초기 노화 단계의 인간 섬유아세포로의 텔로머라아제 mRNA 전달을 위한 최적화된 역전 transfection 프로토콜

요약

본 논문은 노화된 인간 섬유아세포에 뉴클레오사이드 변형 인간 텔로머라아제 역전사 효소(hTERT) mRNA(hTERT mRNA)를 효율적으로 전달하기 위한 최적화된 역전사 transfection 프로토콜을 제시합니다. 배양 표면을 hTERT mRNA-지질 복합체로 미리 코팅하면 섭취가 증가하여 텔로머라아제 활성화, 텔로미어 연장 및 부분적인 회춘이 가능해집니다. 배양 세포는 최종적으로 불멸화 없이 다시 노화 또는 위기 상태로 진입합니다.

초록

세포 노화는 막 유동성 감소, 엔도좀 수송 장애, 엔도사이토시스 능력 저하, 그리고 세포 외 RNase 활성 증가를 포함하여 세포 생리학의 심각한 변화와 연관되어 있으며, 이 모든 요인은 효율적인 mRNA 전달을 방해합니다. 이러한 장벽으로 인해 노화 세포, 특히 거대한 치료용 전사체를 전달하려는 RNA 기반 접근법의 적용이 제한되어 왔습니다. 본 프로토콜은 노화된 인간 섬유아세포에 변형된 메신저 RNA(mRNA)를 효율적으로 전달하기 위해 최적화된 역전이(reverse-transfection) 방법을 설명합니다. 인간 텔로머레이스 역전사 효소(hTERT) mRNA를 모델 전사체로 사용하였으나, 이 워크플로우는 다른 mRNA에도 폭넓게 적용 가능합니다. RNA-지질 복합체를 세포 부착 후 배양액에 첨가하는 기존의 전이 방법과 달리, 역전이는 세포 파종 전에 복합체를 배양 표면에 배치하여 부착되는 세포와 전이 복합체 간의 직접적인 상호작용을 가능하게 합니다. 전이 효율을 극대화하기 위해, 본 프로토콜은 슈도유리딘(pseudouridine)과 5-메틸시티딘(5-methylcytidine)을 포함하는 뉴클레오사이드 변형 mRNA, 연장된 poly(A) 꼬리, 최적화된 복합체 형성 타이밍, RNase 억제, 클로로퀸을 이용한 엔도좀 pH의 일시적 상승, 세포 파종 밀도 증가 및 배양 기간 연장을 포함합니다. 이 접근 방식을 사용하여 5 kb hTERT mRNA 전사체를 전달한 결과, 노화된 섬유아세포에서 약 50%–80%의 전이 효율을 달성했습니다. 텔로머레이스 활성의 정점은 전이 후 24–48 h 만에 검출되었습니다. 단 한 번의 전이 사이클로도 측정 가능한 텔로미어 연장이 나타났으며, 세 번의 연속적인 전이는 상당하지만 한정된 텔로미어 신장을 유도했습니다. 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성 감소, p16 및 p21 발현 감소, 세포 형태의 회복, 복제 수명 연장을 포함하여 노화 관련 표현형의 부분적 역전이 72–96 h 이내에 관찰되었습니다. 전달된 hTERT mRNA는 72–96 h 이내에 분해되었으며, 불멸화는 관찰되지 않았습니다. 본 프로토콜은 노화 세포에 일시적으로 mRNA를 전달하는 실용적인 방법을 제공하며, 다양한 세포 유형 및 종에 적용 가능할 것입니다.

서론

역전이(reverse transfection) 방식은 노화 세포가 표준 전이 방법에 대해 나타내는 근본적인 장벽을 극복하기 위한 중요한 방법론적 적응을 나타냅니다. 세포를 미리 배양하여 부착시킨 후 전이 복합체를 추가하는 순방향 전이(forward transfection)와 달리, 역전이는 부유 상태의 세포를 미리 형성된 hTERT mRNA-지질 복합체 위에 직접 추가하는 방식입니다. 이 기술은 막 재구성(membrane remodeling)이 가장 활발하게 일어나는 중요한 부착 단계 동안 전이 복합체에 대한 노출을 최대화함으로써 노화 세포의 전이 효율을 획기적으로 높여줍니다.

이 프로토콜의 핵심적인 개념적 전환은 노화 세포를 단순히 형질전환이 어려운 젊은 세포의 버전으로 보는 것이 아니라, 별도의 전달 문제로 취급하는 것입니다. 노화 과정에서 인지질, 스핑고지질 및 콜레스테롤을 포함한 막 지질 조성의 전반적인 변화는 막의 유동성, 곡률 및 단백질-지질 상호작용을 변화시키며, 노화 관련 분비 표현형(senescence-associated secretory phenotype)에 기여합니다^1,2,3. 또한 노화 세포는 클라트린 및 카베올래 매개 수용체 엔도사이토시스가 감소하고 엔도사이토시스 경로가 변경된 양상을 보이는데, 이는 부분적으로 amphiphysin-1의 하향 조절과 caveolin 발현의 보상적 변화로 인해 수용체 매개 섭취 및 신호 전달이 저해되기 때문입니다^4,5,6. 이와 동시에 Rab7이 조절하는 후기 엔도솜-리소좀 축과 더 광범위한 엔도솜-자가포식-리소좀(EAL) 네트워크의 조절 장애가 발생하며, 여기서 Rab7은 엔도리소좀 성숙과 자가포식소체-리소좀 융합의 핵심 조절자로 작용하며 이는 노화 및 신경퇴행성 질환에서 교란됩니다⁷.

노화 세포는 일반적으로 TFEB/TFE3 기반의 리소좀 생합성 및 샤페론 매개 오토파지를 포함하여 리소좀 처리 및 적응 시스템(LYPAS)의 여러 구성 요소를 상향 조절함으로써 리소좀 질량을 증가시킵니다. 하지만 개별 리소좀은 종종 루멘 pH 상승, 막 손상 및 단백질 분해 능력 변화를 보이며, 이는 리소좀의 수가 증가했음에도 불구하고 리소좀 기능 장애를 초래하는 원인이 됩니다^8,9,10,11. 종합적으로, 이러한 변화는 내부로 유입된 물질을 분해성 엔도리소좀 구획으로 더 효율적으로 이동시켜, 전달된 RNA 또는 단백질이 생산적인 세포질 방출 전에 분해될 가능성을 높입니다^9,10,11. 역형질전환(Reverse transfection)은 세포 부착 과정 중 막이 재구성되는 가장 초기 단계에 직접적으로 작용하여, 세포와 mRNA-지질 복합체 간의 지속적이고 높은 친화성 접촉을 강제함으로써, 완전히 부착된 노화 세포에서 손상된 정상 상태의 엔도사이토시스를 최소한 부분적으로 우회합니다^4,5,6,12.

RNA 설계 측면에서, 본 프로토콜은 노화 환경에서 단순한 캡(cap)과 꼬리(tail) 기반의 기본 구조로는 불충분하다고 가정합니다. 따라서 번역 과정을 엔도솜의 Toll-like 수용체 감지 및 제1형 인터페론 유도와 분리하기 위해, 완전한 뉴클레오사이드 변형(예: pseudouridine 또는 N1‑methylpseudouridine 및 5‑methylcytidine 추가)을 필수 사항으로 처리합니다. 기초 연구에 따르면, RNA에 변형된 뉴클레오사이드를 도입하면 TLR3, TLR7 및 TLR8의 활성화가 억제되고 수지상 세포의 사이토카인 생산이 현저히 감소하며, 이는 현재의 뉴클레오사이드 변형 mRNA 플랫폼의 선천적 면역원성 감소에 대한 기계론적 근거를 제공합니다¹³. mRNA-LNP 백신 및 mRNA 치료제에 관한 최신 리뷰에서는 선천적 면역 활성화를 최소화하는 동시에 in vivo 안정성과 번역을 높이기 위해 5′ 캡, UTR, 코딩 서열 및 poly(A) 꼬리의 통합적인 엔지니어링을 강조합니다¹⁴. 특히 poly(A) 꼬리의 길이와 구조는 in vitro 전사된 mRNA의 안정성과 번역 효율을 결정하는 핵심 요인으로 밝혀졌으며, 이는 치료용 mRNA에서 연장되거나 엔지니어링된 poly(A) 설계의 동기가 되었습니다¹⁵.

이에 더해, 본 프로토콜은 복합체 형성 및 흡수 과정 동안 세포 외 및 엔도좀 RNase로부터 보호하는 기전을 명시적으로 포함하며, chloroquine^16,17와 같은 일시적 리소좀 친화성 약물을 사용하여 정의된 엔도좀 탈출 창(endosomal‑escape window)을 설정합니다. Chloroquine은 오랫동안 엔도좀 장벽의 기능적 프로브로 사용되어 왔으며, 엔도좀 막의 붕괴와 핵산 화물의 세포질 내 탈출을 촉진함으로써 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 표적 결합 및 사이런싱 효과를 현저히 증가시킬 수 있습니다¹⁸. 동시에, LNP로 전달된 mRNA의 살아있는 세포 및 초고해상도 이미징 결과, 효율적인 전달은 초기/재순환 엔도좀에서의 드문 탈출 사건에 의해 심하게 제약되며, 초기 흡수 그 자체에 의한 것이 아님을 보여주었습니다. 이는 mRNA 치료제 개발 시 엔도좀 탈출 단계를 의도적으로 설계하는 것이 얼마나 중요한지를 강조합니다¹⁹.

종합적으로, 막 동역학, 엔도사이토시스 수송, 리소좀 처리 및 선천성 면역 활성에서의 이러한 노화 관련 변화들은 효율적인 mRNA 전달에 상당한 장벽이 됩니다. 본 연구에서 설명하는 역전이(reverse-transfection) 전략은 최적화된 mRNA 공학, RNase 보호, 강화된 엔도솜 탈출, 그리고 부착 세포를 미리 형성된 mRNA-지질 복합체에 직접 노출시키는 방법을 결합하여 이러한 한계를 해결하기 위해 개발되었습니다. 비록 hTERT mRNA를 모델 화물로 사용하였으나, 본 워크플로우는 노화되었거나 형질전환이 어려운 세포군에 다른 대형 치료용 mRNA 전사체를 전달하는 데 폭넓게 적용 가능합니다^20,21,22.

프로토콜

1. hTERT mRNA의 in vitro 전사

1. In vitro 전사(IVT) (ARCA 및 ΨUTP 사용)
   1. 표 1에 따라 20 µL IVT 반응액을 준비합니다. 더 많은 수득량이 필요한 경우 반응 규모를 선형적으로 확대하십시오.
   2. T7 RNA polymerase를 제외한 모든 반응 성분을 RNase-free 튜브에 혼합합니다. 마지막으로 T7 RNA polymerase를 첨가하고, 부드럽게 섞은 후 튜브를 짧게 원심분리합니다.
   3. 반응액을 37 °C에서 0.5–4 h 동안 배양합니다.
      참고: 템플릿 길이에 따라 배양 시간을 조정하십시오. 짧은 템플릿(약 500 bp)이 포함된 반응은 약 30 min 동안, 긴 템플릿(약 4 kb)이 포함된 반응은 3–4 h 동안 배양하십시오.
2. DNase 처리
   1. RNase-free DNase I 1 µL를 IVT 반응 혼합물에 직접 첨가합니다.
   2. 반응액을 37 °C에서 15 min 동안 배양합니다.
      참고: DNase 처리는 합성된 mRNA를 사전에 정제하지 않고 IVT 반응액에서 직접 수행해야 합니다.
3. mRNA 정제
   1. nuclease-free H₂O 115 µL를 첨가하여 반응 혼합물을 희석합니다.
   2. 제조사의 지침에 따라 RNA cleanup kit를 사용하여 mRNA를 정제합니다.
   3. 정제된 mRNA를 20–30 µL의 nuclease-free H₂O로 용출합니다.
   4. 분광광도법으로 mRNA 순도를 측정하고, 1.0–1.5% 변성 아가로스 겔 또는 저농도 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 RNA 무결성을 확인합니다.
4. Poly(A) tailing
   1. 표 2에 따라 50 µL poly(A)-tailing 반응액을 준비합니다. 반응 성분을 부드럽게 섞고 37 °C에서 30–60 min 동안 배양합니다.
      참고: 투입된 RNA 양에 따라 배양 시간을 조정하십시오.
   2. 0.5 M EDTA (pH 8.0) 2 µL를 첨가하여 반응을 종료합니다.
5. 최종 정제 및 품질 관리
   1. 제조사의 지침에 따라 RNA cleanup kit를 사용하여 poly(A)-tailed mRNA를 정제합니다.
   2. 정제된 mRNA를 20–30 µL의 nuclease-free H₂O로 용출합니다.
   3. 형질전환 단계로 넘어가기 전 mRNA 품질을 평가합니다.
      1. 260 nm에서 mRNA 농도를 측정하고 A260/A280 및 A260/A230 비율을 사용하여 순도를 결정합니다. A260/A280 값이 약 2.0이고 A260/A230 값이 2.0보다 큰 mRNA 준비물을 사용하십시오.
      2. 제조사의 지침에 따라 겔 전기영동 또는 RNA 분석 시스템을 사용하여 mRNA 무결성을 평가합니다.
      3. RT-PCR 또는 Bioanalyzer 분석을 통해 poly(A) 꼬리 길이를 확인합니다. poly(A) 꼬리 길이가 120에서 200 뉴클레오타이드 사이인지 확인하십시오.
      4. 정제된 mRNA를 소분하고, 동결-해동 반복을 최소화하기 위해 소분된 샘플을 −80 °C에 보관합니다.

2. 역전 transfection

1. Day −1: 형질전환 전 준비 단계
   1. 노화 표현형 확인
      1. 대표 세포 샘플에 대해 노화 관련 β-갈락토시다아제(SA-β-gal) 염색을 수행한다. 세포의 70% 이상이 양성인지 확인한다.
      2. qRT-PCR 또는 면역형광법으로 노화 마커(p16 및 p21)의 발현을 확인한다.
      3. 세포 생존율을 측정하여 생존율이 90%를 초과하는지 확인한다.
   2. 시약 준비
      1. 완전 배양 배지를 37 °C로 예열한다.
      2. 인산염 완충 식염수(PBS)를 37 °C로 예열한다.
      3. 신선한 Opti-MEM I 배지를 준비한다.
         참고: 사용 전 Opti-MEM I에 RNase 억제제를 첨가하지 마십시오.
2. Day 0: 형질전환일
   참고: 시약 준비부터 형질전환된 세포의 배양까지 약 3시간의 간격을 둡니다.
   1. hTERT mRNA 준비
      1. hTERT mRNA를 얼음 위에서 해동한다. mRNA 농도를 측정하고 0.5에서 1.0 µg/µL 사이의 농도인 준비물을 사용한다.
      2. 사용하는 배양 형식(표 3)에 따라 필요한 양의 hTERT mRNA를 Opti-MEM I에 희석한다. RNase 억제제를 최종 농도 0.5–1.0 U/µL가 되도록 첨가하고 부드럽게 섞는다.
      3. 복합체 형성 전까지 희석된 mRNA를 얼음 위에 유지한다.
         참고: RNase 억제제는 사용 직전에 첨가하십시오. 냉동 후에는 활성이 감소하므로 RNase 억제제가 포함된 상태로 mRNA를 보관하지 마십시오.
   2. 형질전환 시약 준비
      1. 멸균된 RNase-free 튜브에 6.0 µL의 형질전환 시약과 100 µL의 Opti-MEM I을 혼합한다. 피펫팅으로 부드럽게 섞는다.
      2. 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양한다.
         참고: 큰 hTERT mRNA 구조체(~5 kb)의 경우, 시약 대 mRNA 비율을 mRNA 100 ng당 시약 0.4에서 0.6 µL 사이로 최적화하십시오.
   3. mRNA-지질 복합체 형성
      1. 희석된 hTERT mRNA 용액(100 µL)을 희석된 형질전환 시약 용액(106 µL)에 첨가한다. 피펫팅을 5–6회 하여 부드럽게 섞는다.
      2. 혼합물을 실온에서 15–20분 동안 배양한다.
      3. 복합체 형성 시간을 30분을 초과하지 않도록 한다.
      4. 용액이 약간 뿌옇게 변하는 것을 통해 복합체 형성이 성공적으로 이루어졌는지 확인한다.
         참고: 복합체 형성 기간 동안 세포 준비를 수행하십시오.
   4. 역형질전환을 위한 세포 준비
      1. 노화 세포 배양물에서 배양 배지를 흡입하여 제거한다.
      2. 예열된 PBS(6-well 플레이트의 well당 2 mL)로 세포를 1회 세척한다.
      3. well당 0.05% trypsin-EDTA 500 µL를 첨가한다.
      4. 세포를 37 °C에서 3–5분 동안 배양한다.
      5. 혈청이 포함된 완전 배지 3 mL를 사용하여 트립신을 중화시킨다.
      6. 세포를 부드럽게 파쇄하여 단일 세포 현탁액을 얻는다.
      7. 헤모사이토미터 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정한다.
      8. 완전 배지 내 well당 2.0–2.5 × 10⁵ 세포를 포함하는 현탁액을 준비한다.
         참고: 노화 세포는 기계적 스트레스에 매우 취약하므로 과도한 트립신 처리를 피하십시오. 세포를 현탁 상태로 유지하고, 역형질전환 전에 미리 플레이트에 깔지 마십시오.
   5. 역형질전환
      1. 배양 플레이트 준비
         1. 6-well 플레이트의 각 well에 0.01% poly-L-lysine 500 µL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양한다.
         2. 사용 직전에 코팅 용액을 흡입하여 제거한다.
         3. 각 well의 중앙에 hTERT mRNA-지질 복합체 200 µL를 첨가한다.
         4. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 30분 동안 배양한다.
            참고: 플레이트 코팅은 복합체 형성과 세포 준비와 병행하여 수행하십시오.
      2. 세포 현탁액 준비
         1. 항생제가 없는 완전 배지 1800 µL에 2.0–2.5 × 10⁵ 세포를 현탁한다.
         2. 세포를 부드럽게 재현탁하여 균일한 단일 세포 현탁액을 얻는다.
            참고: 형질전환 중에는 항생제가 없는 배지를 사용하십시오.
      3. 복합체 위로 세포 파종
         1. 미리 형성된 hTERT mRNA-지질 복합체 위에 세포 현탁액 1800 µL를 직접 첨가한다.
         2. 세포가 고르게 분포되도록 플레이트를 각 방향으로 2–3회 부드럽게 기울인다.
            참고: 세포 첨가 후에는 현탁액을 피펫팅하지 마십시오. 이는 mRNA-지질 복합체를 파괴할 수 있습니다.
      4. 세포 배양
         1. 5% CO₂를 포함하는 습윤 배양기에서 세포를 37 °C로 6–8시간 동안 배양한다.
         2. 형질전환 2–3시간 후 광학 현미경으로 세포 부착 상태를 모니터링한다.
         3. 세포가 고르게 분포되어 있고 배양 표면에 부착되기 시작하는지 확인한다.
            참고: 부유 세포나 세포 파편이 과도하게 많으면 형질전환과 관련된 세포 독성을 나타낼 수 있습니다.

3. 세포독성 완화

1. 세포 손실이 20%를 초과하는 경우, transfection 노출 시간을 48 h로 단축하십시오.
2. 세포 생존율을 높이기 위해 transfection 기간 동안 10 µM ROCK 억제제 Y-27632를 배양액에 첨가하십시오.
3. transfection 6–8 h 후, 부분적으로 부착된 세포가 떨어지지 않도록 주의하며 transfection 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하십시오. 각 웰에 약 100 µL의 잔류 배지를 남겨둡니다.
4. 15% FBS가 첨가된 미리 데워진 신선한 완전 성장 배지 1 mL를 각 웰에 추가하십시오.
5. 배지를 교체한 직후, chloroquine을 최종 농도 10–20 µM이 되도록 첨가하십시오.
6. 5% CO₂가 포함된 습윤 인큐베이터에서 37 °C로 2 h 동안 추가로 배양하십시오.
7. chloroquine이 포함된 배지를 신선한 완전 성장 배지로 교체하십시오.
8. 계속적인 성장을 위해 배양물을 인큐베이터로 다시 옮기십시오.
   참고: 회복 기간 동안 세포의 형태와 생존력을 모니터링하십시오. 과도한 세포 박리나 파편이 관찰되면 transfection 관련 세포 독성이 나타난 것일 수 있습니다.

4. 형질전환 후 분석

1. 형질전환 24–48시간 후에 TERT 단백질 발현을 평가합니다.
2. 표준 실험실 절차에 따라 웨스턴 블롯팅 또는 면역형광 염색으로 TERT 단백질 수준을 측정합니다.
3. 동일한 간격 동안 적절한 텔로머레이스 활성 분석법을 사용하여 텔로머레이스 활성을 측정합니다.
   참고: 일시적으로 전달된 hTERT mRNA의 분해로 인해 텔로머레이스 활성은 일반적으로 48시간 후에 감소합니다.
4. 형질전환 48–72시간 후에 단색 다중 정량 PCR(MMqPCR) 또는 그에 상응하는 텔로미어 길이 분석 방법을 사용하여 텔로미어 길이를 평가합니다.
   참고: hTERT mRNA 전달이 성공적으로 이루어지면 감지 가능한 텔로미어 연장이 관찰될 수 있습니다.
5. 형질전환 7일 후에 노화 관련 및 회춘 관련 표현형을 평가합니다.
   1. 노화 관련 β-갈락토시다아제(SA-β-gal) 활성을 측정합니다.
   2. p16 및 p21 발현 수준을 측정합니다.
   3. Ki67 발현을 평가합니다.
   4. 광학 현미경으로 세포 형태를 검사합니다.
      참고: 처리된 배양 세포를 처리되지 않은 세포 또는 모의 형질전환된 노화 대조군과 비교하여 노화 관련 표현형 및 증식 특성의 변화를 평가합니다.

5. 반복 투여 프로토콜 (선택 사항)

1. 섹션 2-4에 설명된 대로 초기 transfection을 수행합니다.
2. 다음 일정에 따라 transfection을 반복합니다: 0일 차: 1차 transfection; 5일 차: 2차 transfection; 10-12일 차: 3차 transfection.
3. 세포를 부착 배양 상태로 유지하며, 후속 transfection 전까지 trypsin 처리하지 마십시오.
4. 섹션 2.2.1-2.2.3에 설명된 대로 신선한 hTERT mRNA-지질 복합체를 준비합니다.
5. 각 웰에서 배양액을 흡입하여 제거합니다.
6. 각 웰에 200 µL의 hTERT mRNA-지질 복합체를 직접 첨가합니다.
7. 복합체 첨가 직후 800 µL의 신선한 complete F-10 배지를 첨가합니다.
8. 5% CO₂가 포함된 습윤 인큐베이터에서 37 °C로 4-6시간 동안 세포를 배양합니다.
9. transfection 배지를 신선한 complete 배지로 교체합니다.
   참고: 누적된 transfection 관련 세포독성을 최소화하기 위해 처리 횟수를 최대 3회 transfection 사이클로 제한하십시오.

6. 순방향 형질전환 프로토콜 (2 µg/mL, 6-well 포맷)

1. Day −1: 세포 파종
   1. 0.05% trypsin-EDTA를 사용하여 노화 또는 조기 노화된 섬유아세포를 분리한다.
   2. 완전 배지로 trypsin을 중화시킨다.
   3. 세포 수와 생존율을 측정한다.
   4. 6-well plate의 well당 2.0–2.5 × 10⁵ cells 밀도로 세포를 파종한다.
   5. 세포가 약 60–80% 합류도(confluence)에 도달할 때까지 5% CO₂가 포함된 습윤 배양기에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양한다.
2. Day 0: hTERT mRNA-시약 복합체 준비
   1. 뉴클레오사이드 변형 hTERT mRNA 분주액을 얼음 위에서 해동한다.
   2. 멸균된 RNase-free tube(Tube A)에서 hTERT mRNA를 Opti-MEM으로 희석하여 최종 농도를 2 µg/mL로 맞춘다.
   3. Tube A에 RNase 억제제를 최종 농도 0.5–1.0 U/µL가 되도록 첨가하고 부드럽게 섞는다.
   4. 두 번째 RNase-free tube(Tube B)에서 mRNA 100 ng당 0.4–0.6 µL의 시약을 사용하여 트랜스펙션 시약을 Opti-MEM으로 희석한다.
   5. Tube B의 내용물을 Tube A에 부드럽게 섞으며 한 방울씩 첨가한다.
   6. 혼합물을 실온에서 15–20분 동안 방치한다.
3. Day 0: 정방향 트랜스펙션(Forward transfection)
   1. 세포의 합류도가 60–80%이며 건강한 형태를 보이는지 확인한다.
   2. 배양액을 흡입하여 제거한다.
   3. 예열된 PBS 1–2 mL로 세포를 1회 세척한다.
   4. 각 well에 예열된 완전 배지 또는 혈청 감소 배지 0.5 mL를 첨가한다.
   5. 선택적으로 chloroquine을 최종 농도 10–20 µM이 되도록 첨가한다.
   6. 단계 6.2.6에서 준비한 hTERT mRNA-시약 복합체 0.5 mL를 각 well에 첨가한다.
   7. plate를 부드럽게 흔들어 복합체를 균일하게 분산시킨다.
   8. 5% CO₂가 포함된 습윤 배양기에서 37 °C로 4–6시간 동안 세포를 배양한다.
      ​참고: 노화된 세포의 경우 필요한 경우 배양 시간을 6–8시간으로 연장한다.
   9. 트랜스펙션 배지를 흡입하여 제거한다.
   10. 각 well에 신선한 완전 배지 2.0 mL를 첨가한다.
   11. 섹션 4에 기술된 대로 트랜스펙션 후 분석을 수행한다.
       참고: 정방향 및 역방향 트랜스펙션 조건을 비교할 때는 동일한 hTERT mRNA 배치, 트랜스펙션 시약 및 공칭 용량을 사용한다.

결과

d2EGFP-T2A-hTERT modRNA는 불안정화된 EGFP(d2EGFP) 리포터가 자가 절단 T2A 펩타이드를 통해 인간 TERT에 연결된 하이브리드 오픈 리딩 프레임으로 설계되었습니다. 모든 컨스트럭트의 전체 뉴클레오타이드 및 단백질 서열은 Supplementary File 1에 제공되어 있습니다. 번역 효율과 mRNA 안정성을 높이기 위해 코딩 서열의 양 끝에는 합성 5′ 비번역 지역(UTR)과 인간 β-globin의 3′ UTR을 배치하였습니다(Figure 1A). 발현 카세트에는 또한 T7 중합효소의 프로세싱 능력을 향상시키고 조기 전사 종결을 줄이기 위해 설계된 합성 효소 안정화 서열(Es)과 합성 전사 증폭 서열(TEs)이 포함되었습니다. T7 프로모터 하단에 클로닝한 후, anti-reverse cap analog(ARCA)와 변형 뉴클레오타이드(m5CTP 및 ΨUTP)를 사용하여 in vitro 전사를 수행하였으며, 이어서 효소적 poly(A) tailing(약 120–200 nt)을 통해 캡핑되고 폴리아데닐화된 고무결성의 d2EGFP-T2A-hTERT modRNA를 생성하였습니다(Figure 1A).

자동 전기영동 RNA 분석을 통해 전사체가 효율적으로 합성되었음을 확인하였으며, 다양한 투입량 전반에서 분해 산물이 최소화된 상태로 예상 크기의 주요 RNA 종이 나타나 전장 modRNA가 성공적으로 생성되었음을 입증하였다(그림 1B). 초기 노화 단계의 LF1 섬유아세포에 2 µg/mL d2EGFP-T2A-hTERT modRNA를 형질전환시킨 후, 24 h 이내에 hTERT 단백질이 검출되었으며 48–96 h 동안 높은 수준으로 유지되어 합성 전사체가 지속적으로 번역되고 있음을 나타냈다(그림 1C). 연결된 d2EGFP 리포터를 분석한 결과, 역형질전환(reverse transfection) 후에는 강력한 형광이 나타난 반면, 순형질전환(forward transfection) 후에는 형광이 상당히 낮게 관찰되었다(그림 1D,E). 이러한 결과는 초기 노화 단계의 LF1 섬유아세포에서 역형질전환 방식을 사용할 때 hTERT modRNA의 전달 및 발현이 향상됨을 시사한다.

초기 노화 단계의 LF1 섬유아세포에 d2EGFP-T2A-hTERT modRNA를 5일 간격으로 반복적으로 forward transfection (FT) 한 결과, monochrome multiplex quantitative PCR (MMqPCR) 측정 시 mock-transfected 대조군에 비해 평균 텔로미어 길이(rT/S)가 점진적으로 증가하는 것이 확인되었습니다(그림 2A). rT/S 비율은 매 FT 사이클 이후 증가하였으며, 통계적 유의성은 *P < 0.05에서 **P < 0.01로 향상되었습니다.

역전이(reverse transfection, RT)를 이용해 동일한 투여 일정을 적용한 결과, 텔로미어 길이가 더욱 뚜렷하게 증가하였다. rT/S 비율은 각 RT 사이클 이후 증가하였으며, 모의 전이(mock-transfected) 대조군과 비교하여 매우 유의미한 차이를 보였다 (*P < 0.05 ~ ****P < 0.0001) (그림 2B). 3회의 처리 사이클 후 FT와 RT를 직접 비교한 결과, 두 방법 모두 모의 전이 대조군에 비해 rT/S 값을 유의하게 증가시켰으나, 동일한 투여량 및 시간 조건에서 RT가 FT보다 더 큰 증가를 유도하였다 (*P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001) (그림 2C).

장기 성장 분석 결과, hTERT modRNA의 반복적인 전달이 복제 수명을 연장시키는 것이 추가로 입증되었습니다(그림 2D). 한 번, 두 번 또는 세 번의 처리 사이클을 거친 세포들은 모의 형질전환 대조군보다 점진적으로 더 큰 누적 집단 배가수를 나타냈습니다. 특히 RT를 통해 hTERT modRNA 처리를 세 차례 받은 배양물은 약 250일에 걸쳐 대조군 성장 곡선과 가장 큰 차이를 보였습니다(최대 ****P < 0.0001). 집단 배가수 계산법은 보충 파일 2에 제시되어 있습니다.

d2EGFP-T2A-hTERT modRNA를 트랜스펙션한 초기 노화 LF1 섬유아세포는 트랜스펙션 48시간 후에 강한 TRAP 래더링을 보인 반면, mock 및 eGFP-modRNA 처리 세포는 배경 신호만을 나타냈으며, 이는 텔로머레이스 활성이 외인성 hTERT 발현에서 기인했음을 나타냅니다 (그림 3A). 열 전처리는 래더링 패턴을 소실시켜 어세이의 특이성을 확인해주었습니다 (그림 3B).

시계열 분석 결과, 텔로머레이스 활성은 트랜스펙션 후 24~48시간 사이에 정점에 도달한 후 점차 감소하여 72~96시간에는 기저 수준에 가깝게 돌아왔음을 확인하였다(그림 3C). hTERT modRNA 농도를 50에서 3,000 ng/mL로 높였을 때 TRAP 신호 강도가 이에 상응하여 증가하였으며, 이는 용량 의존적인 텔로머레이스 활성화를 보여준다(그림 3D).

야생형(wild-type), 촉매 불활성(CI) 및 핵 국소화 신호 결핍(ΔNLS) hTERT 구조체를 이용한 기능 분석 결과, 야생형 hTERT만이 강력한 텔로머레이스 활성을 생성하는 것으로 나타났습니다. CI 및 ΔNLS 변이체는 유사한 전달 조건에도 불구하고 그에 상응하는 활성을 유도하지 못했습니다(그림 3E). 이러한 결과와 일치하게, MMqPCR 분석 결과 야생형 hTERT modRNA를 처리한 세포에서만 평균 텔로미어 길이의 현저한 증가(rT/S ≈ 1.4)가 확인되었습니다. CI-hTERT, ΔNLS-hTERT 또는 mock 처리를 한 세포는 기저 수준에 가깝게 유지되었습니다(rT/S ≈ 0.3; ****P < 0.0001) (그림 3F).

5일 간격으로 hTERT modRNA를 이용해 3회 연속 역형질전환을 수행한 결과, 노화 관련 β-galactosidase 양성 세포의 비율이 유의하게 감소하였습니다. 최종 형질전환 15일 후, 양성 세포의 비율은 mock 처리 배양군의 약 85%에서 hTERT 처리 배양군의 약 40%로 감소하였습니다 (***P < 0.001) (그림 4A).

공초점 면역염색 결과, mock 처리된 대조군과 비교하여 hTERT 역전 transfection을 3회 수행한 세포에서 Ki67 발현이 증가한 것이 확인되었으며, 이는 증식 활성이 증가했음을 나타냅니다(그림 4B). RT-qPCR 분석 결과, hTERT 처리 후 노화 관련 마커인 p16 및 p21의 발현이 감소한 것이 추가로 입증되었습니다. mock 처리된 초기 노화 세포와 비교하여 p16 발현은 약 2.3배에서 0.7배로 감소했고, p21 발현은 약 11배에서 6배로 감소했습니다(**P < 0.01; ****P < 0.0001) (그림 4C,D). 부록 그림 1은 chloroquine (CQ) 또는 Y-27632 단독 처리가 mock transfection된 세포의 p16 또는 p21 발현을 유의하게 변화시키지 않았음을 추가로 보여줍니다. 반면, 3회의 hTERT 역전 transfection 동안 CQ와 Y-27632를 병용 투여했을 때, hTERT 역전 transfection 단독 처리나 각 약물을 개별적으로 처리했을 때보다 p16과 p21 발현이 가장 크게 감소했으며, 단일 약물 처리는 중간 정도의 효과를 보였습니다. 이러한 결과는 CQ와 Y-27632의 병용 사용이 hTERT mRNA 역전 transfection 이후 노화 관련 마커의 발현 감소를 강화했음을 나타냅니다. 종합적으로, 이러한 발견은 hTERT mRNA의 반복적인 역전 transfection이 초기 노화 LF1 섬유아세포에서 텔로미어 연장을 촉진하고, 노화 관련 마커를 감소시키며, 증식 특성을 향상시킨다는 것을 입증합니다.

그림 1: 초기 노화 LF1 섬유아세포에서 d2EGFP‑T2A‑ hTERT mRNA의 설계, 합성 및 기능 검증. (A) hTERT와 불안정화된 EGFP의 동시 발현을 위해 T2A 펩타이드로 연결된 d2EGFP 카세트를 포함하는 하이브리드 hTERT mRNA 구조의 모식도. d2EGFP-T2A-hTERT ORF는 인간 β-글로빈 유전자(HBB)의 3’ UTR과 합성 5’ UTR 사이에 위치한다. mRNA는 변형된 뉴클레오타이드를 사용하여 합성되었으며, 최종적으로 poly (A) 꼬리가 추가되었다. (B) 자동 전기영동 RNA 분석으로 분석한 in vitro 전사를 이용한 고순도 d2EGFP-T2A-hTERT mRNA의 효율적 합성. (C) 2 µg/mL의 d2EGFP-T2A-hTERT mRNA를 트랜스펙션한 후, 자동 모세관 기반 면역 분석법을 사용하여 분석한 hTERT 단백질 발현의 시간 경과 분석. (D) 초기 노화 일차 이배체 섬유아세포(LF1)에서 순방향 트랜스펙션(FT)과 역방향 트랜스펙션(RT) 간의 EGFP 발현을 통해 평가한 d2EGFP-T2A-hTERT mRNA 트랜스펙션의 효율성 및 발현. 스케일 바 = 10 µm. (E) 순방향 또는 역방향 트랜스펙션 후 eGFP 신호의 평균 형광 강도(MFI) 정량화. 각 조건에 대해 5개의 생물학적 반복 실험에서 4개의 서로 다른 영역을 포함하여 총 20개의 개별 이미지를 분석하였다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. **P < 0.01; Welch 교정을 적용한 unpaired t-test로 평가됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 초기 노화 LF1 섬유아세포에서 hTERT mRNA의 반복적인 순방향 및 역방향 transfection 후의 텔로미어 길이 역학 및 증식 수명. (A) 평균 텔로미어 길이(rT/S)를 Telomere MMqPCR을 사용하여 결정하였다. 초기 노화 섬유아세포에 Population Doubling (PD) #76부터 5일 간격으로 d2EGFP-T2A-hTERT mRNA를 세 번 연속 순방향 transfection (FT) 하였다. 오차 막대는 SEM을 나타내며, n = 5 생물학적 반복 실험 결과이다; mock만 처리한 세포와 비교하여 *P < 0.05, **P < 0.01. (B) (A)와 유사하게, 초기 노화 세포에 Population Doubling (PD) #76부터 5일 간격으로 d2EGFP-T2A-hTERT mRNA를 세 번 연속 반복 transfection (RT) 했을 때의 rT/S를 평가하였다. 오차 막대는 SEM을 나타내며, n = 7 생물학적 반복 실험 결과이다; mock만 처리한 세포와 비교하여 *P < 0.05, ****P < 0.0001. (C) 5일 간격으로 3회의 순방향 및 역방향 transfection을 연속적으로 수행하거나 mock만 처리한 후의 평균 텔로미어 길이(rT/S) 비교. 오차 막대는 SEM을 나타내며, n = 10 생물학적 반복 실험 결과이다; *P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. (D) PD# 76부터 5일 간격으로 2 µg/ml d2EGFP-T2A-hTERT mRNA 또는 mock만을 한 번, 두 번 또는 세 번 연속 transfection한 LF1 섬유아세포의 성장 곡선. 검은색 화살표는 처리 시점을 나타낸다. 성장 곡선은 세 번 반복되었으며, 각 세포군은 세 번 중복 배양되었다. 생물학적 샘플당 3회의 기술적 반복 실험을 수행하였으며, 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. Brown-Forsythe 및 Welch’s ANOVA 테스트로 평가한 결과 *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 촉매 활성이 있고 핵에 국소화된 hTERT mRNA는 일시적이고 용량 의존적인 텔로머레이스 활성 급증을 유도하며, 이는 초기 노화 LF1 섬유아세포에서 측정 가능한 텔로미어 연장을 촉진하기에 충분하다. (A) 초기 노화 세포에 mock, eGFP 또는 d2EGFP-T2A-hTERT mRNA를 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 48 h 후, 20,000개의 세포로부터 세포 추출물을 준비하여 TRAP assay를 수행하였다. 반응 생성물을 native PAGE로 전기영동하고 SYBR Green으로 염색하였다. (B) TRAP assay를 사용하여 측정한 열 유도 텔로머레이스 불활성화. (C) hTERT mRNA 트랜스펙션 후 초기 노화 LF1 세포에서 시간에 따른 텔로머레이스 활성을 분석한 결과, 활성이 72 h 이내에 기저 수준으로 돌아와 효소 활성화가 일시적임을 보여주었다. (D) 초기 노화 LF1 세포에 다양한 양의 d2EGFP-T2A-hTERT mRNA (0–3,000 ng/mL)를 처리하였을 때, 용량에 비례하여 텔로머레이스 활성이 증가함을 보여주었다. (E) 2 µg/ml TERT 전달은 초기 노화 LF1 세포에서 텔로머레이스 활성을 증가시켰다. ΔNLS는 세포질에서 작동하지만 핵으로 전이되지 않으므로, 텔로미어 연장을 유도하지 않고 텔로머레이스 활성을 부분적으로 증강시켰다. 반면 CI TERT mRNA는 이러한 효과를 일으키지 않아 서로 다른 기능적 결과를 나타냈다. (F) 기능성 TERT, 핵 국소화 신호 결손(ΔNLS) 및 촉매 불활성(CI) TERT 역트랜스펙션이 초기 노화 LF1 세포의 평균 텔로미어 길이(rT/S)에 미치는 영향으로, 텔로미어 연장에 있어 핵에 국소화된 촉매 활성 TERT의 중요성을 나타낸다. 오차 막대는 SD를 나타내며, n = 7 생물학적 반복 실험 결과이다. Welch 보정을 적용한 one-way ANOVA로 평가했을 때 mock만 처리한 세포와 비교하여 ****P < 0.0001이다. RTA%-상대적 텔로머레이스 활성(대조군의 %)이 각 레인 하단에 표시되어 있다. TRAP 샘플 래더와 ITAS 밴드(내부 대조군- IC)의 강도 수준 비율은 각 레인에 대해 다음 공식을 사용하여 계산하였다: Activity _normalized = Ladder intensity/ IC intensity. 각 샘플은 다음 공식을 사용하여 양성 대조군(양성 대조군; H1299 2,500 cells)에 대해 백분율로 정규화하였다: Relative activity (%) =Activity _normalized (sample)/ Activity _normalized (reference). 각 단계에서 배경 감산(Background subtraction)이 적용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4최적화된 hTERT mRNA 역형질전환은 초기 노화 단계의 LF1 섬유아세포에서 노화 관련 표현형을 부분적으로 역전시키고 증식 마커를 회복시킨다. (A) 의 대표 이미지 β5일 간격으로 변형된 hTERT mRNA를 3회 연속 transfection한 후 $\beta$-gal을 발현하는 초기 노화 LF1 세포. 스케일 바 = 100 µm. β마지막 트랜스펙션 15일 후에 -gal 발현을 분석하였습니다. 실험은 세 번 반복 수행되었으며 >샘플당 100개의 세포를 수동으로 판독함. (B) 증식 마커인 Ki67로 염색한 초기 노화 LF1 세포의 대표 공초점(20배 배율) 이미지. 스케일 바 = 100 µmhTERT를 이용한 3회 역전이(reverse transfection) 후 Ki-67 발현의 유의미한 증가. 3회 이후 Ki-67 양성 핵의 비율이 유의미하게 증가함× hTERT (RT). 그래프는 평균값을 나타냅니다. ± Mock-transfected 조건으로 정규화한 Ki67 양성 핵 수의 표준편차(SD). 각 조건에 대해 총 18장의 이미지를 분석하였으며, 3회의 생물학적 반복 실험(n = 3 biological replicates) 각각에서 6개의 서로 다른 시야를 선택하였다. ****P < 0.0001. (C) 3일 후 노화 마커 발현× RT-qPCR로 평가한 hTERT 매개 부분 회춘(n = 6). 모든 데이터는 평균값을 나타냄 ± 표준편차(SD).P < 0.01; ****P < Welch 보정 unpaired t-test로 평가한 결과, 0.0001였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

구성 요소	부피/최종 농도
PCR 템플릿 DNA	200 –1000 ng
10× IVT 버퍼	2 μL
ATP (100 mM)	2 μL (최종 농도 10 mM)
GTP (100 mM)	1.5 μL (최종 농도 7.5 mM)
CTP (100 mM)	2 μL (최종 농도 10 mM)
m1Ψ-5′-TP (100 mM)	2 μL (최종 농도 10 mM) (일반 UTP를 1:4-2:2 비율로 혼합하여 첨가함으로써 pseudo-UTP의 삽입 효율을 높일 수 있습니다(m1Ψ-5′-TP:UTP).)
ARCA (10 mM)	4 μL (최종 농도 2 mM)
RNase 억제제 (40 U/μL)	0.5 μL (20 U)
T7 RNA 중합효소 (50 U/μL)	2 μL (100 U)
뉴클레아제 제거 H₂O	20 μL

표 1: 뉴클레오사이드 변형 hTERT mRNA 합성을 위한 인비트로 전사(IVT) 반응 조성. ARCA-캡핑 IVT 합성에 사용된 반응 구성 요소와 최종 양이 나열되어 있습니다.

성분	부피/최종 농도
정제된 mRNA 최대 5 μg	≤20 μL
10× Poly(A) Tailing Buffer	5 μL
ATP (10 mM)	5 μL (최종 1 mM) (이미 버퍼에 포함되어 있으나, 추가로 첨가하면 poly A 안정화에 도움이 됩니다.)
Poly(A) Polymerase (5 U/μL)	1 μL (5 U)
Nuclease-free H₂O	최종 부피 50 μL까지

표 2: hTERT mRNA의 전사 후 수정을 위해 사용된 poly(A)-tailing 반응의 조성. 120–200 nucleotide poly(A) tail 생성을 위한 시약 부피 및 반응 조건이 표시되어 있다.

매개변수	12-Well 포맷	6-Well 포맷
성장 표면적	~3.8 cm²	~9.5 cm²
웰당 배지 양	1.0 mL	2.0 mL
세포 파종 수	5× 104–6.5× 104 Cells/ml	2.0–2.5 × 10⁵
평균 세포 수 (100% 합류도 기준)	5.7× 104–7.2× 104 Cells/ml	2.9–3 × 10⁵
mRNA 트랜스펙션 양	750 –1000ng	2000–3500 ng
mRNA 트랜스펙션 시약	1.5 – 3.0 µL	4.75 – 7 µL
Opti-MEM 내 mRNA + 트랜스펙션 시약의 최종 부피	50 µL	200 µL

표 3: 6-웰 및 12-웰 배양 형식에서 hTERT mRNA 전달을 위한 권장 트랜스펙션 파라미터. 정방향 및 역방향 트랜스펙션 실험에 사용된 세포 파종 밀도, mRNA 양, 트랜스펙션 시약 부피 및 복합체 형성 부피를 요약하였다.

보충 그림 1: 반복적인 hTERT mRNA 역전이 후 노화 관련 p16 및 p21 발현에 미치는 chloroquine과 Y-27632의 영향.(A) 표시된 바와 같이 chloroquine (CQ), Y-27632 또는 이들의 조합으로 처리한 mock 처리군 및 3× hTERT 역전이 (RT) LF1 섬유아세포의 p16 mRNA 발현에 대한 정량적 RT-PCR 분석. (B) 동일한 실험 조건에서의 p21 mRNA 발현에 대한 정량적 RT-PCR 분석. 전사체 수준은 RpL13a로 정규화되었으며 젊은 대조군 세포 (PD#12)에 상대적으로 표현되었다. 개별 데이터 포인트는 생물학적 반복 실험을 나타낸다. 데이터는 n = 2 생물학적 반복 실험의 평균 ± SD이며, 생물학적 반복 실험당 5회의 기술적 반복 실험이 수행되었다. 통계적 유의성은 그림에 표시되어 있으며, ns는 유의하지 않음을 나타낸다. Brown–Forsythe 및 Welch's ANOVA로 결정된 결과, *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001이다. 약어: CQ, chloroquine; RT, 역전이; Y-27632, Rho-associated protein kinase (ROCK) 억제제.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: hTERT 발현 구조체의 DNA 및 단백질 서열.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 세포 집단 배가(Population doubling, PD) 계산.세포 집단 배가(PD)는 PD = log₂ (Nf/N₀) 공식을 사용하여 계산하였으며, 여기서 N₀는 파종된 세포 수이고 Nf는 회수된 생존 세포 수입니다. 누적 PD는 계대 배양 전반에 걸쳐 PD 값을 합산하여 결정하였습니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 연구는 세포 노화를 증식 생리학의 사소한 변형이 아닌 별개의 전달 문제로 재정의하고, 노화 상태의 생물물리학적 및 면역학적 제약 조건에 맞춘 텔로머라제 mRNA 트랜스펙션 전략을 개발합니다. 노화 세포는 경직되고 콜레스테롤이 풍부한 막과 감소된 엔도사이토시스 활성을 나타내어, 핵산의 효율적인 전달에 상당한 장벽을 형성합니다. 본 프로토콜은 역전이(reverse-transfection) 방식을 채택하여 노화 세포가 막 리모델링을 거치고 막 가소성이 증가하는 일시적인 부착 기간을 활용함으로써, 세포-복합체 접촉을 흡수 잠재력이 향상된 시기와 동기화합니다^3,4. 대표적인 결과에 따르면, 이 전략은 기존의 순방향 트랜스펙션(forward transfection)과 비교하여 hTERT modRNA의 전달 및 발현을 개선하며, 이는 더 큰 텔로미어 신장과 더 뚜렷한 회춘 관련 표현형으로 이어집니다.

이 방법의 핵심 특징은 노화 세포의 세 가지 주요 장벽인 내재성 면역 신호 전달의 증가, RNA 분해의 가속화, 그리고 번역 능력의 저하를 해결하기 위해 설계된 다층적 mRNA 엔지니어링 전략입니다^23,24,25. pseudouridine과 5-methylcytidine의 도입은 TLR3, TLR7/8 및 RIG-I 신호 전달 경로의 활성화를 감소시키는 동시에 전사체의 안정성과 번역 효율을 향상시킵니다^13,26. ARCA capping 및 poly(A) 꼬리 최적화는 전사체 안정성과 번역 출력물을 더욱 개선하여, 강력하면서도 일시적인 hTERT 발현을 가능하게 합니다. 이전 연구들과 일관되게, 이러한 수정 사항들은 외인성 RNA 전달과 관련된 내재성 면역 활성화를 최소화하면서 효율적인 텔로머레이스 발현을 지원합니다.

이 프로토콜은 노화된 배양물의 특징인 RNase가 풍부한 세포 외 환경 문제도 다룹니다²⁷. 뉴클레오사이드 변형, 지질 복합체 형성 및 트랜스펙션 직전 RNase 억제제 첨가를 통해 RNA 보호 능력을 향상시켰습니다. 또한, 역트랜스펙션(reverse transfection) 시점을 노화된 세포의 더 느린 부착 역학에 맞게 조정하여, 세포 부착 과정 동안 세포와 mRNA-지질 복합체 간의 상호작용 시간이 충분히 확보되도록 하였습니다. 이러한 수정 사항들은 종합적으로 트랜스펙션이 까다로운 세포군에서 화물(cargo)의 성공적인 흡수 확률을 높여줍니다.

엔도솜 탈출은 노화 세포의 mRNA 전달에 있어 두 번째 핵심적인 병목 지점이 됩니다. 노화 세포는 리소좀 함량이 증가하고, 엔도사이토시스로 유입된 화물이 분해 구획으로 이동하는 트래픽 현상이 강화되는 특성을 보입니다^17,28. 형질전환 후 초기 단계에서 클로로퀸에 일시적으로 노출시키면 엔도솜 탈출이 촉진되고 내부로 유입된 mRNA의 리소좀 분해가 감소하여 기능적 전달 효율이 향상됩니다. 최적 용량과 노출 시간은 세포 유형에 따라 다를 수 있으나, 본 결과는 엔도솜 탈출을 강화하는 것이 노화된 섬유아세포의 전달 효율을 상당히 개선한다는 것을 보여줍니다.

기능적 수준에서, hTERT modRNA를 반복적으로 투여한 결과 상대적 텔로미어 길이가 누적되어 증가하고, 복제 수명이 연장되었으며, 여러 노화 관련 표현형이 감소하였습니다. 반복적인 hTERT 처리를 받은 세포는 모의 형질전환 대조군에 비해 SA-β-gal 활성이 감소하고, p16 및 p21 발현이 저하되었으며, Ki67 발현이 증가하고 증식 능력이 향상된 모습을 보였습니다. 중요한 점은 텔로머라제 활성이 일시적으로 유지되었으며, 형질전환 후 수일 내에 거의 기저 수준으로 돌아왔다는 것입니다. 이러한 일시적 발현 프로파일은 영구적인 유전자 변형을 피하면서도, 측정 가능한 생물학적 효과를 촉진하기에 충분한 텔로머라제 활성을 제공합니다. 다만, MMqPCR로 얻은 상대적 텔로미어 길이 측정값은 절대적인 텔로미어 연장 정도를 직접적으로 정량화한 것은 아니라는 점에 유의해야 합니다. 향후 말단 제한 단편 분석(terminal restriction fragment analysis), 정량적 형광 제자리 하이브리드법(quantitative fluorescence in situ hybridization), Flow-FISH 또는 TeSLA 방법론을 통합한 연구를 통해 hTERT mRNA 전달 이후의 텔로미어 길이 역동성에 대한 더욱 정밀한 평가가 가능할 것입니다.

몇 가지 고려해야 할 제한 사항이 있습니다. 노화 세포군은 본질적으로 이질적이며, 노화 유도 방법, 공여자 기원 및 배양 이력에 따라 mRNA 전달에 대한 반응성이 다를 수 있습니다. 결과적으로, 형질전환 효율과 회춘 결과는 실험 시스템마다 다를 수 있습니다. 또한, 텔로머라제 재활성화는 주로 세포 노화의 텔로미어 의존적 측면을 해결하며, 노화의 모든 특징을 직접적으로 교정하지는 않습니다. 후성유전학적 표류, 미토콘드리아 기능 장애, 단백질 항상성 변화 및 만성 염증 신호 전달과 같은 노화 관련 변화는 텔로미어 연장이 성공적으로 이루어진 후에도 지속될 수 있습니다^29,30. 따라서 본 프로토콜은 포괄적인 회춘 전략이라기보다 텔로미어 유도 노화를 연구하고 부분적으로 되돌리기 위한 표적 도구로 간주되어야 합니다.

본 프로토콜에 기술된 파라미터는 노화된 인간 세포를 위한 실질적인 가이드라인으로 의도되었으며, 발표된 연구 및 실험 경험을 바탕으로 반복적인 최적화를 통해 개발되었습니다. 세포 밀도, transfection 시약 대비 mRNA 비율, 복합체 형성 시간 및 엔도솜 탈출 조건 등의 요인은 개별 세포 유형 및 실험 설정에 따라 조정이 필요할 수 있습니다. 따라서 연구자는 보고된 조건을 보편적으로 적용 가능한 최종 결과값이 아닌, 최적화를 위한 시작점으로 고려해야 합니다.

요약하자면, 본 프로토콜은 노화의 생리적 특성에 최적화된 역전이(reverse-transfection) 전략을 사용하여 노화된 인간 세포에 변형된 hTERT mRNA를 전달하기 위한 재현 가능한 프레임워크를 제공합니다. 이 접근법은 일시적인 텔로머라제 재활성화, 측정 가능한 텔로미어 연장, 복제 수명 연장 및 노화 관련 표현형의 부분적 역전을 가능하게 합니다. 향후 연구에서는 이 전략을 다른 노화 세포 유형에 적용할 수 있는지 평가하고, 상호 보완적인 회춘 중재법과의 병용 접근법을 조사하며, in vivo 전달 플랫폼으로의 전환 가능성을 탐색해야 합니다. 따라서 이 방법은 노화 연구에서 텔로미어 생물학, 세포 회춘 및 노화 메커니즘을 조사하는 데 유용한 도구가 될 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ham's F-10 영양 혼합액	Thermo Fisher	11550043	세포 배양 배지
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA 캡 구조 유사체	New England Biolabs	S1411L	대부분의 RNA에서 캡 구조는 안정성을 높이고, 엑소뉴클레아제 분해에 대한 민감도를 낮추며, mRNA 개시 복합체의 형성을 촉진합니다.
5-메틸-시티딘-5´-트리포스페이트 (5-메틸-CTP)	New England Biolabs	N0432S	수정된 NTP는 인비트로 전사(in vitro transcription) RNA의 면역원성을 감소시키기 위해 흔히 사용됩니다.
6웰 플레이트	Corning	351146	독립적인 실험 조건 하에서 중간에서 대량의 부착성 또는 부유 세포를 배양하고 처리하기 위함입니다.
Anti-Ki67 항체 (SP6)	abcam	ab16667	Ki67은 주로 증식하는 세포에서 발현됩니다.
세포 노화 분석 키트 (SA-beta-gal 염색)	cellbiolabs	CBA-230	SA-β-갈락토시idase(SA-β-galactosidase)를 이용한 노화 세포 식별β$\beta$-갈락토시다아제 염색 분석
DNA LoBind 0.5ml 튜브	Eppendorf	022431005	손실 없는 효율적인 DNA 및 RNA 회수를 위하여
DNA LoBind 1.5ml 튜브	Eppendorf	22431021	손실 없는 효율적인 DNA 및 RNA 회수를 위하여
DNase I, RNase-free (1 U/μL)	Thermo Fisher	EN0521	RNase-free DNase I은 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA를 분해하는 엔도뉴클레아제(endonuclease)입니다.
E. coli 폴리(A) 중합효소	New England Biolabs	M0276S	Escherichia coli에서 Poly(A) Polymerase I (PAP I)은 주로 RNA 분자의 3' 말단에 아데노신 일인산(AMP) 잔기를 템플릿 독립적으로 첨가하는 촉매 역할을 합니다.
우태아혈청	Thermo Fisher	A5256701	세포 배양 혈청 보충제
HiScribe T7 ARCA mRNA 키트	New England Biolabs	E2065S	HiScribe T7 ARCA mRNA Kit(tailing 포함)는 ARCA 캡(cap) 및 poly(A) 꼬리가 달린 mRNA를 인비트로(in vitro)에서 빠르게 생산하도록 설계되었습니다. 캡 mRNA는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 Anti-Reverse Cap Analog(ARCA)를 전사 과정에서 함께 통합함으로써 합성됩니다.
CleanCap Reagent AG가 포함된 HiScribe T7 mRNA 키트	New England Biolabs	E2080S	CleanCap Reagent AG가 포함된 HiScribe T7 mRNA Kit를 사용하면 하나 또는 여러 개의 전사체를 신속하고 간편하게 생성할 수 있으며, 일반적인 수율은 다음과 같습니다. ≥90 μ반응당 g,
LongAmp Hot Start Taq DNA Polymerase	New England Biolabs	M0534S	LongAmp Hot Start Taq DNA Polymerase는 긴 앰플리콘(amplicon)을 대상으로 탁월한 성능을 제공합니다.
M-MuLV 역전사효소	New England Biolabs	M0253L	M-MuLV 역전사 효소는 RNA(cDNA 합성) 또는 단일 가닥 DNA를 템플릿으로 사용하여 프라이머로부터 시작되는 상보적 DNA 가닥을 합성합니다.
Monarch Spin RNA Cleanup Kit (50회분) μg)	New England Biolabs	T2040L	Monarch의 주요 기능® Spin RNA Cleanup Kit (50회분) μg) 최대 50까지 정제 및 농축하는 것입니다. μ효소 반응 또는 추출 혼합물로부터 고품질의 RNA $\mu\text{g}$ 추출.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2621L	NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix를 사용하면 단편의 길이 또는 말단 호환성에 관계없이 여러 DNA 단편을 이음매 없이 조립할 수 있습니다. 이 제품은 사용 편의성, 유연성 및 단순한 마스터 믹스 형식을 갖추고 있어 합성 생물학 분야뿐만 아니라 여러 단편의 단일 단계 클로닝에서도 유용하게 활용됩니다.
Opti-MEM - 저혈청 배지	Thermo Fisher	31985070	지질-페이로드 복합체 형성 과정 중 세포 형질전환 효율을 극대화하기 위함입니다. 이는 포유류 세포의 높은 생존력을 유지하는 동시에 표준 혈청 보충의 필요성을 줄여주는 최적화된 화학적 정의 환경(chemically defined environment)의 역할을 합니다.
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher	10010023	pH 7.4의 인산완충식염수(Phosphate-Buffered Saline, PBS)의 주요 기능적 용도는 포유류 세포와 생체 분자를 위해 안정적인 pH와 삼투압 균형을 유지하는 것입니다.
PCR 스트립	Thermo Fisher	AB0776	PCR 스트립 튜브(주로 8-스트립 또는 12-스트립 형식)의 주된 기능적 용도는 고처리량 열 순환 과정 동안 소량의 액체 반응물을 수용하는 것입니다.
폴리-L-라이신 하이드로브로마이드	Millipore Sigma	P4707-50ML	세포 부착을 위한 Poly-L-Lysine (PLL) Hydrobromide의 주요 기능적 용도는 유리나 플라스틱과 같이 음전하를 띠는 고체 표면을 코팅하여, 접착력이 강한 양전하 기질을 형성하는 것입니다.
슈도유리딘-5´-트리포스페이트 (Pseudo-UTP- ΨUTP)	New England Biolabs	N0433S	슈도우리딘-5´-트리포스페이트(Pseudo-UTP)는 일반적으로 인비트로(in vitro) 전사 RNA의 면역원성을 감소시키기 위해 사용됩니다.
리보뉴클레오타이드 용액 세트	New England Biolabs	N0450L	ATP, GTP, CTP 및 UTP의 네 가지 개별 용액
ROCK 억제제 Y-27632 (염산염)	줄기세포 기술	72302	Y-27632는 세포 투과성 및 고효능의 선택적 Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK) 억제제입니다. Y-27632는 촉매 부위의 ATP 결합과 경쟁함으로써 ROCK1 (Ki = 220 nM)과 ROCK2 (Ki = 300 nM)를 모두 억제합니다.
RT-PCR 등급 증류수	Thermo Fisher	AM9935	RT-PCR 등급 용수(종종 Nuclease-Free Water로 표시됨)의 주요 기능적 용도는, 미량의 오염으로도 샘플이 분해되거나 증폭이 억제될 수 있는 민감한 효소 분석법에서 초고순도 용매로 사용되는 것입니다.
SUPERase·RNase 억제제 내에	Thermo Fisher	AM2694	SUPERase In RNase 억제제는 비인간 유래의 단백질 기반 억제제로, RNase A, B, C, 1 및 T1을 포함하여 가장 흔하고 까다로운 RNase들에 비공유 결합하여 이를 억제합니다.
SYBR Green I 핵산 겔 염색제	Thermo Fisher	S7563	SYBR의 주요 기능적 용도™ Green I 핵산 겔 염색약은 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 내의 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 시각화하고 정량화하는 데 사용됩니다.
TransIT-mRNA 형질전환 키트	Mirusbio/ Millipore Sigma	MIR 2250	대형 RNA를 위한 고효율, 저독성 형질전환 시약
TRAPeze 텔로머레이스 검출 키트	Millipore Sigma	S7700	TRAP(Telomeric Repeat Amplification Protocol) 분석법은 포유류 세포 및 조직 시료에서 텔로머라아제 활성을 검출하고 측정하기 위해 널리 사용되는 민감한 PCR 기반 방법입니다. 이 분석법은 텔로머라아제에 의한 텔로미어 반복 서열의 연장, PCR을 이용한 해당 산물의 증폭, 그리고 후속 검출의 세 가지 주요 단계로 구성됩니다.
Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드	Thermo Fisher	25300054	일상적인 세포 계대 배양(subculturing) 및 수확 과정에서 배양 용기로부터 부착성 포유류 세포를 분리하기 위해.