방법 논문

신경정신질환과 유사한 행동을 연구하기 위한 TSC 제브라피시 유충 혈류에 인터루킨-6 미세주입

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DOI:

10.3791/71524

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2026년 6월 26일

 , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, International Institute of Molecular Mechanisms and Machines, IMol, Polish Academy of Sciences, 2Warsaw-4-PhD doctoral school, International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

이 논문에서

요약

유전적으로 감수성이 있는 유기체에서 염증 신호가 신경 발달에 미치는 영향을 모델링하기 위해, 우리는 제브라피시 유충의 Cuvier관(공중정맥)에 IL-6를 미세주입하는 프로토콜을 제시하여, 결절성 경화증 복합체(TSC) 맥락에서 염증을 통제된 유도하고 발달 영향을 평가할 수 있게 합니다.

초록

결절성 경화증 복합체(TSC1/TSC2 돌연변이)를 가진 환자는 자폐 스펙트럼 장애(ASD)의 발현도 가변성을 보이며, 모체의 면역 활성화는 ASD 위험을 높이는 것으로 알려져 있습니다. 인터루킨-6(IL-6)는 면역 조절, 염증, 신경염증 과정에서 잘 알려진 다기능 사이토카인입니다. 감염이나 조직 손상에 반응하여 여러 면역 세포 유형에 의해 생성되며, 일반적으로 염증 촉진 매개체로 분류됩니다. 특히 IL-6는 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있으며, 자폐 스펙트럼 장애(ASD)와 지적 장애(ID) 등 신경염증 및 염증 관련 신경정신과적 질환과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다. 여기서는 Cuvier 관에 IL-6를 주입하여 제브라피시에서 전신 염증 신호를 유도하는 프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 초기 발달에서 염증에 의해 발생하는 변화를 연구할 수 있도록 통제되고 재현 가능한 염증 반응을 가능하게 합니다. 프로토콜은 IL-6 준비, 미세 주입, 그리고 질병과 신경염증의 제브라피시 모델에서의 후속 실험적 응용을 위한 필수 단계를 상세히 설명하며, 유전자-환경 상호작용을 탐구하는 연구도 포함합니다. 전신 염증 신호의 통제된 유도를 가능하게 함으로써, 유전적 감수성과 염증 노출이 어떻게 교차하여 발달 결과를 형성하는지 연구할 수 있는 다재다능한 플랫폼을 제공합니다.

서론

염증 신호가 초기 신경발달에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 것은 특히 유전적으로 취약한 맥락에서 신경발달장애의 기전을 해부하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 인터루킨-6(IL-6)를 큐비에르 관(공동 중심정맥)에 직접 미세주입하여 제브라피시 유생에서 전신 염증 신호를 유도하는 정밀하고 재현 가능한 접근법을 제공하는 것입니다.

결절성 경화증 복합체(TSC)는 이러한 유전자-환경 상호작용의 대표적인 사례입니다. TSC는 TSC1 또는 TSC2의 돌연변이로 인해 발생하는 희귀 유전 질환으로, 각각 하마틴과 튜베린을 암호화하는 단백질이 일반적으로 mTORC1 신호를 억제하는 복합체를 형성합니다. 이 억제가 상실되면 mTORC1 경로가 과활성화되어 비정상적인 세포 성장과 자폐 스펙트럼 장애(ASD)를 포함한 광범위한 임상 증상이 나타납니다1,2. ASD는 선진국에서 평균 진단 연령 ~3세의 개인의 ~1.5%에 영향을 미치는 것으로 추정됩니다3. ASD는 반복 행동, 사회적 상호작용 저하, 인지 유연성 저하가 특징이며, 환자들은 종종 불안, 우울증, 지적 장애와 같은 추가적인 신경행동적 문제를 겪는 경우가 많습니다. 특히 TSC 환자의 40%-60%가 ASD관련 특징을 보이지만, 증상의 심각도는 비슷한 돌연변이를 가진 환자들 사이에서도 크게 다르며, 이는 환경적 요인이 유전적 위험을 조절함을 시사합니다.

그 중 하나가 염증입니다. ASD의 병인은 여전히 대부분 알려져 있지 않지만, 여러 뇌 영역에 걸친 신경염증은 오랫동안 관련이 있다고 여겨져왔습니다. 점점 더 많은 전임상 및 임상 증거는 산모 면역 활성화(MIA)에 의해 유발되는 태아 신경염증과 그에 따른 사이토카인 신호 증가가 ASD6의 발병 기전에 크게 기여할 수 있음을 시사합니다. 따라서 TSC와 같은 유전적으로 민감한 시스템에서 염증성 사이토카인 노출을 모델링하는 것은 면역 신호가 교란된 mTORC1 조절과 어떻게 교차하여 초기 뇌 발달에 영향을 미치는지 탐구하는 강력한 틀을 제공합니다.

이 프로토콜 개발의 근거는 사이토카인 매개 염증, 특히 IL-6 신호가 유전적 취약성과 상호작용하여 신경발달 궤적에 영향을 미칠 수 있다는 인식이 커지고 있기 때문입니다. 사이토카인은 면역계 내 소통을 조정하는 저분자량 당단백질입니다. ASD 분야에서는 여러 연구가 말초혈 내 IL-6를 포함한 염증성 사이토카인 수치가 일관되게 높다고 보고하여, IL-6 신호 조절 장애가 이 장애의 신경발달 및 행동 특징에 기여할 수 있다는 가설을 뒷받침합니다. IL-6는 감염이나 조직 손상에 반응하여 다양한 면역 세포 유형이 생성하는 면역 활성화의 핵심 매개체입니다. IL-6가 혈액-뇌 장벽을 통과해 뉴런, 성상교세포, 미세아교세포에 직접 영향을 미칠 수 있기 때문에, 이 사이토카인의 지속적인 증가는 신경발달 경로, 시냅스 가소성, 신경면역 항상성 변화에 연관되어 있으며, 이는 ASD 병태생리학에서 점점 더 탐구되는 메커니즘입니다 11,12. 이러한 연관성은 임신 중 산모의 IL-6 수치가 높으면 태아 뇌 발달이 방해받고 ASD 관련 위험을 증가시키는 MIA 연구로 더욱 강화되었습니다13. 그러나 기존의 척추동물 모델은 병원체 관련 분자나 모체 노출 패러다임을 통한 전신 면역 자극에 의존하는 경우가 많아, 이로 인해 변동성이 생기고 여러 면역 경로를 동시에 활성화하며 IL-6의 특정 기여를 분리하는 능력이 제한될 수 있습니다. 제브라피시에 직접 IL-6 미세주입을 하면 투명하고 유전적으로 다루기 쉬운 생물체 내에서 단일 사이토카인을 표적으로 조작할 수 있어 이러한 한계를 극복합니다.

제브라피시는 사이토카인 주도 발달 효과를 연구하는 데 여러 가지 장점을 제공합니다. 광학 투명성 덕분에 면역 및 신경 반응을 실시간으로 시각화할 수 있습니다; 빠른 발전으로 고처리량 실험이 가능하며; 보존된 사이토카인 신호 전달 경로는 염증 기전을 해부하는 강력한 척추동물 모델로 만듭니다 14,15,16,17,18. 실험 연구에서는 박테리아, 암세포, DNA, 나노입자 등 외부 물질을 제브라피시 유생에 전달하는 것이 필요합니다. 한 가지 방법은 유충을 관심 물질이 포함된 용액에 노출시켜 피부, 아가미 또는 위장관을 통해 수동적으로 흡수하는 것입니다. 두 번째이자 더 직접적인 방법은 미세주입으로, 외부 재료를 미세한 유리바늘 19, 20, 21을 사용해 특정 배아 또는 유충 구획에 주입하는 것이다. 중요한 점은, 큐비에르 관에 미세주입을 하면 전신 전달을 신뢰할 수 있는 경로를 제공하여, 전체 유기체 면역 자극의 혼란 효과 없이 순환계 전체에 IL-6가 빠르게 분포되도록 보장한다는 것입니다.

이 프로토콜에서는 주사 주사기 준비부터 제브라피시 유충의 Cuvier 관을 통해 혈류에 IL-6를 주입하는 단계별 절차를 제시합니다. 이는 수정 후 2일과 3일(dpf)입니다. 이 방법은 특정 염증 신호가 초기 발달 과정에 미치는 영향, 신경발달 또는 면역 관련 장애 모델에서의 유전자-환경 상호작용, 생체 내 사이토카인 노출의 세포 및 분자 결과, 유전적 돌연변이와 염증 신호 경로 간의 상호작용을 연구하는 연구자들에게 특히 유용합니다. 통제되고 사이토카인 특이적이며 발달적으로 정밀한 접근법을 제공함으로써, 이 프로토콜은 IL-6 및 관련 면역 신호가 초기 면역, 신경, 행동 결과를 어떻게 형성하는지 탐구할 수 있는 다재다능한 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

여기서 설명한 절차에서는 tsc2vu242/+ 제브라피시 라인22,23이 사용되었습니다. 수행된 모든 실험은 관련 법률에 따라 수행되었으며, 발달 단계(<5 DPF)가 의무적 윤리 심사 범위 밖에 있기 때문에 윤리위원회의 추가 승인이 필요하지 않습니다. 그림 1은 프로토콜의 회로도를 보여줍니다.

1. 마이크로피펫 추출

  1. 붕규산 유리 모세혈관에서 마이크로피펫 풀러를 사용하여 미세한 절차에 따라 미세주입 바늘을 준비합니다.24.
  2. 길이 10cm 크기의 붕규산 유리 모세혈관(외경 1.0mm, 얇은 벽)을 사용해 마이크로피펫 풀러에 넣으세요.
  3. 모세관을 풀러 캐리지 안에 조심스럽게 위치시키고, 지정된 홈 내에서 정확한 정렬을 확인하고, 장비 클램프로 단단히 고정하여 당기는 동안 움직임을 방지하세요.
  4. 모세관을 가열 필라멘트 중앙에 맞추어 뽑을 부위에 균일하게 가열하여 바늘 형성이 일정하도록 하세요.
  5. 최적화된 매개변수(예: 서터 기기의 경우 열: 533, 당김: 50, 속도: 60, 지연: 90, 압력: 200)를 사용하여 미세 팁 미세인젝션 바늘을 생성하는 풀 프로그램을 시작합니다.
    주의: 유리 모세혈관에서 뽑은 미세니드는 약하여 쉽게 금이 가거나 막히거나 주입 부피를 변화시키는 불규칙한 팁 모양이 생길 수 있습니다. 사용 전 각 바늘을 입체현미경으로 점검하고, 끝을 단단한 표면에 닿지 않게 하며, 저항, 누출, 또는 물적 크기가 일정하지 않으면 즉시 바늘을 교체하세요.
    참고: 당기는 과정 후에는 모세혈관 양 끝에 테이퍼드 바늘 끝이 형성됩니다. 사용 전에는 입체현미경 아래에서 미세한 겸자로 부드럽게 부러뜨려 미세한 주입에 필요한 조리개 크기를 얻기 위해 조심스럽게 열어야 합니다.

2. 완충기 및 스톡 용액 준비

  1. E3 배아 배지 60× 스톡 용액을 준비합니다( 표 1 참조). 용액을 오토클레이브로 멸균하여 4 °C에서 보관합니다. 사용 시에는 스톡 용액을 초순수수에 희석하여 1× E3 작동 용액을 얻으세요.
    참고: E3 배아 배지 60× 재고 용액은 장기 보관을 위해 4 °C에서 보관할 수 있습니다.
  2. 표 1에 설명된 대로 20배 트라이카인 용액(MS-222)을 준비합니다. 분해를 방지하기 위해 4°C의 어두운 곳에 보관하세요. 사용 전에 E3 배지에 1× 농도로 희석하세요.
    참고: 트리카인 스톡 용액의 pH를 1 M Tris pH 9.0을 사용해 7.5로 조절하세요. 이 용액은 분할 보관하여 -20°C(냉동)에서 장기 보관하거나 4°C에서 보관할 수 있습니다. 트리카인은 RT와 조명 아래에서 독성 화합물로 분해됩니다.
    주의: 마취에 트리카인(MS-222)을 사용할 때는 특히 주의해야 하며, 과다 노출 및 과다 노출은 유충의 생리와 행동에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 과도한 노출은 심장 기능을 저하시키고 이후 행동을 변화시킬 수 있으며, 마취가 부족하면 장착 시 부상 위험이 증가합니다. 최소 유효 농도와 지속 시간만 사용하고, 행동 검사 전에 신선한 배아 배지에서 완전한 회복을 기다려야 합니다.
  3. E3 배지에 1% (w/v) 아가로스 용액을 가열하여 완전히 녹게 만듭니다.
    참고: 사전에 준비한 경우 용액은 4 °C에서 보관한 후 사용 전에 재가열할 수 있습니다. 실험 당일에는 조기 응고를 방지하기 위해 아가로스를 55–60 °C의 액체 상태로 유지하세요.
  4. 0.9% (w/v) NaCl 용액을 준비하여 상온에서 최대 1주일간 보관하거나, 4°C에서 장기간 보관할 수 있습니다. 사용 전에는 용액을 상온에 평형으로 맞추거나 배아의 생리적 조건에 맞게 28.5 °C에서 배양하세요.
  5. 0.9% NaCl에 2 pg/nL IL-6 용액을 준비합니다. 반복적인 동결-해동 과정을 피하기 위해 용액을 분할 단위로 섞어 -20 °C에서 보관하세요. 사용 전에 해동한 후 상온에 넣으세요.
  6. 초순수수에 20 mg/mL 스톡 용액을 추출하여 E3 배지에 0.5 mg/mL 프로나스 작동 용액을 준비합니다.

3. 배아를 2 DPF까지 채취하고 키우기

  1. 여러 마리의 tsc2vu242/vu242 성체 제브라피시를 산란 어항에 넣어 그룹 산란을 설정하세요.
    참고: 수컷과 암컷은 조기 산란을 막기 위해 밤새 분리할 수 있으며, 다음 날 아침 분리기를 제거해 동기화된 교미를 유도합니다. 또는 빛이 조절되는 환경에서 구분대 없이 물고기를 유지할 수도 있는데, 어두운 밤에서 밝은 빛(아침)으로 전환하는 것이 산란 신호 역할을 합니다.
  2. 다음 날에는 칸막이를 제거하고(사용 가능하다면) 약 1시간 동안 산란을 진행하세요.
  3. 수정된 배아를 신속히 채취하여 40mL E3 배아 배양지를 담은 100mm 페트리 접시로 옮기고, 접시당 최대 ~60개의 배아 밀도를 유지하여 최적의 발달을 보장합니다.
  4. 배아는 28.5 °C에서 14시간의 빛과 10시간의 어두운 낮 주기로 통제된 주행 주기로 배아를 배양합니다.
  5. 1 dpf와 2 dpf 시, 입체현미경으로 배아를 검사하고 죽은 배아, 수정되지 않은 난자, 잔해를 제거하여 배양 품질을 유지합니다.
  6. 노폐물 축적을 최소화하고 정상적인 배아 발달을 지원하기 위해 E3 배지를 신선한 용액으로 교체하세요.

4. 미세 주입 및 탈코리오네이션을 위한 아가로스 플레이트 준비

  1. 1% (w/v) 아가로스 용액을 E3 배지에 준비하고 아가로스가 완전히 녹아 용액이 투명해질 때까지 가열합니다.
  2. 용액을 잠시 식힌 후 약 30mL를 100mm 페트리 접시에 부어 표면에 고르게 덮이도록 합니다.
  3. 아가로스가 아직 액체 상태이지만 굳기 시작할 때, 실리콘 몰드를 표면에 부드럽게 놓아 균일한 홈을 만듭니다.
    참고: 여기서는 피라미드형 패턴을 가진 실리콘 몰드(그림 2)를 사용하여 미세 주입 시 과잉 E3를 저장할 수 있는 웰을 생성합니다. 이 웰들은 표준 배상 조건 밖에서도 충분한 수분을 유지하여 건조를 방지하고 배아의 생존 가능성을 몇 분간 보장함으로써 취급 및 주입 시 일시적으로 안정성을 제공하도록 설계되었습니다.
  4. 용융된 1% 아가로스 용액 약 5mL를 부어 표면을 고르게 코팅하기 위해 효소 탈코리오네이션(직경 50mm)의 아가로스 코팅 페트리 접시를 준비합니다.
  5. 과잉 아가로스는 제거하세요.
  6. 아가로오스를 실온에서 10–15분 정도 굳히세요. 고정이 완료되면 접시는 배아의 효소 탈코리온에 사용할 준비가 됩니다.

5. 2 dpf 어류의 효소 탈코리오션

  1. 약 100개의 배아를 2 dpf 용량의 코리온 배아를 작은(50mm) 아가로스 코팅 페트리 접시에 이식합니다.
  2. 효소 용액의 희석을 최소화하고 효율적인 데코리오네이션을 보장하기 위해 가능한 한 많은 E3 배지를 제거하세요.
  3. 접시에 신선하게 준비된 프로나제 용액 4mL(재고 농도: 20 mg/mL [초순수수에서 조제], 작업 농도: 0.5 mg/mL [E3에 희석됨])를 추가하여 배아가 완전히 잠기도록 합니다.
    주의: 프로나제 치료는 신중하게 조절해야 하며, 과도한 소화는 유충 조직을 손상시켜 다루는 시 취약함을 높이고 생존이나 행동에 영향을 줄 수 있습니다. 최소 유효 노출 시간만 사용하고, 이후 배아를 충분히 헹구어 효소 활성을 유지하세요.
  4. 실온에서 3–5분간 배양하며 입체현미경으로 코리온에서 방출되는 현상을 관찰합니다.
  5. 접시를 부드럽게 돌리거나 간헐적으로 돌려서 효소로 코리온을 제거하는 데 도움을 줍니다. 대부분의 배아가 코리온에서 방출될 때까지 계속합니다.
    참고: 벌거벗은 배아는 항상 용액에 담가두어야 합니다; 그렇지 않으면 난황낭이 파열되어 배아가 죽을 수 있습니다.
  6. 탈코리오네이션이 이루어지면, 배아를 신선한 E3 배지를 5–6회 교체하여 완전히 세척합니다.
    참고: 벌거벗은 배아는 항상 용액에 담가두어야 합니다; 그렇지 않으면 난황낭이 파열되어 배아가 죽을 수 있습니다.
  7. 유충 손상을 방지하고 최적의 배양 조건을 유지하기 위해 모든 코리온과 프로나제 잔류물을 제거하세요.
  8. 유리 파스퇴르 피펫을 사용해 40mL E3 배지가 든 100mm 페트리 접시에 ~50마리의 데코리온 유충을 옮깁니다.
  9. 유충을 미세 주입할 때까지 이 상태로 유지하세요.

6. 제브라피시 배아 주입

  1. 입체 현미경(≥150× 배율) 아래에서 미세한 겸자를 사용해 당겨진 유리 모세관(섹션 1)의 끝을 조심스럽게 부러뜨려 약 3μm 직경의 마이크로피펫을 생성합니다.
    참고: 적절한 마이크로피펫은 팁이 미세하게 열려 있고, 눈에 띄는 평탄화나 넓은 열린 표면이 없음을 확인하면 식별할 수 있습니다. 끝이 너무 넓게 부러지면 물고기 피부에 효과적으로 침투하지 못해 주입이 불안정하거나 불안정해질 수 있습니다. 따라서 팁 개방은 입체현미경으로 고배율로 신중하게 수행하여 모세관 끝에서 최소한의 통제된 끊김을 보장해야 합니다.
  2. 0.9% NaCl(대조군) 또는 IL-6(2 pg/nL) 주입액을 0.9% NaCl에 준비하고, 10 μL 용액마다 0.1% 트리판 블루 1 μL 주입하여 주입 시 시각화를 용이하게 합니다.
  3. 마이크로로더 팁을 사용해 준비된 마이크로피펫에 ~3 μL 분량의 주입액을 되채워 공기 방울이 발생하지 않도록 합니다.
  4. 적재된 마이크로피펫을 미세주입 시스템에 연결된 모세관 홀더(그림 2)에 고정합니다.
  5. 보정 슬라이드 위에 미네랄 오일 한 방울을 떨어뜨립니다.
  6. 방울을 광유에 배출하여 0.01mm 스케일의 보정 슬라이드(그림 2)를 사용해 주입량을 보정합니다. 주입 압력(300–500 hPa 사이)을 조정하여 액적 부피 ~1 nL를 달성합니다.
  7. 마취용으로 유충이 포함된 E3 배지에 트리카인(MS-222)을 최종 농도인 1×까지 첨가합니다. 스트레스를 줄이고 꾸준한 진정을 위해 유충을 소량으로 사용하세요.
  8. 개별 2개의 DPF 유충을 굳어진 아가로스 주입판에 옮깁니다. 여러 마리의 유충(예: 최대 10마리)은 취급 능력에 따라 접시당 배치될 수 있습니다.
  9. 접시를 입체현미경 아래에 두세요. 유리 피펫을 사용해 각 유충을 부드럽게 방향을 잡아 쿠비에의 관이 명확하게 보이고 접근 가능하도록 합니다.
    참고: 여러 유충을 다룰 때는 건조를 방지하기 위해 트리카인(1×)이 포함된 E3 배지를 주기적으로 첨가하여 아가로스 표면에 수분을 유지하도록 하세요.
  10. 마이크로피펫 팁을 큐비에르 관의 입구( 그림 3에 보이는 대로)에 위치시키며, 입체현미경으로 심장 쪽으로 움직이는 혈액 세포를 추적하여 식별할 수 있습니다.
  11. 준비된 용액의 두 방울(각각 ~1 nL)을 큐비에르 관에 연속으로 주입하며, 주입 간격은 약 20초 간격으로 적절한 분포를 확보합니다.
  12. 주입 후에는 유충을 아가로스 플레이트에서 40 mL E3 배지가 들어있는 신선한 100mm 페트리 접시로 부드럽게 옮깁니다. 이식 시 기계적 스트레스를 최소화하세요.
  13. 유충을 28.5 °C의 인큐베이터로 다시 보내 회수하세요.
  14. 다음 날(3 dpf)에는 6.8–6.13 단계에 설명된 미세주사 절차를 반복합니다.
    참고: 단일 주사는 단기간 신호만 생성하고 일관된 행동 반응이 없으나, 두 번째 주사는 신경발달과 관련된 초기 유충 발달 창을 통한 염증 경로의 지속적 활성화를 보장하고, 대표 결과 섹션에 설명된 행동 변화를 유발합니다.
  15. 5 dpf 시에는 유충을 행동 분석, 뇌 영상, 면역형광 분석 등 후속 용도로 사용합니다.

결과

IL-6 미세주입이 유충의 생리와 행동에 미치는 영향을 평가하기 위해, IL-6 주입 유충과 NaCl 주입 대조군을 생존 기간 및 제브라피시의 불안 유사 및 반복 행동 평가에 흔히 사용하는 두 가지 행동 측정값을 비교하였다. IL-6 미세주입은 NaCl 주사에 비해 유충의 생존력에 영향을 미치지 않았습니다(그림 4A). 5 dpf 투여 그룹과 NaCl 주입군 간 생존율은 구별이 불가능하여, 투여 방식이 잘 내약하며 비특이적 독성을 유발하지 않음을 나타냈다. 미세주사 자체는 주사하지 않은 형제자매에 비해 생존율을 약간 감소시켜, IL-6 노출과는 독립적으로 다루는 영향이 적은 것으로 나타났습니다. 이는 프로토콜이 하위 행동 분석에 적합함을 확인시켜 줍니다.

IL-6 미세주입 패러다임이 5 dpf에서 측정 가능한 염증 반응을 유도한다는 것을 검증하기 위해, 우리는 사이토카인 주도 염증 신호의 하류 매개체인 프로스타글란딘 E2(PGE2)를 정량화했다25. tsc2-/- 동형접합 돌연변이체는 IL-6 주사 없이도 기저 PGE2 수치가 높았으며, 이는 야생형(WT) tsc2+/+ 형제보다 유의미하게 높았습니다(그림 4B). 이형접합 tsc2+/- 돌연변이체는 WT 유충에 비해 기저 PGE2가 미미하고 유의하지 않은 증가를 보였으나, IL-6 미세주입 후 PGE2 수치가 급격히 상승했다는 점이 중요하다. 이 패턴은 유전자× 환경 상호작용을 모델링하려는 우리의 목표와 일치합니다: WT 유충은 경미하고 일시적인 IL-6 노출에 거의 영향을 받지 않는 반면, 유전적으로 감수성이 있는 TSC2+/- 돌연변이는 뚜렷한 염증 반응을 보입니다.

이러한 유전자형 의존적 염증 톤 차이에 따라, 다음으로 IL-6 유도 신호가 오픈 필드 분석에서 측정 가능한 행동 변화로 이어지는지 조사했습니다. 5 dpf 상태에서의 개방 실험(앞서 언급한22)에서는 tsc2 돌연변이 유충이 WT 형제자매에 비해 불안과 유사한 행동이 증가한 것으로 나타났습니다(그림 4C); IL6의 미세 주입은 이러한 행동에 영향을 주지 않았습니다. 구체적으로, tsc2+/-와 tsc2-/-유충은 경기장 외곽 구역에서 유의미하게 더 많은 시간을 보냈고, tsc2+/+에 비해 중심 탐색이 감소했는데, 이는 제브라피시 유충에서 확립된 불안 관련 표현형과 일치한다.

IL-6 주사는 특히 tsc2+/- 돌연변이 유충에서 반복적이고 고정관념적인 수영 패턴을 증가시켰으며(그림 4D–E), 이는 제브라피시 모델에서 ASD 관련 지표로 흔히 사용되는 행동 특징이다26. 반복 수영(3회 이상의 연속 원형 수영으로 정의됨)을 상세히 정량화한 결과, NaCl 주입 대조군에 비해 IL-6 주입 tsc2+/- 돌연변이체 비율이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. 유전적으로 감수성이 있는 유충에서 반복적인 수영을 선택적으로 강화하는 현상은, 가벼운 염증 자극이 tsc2+/- 돌연변이 배경에서 ASD 유사 행동 경향을 드러내거나 증폭시키는 유전자× 환경 상호작용을 더욱 뒷받침합니다.

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그림 1: 프로토콜 개요. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 2: 마이크로인젝션 워크스테이션 구성. 유충 제브라피시 주입에 사용되는 마이크로 인젝션 워크스테이션 도식. (1) 인젝터 홀더에 장착된 유리 마이크로피펫; (2) 유충 위치를 위한 몰딩 웰이 있는 아가로스 코팅 페트리 접시; (3) 보정용 광유; (4) 트라이판 블루 용액; (5) 당김 유리 바늘; (6) 보정 슬라이드; (7) 확장된 피펫 팁; (8) 파스퇴르 피펫; (9) 실리콘 몰드. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 3: 쿠비에르 관에 주입. (A) 5 dpf 유충 제브라피시 유충의 큐비에관 주입 부위 및 대표적인 개방 운동 궤도. (B) 대조군(주입하지 않은 상태)과 NaCl 및 IL-6 주사의 대표 이미지. 스케일 바: 250 μm. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 4: tsc2 돌연변이 계통을 이용한 유전자 x 환경 상호작용의 대표 결과. (A) 실험 기간 동안 대조군(주입되지 않음), NaCl 주입군, IL-6 주입군에 걸친 tsc2vu242 유충의 생존율(%). 데이터는 5 dpf ± SEM 평균 형태로 제시됩니다(n = 4개의 독립 실험 복제, 각 유전자형 × 처리 조합에는 60–70마리의 물고기가 포함되어 있습니다). 통계 분석은 ANOVA를 사용한 후 Tukey 사후 검정을 사용하여 쌍별 비교를 수행하였습니다. 대조군과 IL-6 주입군 간(p = 0.00150), 대조군과 NaCl 주입군 간에는 유의한 차이가 관찰되었습니다(p = 0.00243). (B) 제조사 프로토콜에 따라 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 키트를 사용하여 tsc2 돌연변이 및 형제자매의 PGE2 수치를 나타내는 박스플롯(유전자형 2방향 ANOVA: F = 7.4503; P = 0.01234). 각 샘플에는 20개의 앞면이 포함되어 있으며(꼬리는 유전체형 분석에 사용됨). 박스플롯의 점들은 생물학적 복제체를 나타냅니다. (C) Tsc2 돌연변이 어류에 대한 개방 필드 검사 결과 박스플롯, 각 유전자형별 NaCl 및 IL-6 주입 후 벽 옆에서 상대적으로 머무는 시간 (유전자형에 대한 2방향 ANOVA: F = 7.021; P = 0.00106). 개방 현장 시험은 이전에 보고된 프로토콜22에 따라 자동 분석실(재료표)을 사용하여 수행되었습니다. (D) NaCl 주입 후 무작위 탐색 행동과 IL-6 주사 후 반복적인 루프 현상을 보여주는 예시적 도해. (E) NaCl 또는 IL-6 주입 후 각 tsc2 유전자형과 주입되지 않은 대조군 어류의 정상 및 반복 반복 행동을 보이는 동물 수를 나타내는 박스플롯(유전자형 2방향 ANOVA: F = 5.7615; P = 0.005849). 각 유전자형× 처리 조합에 따라 60–70마리의 물고기를 포함한 세 개의 독립 실험 복제가 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

60 x E3 스톡 솔루션
시약최종 집중양
나클297 mM17.4g
KCl10.7 mM0.8g
CaCl219.6 mM2.18 g
MgCl2·6H2O24 mM4.89g
울트라퓨어 H2O해당 없음최대 1L 충전
총해당 없음1 L
트리케인 스톡 용액
시약최종 집중양
트리케인15.3 mM1 g
1 M 트리스-HCl pH 921 mM5.25 mL
울트라퓨어 H2O해당 없음244.75 mL
총해당 없음250 mL

표 1: E3 및 트리카인 용액의 조성.

토론

예상대로, tsc2 동형접합 돌연변이체는 이전에 보고된 표현형과 일치하는 높은 수준의 불안 유사성을 보였다22,27. 이 유충들은 이미 심각한 행동 이상을 보이고 있기 때문에, IL-6 주사는 표현형을 더 악화시키지 않았습니다. 반면, tsc2 이형접합체는 명확한 IL-6 유도 변화를 보였다. 이러한 선택적 민감성은 이 프로토콜이 유전자× 환경 상호작용을 탐구하는 데 유용함을 강조하며, 가벼지만 장기간 염증 신호가 기저 유전적 취약성과 상호작용하여 신경행동 결과를 형성하는 데 도움을 줍니다.

LPS 노출은 제브라피시에서 가장 널리 사용되는 염증 유발 패러다임으로 남아 있으며, 강력한 촉진염증성 사이토카인의 유도, 선천 면역세포의 모집, 용량 의존적 사망률을 특징으로 하는 광범위하고 강력한 면역 반응을 신뢰성 있게 생성합니다28. 강력한 LPS는 여러 Toll 유사 수용체 경로를 동시에 활성화하여 개별 사이토카인이 하위 신경발달 효과에 기여하는 것을 분리하기 어렵게 만듭니다. 반면, 여기서 설명하는 IL-6 미세주사 프로토콜은 모체 면역 활성화에 중심적인 단일 사이토카인을 증강시켜 표적화되고 통제된 접근법을 제공합니다. 중요한 점은, IL-6 주사는 NaCl 주입 대조군에 비해 사망률을 증가시키지 않아 행동 및 분자 표현형을 독성 교란 없이 검사할 수 있게 한다는 것입니다. 더불어, IL-6 미세주입은 PGE2 수치 상승으로 나타나는 특정 하류 염증 신호를 생성하고, 특히 tsc2 이형접합 유충에서 반복 수영 증가를 유발하여 유전적 감수성이 사이토카인 노출과 상호작용하는 측정 가능한 행동 변화를 유도합니다. 이러한 구분은 LPS가 전반적 면역 활성화를 모델링하는 반면, IL-6 미세주입은 신경발달 위험과 관련된 사이토카인 특이적 기전을 정밀하게 해부할 수 있음을 강조합니다.

여기 제시된 대표적인 결과는 tsc2 돌연변이 배경에서 IL-6 효과를 보여주지만, 프로토콜 자체는 널리 적용 가능합니다. 이 방법은 야생형 유충이나 기타 유전적 모델에서 쉽게 구현되어 정의된 염증 신호가 초기 신경발달 과정에서 다양한 유전적 맥락과 어떻게 교차하는지 조사할 수 있습니다. tsc2 모델 외의 응용을 위해서는 최적의 IL-6 용량을 실증적으로 결정할 것을 권장하는데, 이는 사이토카인 감수성과 염증 임계치가 유전자형과 실험 목적에 따라 다를 수 있기 때문입니다.

이 프로토콜에서 중요한 기술적 고려사항은 주입량의 일관성으로, IL-6의 생물학적 효과는 주입당 약 1 nL의 정확한 전달에 의존합니다. 방울 크기의 변동성은 바늘 구멍이나 주입 압력 차이에서 자주 발생합니다. 물방울이 너무 작을 경우, 압력을 점진적으로 올리거나 고배율에서 바늘 끝을 약간 넓히면 일반적으로 적절한 흐름이 회복됩니다. 반대로 빗방울이 의도된 부피를 초과하면 바늘 구멍이 너무 넓다는 뜻이므로, 압력을 줄이거나 더 좁은 끝으로 새 바늘을 준비해야 합니다. 정확한 주사 양을 유지하는 것이 필수적인데, 편차는 염증 부하를 변화시키고 재현성을 저해할 수 있기 때문입니다. 가끔 사용자는 바늘에서 해액이 배출되지 않는 상황을 겪을 수 있습니다. 이는 대부분 바늘 끝에 있는 공기 방울, 이물질, 막힘 때문입니다. 입체 현미경으로 바늘을 점검하고 인젝터 시스템의 누수나 느슨한 연결부를 점검하면 보통 문제가 해결됩니다. 바늘 끝이 깨끗하고 막힘 없는 상태를 유지하는 것은 일관된 전달과 유충을 손상시킬 수 있는 압력 축적을 막는 데 필수적입니다.

또 다른 중요한 요소는 주입된 부피의 생리적 내용입니다. 유충은 일반적으로 ~1 nL을 잘 견디지만, 특히 연속된 여러 주사를 시행할 경우 더 많은 양이 사망률을 높일 수 있습니다. 반복 투여가 필요한 실험의 경우, 기계적 스트레스를 최소화하고, 주사 사이에 충분한 회복 시간을 두며, 원하는 용량을 달성하기 위해 부피가 아닌 IL-6 농도를 조절하는 것이 매우 중요합니다. 이러한 고려사항은 관찰된 표현형이 주사 관련 손상이 아닌 사이토카인 노출을 반영하는지 확인하는 데 도움을 줍니다.

마지막으로, 주사 관련 사망률은 사용자 경험에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 숙련된 사용자는 보통 5% 근처의 사망률을 기록하지만, 경험이 부족한 사용자는 50%에 이를 수도 있습니다. 대부분의 손실은 장착 시 기계적 손상, 바늘 삽입 오류, 또는 노른자 주머니나 주변 조직의 우발적 천공에서 비롯됩니다. 실험 주사 전에 야생형 유충에 대해 이 절차를 연습하면 일관성이 크게 향상되고 사망률이 줄어듭니다. 유충을 적절한 위치로 배치해 Cuvier의 관을 명확히 관찰하고, 장착 및 회수 시 부드럽게 다루는 것은 시술적 손상을 더욱 최소화합니다.

공개 사항

저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

tsc2vu242/+ 어류를 제공해 준 케빈 에스와 릴리아나 솔니카-크레젤(밴더빌트 대학교)과 성체 물고기 지원을 제공한 IIMCB ZCF에 감사드립니다. 이 연구는 폴란드 국립과학센터에서 JZ에게 지원받은 SONATA BIS 보조금 번호 2023/50/E/NZ3/00252의 지원을 받았습니다.

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
보로실리케이트 유리 모세관 (외경 1.0 mm/ 내경 0.75 mm)Sutter InstrumentBF150-75-10
CaCl2 (칼슘 염화물)Chempur118748703
교정 슬라이드 (1/100 mm)Bresser5916710
모세관 홀더 (그립 헤드 세트 4 사이즈 0)Fertilart Sp. z o.o5196082001
플레이밍/브라운 마이크로파이펫 풀러Sutter InstrumentP-1000
HClChempur115752837
Human IL6Thermo Fischer Scientific200-06-20UG재고 농도: 10 µg/mL, 작업 농도: 2 pg/nL (0.9% NaCl에 희석)
인젝터 펌프 FemtoJet 4iEppendorfE5252000021
KCl (칼륨 염화물)Chempur117397402
MgCl2·6H2O (마그네슘 염화물 6수화물)Chempur116120500
Femtotips Microloader Tips for Femtojet MicroinjectorEppendorfEPE 5242956003
현미경 Leica M165 FC 1983 배율Leica Microsysytemshttps://www.leica-microsystems.com/products/
light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m165-fc/
미네랄 오일Sigma-AldrichM5904
NaCl (나트륨 염화물)Chempur117941206
PronaseSigma-AldrichP5147-1G재고 농도: 20 mg/mL (초순수에 준비), 작업 농도: 0.5 mg/mL (E3에 희석)
TricaineSigma-Aldrich/MerckA-5040
Tris 베이스Carl Roth4855.3
트리판 블루Thermo Fischer Scientific15250061
UltraPure 저용점 아가로오스Thermo Fischer Scientific16520050
ZebraBox 확장 - 포토 모터 반응 EZBPMRAnimalabhttps://animalab.eu/zebrabox-high-throughput-monitoring-system
ZebraboxViewPointhttps://www.viewpoint.fr/product/zebrafish/fish-behavior-monitoring/zebrabox자동 분석 챔버
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