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방법 논문

중환자실 환자의 하기도 감염 원인균에 대한 신속 현장 진단

649 조회수

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DOI:

10.3791/71534

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2026년 9월 19일

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1National Infrastructures for Translational Medicine, State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Institute of Clinical Medicine, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd, 3Department of Critical Care Medicine, State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, 4Department of Medicine, Cape Cod Hospital, 5Harvard T.H. Chan School of Public Health, 6Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Center for Inflammation Research, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 중환자실(ICU) 환자의 하기도 감염을 유발하는 15종의 병원체를 1시간 이내에 현장 진단(point-of-care detection)할 수 있는 완전 통합형 미세유체 칩 기반 LAMP 방법을 설명합니다.

초록

하기도 감염(LRTI)은 중증 환자의 임상적 상태 악화 및 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 중환자실(ICU)에서는 적절한 항균 치료를 위해 원인 병원균을 신속하게 식별하는 것이 필수적이지만, 기존의 배양법은 3~5일이 소요되며 특히 진균의 경우 양성률이 낮다는 단점이 있습니다. PCR과 같은 분자 진단 방식은 소요 시간을 단축하지만, 여전히 수동 핵산 추출과 열 순환 과정에 의존하므로 병상 옆(bedside)에서 사용하기에는 한계가 있습니다. 본 프로토콜에서는 자기 비드 기반의 핵산 정제와 고리 매개 등온 증폭법(LAMP)이 결합된 완전 통합형 디스크 모양의 미세 유체 칩(CD 칩)을 중심으로 한 현장 진단(point-of-care) 워크플로를 설명합니다. 단순화된 수동 액화 및 용해 단계를 거친 처리 시료는 두 개의 사전 포장된 시약 바이알과 함께 칩에 로딩됩니다. 이후 장비가 자율적으로 추출, 65 °C에서의 증폭, 실시간 형광 판독을 수행하여 11종의 세균, 3종의 진균, 1종의 비정형 병원균 등 총 15종의 표적에 대한 정성적 결과를 기기 작동 후 45분 이내에 제공합니다(수동 전처리 단계를 포함한 전체 시료-결과 워크플로는 약 1시간이 소요됩니다). 우리는 가래, 기관지 흡인물, 기관지폐포 세척액을 포함한 10개의 ICU 시료에서 검출 데이터를 제시하며, 여기에는 단일 병원균 감염 및 단일 칩에서 최대 7종의 미생물이 확인된 다중균 공동 감염 사례가 모두 포함되어 있습니다. 밀폐형 카트리지 설계는 에어로졸 오염 위험을 최소화하며, 단일 로딩 단계는 특수 교육을 필요로 하지 않아 이 시스템을 ICU 의료진을 위한 실용적인 병상 진단 도구로 활용할 수 있게 합니다.

서론

중환자실(ICU)의 중증 환자들 사이에서 인공호흡기 관련 폐렴(VAP)을 비롯한 하기도 감염은 이환율, 기계적 환기 기간 연장 및 과잉 사망률을 유발하는 지속적인 원인이 되고 있습니다1,2. 중환자실 획득 하기도 감염(LRTI)의 미생물학적 양상은 지역사회 획득성 질환과 현저하게 다릅니다. 다제내성 그람 음성균(Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii)이 주를 이루며, 종종 경험적 치료법을 어렵게 만드는 다균성 군집 형태로 나타납니다3,4. 기회성 진균은 여기에 복잡성을 더합니다. 한때 심각한 면역 억제 상태의 전형적인 특징으로 여겨졌던 침습성 폐 아스페르길루스증은 이제 비중성구 감소성 중환자실 환자, 특히 중증 인플루엔자와 COVID-19 이후에 발생하는 빈도가 높아지고 있음이 인식되고 있습니다5. 아스페르길루스증에 대한 기존의 진단 알고리즘은 수율이 낮은 배양법과 갈락토만난(GM) 항원 검사를 병행하지만, GM 분석은 이미 잘 알려진 진단 가능 시간대의 제약과 비중성구 감소성 숙주에서의 가변적인 민감도로 인해 한계가 있습니다6. 패혈증에 대해 적절한 항균 요법을 시작하는 것이 한 시간 지연될 때마다 사망률의 유의미한 증가와 연관됩니다7. 종합하면, 중환자실 감염의 신속함과 복잡성은 임상적 긴급성에 부합하는 진단 도구를 필요로 합니다.

표준 미생물 배양은 감수성 테스트에 필수적이지만, 기본적으로 속도 제한이 있습니다. 분석 소요 시간은 3~5일에 달하며, 까다로운 미생물은 누락되고, 진균 배양의 양성률은 낮은 수준에 머물러 있습니다8. 메타게놈 차세대 염기서열 분석(mNGS)은 편향 없는 대안을 제공하지만, 비용, 24~48시간의 처리 시간, 생물정보학 파이프라인에 대한 의존성, 그리고 제한적인 현장 진단 가능성으로 인해 임상 도입이 제약되고 있습니다9. PCR 기반 패널은 시간 간격을 좁혔으나, 여전히 다단계 핵산 추출, 열 순환 장비, 그리고 기존 방식의 경우 증폭 후 전기영동 과정이 필요합니다10. 이러한 플랫폼 중 중환자실(ICU)의 융합적 요구 사항인 1시간 미만의 속도, 최소한의 수작업 시간, 진균을 포함한 다중 병원균 검출 범위, 그리고 비실험실 인력도 다룰 수 있을 정도의 운영 간소화를 완전히 충족하는 것은 없습니다.

고리 매개 등온 증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 이러한 여러 제약 사항을 해결합니다. Notomi 등이 처음 기술한 이 방법은 가닥 치환 중합효소(strand-displacing polymerase)를 이용하여 6개의 서로 다른 영역을 인식하는 4~6개의 프라이머 세트를 통해 표적 DNA를 65 °C의 일정한 온도에서 증폭합니다11. 이 반응은 실시간 형광으로 검출 가능한 특징적인 줄기-고리(stem-loop) 및 콜리플라워 모양의 증폭산물 구조를 생성하며, 임계값 통과 후 수 분 이내에 S자형 곡선을 나타냅니다. 낮은 템플릿 농도에서의 민감도가 높으며, 다중 프라이머 설계는 위양성을 제한하는 선택성을 부여합니다12,13. 미세유체 칩 플랫폼과 결합하면, LAMP는 단일 검체 로딩으로 여러 표적에 대해 병렬적으로 수행될 수 있습니다14. 이전 연구에서는 LAMP 칩 시스템이 3시간 미만의 소요 시간으로 호흡기 병원체를 검출할 수 있음을 입증하였습니다15. 그러나 이러한 시스템의 주요 한계는 별도의 수동 DNA 추출 과정에 의존한다는 점이며, 이는 시간과 운영상의 복잡성을 증가시키고 오염 위험을 초래합니다.

여기에 기술된 시스템은 이러한 병목 현상을 제거합니다. 일회용 원판형 미세유체 칩(직경 86 mm)을 기반으로 구축된 이 시스템은 시료 로딩, 자기 비드 기반의 핵산 정제, 그리고 16-plex LAMP 증폭 과정을 하나의 밀봉된 카트리지에 통합하였습니다(그림 1). 운용자는 전용 처리 튜브를 사용하여 짧은 수동 액화-용해 단계를 수행한 후, 용해물과 두 개의 시약 바이알을 칩에 로드합니다(그림 2). 그 이후부터 기기가 추출, 65 °C에서의 등온 증폭, 그리고 형광 획득을 자율적으로 처리하여, 45분 이내에 11종의 박테리아, 3종의 진균(Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii), 1종의 비정형 병원체(Mycoplasma pneumoniae) 등 임상적으로 관련 있는 15가지 표적에 대한 정성적 판정 결과를 제공합니다. 내부 대조군으로 사용되는 neuroblastoma breakpoint family (NBPF) 유전자는 각 분석의 검체 적절성과 반응 무결성을 검증합니다. 본 프로토콜은 ICU 검체 수집부터 전처리, 칩 로딩, 자동 검출 및 결과 해석에 이르는 전체 워크플로우에 대한 단계별 지침을 제공하며, 임상 실험실 직원과 ICU 병상 팀 모두를 대상으로 합니다.

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프로토콜

모든 시료는 중국 의학과학원 북경협화병원 윤리심의위원회의 승인을 받은 프로토콜(승인 번호 I-24PJ1778)에 따라 수집되었습니다. 검체 수집 전, 각 참여자 또는 법적 대리인으로부터 서면 동의서를 얻었습니다. 표적 병원체 패널과 반응 웰 할당 내용은 표 1에 기재되어 있으며, 시료 전처리 과정에서 사용된 소모품은 표 2에 기재되어 있습니다.

1. ICU에서의 하기도 임상 검체 채취

  1. 객담 수집
    1. 음식물 찌꺼기와 구강 내 상재균을 제거하기 위해 깨끗한 물 또는 멸균 생리식염수로 구강을 3회 헹굽니다.
    2. 환자에게 두세 번 심호흡을 하도록 안내한 다음, 강하게 기침하여 하기도의 객담을 멸균 수집 컵에 직접 뱉어내게 하십시오.
      참고: 적합한 검체는 기관 하부에서 채취한 점성이 있거나 화농성 또는 혈성 streaks(혈흔)이 포함된 물질로 구성됩니다. 투명한 타액이나 후비루는 부적절하며, 이는 후속 검출 단계에 영향을 줄 수 있습니다.
  2. 기관지 흡인물(BAS) 채취
    1. 기관 삽관을 하지 않은 환자의 경우, 멸균 흡인 카테터(10~12 Fr 카테터, 흡인원은 -200 mmHg에 해당하는 -0.0267 MPa의 압력으로 설정)를 비강 또는 구강 경로를 통해 약 30 cm 깊이까지 삽입하십시오.
    2. 카테터를 회전시키면서 흡인을 적용하고 카테터를 천천히 제거합니다. 흡인된 분비물을 멸균 검체 트랩에 수집합니다.
      참고: 분비물이 적은 경우, 흡인 전 카테터를 통해 멸균 생리식염수 약 5 mL를 주입하십시오.
    3. 기계 환기 환자의 경우, 기관내관 크기에 따라 흡인 카테터를 선택하십시오. 7.0~7.5mm 튜브에는 10 Fr 카테터를 사용하고, 8.0mm 튜브에는 12 Fr 카테터를 사용하십시오.
    4. 흡인 전, 100% 산소로 30~60초 동안 환자를 사전 산소화하십시오. 인공호흡기 회로를 분리하고, 저항이 느껴질 때까지 선택한 카테터를 인공 기도를 통해 삽입하십시오.
    5. -0.0267 MPa(-200 mmHg에 해당)의 음압을 가하며, 무기폐 재발 및 저산소혈증을 최소화하기 위해 각 흡인 횟수 및 이에 따른 인공호흡기 분리 시간을 15초 이내로 제한하고, 흡인 후에는 100% 산소로 30~60초 동안 환자에게 다시 산소를 공급한다.
    6. 카테터를 통해 멸균 식염수 1~2mL를 주입하고 3초 동안 대기하십시오.
    7. 흡인을 적용하고 카테터를 제거하십시오. 흡인된 분비물을 멸균 검체 트랩에 수집하십시오. 검체 수집 직후 인공호흡기 회로를 즉시 다시 연결하십시오.
      참고: 검체의 병원 내 감염 오염을 방지하기 위해 전 과정에서 엄격한 무균 조작법을 준수하는 것이 필수적입니다.
  3. 기관지폐포 세척액(BALF) 수집
    1. 흉부 영상에서 표적 분절을 확인하십시오. 기관지경을 진입시켜 적절한 분절 또는 아분절 기관지에 고정시키십시오.
    2. 멸균 식염수 20-50 mL를 빠르게 주입하며, 이를 3-5회 반복합니다(총 60-120 mL). 각 주입 후 부드럽게 흡입하여 회수된 액체를 멸균된 밀폐 용기에 수집합니다.
      주의: 중환자실 환자의 기관지폐포 세척술(BAL) 중에는 지속적인 혈역학 및 환기 모니터링이 필수적입니다. 기계 환기 적용 대상자의 경우, 필요에 따라 인공호흡기 설정을 조정하십시오.
      참고: 일반적인 회수율은 주입량의 40~60%입니다. 회수량이 적은 경우 기관지경 팁의 위치를 재조정해야 할 수 있습니다.

2. 액화 및 병원체 용해

  1. #2 일회용 피펫을 사용하여 검체를 표시선(약 1 mL)까지 흡입한 후 액화 튜브에 분주합니다. 피펫 벌브를 반복해서 짜서 모든 점성 물질을 옮긴 다음 튜브 캡을 닫습니다.
    참고: BALF 또는 묽은 객담의 경우, 충분한 병원체 투입량을 확보하기 위해 피펫 용량의 2배를 로드하십시오.
  2. 액화 튜브를 손으로 1분 동안 강하게 흔듭니다. 시료를 육안으로 확인하며, 가시적인 점액 덩어리가 남지 않고 #1 일회용 피펫을 통해 저항 없이 검체가 자유롭게 흐를 때까지(균일하고 물과 같은 점성) 계속 흔듭니다. 최소 1분 동안 흔들되, 점성이 매우 높은 검체의 경우 이 기준이 충족될 때까지 시간을 연장하십시오.
  3. 용해 튜브의 밀폐 캡을 엽니다.
  4. #1 일회용 피펫을 사용하여 균질화된 시료 약 0.5 mL를 흡입하여 용해 튜브에 분주합니다.
  5. 밀폐 캡을 닫고 팁 캡이 단단히 조여졌는지 확인합니다.
  6. 용해 튜브를 시료 전처리 장치(SP 장치)에 고정될 때까지 눌러 안착시킵니다. Start를 누릅니다.
  7. SP 장치가 약 15분간 지속되는 자동 액화-용해 사이클(표 3의 파라미터)을 완료할 때까지 기다립니다.
    참고: 처리 중에 튜브를 열거나 제거하지 마십시오.

3. 칩 로딩 및 자동 검출

  1. 시약 및 시료 로딩
    1. CD 칩을 제거하십시오. 4 °C 보관하고 이를 실온(약 25 °C)로 10분 동안 처리한다.
      ​참고: 시약 병 O와 B 및 전처리된 용해물은 상온에서 사용하며, 칩 내 LAMP 증폭은 다음 온도에서 수행합니다. 65 °C (단계 3.2.3 및 다음을 참조하십시오. 표 3).
    2. 포일 파우치를 열고 칩을 평평한 표면에 놓으십시오.
    3. 캡을 시계 반대 방향으로 돌려 칩을 엽니다.
    4. 바이알 O를 가볍게 쳐서 액체를 바이알 바닥으로 모으십시오.
    5. 바이알 O의 캡을 열고, 노즐을 O 포트에 삽입한 후, 내용물 전체를 포트에 분주하십시오.
    6. 바이알 O를 폐기하십시오. 바이알 B와 B 포트를 사용하여 해당 절차를 반복하십시오.
    7. 처리된 용해 튜브를 SP 장치에서 제거하고 팁 캡을 제거하십시오.
    8. 튜브 팁을 S 포트에 맞추고 용해물 전체 부피를 칩에 분주하십시오.
    9. 사용한 용해 튜브를 폐기하십시오.
    10. 칩 캡을 시계 방향으로 돌려 두 번의 클릭 소리가 들려 완전히 밀봉되었음을 확인하십시오.
      주의: 포트의 충전이 불충분할 경우 개별 채널의 오류가 발생할 수 있습니다. 밀봉 전 분주가 완전히 되었는지 확인하십시오. 불완전한 밀봉 및 오염 위험을 방지하기 위해 캡 밀봉 시 PE 장갑을 착용하지 마십시오. 대신 라텍스 또는 니트릴 장갑 착용을 권장합니다.
  2. 기기 조작
    1. 자동 핵산 분석기의 전원을 켭니다. 다음을 누릅니다. 검출칩 호일 파우치의 바코드를 스캔하고, 환자 인적 사항과 검체 ID를 입력하십시오.
    2. 칩을 회전 스핀들에 장착하고, 클릭 소리가 나며 결합이 확인될 때까지 아래로 누르십시오.
    3. 태핑(Tap) 제시된 텍스트가 없으므로 번역을 시작할 수 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 제공해 주시기 바랍니다.장비가 원심분리 시약 분배, 자성 비드 추출, LAMP 증폭을 자율적으로 수행하며 65 °C및 형광 획득을 수행합니다. 실행 시간은 약 45분이며 (시약/시료 로딩 및 기기 작업 흐름은 다음으로 요약됩니다. 그림 3).
      참고: 작동 중에는 덮개를 열지 마십시오.
  3. 결과 해석
    1. 해당 소프트웨어는 2차 미분 최댓값 분석을 통해 각 S자형 증폭 곡선의 변곡점을 식별하고, 그에 해당하는 TP 값(양성 판정 시간)을 보고합니다.
    2. 각 TP 값을 해당 목록에 기재된 임계값과 비교하십시오. 표 4TP 값이 임계값 이하인 채널은 양성으로, 임계값을 초과하는 채널은 음성으로 분류하십시오.
    3. 내부 대조군 채널(well 16)이 12분 미만의 TP 값과 함께 S자형 증폭 곡선을 나타내는지 확인하십시오.
    4. 내부 대조군(internal control)이 실패한 경우 해당 런(run)을 거부하십시오. 새 칩을 사용하여 테스트를 반복하거나 검체를 다시 채취하십시오.

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결과

유효한 런(run)이 완료되면, 기기는 16개 모든 채널에 대한 실시간 형광 트레이스를 표시했습니다. 양성 채널은 자동으로 주석 처리된 TP 값과 함께 예상되는 S자형 증폭 kinetics를 나타냈으며, 음성 채널은 기저선 상태를 유지했습니다. IC 채널(well 16)은 모든 유효한 런에서 TP < 12 min인 S자형 곡선을 생성했습니다.

본 프로토콜의 파일럿 및 개념 증명 시연을 위해, 6개의 기관지 흡인물(BAS), 2개의 기관지지폐 세척액(BALF) 검체, 2개의 심부 객담(Spt) 검체를 포함하여 중환자실(ICU) 진료에서 접하는 다양한 임상 상황을 보여줄 수 있는 10개의 대표 검체를 선정하였습니다. 이러한 검체들은 병원균의 유병률을 추정하기보다는 단일 미생물 및 복합 다제내성균 사례를 포괄하도록 의도적으로 선택되었으며, 10개 중 8개는 다제내성균(각 2~7개 표적), 2개는 단일 미생물 사례였습니다. 전체 TP 데이터는 표 5...

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토론

중환자실(ICU) 감염 관리에서는 병원균의 신속한 식별이 매우 중요합니다. 본 연구에서 설명하는 시스템은 배양에 통상적으로 소요되는 3~5일의 병원균 식별 시간을 1시간 미만으로 단축하며, 이는 대개 1차 항균제 결정이 내려지는 시간 범위에 해당합니다7. 핵산 추출, 정제 및 16-plex LAMP 증폭 과정을 하나의 밀폐된 칩 내에 통합함으로써, 본 워크플로우는 이전 LAMP 칩 플랫폼의 주요 운영 병목 지점이었던 수동 DNA 추출 단계를 제거했습니다15. 그 결과, 전문적인 분자 생물학 교육을 받지 않은 인력도 수행할 수 있는 단일 로딩 절차가 구현되었습니다.

몇 가지 절차적 측면에서 특별한 주의가 필요합니다. 검체의 품질이 필수적입니다. 인공호흡기를 사용하는 환자의 경우, 구강인두 오염으로 인해 실제 병원체 신호가 가려질 수 있으므로 객담보다는 기관지 흡인물이나 기관지폐포 세척액과 같은 심...

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공개 사항

저자들은 이해 상충 관계가 없음을 밝힙니다.

감사의 글

비전염성 만성 질환-국가 과학 기술 주요 프로젝트(No. 2023ZD0516500), 국가 고수준 병원 임상 연구 기금(2026-PUMCH-A-103), CMB 공개 경쟁 프로그램(24-561) 및 북경협화 의과대학 부속병원 인재 양성 프로그램(No.UGG11571)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
자동 핵산 분석기Beijing Taihao Biotechnology Co., LtdTHE-T80-01TurboFlow T; 원심 분리 시약 분배, 자성 비드 추출, 65 °C에서의 LAMP 및 실시간 형광 검출 수행 (~45분 소요)
#1 일회용 파스퇴르 피펫Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen)Custom-made일회용 소모품; 0.5 mL; 균질화된 검체를 용해 튜브로 옮기는 데 사용
#2 일회용 파스퇴르 피펫Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen)Custom-made일회용 소모품; 2 mL; 검체를 액상화 튜브의 표시선까지 흡입하는 데 사용
CD 칩Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., LtdCustom-made일회용 소모품; 중앙 로딩 구역(포트 O, B, S), 자성 비드 정제 구역 및 16개의 반응 웰(15종의 병원체 표적 + NBPF 내부 대조군)이 있는 외곽 링을 포함한 86 mm 디스크
LAMP 반응 시약Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd16730ES80동결 건조 비드 형태로 CD 칩에 미리 저장된 LAMP 반응 시약
액상화 튜브Beijing Taihao Biotechnology Co., LtdCustom-made일회용 소모품; 튜브당 2 mL; 수동 균질화를 위한 검체 수용
용해 튜브Beijing Taihao Biotechnology Co., LtdCustom-made일회용 소모품; 튜브당 0.5 mL; 200 µm 필터 막이 있는 압축 가능한 실리콘 본체; 용해 시약 사전 충전됨
프라이머Sangon Biotech (Shanghai) Co., LtdCustom-madeCD 칩의 반응 챔버에 내장된 프라이머 혼합물
시료 전처리 장치Beijing Taihao Biotechnology Co., LtdTHE-R10-02TS-2000; 자동 액상화–용해 사이클 (~15분 소요)
단회 투여 바이알 “B”Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., LtdCustom-made일회용 소모품; 칩 내 사전 패키징된 시약; 테스트당 1개 사용; 4 °C에서 보관하고 로딩 전 실온(~25 °C)으로 평형화
단회 투여 바이알 “O”Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., LtdCustom-made일회용 소모품; 칩 내 사전 패키징된 시약; 테스트당 1개 사용; 4 °C에서 보관하고 로딩 전 실온(~25 °C)으로 평형화

참고문헌

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  12. Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): the better sibling of PCR? Cells. 2021;10(8):1931.
  13. Parida M et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 2008;18(6):407-421.
  14. Ou H et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 2021;10(10):11053-11066.
  15. Lai JX et al. Rapid detection of bacterial pathogens causing lower respiratory tract infections via microfluidic-chip-based loop-mediated isothermal amplification. J Vis Exp. 2024;(205):e66677.

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