주에서 장기간 정액 노출이 SDF에 미치는 영향을 평가해야 합니다. 또한, SDF 시간 의존성 증가가 수정, 배아 발달, 착상, 임신, 유산, 생산율 등 ART 결과에 임상적으로 유의미한 차이로 이어지는지 여부를 규명하기 위해 전향적 무작위 대조 시험이 필요합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ANOVA 계산기	통계 왕국		통계 분석 https://www.statskingdom.com/anova_manova.html
Halosperm G2	Halotech	HT-HSG2	정자 DNA 조각화 측정을 위한 체외 진단 키트 https://halotechdna.com/en/producto/halosperm-g2/
Microcell	Vitrolife	15423	정액 분석을 위한 일회용 계수 챔버 https://www.vitrolife.com/products/sperm-processing/microcell--accessories/
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