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연구 논문

miR-486-3p은 폐선암 세포에서 악성 표현형을 억제하며 WNT5B, DVL1 및 β-catenin 발현의 감소와 연관되어 있다

44 조회수

⸱

DOI:

10.3791/71545

⸱

2026년 8월 21일

 ,  ,  , 
1Department of Thoracic Surgery, The First Hospital of Jiaxing

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

miR-486-3p의 강제 과발현은 A549 및 H358 폐선암 세포에서 증식 관련 활성, 클론 형성 성장, 상처 폐쇄 및 Matrigel 통과를 억제합니다. 이러한 효과는 WNT5B, DVL1, β-catenin 및 BCL-2의 발현 감소와 수반되며, 이는 직접적인 타겟팅이나 경로의 인과 관계를 입증하지는 않으나 in vitro에서 Wnt 관련 변화와의 연관성이 있음을 나타냅니다.

초록

폐선암(LUAD)은 비소세포폐암의 지배적인 조직학적 아형이며, 여전히 상당한 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 이전 연구들은 LUAD에서 miR-486-3p의 종양 억제 기능이 있음을 밝혀냈으나, WNT5B, DVL1 및 β-catenin 관련 발현 변화와의 관계는 명확하게 정의되지 않았습니다. 본 연구에서는 A549 및 H358 LUAD 세포와 각각의 일반적인 조건에서 유지된 Beas-2b 기관지 상피 세포에서의 기저 miR-486-3p 풍부도를 조사하고 비교하였습니다. 렌티바이러스 형질도입을 통해 안정적인 miR-486-3p 과발현 모델을 생성하였습니다. 세포 성장 관련 활성, 클론 생성 성장, 상처 폐쇄 및 Matrigel 코팅 막 통과 여부를 Cell Counting Kit-8, 콜로니 형성, 상처 치유 및 Transwell 분석을 사용하여 평가하였습니다. WNT5B, DVL1, β-catenin 및 BCL-2 단백질 풍부도는 Western blotting으로 평가하였으며, WNT5B, DVL1, CTNNB1 및 BCL2 mRNA 수준은 RT-qPCR로 추가 조사하였습니다. 사용된 배양 조건 하에서 miR-486-3p 풍부도는 Beas-2b 세포보다 A549 및 H358 세포에서 더 낮았으며, 렌티바이러스 형질도입을 통해 두 LUAD 세포주 모두에서 안정적인 과발현이 유도되었습니다. 강제적인 miR-486-3p 과발현은 CCK-8 신호, 콜로니 형성, 상처 폐쇄 및 Matrigel 코팅 막 통과를 감소시켰으며, 이는 더 낮은 WNT5B, DVL1, total β-catenin 및 BCL-2 단백질 풍부도를 동반하였습니다. RT-qPCR 결과, miR-486-3p 과발현 후 두 LUAD 세포주 모두에서 WNT5B, DVL1, CTNNB1 및 BCL2 전사체 풍부도가 더 낮게 나타났습니다. 이러한 결과는 강제적인 miR-486-3p 발현, 여러 악성 세포 지표의 약화 및 Wnt 관련 발현 변화 사이의 in vitro 연관성을 뒷받침하지만, 직접적인 miRNA-표적 결합, 경로 활성 또는 인과적인 선형 신호 전달 메커니즘을 확립하는 것은 아닙니다.

서론

폐선암(LUAD)은 비소세포폐암(NSCLC)의 가장 흔한 조직학적 아형이며, 전 세계적으로 폐암 관련 이환율과 사망률에 상당한 영향을 미칩니다1,2,3,4,5. 분자적 분류와 표적 치료를 통해 특정 환자군에서의 예후가 개선되었으나, 진행성 LUAD는 여전히 치료가 어렵고 생물학적 이질성이 큽니다1,2,3,4,5. 따라서 악성 세포 행동에 기여하는 조절 과정을 정의하는 것은 검증 가능한 치료 가설을 수립하는 데 있어 여전히 중요합니다.

Wnt 신호 전달 체계는 증식, 생존, 극성 및 운동성을 조절하는 β-catenin 의존적 경로와 β-catenin 비의존적 경로로 구성됩니다6,7,8,9. WNT5B는 주로 비정형 신호 전달과 연관되어 있으나, 그 생물학적 효과는 수용체 및 세포 환경에 따라 달라집니다10,11. DVL1은 여러 Wnt 경로가 공유하는 세포질 내 신호 전달 단백질이며, 폐암에서 β-catenin 관련 거동과 연관된 것으로 알려져 있습니다12. 따라서 WNT5B, DVL1 및 β-catenin의 동시 변화 그 자체만으로는 단일 선형 경로의 근거로 해석되어서는 안 됩니다.

MicroRNA(miRNA)는 표적 전사체와 서열 의존적 상호작용을 통해 유전자 발현을 조절하는 짧은 비코딩 RNA입니다13,14,15. 하나의 miRNA가 여러 RNA에 영향을 미칠 수 있으므로, miRNA 풍부도의 변화는 다양한 종양 관련 표현형에 영향을 줄 수 있습니다13,14,15,16,17,18. 여러 miRNA가 폐암의 성장, 이동성 및 신호 전달과 연관되어 있으며, miRNA와 Wnt 관련 네트워크 간의 상호작용(crosstalk)이 다양한 암 상황에서 설명된 바 있습니다16,17,18,19,20.

MIR486 유전자좌는 성숙한 가닥인 miR-486-3p와 miR-486-5p를 생성합니다. miR-486-3p는 구강암과 교모세포종에서 종양 억제 활성을 보였으나, 피부 편평세포암에서는 종양 촉진 효과가 보고되었습니다21,22,23,24,25. 본 연구에서는 공개된 LUAD 데이터에서 miR-486-3p의 발현량이 감소되어 있다는 점, LUAD에서 이전에 보고된 종양 억제 활성, 그리고 WNT 관련 후보 전사체와의 연관성을 보여주는 생물정보학적 예측을 바탕으로 가설 기반 전략을 통해 miR-486-3p를 선정하였습니다. Tomioka 등은 LUAD에서 두 miR-486 가닥 모두의 종양 억제 효과를 입증하였으며, 전장 유전체 표적 스크리닝을 통해 GINS4를 확인하였습니다26. 따라서 본 연구는 항종양 표현형의 최초 입증을 주장하는 것이 아닙니다. 그 대신, 강제적인 miR-486-3p 발현이 WNT5B, DVL1 및 β-catenin의 풍부도 변화와 동반되는지, 그리고 두 가지 LUAD 세포주에서 재현 가능한 표현형 변화가 나타나는지를 평가합니다. 이러한 분석은 상관관계를 평가하는 것이며, 직접적인 표적화, 경로 활성 또는 선형적인 WNT5B/DVL1/β-catenin 메커니즘을 입증하는 것은 아닙니다.

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프로토콜

사용된 시약과 장비는 재료 목록에 나열되어 있습니다.

세포 배양

인간 폐선암(LUAD) 세포주인 A549와 H358, 그리고 불멸화된 기관지 상피 세포주인 Beas-2b를 사용하였습니다. A549 (KRAS G12S)와 H358 (KRAS G12C; STK11-결핍)은 서로 다른 KRAS 돌연변이 배경을 가진 일반적인 LUAD 모델로 선택되었으며, Beas-2b는 비종양성 기관지 상피 대조군으로 포함되었습니다. A549 및 H358 세포는 RPMI-1640 배지에서 유지하였고, Beas-2b 세포는 DMEM에서 유지하였으며, 각 배지에는 10% fetal bovine serum과 1% penicillin-streptomycin이 포함되었습니다. 세포는 5% CO₂가 포함된 습윤한 분위기의 37 °C에서 배양되었습니다. 종양 세포주와 상피 대조군 세포주가 서로 다른 루틴 배지에서 유지되었으므로, 세포주 간의 기저 발현 비교는 주의 깊게 해석하였습니다.

렌티바이러스 형질전환 및 안정적 세포 선택

hsa-miR-486-3p 전구체를 운반하는 렌티바이러스 벡터(LV-miR-486-3p) 또는 스크램블된 음성 대조군 서열(LV-NC)을 사용하여 안정적인 기능 획득(gain-of-function) 설계를 수행하였다. A549 및 H358 세포를 6-well 플레이트에 5 × 104 cells/well 농도로 분주하고 하룻밤 동안 배양하였다. 다음 날, 8 µg/mL polybrene 존재 하에 10의 감염 다중도(MOI)로 렌티바이러스를 처리하였다. 24시간 후, 바이러스 접종액을 신선한 완전 배지로 교체하였다. 형질도입된 세포는 2 µg/mL puromycin으로 7일 동안 선택 과정을 거쳤다. 선택 후 생존한 세포를 회복시킨 뒤 확장 배양하여 후속 분자 및 기능 분석에 사용하였다. 본 연구는 안정적인 강제 과발현 효과를 평가하기 위해 특별히 설계되었으므로 miR-486-3p 억제제 군은 포함하지 않았다.

참고: 세포 생존율에서 처리 방식에 따른 차이를 최소화하기 위해, LV-NC 그룹과 LV-miR-486-3p 그룹 간의 MOI, polybrene 노출 시간 및 puromycin 선택 조건을 동일하게 유지해야 합니다.

RT-qPCR

A549 및 H358 세포에서 miR-486-3p 발현 수준을 측정하고 렌티바이러스 과발현 효율을 확인하기 위해 RT-qPCR을 수행하였다. 총 RNA는 제조사의 지침에 따라 TRIzol 시약을 사용하여 분리하였다. RNA 농도와 순도는 분광 광도계로 평가하였으며, A260/A280 비율이 1.8–2.1인 경우를 적절한 것으로 간주하였다. mRNA 분석을 위해 1 µg의 총 RNA를 상용 cDNA 합성 키트를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 cDNA로 역전사하였다. microRNA 분석의 경우, miRNA 특이적 stem-loop 역전사 프라이머를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 정량적 PCR은 10 µL의 2× SYBR Green Master Mix, 각 0.4 µM의 프라이머, 그리고 2 µL의 cDNA 템플릿을 포함하여 총 반응 부피 20 µL로 진행하였다. 증폭 프로토콜은 95 °C에서 5분간 초기 변성을 거친 후, 95 °C에서 10초간 변성 및 60 °C에서 30초간 어닐링/신장을 40주기 반복하는 과정으로 구성되었다. 이후 증폭 특이성을 검증하기 위해 멜팅 커브 분석을 수행하였다. miRNA 정량을 위한 내부 대조군으로는 U6 small nuclear RNA를 사용하였으며, mRNA 정규화를 위한 참조 유전자로 GAPDH를 사용하였다. 상대적 발현 수준은 2−ΔΔCq법을 사용하여 결정하였다.

miRNA 프라이머 서열은 다음과 같습니다: stem-loop 역전사 프라이머, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; miR-486-3p 정방향 프라이머, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; 공통 역방향 프라이머, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; U6 정방향 프라이머, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′; 및 U6 역방향 프라이머, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 및 GAPDH의 프라이머 서열과 앰플리콘 길이 및 증폭 효율은 Table 1에 제공되어 있습니다. mRNA 발현은 GAPDH를 기준으로 표준화하였으며, miR-486-3p 발현은 U6를 기준으로 표준화하였습니다. 각 실험은 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험을 포함하였으며, 각 생물학적 반복당 3회의 기술적 반복 실험을 수행하였습니다.

웨스턴 블로팅

7일간의 puromycin 선택 및 회복 기간이 완료된 후, 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 버퍼로 세포를 용해하였다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석법을 사용하여 결정하였다. 동일한 양의 단백질(레인당 20 µg)을 10% SDS-PAGE 젤에서 분리하고, 300 mA에서 120분 동안 습식 전사(wet transfer) 방식으로 PVDF 막으로 옮겼다. 막은 0.1% Tween-20이 포함된 Tris-buffered saline(TBST)으로 조제한 5% 탈지분유로 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 막을 WNT5B (1:1,000), DVL1 (1:1,000), β-catenin (1:1,000), BCL-2 (0.5 µg/mL) 또는 β-actin (1:5,000)에 대한 1차 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 모든 항체의 제조사와 카탈로그 번호는 재료 표(Table of Materials)에 제공되어 있다. TBST로 10분씩 3회 세척한 후, 1:5,000으로 희석한 HRP-접합 염소 항-토끼 IgG 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 막을 TBST로 3회 세척하고, 화학발광 기질을 사용하여 단백질 밴드를 시각화한 뒤 젤 문서화 및 이미징 시스템으로 촬영하였다. 밴드 강도는 ImageJ를 사용하여 정량화하였다. 각 표적 단백질의 양은 동일한 생물학적 시료의 해당 β-actin 신호로 표준화하였다. 밀도 분석에는 선형의 비포화 검출 범위 내의 노출값만 사용하였다. 세 번의 독립적인 생물학적 실험을 수행하였다.

Cell Counting Kit-8 분석

LV-NC 또는 LV-miR-486-3p가 안정적으로 형질전환된 A549 및 H358 세포를 96-well plate에 100 µL의 완전 배지를 사용하여 well당 1.5 × 104 cells로 분주하였다. 하룻밤 동안 세포를 부착시킨 후 배지를 교체하였으며, Cell Counting Kit-8 시약을 첨가한 직후 0시간의 흡광도를 측정하였다. 0 h, 24 h, 48 h, 72 h 및 96 h에 well당 10 µL의 시약을 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 수정된 시간 경과 분석을 위해, 각 그룹의 값을 플로팅하기 전 각 그룹의 0시간 값으로 정규화하였다. 세 번의 독립적인 생물학적 실험을 수행하였으며, 통계 분석 전 각 실험 내의 기술적 반복 well 값들을 평균하였다.

콜로니 형성 분석

안정적으로 선택된 A549 및 H358 세포를 5 × 102 cells/mL 농도의 단일 세포 현탁액으로 준비하였다. 6-well 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 1 mL를 분주한 후, 완전 배지 3 mL를 추가하였다. 세포를 14일 동안 배양하였으며, 배지는 5일마다 교체하였다. 콜로니를 PBS로 세척하고, 4% paraformaldehyde로 20분 동안 고정시킨 후, crystal violet으로 20분 동안 염색하고 세척하여 자연 건조하였다. 50개 이상의 세포를 포함하는 콜로니를 ImageJ로 계수하였다. 세 차례의 독립적인 생물학적 실험을 수행하였다.

참고: 세포의 인위적인 응집을 방지하기 위해서는 균일한 단일 세포 현탁액을 준비하고, 콜로니 형성 과정 중 플레이어의 흔들림을 최소화해야 합니다.

세포 이동 분석

안정적으로 형질전환된 A549 및 H358 세포를 6-well plate에 분주하고 단일층(monolayer)이 형성될 때까지 배양하였다. 멸균된 10 µL 피펫 팁을 사용하여 직선 형태의 스크래치를 만들고, 탈락된 세포를 제거한 후 동일한 표시 영역을 0 h, 24 h, 48 h, 72 h에서 촬영하였다. ImageJ를 사용하여 상처 면적을 측정하였으며, 상처 폐쇄율은 (0 h에서의 면적 − 해당 시점의 면적) / 0 h에서의 면적 × 100%로 계산하였다. 세 차례의 독립적인 생물학적 실험을 수행하였다. 약리학적 증식 억제제를 사용하지 않았으므로, 본 분석은 이동 전용 결과값이 아닌 상처 폐쇄 측정값으로 해석하였다.

참고: 스크래치는 일정한 너비와 압력으로 생성해야 하며, 전체 시간 경과 동안 동일한 영역을 관찰해야 합니다.

세포 침습 분석

Transwell 침습 분석은 공극 크기가 8 µm인 24-well 폴리카보네이트 막 인서트를 사용하여 수행되었다. 각 인서트의 상단 표면에 무혈청 DMEM으로 1:8로 희석하여 최종 단백질 농도를 약 1 mg/mL로 맞춘 100 µL의 Matrigel 기저막 매트릭스를 코팅하고 37 °C에서 4시간 동안 배양하였다. A549 및 H358 세포를 각각 8 × 105 cells/mL 및 4 × 105 cells/mL의 밀도로 무혈청 RPMI-1640 배지에 재현탁하였다. 세포 현탁액 200 µL를 상단 챔버에 첨가하였으며, 이는 인서트당 1.6 × 105개의 A549 세포 또는 8 × 104개의 H358 세포에 해당한다. 하단 챔버에는 화학 유인 물질로서 20% 소태아혈청을 함유한 RPMI-1640 배지 500 µL를 채웠다. 5% CO₂를 함유한 습윤한 분위기의 37 °C에서 48시간 동안 배양한 후, 막의 상단 표면에 남아 있는 비침습 세포를 면봉으로 부드럽게 제거하였다. 막을 통해 침습한 세포는 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정시켰으며, 상온에서 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 20분간 염색하였다. 각 인서트당 무작위로 선택한 5개의 현미경 시야를 촬영하였고, ImageJ를 사용하여 침습된 세포 수를 정량화하였다. 5개 시야의 평균 세포 수를 각 인서트의 단일 값으로 간주하였으며, 개별 현미경 시야가 아닌 인서트를 실험 단위로 처리하였다. 세 번의 독립적인 생물학적 실험을 수행하였다.

참고: 막이 손상되거나 하단 표면으로 이동한 세포가 떨어져 나가는 것을 방지하기 위해, 침습하지 않은 세포를 조심스럽고 균일하게 제거하십시오.

통계 분석

별도의 설명이 없는 한 데이터는 평균 ± SD로 표시하며, n는 독립적인 생물학적 실험 횟수를 나타냅니다. 기술적 반복 실험 또는 동일한 실험 단위 내의 여러 현미경 시야는 추론 통계 검정 전 평균값을 산출하였습니다. 세 가지 세포주 간의 비교를 위해 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey 보정 쌍별 비교를 수행하였습니다. CCK-8 및 상처 폐쇄 시간 경과 분석에서는 이원 반복 측정 분산 분석(two-way repeated-measures ANOVA)을 사용하여 처리, 시간 및 처리-시간 상호작용 효과를 평가하였으며, 이후 개별 시점에서 Šídák 보정 비교를 수행하였습니다. 두 그룹 간의 비교는 양측 비쌍체 Student's t-test를 사용하여 분석하였습니다. 통계 분석 및 데이터 시각화는 통계 분석 및 그래프 작성 소프트웨어를 사용하여 수행하였습니다. 정확한 p-값은 피규어 패널 또는 소스 데이터 표에 기재되어 있습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 정의하였으며, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001로 표시하였습니다.

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결과

TCGA/starBase 분석 결과 LUAD에서 miR-486-3p의 발현량이 감소한 것으로 나타났으며, TargetScan을 통해 후보 결합 부위를 확인하였다

starBase v3.0를 통해 접근한 TCGA 유래 발현 데이터에 따르면, 512개의 폐선암(LUAD) 샘플에서 miR-486-3p의 발현량이 20개의 비종양 폐 샘플보다 유의하게 낮게 나타났습니다 (Wilcoxon rank-sum test, p = 3.2 × 10⁻5; 그림 1). TargetScanHuman을 통해 DVL1 3′ 비번역 부위(3′ UTR)의 468–474번 위치에서 보존성이 낮은 miR-486-3p 후보 7mer-m8 사이트를 확인하였으며, context++ 점수는 −0.23, context++ 점수 백분위수는 80이었습니다. 또한 <...

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토론

본 기능 획득 연구에서는 A549 및 H358 폐선암(LUAD) 세포에서 miR-486-3p의 안정적인 강제 발현 효과를 평가하였습니다. 두 모델 모두에서 miR-486-3p의 과발현은 성장 관련 CCK-8 신호의 감소, 클론 형성 성장 저하, 상처 폐쇄 속도 감소, 그리고 Matrigel이 코팅된 Transwell 막을 통과하는 세포 수의 감소와 관련이 있었습니다. 이러한 표현형 변화는 WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 전사체 수준의 저하와 더불어 WNT5B, DVL1, total β-catenin 및 BCL-2 단백질 양의 감소를 동반하였습니다. 종합적으로, 이러한 결과는 강제적인 miR-486-3p 발현, 여러 악성 세포 표현형의 약화, 그리고 선택된 Wnt 관련 분자들의 협응된 변화 사이의 연관성을 뒷받침합니다. 다만, 본 연구가 miRNA-표적 결합, 경로 활성 또는 인과적 신호 전달 서열을 직접적으로 규명하는 것은 아닙니다.

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공개 사항

저자들은 선언할 이해상충 관계가 없습니다.

감사의 글

본 연구는 절강성 의료 및 보건 과학 기술 계획(2025KY349)과 가흥시 중점 지원 학과(2023-zc-014)의 재정적 지원을 받아 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 M Tris-HCl (pH 6.8)SolarbioT1020SDS-PAGE 스태킹 겔 제조
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)SolarbioT1010SDS-PAGE 분리 겔 제조
20× TBS 버퍼Solarbio71080웨스턴 블롯 세척 및 항체 희석용 스톡 버퍼
30% acrylamide/bis-acrylamide 용액 (29:1)SolarbioA1010SDS-PAGE 겔 제조
4% 파라포름알데히드 고정액ServicebioG1101콜로니 형성 및 Transwell 분석을 위한 고정
5× 단백질 로딩 버퍼BeyotimeP0015SDS-PAGE용 단백질 시료 준비
Ammonium persulfateSolarbio427A038SDS-PAGE 겔 중합 개시제
BCA Protein Assay KitBeyotimeP0009-1단백질 농도 측정
BCL-2 항체Boster Biological TechnologyA00040-2토끼 다클론 항체; 웨스턴 블로팅 1:5,000 희석
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)TargetMolC0005세포 성장 관련 대사 활성 분석; 배양액 100 μL당 10 μL 사용
화학발광 이미징 시스템Bio-RadChemiDoc MP웨스턴 블롯 이미징
클로로포름ServicebioG3005TRIzol 기반 RNA 추출 중 상분리
크리스탈 바이올렛 염색액ServicebioG1014콜로니 및 Transwell 막 염색
DMEMServicebioG4511Beas-2b 세포용 일반 배양액
DVL1 항체Signalway Antibody53180토끼 1차 항체; 웨스턴 블로팅 1:5,000 희석
소태아혈청 (FBS)BiosharpBL203B일반 세포 배양용 10% (v/v) 첨가물; Transwell 하단 챔버용 20% (v/v)
GraphPad Prism 8GraphPad SoftwareVersion 8그래프 작성 및 통계 분석
Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)Yeasen Biotechnology11201ES08SYBR Green 기반 정량적 PCR
Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)Yeasen Biotechnology11141ES60mRNA RT-qPCR을 위한 역전사
IBM SPSS StatisticsIBMVersion 22.0통계 분석
ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.53웨스턴 블롯 밀도 측정, 상처 면적 측정, 콜로니 계수 및 Transwell 세포 계수
도립 현미경OlympusCKX53상처 치유 및 Transwell 분석 이미징
이소프로판올ServicebioG3006TRIzol 기반 추출 중 RNA 침전
LV-miR-486-3p 및 LV-NC 렌티바이러스 제제GenePharmaCustom synthesis안정적 miR-486-3p 과발현 벡터 및 스크램블 음성 대조군 벡터
Matrigel basement membrane matrixCorning354234무혈청 DMEM에 1:8로 희석; 최종 단백질 농도 약 1 mg/mL
메탄올Xilong ScientificGB/T 683-2006PVDF 막 활성화
마이크로플레이트 리더BioTekELx800450 nm에서 흡광도 측정
마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계AllshengNano-600RNA 농도 및 A260/A280 순도 평가
Penicillin-streptomycinGibco, Thermo Fisher Scientific15240062일반 세포 배양용 1% (v/v) 첨가물
인산완충식염수 (PBS)ServicebioG0002세포 및 막 세척
Protease Inhibitor CocktailAPExBIOK1007RIPA 용해 버퍼에 첨가
단백질 래더BiosharpBL712A웨스턴 블로팅용 분자량 기준
PVDF 막MilliporeK2MA8350E웨스턴 블로팅용 단백질 전이 막
QuantStudio 5 Real-Time PCR SystemThermo Fisher ScientificQuantStudio 5RT-qPCR 데이터 획득
RIPA 용해 버퍼BeyotimeP0013B전체 세포 단백질 추출
RNA 추출 시약 (TRIzol 유형)ServicebioG3013전체 RNA 추출
RPMI 1640 배지ServicebioG4510A549 및 H358 세포용 일반 배양액 및 무혈청 Transwell 세포 현탁액
SDSSolarbioS8010SDS-PAGE 시약
탈지분유BD2271470웨스턴 블로팅용 5% 블로킹 용액
StarBase v3.0Sun Yat-sen Universityhttps://rnasysu.com/encori/TCGA 기반 miR-486-3p 발현 분석
TargetScanHumanWhitehead Institute for Biomedical Researchhttps://www.targetscan.org/vert_80/후보 miR-486-3p 결합 부위 예측
TEMEDSigma-AldrichT8090SDS-PAGE 겔 중합 촉매
Transwell 인서트, 24-well, 8 μm 공극 크기Corning3428Matrigel 코팅 막 통과 분석
트립신ServicebioG4000세포 분리
Tween-20Solarbio815A043웨스턴 블롯 세척 버퍼 제조
수직 전기영동 시스템Liuyi BiotechnologyDYCZ-24DNSDS-PAGE 단백질 분리
Western HRP substrate luminol 시약Affinity BiosciencesKF001화학발광 웨스턴 블롯 검출
습식 전이 시스템Bio-Rad1703930PVDF 막으로의 단백질 전이
WNT5B 항체Signalway Antibody56808토끼 1차 항체; 웨스턴 블로팅 1:5,000 희석
β-actin 항체Abcamab8227로딩 컨트롤; 웨스턴 블로팅 1:5,000 희석
β-catenin 항체Signalway Antibody21725토끼 1차 항체; 웨스턴 블로팅 1:5,000 희석

참고문헌

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