miR-486-3p의 강제 과발현은 A549 및 H358 폐선암 세포에서 증식 관련 활성, 클론 형성 성장, 상처 폐쇄 및 Matrigel 통과를 억제합니다. 이러한 효과는 WNT5B, DVL1, β-catenin 및 BCL-2의 발현 감소와 수반되며, 이는 직접적인 타겟팅이나 경로의 인과 관계를 입증하지는 않으나 in vitro에서 Wnt 관련 변화와의 연관성이 있음을 나타냅니다.
연구 논문
miR-486-3p은 폐선암 세포에서 악성 표현형을 억제하며 WNT5B, DVL1 및 β-catenin 발현의 감소와 연관되어 있다
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
폐선암(LUAD)은 비소세포폐암의 지배적인 조직학적 아형이며, 여전히 상당한 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 이전 연구들은 LUAD에서 miR-486-3p의 종양 억제 기능이 있음을 밝혀냈으나, WNT5B, DVL1 및 β-catenin 관련 발현 변화와의 관계는 명확하게 정의되지 않았습니다. 본 연구에서는 A549 및 H358 LUAD 세포와 각각의 일반적인 조건에서 유지된 Beas-2b 기관지 상피 세포에서의 기저 miR-486-3p 풍부도를 조사하고 비교하였습니다. 렌티바이러스 형질도입을 통해 안정적인 miR-486-3p 과발현 모델을 생성하였습니다. 세포 성장 관련 활성, 클론 생성 성장, 상처 폐쇄 및 Matrigel 코팅 막 통과 여부를 Cell Counting Kit-8, 콜로니 형성, 상처 치유 및 Transwell 분석을 사용하여 평가하였습니다. WNT5B, DVL1, β-catenin 및 BCL-2 단백질 풍부도는 Western blotting으로 평가하였으며, WNT5B, DVL1, CTNNB1 및 BCL2 mRNA 수준은 RT-qPCR로 추가 조사하였습니다. 사용된 배양 조건 하에서 miR-486-3p 풍부도는 Beas-2b 세포보다 A549 및 H358 세포에서 더 낮았으며, 렌티바이러스 형질도입을 통해 두 LUAD 세포주 모두에서 안정적인 과발현이 유도되었습니다. 강제적인 miR-486-3p 과발현은 CCK-8 신호, 콜로니 형성, 상처 폐쇄 및 Matrigel 코팅 막 통과를 감소시켰으며, 이는 더 낮은 WNT5B, DVL1, total β-catenin 및 BCL-2 단백질 풍부도를 동반하였습니다. RT-qPCR 결과, miR-486-3p 과발현 후 두 LUAD 세포주 모두에서 WNT5B, DVL1, CTNNB1 및 BCL2 전사체 풍부도가 더 낮게 나타났습니다. 이러한 결과는 강제적인 miR-486-3p 발현, 여러 악성 세포 지표의 약화 및 Wnt 관련 발현 변화 사이의 in vitro 연관성을 뒷받침하지만, 직접적인 miRNA-표적 결합, 경로 활성 또는 인과적인 선형 신호 전달 메커니즘을 확립하는 것은 아닙니다.
서론
폐선암(LUAD)은 비소세포폐암(NSCLC)의 가장 흔한 조직학적 아형이며, 전 세계적으로 폐암 관련 이환율과 사망률에 상당한 영향을 미칩니다1,2,3,4,5. 분자적 분류와 표적 치료를 통해 특정 환자군에서의 예후가 개선되었으나, 진행성 LUAD는 여전히 치료가 어렵고 생물학적 이질성이 큽니다1,2,3,4,5. 따라서 악성 세포 행동에 기여하는 조절 과정을 정의하는 것은 검증 가능한 치료 가설을 수립하는 데 있어 여전히 중요합니다.
Wnt 신호 전달 체계는 증식, 생존, 극성 및 운동성을 조절하는 β-catenin 의존적 경로와 β-catenin 비의존적 경로로 구성됩니다6,7,8,9. WNT5B는 주로 비정형 신호 전달과 연관되어 있으나, 그 생물학적 효과는 수용체 및 세포 환경에 따라 달라집니다10,11. DVL1은 여러 Wnt 경로가 공유하는 세포질 내 신호 전달 단백질이며, 폐암에서 β-catenin 관련 거동과 연관된 것으로 알려져 있습니다12. 따라서 WNT5B, DVL1 및 β-catenin의 동시 변화 그 자체만으로는 단일 선형 경로의 근거로 해석되어서는 안 됩니다.
MicroRNA(miRNA)는 표적 전사체와 서열 의존적 상호작용을 통해 유전자 발현을 조절하는 짧은 비코딩 RNA입니다13,14,15. 하나의 miRNA가 여러 RNA에 영향을 미칠 수 있으므로, miRNA 풍부도의 변화는 다양한 종양 관련 표현형에 영향을 줄 수 있습니다13,14,15,16,17,18. 여러 miRNA가 폐암의 성장, 이동성 및 신호 전달과 연관되어 있으며, miRNA와 Wnt 관련 네트워크 간의 상호작용(crosstalk)이 다양한 암 상황에서 설명된 바 있습니다16,17,18,19,20.
MIR486 유전자좌는 성숙한 가닥인 miR-486-3p와 miR-486-5p를 생성합니다. miR-486-3p는 구강암과 교모세포종에서 종양 억제 활성을 보였으나, 피부 편평세포암에서는 종양 촉진 효과가 보고되었습니다21,22,23,24,25. 본 연구에서는 공개된 LUAD 데이터에서 miR-486-3p의 발현량이 감소되어 있다는 점, LUAD에서 이전에 보고된 종양 억제 활성, 그리고 WNT 관련 후보 전사체와의 연관성을 보여주는 생물정보학적 예측을 바탕으로 가설 기반 전략을 통해 miR-486-3p를 선정하였습니다. Tomioka 등은 LUAD에서 두 miR-486 가닥 모두의 종양 억제 효과를 입증하였으며, 전장 유전체 표적 스크리닝을 통해 GINS4를 확인하였습니다26. 따라서 본 연구는 항종양 표현형의 최초 입증을 주장하는 것이 아닙니다. 그 대신, 강제적인 miR-486-3p 발현이 WNT5B, DVL1 및 β-catenin의 풍부도 변화와 동반되는지, 그리고 두 가지 LUAD 세포주에서 재현 가능한 표현형 변화가 나타나는지를 평가합니다. 이러한 분석은 상관관계를 평가하는 것이며, 직접적인 표적화, 경로 활성 또는 선형적인 WNT5B/DVL1/β-catenin 메커니즘을 입증하는 것은 아닙니다.
프로토콜
사용된 시약과 장비는 재료 목록에 나열되어 있습니다.
세포 배양
인간 폐선암(LUAD) 세포주인 A549와 H358, 그리고 불멸화된 기관지 상피 세포주인 Beas-2b를 사용하였습니다. A549 (KRAS G12S)와 H358 (KRAS G12C; STK11-결핍)은 서로 다른 KRAS 돌연변이 배경을 가진 일반적인 LUAD 모델로 선택되었으며, Beas-2b는 비종양성 기관지 상피 대조군으로 포함되었습니다. A549 및 H358 세포는 RPMI-1640 배지에서 유지하였고, Beas-2b 세포는 DMEM에서 유지하였으며, 각 배지에는 10% fetal bovine serum과 1% penicillin-streptomycin이 포함되었습니다. 세포는 5% CO₂가 포함된 습윤한 분위기의 37 °C에서 배양되었습니다. 종양 세포주와 상피 대조군 세포주가 서로 다른 루틴 배지에서 유지되었으므로, 세포주 간의 기저 발현 비교는 주의 깊게 해석하였습니다.
렌티바이러스 형질전환 및 안정적 세포 선택
hsa-miR-486-3p 전구체를 운반하는 렌티바이러스 벡터(LV-miR-486-3p) 또는 스크램블된 음성 대조군 서열(LV-NC)을 사용하여 안정적인 기능 획득(gain-of-function) 설계를 수행하였다. A549 및 H358 세포를 6-well 플레이트에 5 × 104 cells/well 농도로 분주하고 하룻밤 동안 배양하였다. 다음 날, 8 µg/mL polybrene 존재 하에 10의 감염 다중도(MOI)로 렌티바이러스를 처리하였다. 24시간 후, 바이러스 접종액을 신선한 완전 배지로 교체하였다. 형질도입된 세포는 2 µg/mL puromycin으로 7일 동안 선택 과정을 거쳤다. 선택 후 생존한 세포를 회복시킨 뒤 확장 배양하여 후속 분자 및 기능 분석에 사용하였다. 본 연구는 안정적인 강제 과발현 효과를 평가하기 위해 특별히 설계되었으므로 miR-486-3p 억제제 군은 포함하지 않았다.
참고: 세포 생존율에서 처리 방식에 따른 차이를 최소화하기 위해, LV-NC 그룹과 LV-miR-486-3p 그룹 간의 MOI, polybrene 노출 시간 및 puromycin 선택 조건을 동일하게 유지해야 합니다.
RT-qPCR
A549 및 H358 세포에서 miR-486-3p 발현 수준을 측정하고 렌티바이러스 과발현 효율을 확인하기 위해 RT-qPCR을 수행하였다. 총 RNA는 제조사의 지침에 따라 TRIzol 시약을 사용하여 분리하였다. RNA 농도와 순도는 분광 광도계로 평가하였으며, A260/A280 비율이 1.8–2.1인 경우를 적절한 것으로 간주하였다. mRNA 분석을 위해 1 µg의 총 RNA를 상용 cDNA 합성 키트를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 cDNA로 역전사하였다. microRNA 분석의 경우, miRNA 특이적 stem-loop 역전사 프라이머를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 정량적 PCR은 10 µL의 2× SYBR Green Master Mix, 각 0.4 µM의 프라이머, 그리고 2 µL의 cDNA 템플릿을 포함하여 총 반응 부피 20 µL로 진행하였다. 증폭 프로토콜은 95 °C에서 5분간 초기 변성을 거친 후, 95 °C에서 10초간 변성 및 60 °C에서 30초간 어닐링/신장을 40주기 반복하는 과정으로 구성되었다. 이후 증폭 특이성을 검증하기 위해 멜팅 커브 분석을 수행하였다. miRNA 정량을 위한 내부 대조군으로는 U6 small nuclear RNA를 사용하였으며, mRNA 정규화를 위한 참조 유전자로 GAPDH를 사용하였다. 상대적 발현 수준은 2−ΔΔCq법을 사용하여 결정하였다.
miRNA 프라이머 서열은 다음과 같습니다: stem-loop 역전사 프라이머, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; miR-486-3p 정방향 프라이머, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; 공통 역방향 프라이머, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; U6 정방향 프라이머, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′; 및 U6 역방향 프라이머, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 및 GAPDH의 프라이머 서열과 앰플리콘 길이 및 증폭 효율은 Table 1에 제공되어 있습니다. mRNA 발현은 GAPDH를 기준으로 표준화하였으며, miR-486-3p 발현은 U6를 기준으로 표준화하였습니다. 각 실험은 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험을 포함하였으며, 각 생물학적 반복당 3회의 기술적 반복 실험을 수행하였습니다.
웨스턴 블로팅
7일간의 puromycin 선택 및 회복 기간이 완료된 후, 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 버퍼로 세포를 용해하였다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석법을 사용하여 결정하였다. 동일한 양의 단백질(레인당 20 µg)을 10% SDS-PAGE 젤에서 분리하고, 300 mA에서 120분 동안 습식 전사(wet transfer) 방식으로 PVDF 막으로 옮겼다. 막은 0.1% Tween-20이 포함된 Tris-buffered saline(TBST)으로 조제한 5% 탈지분유로 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 막을 WNT5B (1:1,000), DVL1 (1:1,000), β-catenin (1:1,000), BCL-2 (0.5 µg/mL) 또는 β-actin (1:5,000)에 대한 1차 항체와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 모든 항체의 제조사와 카탈로그 번호는 재료 표(Table of Materials)에 제공되어 있다. TBST로 10분씩 3회 세척한 후, 1:5,000으로 희석한 HRP-접합 염소 항-토끼 IgG 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 막을 TBST로 3회 세척하고, 화학발광 기질을 사용하여 단백질 밴드를 시각화한 뒤 젤 문서화 및 이미징 시스템으로 촬영하였다. 밴드 강도는 ImageJ를 사용하여 정량화하였다. 각 표적 단백질의 양은 동일한 생물학적 시료의 해당 β-actin 신호로 표준화하였다. 밀도 분석에는 선형의 비포화 검출 범위 내의 노출값만 사용하였다. 세 번의 독립적인 생물학적 실험을 수행하였다.
Cell Counting Kit-8 분석
LV-NC 또는 LV-miR-486-3p가 안정적으로 형질전환된 A549 및 H358 세포를 96-well plate에 100 µL의 완전 배지를 사용하여 well당 1.5 × 104 cells로 분주하였다. 하룻밤 동안 세포를 부착시킨 후 배지를 교체하였으며, Cell Counting Kit-8 시약을 첨가한 직후 0시간의 흡광도를 측정하였다. 0 h, 24 h, 48 h, 72 h 및 96 h에 well당 10 µL의 시약을 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 수정된 시간 경과 분석을 위해, 각 그룹의 값을 플로팅하기 전 각 그룹의 0시간 값으로 정규화하였다. 세 번의 독립적인 생물학적 실험을 수행하였으며, 통계 분석 전 각 실험 내의 기술적 반복 well 값들을 평균하였다.
콜로니 형성 분석
안정적으로 선택된 A549 및 H358 세포를 5 × 102 cells/mL 농도의 단일 세포 현탁액으로 준비하였다. 6-well 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 1 mL를 분주한 후, 완전 배지 3 mL를 추가하였다. 세포를 14일 동안 배양하였으며, 배지는 5일마다 교체하였다. 콜로니를 PBS로 세척하고, 4% paraformaldehyde로 20분 동안 고정시킨 후, crystal violet으로 20분 동안 염색하고 세척하여 자연 건조하였다. 50개 이상의 세포를 포함하는 콜로니를 ImageJ로 계수하였다. 세 차례의 독립적인 생물학적 실험을 수행하였다.
참고: 세포의 인위적인 응집을 방지하기 위해서는 균일한 단일 세포 현탁액을 준비하고, 콜로니 형성 과정 중 플레이어의 흔들림을 최소화해야 합니다.
세포 이동 분석
안정적으로 형질전환된 A549 및 H358 세포를 6-well plate에 분주하고 단일층(monolayer)이 형성될 때까지 배양하였다. 멸균된 10 µL 피펫 팁을 사용하여 직선 형태의 스크래치를 만들고, 탈락된 세포를 제거한 후 동일한 표시 영역을 0 h, 24 h, 48 h, 72 h에서 촬영하였다. ImageJ를 사용하여 상처 면적을 측정하였으며, 상처 폐쇄율은 (0 h에서의 면적 − 해당 시점의 면적) / 0 h에서의 면적 × 100%로 계산하였다. 세 차례의 독립적인 생물학적 실험을 수행하였다. 약리학적 증식 억제제를 사용하지 않았으므로, 본 분석은 이동 전용 결과값이 아닌 상처 폐쇄 측정값으로 해석하였다.
참고: 스크래치는 일정한 너비와 압력으로 생성해야 하며, 전체 시간 경과 동안 동일한 영역을 관찰해야 합니다.
세포 침습 분석
Transwell 침습 분석은 공극 크기가 8 µm인 24-well 폴리카보네이트 막 인서트를 사용하여 수행되었다. 각 인서트의 상단 표면에 무혈청 DMEM으로 1:8로 희석하여 최종 단백질 농도를 약 1 mg/mL로 맞춘 100 µL의 Matrigel 기저막 매트릭스를 코팅하고 37 °C에서 4시간 동안 배양하였다. A549 및 H358 세포를 각각 8 × 105 cells/mL 및 4 × 105 cells/mL의 밀도로 무혈청 RPMI-1640 배지에 재현탁하였다. 세포 현탁액 200 µL를 상단 챔버에 첨가하였으며, 이는 인서트당 1.6 × 105개의 A549 세포 또는 8 × 104개의 H358 세포에 해당한다. 하단 챔버에는 화학 유인 물질로서 20% 소태아혈청을 함유한 RPMI-1640 배지 500 µL를 채웠다. 5% CO₂를 함유한 습윤한 분위기의 37 °C에서 48시간 동안 배양한 후, 막의 상단 표면에 남아 있는 비침습 세포를 면봉으로 부드럽게 제거하였다. 막을 통해 침습한 세포는 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정시켰으며, 상온에서 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 20분간 염색하였다. 각 인서트당 무작위로 선택한 5개의 현미경 시야를 촬영하였고, ImageJ를 사용하여 침습된 세포 수를 정량화하였다. 5개 시야의 평균 세포 수를 각 인서트의 단일 값으로 간주하였으며, 개별 현미경 시야가 아닌 인서트를 실험 단위로 처리하였다. 세 번의 독립적인 생물학적 실험을 수행하였다.
참고: 막이 손상되거나 하단 표면으로 이동한 세포가 떨어져 나가는 것을 방지하기 위해, 침습하지 않은 세포를 조심스럽고 균일하게 제거하십시오.
통계 분석
별도의 설명이 없는 한 데이터는 평균 ± SD로 표시하며, n는 독립적인 생물학적 실험 횟수를 나타냅니다. 기술적 반복 실험 또는 동일한 실험 단위 내의 여러 현미경 시야는 추론 통계 검정 전 평균값을 산출하였습니다. 세 가지 세포주 간의 비교를 위해 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후 Tukey 보정 쌍별 비교를 수행하였습니다. CCK-8 및 상처 폐쇄 시간 경과 분석에서는 이원 반복 측정 분산 분석(two-way repeated-measures ANOVA)을 사용하여 처리, 시간 및 처리-시간 상호작용 효과를 평가하였으며, 이후 개별 시점에서 Šídák 보정 비교를 수행하였습니다. 두 그룹 간의 비교는 양측 비쌍체 Student's t-test를 사용하여 분석하였습니다. 통계 분석 및 데이터 시각화는 통계 분석 및 그래프 작성 소프트웨어를 사용하여 수행하였습니다. 정확한 p-값은 피규어 패널 또는 소스 데이터 표에 기재되어 있습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 정의하였으며, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001로 표시하였습니다.
결과
TCGA/starBase 분석 결과 LUAD에서 miR-486-3p의 발현량이 감소한 것으로 나타났으며, TargetScan을 통해 후보 결합 부위를 확인하였다
starBase v3.0를 통해 접근한 TCGA 유래 발현 데이터에 따르면, 512개의 폐선암(LUAD) 샘플에서 miR-486-3p의 발현량이 20개의 비종양 폐 샘플보다 유의하게 낮게 나타났습니다 (Wilcoxon rank-sum test, p = 3.2 × 10⁻5; 그림 1). TargetScanHuman을 통해 DVL1 3′ 비번역 부위(3′ UTR)의 468–474번 위치에서 보존성이 낮은 miR-486-3p 후보 7mer-m8 사이트를 확인하였으며, context++ 점수는 −0.23, context++ 점수 백분위수는 80이었습니다. 또한 WNT5B 3′ UTR의 913–920번 위치에서 보존성이 낮은 후보 8mer 사이트가 확인되었으며, context++ 점수는 −0.46, context++ 점수 백분위수는 97이었습니다 (그림 2). 이러한 전산 예측 사이트들은 실험적 가설을 세우는 데 사용되었으며, miRNA-타겟 간의 직접적인 결합 증거로 간주되지는 않았습니다. 소스 URL은 표 2에 제공되어 있습니다.
LUAD 세포주에서 miR-486-3p 발현량이 감소하며, 렌티바이러스 형질도입 후에는 현저히 증가한다
각각의 일상적인 배양 조건 하에서, RT-qPCR 분석 결과 miR-486-3p의 발현량이 Beas-2b 기관 상피 세포보다 A549 및 H358 세포에서 더 낮게 나타났습니다. 일원 분산 분석 후 Tukey 보정 비교를 통해 A549와 Beas-2b 세포 간(p < 0.01) 및 H358과 Beas-2b 세포 간(p < 0.001; 그림 3A)에 유의미한 차이가 있음을 확인하였습니다.
LV-miR-486-3p를 이용한 안정적 형질도입은 해당 LV-NC 그룹과 비교하여 miR-486-3p의 발현량을 현저히 증가시켰습니다. 발현량은 A549 세포에서 약 1,470배, H358 세포에서 약 220배 증가하였으며, 두 비교 모두 통계적 유의성에 도달하였습니다(p < 0.001; 그림 3B,C). 이러한 결과는 miR-486-3p가 과발현된 안정적 세포 모델이 성공적으로 구축되었음을 확인해 주었습니다.
miR-486-3p의 강제 발현은 WNT5B, DVL1, β-catenin 및 BCL-2 발현의 감소와 연관이 있다
Western blotting 결과, LV-miR-486-3p가 형질전환된 세포에서 각각의 LV-NC 대조군보다 WNT5B, DVL1, total β-catenin 및 BCL-2 단백질 발현량이 더 낮은 것으로 나타났다(그림 4A–E). A549 세포에서 miR-486-3p의 강제 발현은 β-catenin (p = 0.022), WNT5B (p = 0.0008), DVL1 (p = 0.019) 및 BCL-2 (p = 0.0017) 단백질 발현량의 감소와 연관이 있었다. H358 세포에서도 β-catenin (p = 0.001), WNT5B (p = 0.0002), DVL1 (p = 0.0003) 및 BCL-2 (p = 0.0018)에 대해 상응하는 감소가 관찰되었다.
단백질 분석 결과에 상응하는 전사 수준의 변화가 동반되었는지 확인하기 위해 RT-qPCR을 수행하였다(그림 4F–I). A549 세포에서 miR-486-3p를 강제 발현시킨 결과, LV-NC 그룹과 비교하여 CTNNB1 mRNA는 0.226배(p = 0.004), WNT5B mRNA는 0.180배(p = 0.004), DVL1 mRNA는 0.278배(p = 0.006), BCL2 mRNA는 0.259배(p = 0.003)로 감소하였다.
H358 세포에서도 유사한 전사 수준의 변화가 검출되었다. CTNNB1 mRNA는 LV-NC 그룹 대비 0.288배로 감소하였고 (p = 0.028), WNT5B mRNA는 0.250배 (p = 0.019), DVL1 mRNA는 0.271배 (p = 0.020), 그리고 BCL2 mRNA는 0.534배 (p = 0.003)로 감소하였다. 따라서, 전사 수준 변화의 방향성은 두 세포주 모두에서 해당 단백질 수준의 결과와 일치하였다. 이러한 결과는 협응된 발현 변화를 보여주지만, 직접적인 타겟팅이나 선형적인 WNT5B/DVL1/β-catenin 신호 전달 메커니즘의 활성을 입증하는 것은 아니다.
강제적인 miR-486-3p 발현은 성장 관련 CCK-8 신호를 감소시킨다
CCK-8 측정값은 각 실험군의 해당 0시간 값으로 정규화되었습니다. 정규화된 CCK-8 신호는 LV-NC 및 LV-miR-486-3p가 형질전환된 세포 모두에서 시간이 지남에 따라 증가하였으나, miR-486-3p를 강제 발현시킨 경우 일반적으로 더 낮은 수치가 관찰되었습니다(그림 5).
A549 세포에서, 이원 반복측정 분산 분석(two-way repeated-measures analysis of variance) 후 Šídák 보정을 통한 비교 결과, LV-miR-486-3p 군의 CCK-8 신호가 24, 48, 96시간에서 LV-NC 군보다 유의하게 낮게 나타났으나(p < 0.05), 72시간에서의 차이는 통계적으로 유의하지 않았습니다(그림 5A). H358 세포의 경우, 24, 48, 72, 96시간 모두에서 LV-miR-486-3p 군의 CCK-8 신호가 유의하게 낮았습니다(p < 0.05; 그림 5B). 이러한 결과는 강제적인 miR-486-3p 발현이 성장 관련 대사 활성을 감소시켰으며, H358의 시간 경과에 따라 더 일관된 효과가 나타났음을 나타냅니다.
miR-486-3p의 강제 발현은 클론 형성 성장을 감소시킨다
장기적인 클론 형성 성장을 평가하기 위해 콜로니 형성 분석을 수행하였다. LV-miR-486-3p를 형질전환시킨 A549 세포는 해당 LV-NC 세포에 비해 콜로니 형성 수가 유의하게 적었다(p = 0.013; 그림 6A). H358 세포에서도 콜로니 수의 유의한 감소가 관찰되었다(p = 0.006; 그림 6B). 이러한 감소는 A549 세포보다 H358 세포에서 더 뚜렷하게 나타났으며, 이는 두 LUAD 모델 간에 클론 형성 효과의 크기가 다름을 나타낸다.
강제적인 miR-486-3p 발현은 상처 폐쇄를 감소시킨다
스크래치 처리 후 24시간, 48시간, 72시간 시점에서 상처 폐쇄 정도를 정량화하였다(그림 7). A549 배양 세포에서 LV-miR-486-3p 군은 24, 48, 72시간 모두에서 LV-NC 군보다 상처 폐쇄 정도가 유의하게 낮게 나타났다(각 비교에서 p < 0.05; 그림 7A,C).
마찬가지로, LV-miR-486-3p가 형질전환된 H358 배양 세포에서 24시간 및 48시간(p < 0.05)과 72시간(p < 0.01; 그림 7B,D)에 상처 폐쇄가 감소되었습니다. 약리학적 증식 억제제 없이 분석을 수행했기 때문에, 이러한 결과는 배타적인 이동 특이적 효과의 증거라기보다 상처 폐쇄의 감소로 해석되었습니다.
miR-486-3p의 강제 발현은 Matrigel이 코팅된 막의 통과를 감소시킨다
48시간 후 Matrigel이 코팅된 Transwell 막을 통과하는 세포의 능력을 평가하였다. A549 LV-miR-486-3p 군의 하단 막 표면에서 검출된 crystal violet 염색 세포 수는 A549 LV-NC 군보다 유의하게 적었다(p = 0.0001; 그림 8A). H358 세포에서도 유사한 감소가 관찰되었다(p = 0.0007; 그림 8B).
각 인서트(insert)당 5개의 현미경 시야를 평균화하였으며, 인서트를 실험 단위로 처리하였습니다. 이러한 결과는 본 분석에 사용된 조건에서 miR-486-3p의 강제 발현 이후 Matrigel이 코팅된 막의 통과가 감소했음을 보여줍니다.
데이터 가용성:
그림의 근거가 되는 모든 소스 데이터는 데이터베이스 소스 파일, RT-qPCR 데이터, 잘리지 않은 웨스턴 블롯, 밀도 측정값, 현미경 이미지, 계수 기록, CCK-8 측정값 및 통계 분석 파일을 포함하여 보충 파일 1(Supplementary File 1)에 포함되어 있습니다.
그림 1: TCGA/starBase의 LUAD 및 정상 폐 샘플 내 miR-486-3p 풍부도. TCGA 유래 발현 데이터는 2026년 5월 starBase v3.0을 통해 검색되었으며, 512개의 폐선암(LUAD) 샘플과 20개의 정상 폐 샘플이 포함되었습니다. 그룹 간 비교는 Wilcoxon rank-sum test(p = 3.2 × 10⁻5)를 사용하여 수행되었습니다. LUAD, 폐선암. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: DVL1 및 WNT5B 3′ UTR에서 TargetScan으로 예측된 후보 miR-486-3p 결합 사이트. TargetScanHuman은 DVL1 3′ 비번역 영역(3′ UTR)의 468~474번 위치에서 후보 7mer-m8 사이트를, WNT5B 3′ UTR의 913~920번 위치에서 후보 8mer 사이트를 식별하였습니다. 소스 URL은 표 2에 제공되어 있습니다. 이러한 컴퓨터 예측은 가설 생성에 사용되었으며, 직접적인 결합에 대한 실험적 증거가 아닙니다. 여기에서 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.
그림 3: 기저 miR-486-3p 발현량 및 렌티바이러스 과발현 검증. (A>) 각각의 일상적인 배양 배지에서 유지된 A549, H358 및 Beas-2b 세포의 miR-486-3p 발현량에 대한 RT-qPCR 분석. (B,C>) LV-NC 또는 LV-miR-486-3p를 도입시킨 A549 (B>) 및 H358 (C>) 세포에서 miR-486-3p 과발현의 RT-qPCR 검증. 발현량은 U6로 정규화되었다. 데이터는 세 번의 독립적인 생물학적 실험의 평균 ± SD로 나타내었다. (A>)는 one-way ANOVA 이후 Tukey-adjusted 다중 비교를 통해 분석하였다. (B,C>)는 양측 비쌍체 Student’s t-test를 사용하여 분석하였다. *p < 0.01; **p < 0.001. LV-NC, 음성 대조군 렌티바이러스; RT-qPCR, 역전사 정량 PCR; SD, 표준 편차. 여기에서 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.
그림 4: miR-486-3p의 강제 발현은 후보 유전자 발현의 감소와 연관되어 있다. (A>) LV-NC 또는 LV-miR-486-3p를 도입한 A549 및 H358 세포에서 β-catenin, WNT5B, DVL1, BCL-2 및 β-actin의 풍부도를 보여주는 대표적인 Western blot. 분자량은 kilodaltons로 표시되었다. (B–E>) β-actin으로 표준화한 β-catenin (B), WNT5B (C), DVL1 (D) 및 BCL-2 (E)의 밀도 측정 정량 분석. (F–I>) GAPDH로 표준화한 CTNNB1 (F), WNT5B (G), DVL1 (H) 및 BCL2 (I) 전사체 풍부도의 RT-qPCR 분석. 데이터는 3회의 독립적인 생물학적 실험의 평균 ± SD로 표시되었으며, 개별 점은 독립적인 생물학적 반복물을 나타낸다. 그룹 간 비교는 양측성 비쌍체 Student’s t-test를 사용하여 수행되었다. 정확한 p-값과 배수 변화(fold change)는 해당 패널에 제공되었다. kDa, kilodaltons; LV-NC, 음성 대조군 렌티바이러스; RT-qPCR, 역전사 정량 PCR; SD, 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 강제적인 miR-486-3p 발현은 시간이 경과함에 따라 성장 관련 CCK-8 신호를 감소시킨다. LV-NC 또는 LV-miR-486-3p가 형질전환된 A549 (A) 및 H358 (B) 세포를 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h에서 분석하였다. OD450 값은 각 그룹 내의 해당 0-h 값으로 표준화하였다. 데이터는 세 번의 독립적인 생물학적 실험의 평균 ± SD로 표시되었다. 처리, 시간 및 처리-시간 상호작용의 효과는 two-way repeated-measures ANOVA를 사용하여 분석하였으며, 이후 각 시점에서 그룹 간 Šídák 보정 비교를 수행하였다. *p < 0.05. CCK-8, Cell Counting Kit-8; LV-NC, 음성 대조군 렌티바이러스; OD450, 450 nm에서의 광학 밀도; SD, 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: miR-486-3p의 강제 발현은 클론 생성 성장을 감소시킨다. LV-NC 또는 LV-miR-486-3p를 도입한 A549 (A) 및 H358 (B) 세포의 대표적인 웰 전체 이미지와 정량화된 콜로니 수가 제시되어 있다. 콜로니는 모든 그룹에 대해 동일한 분석 설정을 적용하여 ImageJ로 정량화하였다. 데이터는 세 번의 독립적인 생물학적 실험의 평균 ± SD로 표시되었으며, 양측 독립 표본 Student’s t-검정을 통해 분석되었다. 정확한 p-값은 해당 패널에 제공되어 있다. LV-NC, 음성 대조군 렌티바이러스; SD, 표준 편차. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: miR-486-3p의 강제 발현은 상처 폐쇄를 감소시킨다. 스크래칭 후 0 h, 24 h, 48 h, 72 h에서 A549 (A,C) 및 H358 (B,D) 세포의 대표 이미지와 정량적 상처 폐쇄 측정 결과가 제시되어 있다. 상처 폐쇄는 다음과 같이 계산되었다: (0 h에서의 상처 면적 − 지정된 시점에서의 상처 면적) / 0 h에서의 상처 면적 × 100%. 데이터는 세 번의 독립적인 생물학적 실험의 평균 ± SD로 표시되었다. 처리, 시간 및 처리와 시간 간의 상호작용 효과는 이원 반복측정 ANOVA로 분석하였으며, 이후 각 시점별 그룹 간 비교는 Šídák 보정법을 사용하여 분석하였다. 스케일 바, 200 µm. *p < 0.05; **p < 0.01. LV-NC, 음성 대조군 렌티바이러스; SD, 표준편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: miR-486-3p의 강제 발현은 Matrigel이 코팅된 Transwell 막의 통과를 감소시킨다. LV-NC 또는 LV-miR-486-3p가 형질전환된 A549 (A) 및 H358 (B) 세포에 대해 대표적인 크리스탈 바이올렛 염색 현미경 시야와 정량적인 인서트 수준의 세포 수가 제시되어 있다. 공극 크기가 8-µm인 Transwell 인서트가 사용되었다. 각 인서트에 대해 5개의 현미경 시야를 평균냈으며, 각 인서트를 하나의 실험 단위로 처리하였다. 데이터는 3회의 독립적인 생물학적 실험의 평균 ± SD로 표시되었으며, 양측 비쌍체 Student’s t-test를 사용하여 분석되었다. 스케일 바, 200 µm. 정확한 p-값은 해당 패널에 제공되어 있다. LV-NC, 음성 대조군 렌티바이러스; SD, 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 유전자 | 프라이머 서열 | 앰플리콘 길이 | 증폭 효율 | |
| WNT5B | 정방향: 5'-AAATGCCACGGCGTCTCG-3', | 118 bp | 101% | |
| 역방향: 5'-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3' | ||||
| DVL1 | 정방향: 5'-GAGGGTGCTCACTCGGATG-3', | 158 bp | 95.60% | |
| 역방향: 5'-GTGCCTGTCTCGTTGTCCA-3' | ||||
| CTNNB1 | 정방향: 5'- GCGCCATTTTAAGCCTCTCG -3', | 140 bp | 96.30% | |
| 역방향: 5'-AAATACCCTCAGGGGAACAGG-3' | ||||
| BCL2 | 정방향: 5'- GTCATGTGTGTGGAGAGCGT-3', | 139 bp | 97.20% | |
| 역방향: 5'-ATAGTTCCACAAAGGCATCC-3' | ||||
| GAPDH | 정방향: 5'-GACTTCAACAGCAACTCCCACTC-3', | 107 bp | 98.30% | |
| 역방향: 5'-TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG-3' | ||||
표 1: ~에 사용된 프라이머 서열 실시간 역전사 정량 PCR (RT-qPCR).
| 표적 | 예측 정보 | (번역할 소스 텍스트가 제공되지 않았습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.) | ||
| DVL1 | 7mer-m8, 468–474번 위치 | TargetScan URL (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000397196.2&taxid=9606&구성원=miR-486-3p&CNC 표시=1& 표시됨c=1&shownc_nc=1&showncf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
| WNT5B | 8mer, 913-920번 위치 | TargetScan URL (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000378891.5&taxid=9606&구성요소=miR-486-3p&CNC 표시=1& 표시됨c=1&shownc_nc=1&표시된cf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
표 2: TargetScan 데이터베이스 및 해당 URL.
보충 파일 1: 본 연구의 결과물을 뒷받침하는 데이터.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
본 기능 획득 연구에서는 A549 및 H358 폐선암(LUAD) 세포에서 miR-486-3p의 안정적인 강제 발현 효과를 평가하였습니다. 두 모델 모두에서 miR-486-3p의 과발현은 성장 관련 CCK-8 신호의 감소, 클론 형성 성장 저하, 상처 폐쇄 속도 감소, 그리고 Matrigel이 코팅된 Transwell 막을 통과하는 세포 수의 감소와 관련이 있었습니다. 이러한 표현형 변화는 WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 전사체 수준의 저하와 더불어 WNT5B, DVL1, total β-catenin 및 BCL-2 단백질 양의 감소를 동반하였습니다. 종합적으로, 이러한 결과는 강제적인 miR-486-3p 발현, 여러 악성 세포 표현형의 약화, 그리고 선택된 Wnt 관련 분자들의 협응된 변화 사이의 연관성을 뒷받침합니다. 다만, 본 연구가 miRNA-표적 결합, 경로 활성 또는 인과적 신호 전달 서열을 직접적으로 규명하는 것은 아닙니다.
본 연구에서 관찰된 일반적인 종양 억제 표현형은 이전 보고들과 일치하며, 이를 주된 새로운 발견으로 해석해서는 안 됩니다. Tomioka 등은 이전에 miR-486-3p와 miR-486-5p 모두 LUAD 세포의 악성 표현형을 억제한다는 것을 입증하였으며, 편향되지 않은 타겟 스크리닝 전략을 통해 GINS4를 확인하였습니다26. 본 연구의 기여도는 보다 구체적입니다. 즉, 두 가지 LUAD 세포 모델에서 miR-486-3p의 강제 발현은 WNT5B, DVL1 및 β-catenin의 양 감소를 동반하였습니다. 또한, 본 연구는 안정적인 렌티바이러스 형질도입, RT-qPCR, Western blotting, CCK-8 분석, 콜로니 형성, 상처 폐쇄 및 Matrigel 코팅 Transwell 분석을 결합한 통합 실험 워크플로우를 제공합니다. 이러한 차별점은 본 연구가 LUAD에서 miR-486-3p의 항종양 활성을 처음으로 입증했다고 주장하는 것이 아니라, miR-486-3p 과발현과 관련된 분자적 관찰 결과를 확장했다는 점에서 중요합니다.
Wnt 관련 결과는 신중하게 해석해야 합니다. WNT5B는 일반적으로 비정형(noncanonical) Wnt 리간드로 설명되며, 수용체 및 상황에 따라 평면 세포 극성(planar-cell-polarity) 또는 Wnt/Ca2⁺ 신호 전달을 활성화할 수 있습니다. 일부 세포 환경에서 비정형 Wnt 신호 전달은 β-catenin 의존적 신호 전달을 억제할 수도 있습니다10,11. DVL1은 정형(canonical) 및 비정형 Wnt 신호 전달 모두에 참여할 수 있는 공통 세포 내 매개체이며, 비소세포폐암에서 β-catenin 관련 표현형과 연관되어 왔습니다12. 따라서 WNT5B, DVL1 및 전체 β-catenin의 동시 감소가 선형적인 WNT5B→DVL1→β-catenin 경로를 입증하는 것은 아닙니다. 대신 본 데이터는 miR-486-3p의 강제 발현 후 WNT5B 발현과 DVL1 및 β-catenin 함량이 동시에 감소했음을 나타냅니다.
전사 수준의 결과는 Western blot 분석 결과와 방향성 측면에서 일치했다. miR-486-3p의 강제 발현은 A549 및 H358 세포 모두에서 WNT5B, DVL1 및 CTNNB1 전사체의 풍부도를 감소시켰다. 이러한 일치성은 관찰된 단백질 변화가 단백질 안정성의 변화에만 기인한 것이 아니라 전사체 풍부도의 변화를 동반했을 가능성을 시사한다. 그럼에도 불구하고, 전사체 및 단백질 수준의 감소만으로는 miR-486-3p가 예측된 3′ 비번역 부위에 직접 결합한다는 것을 입증할 수 없다. WNT5B 또는 DVL1이 miR-486-3p에 의해 직접 조절되는지 확인하기 위해서는 야생형 및 돌연변이 결합 부위를 이용한 Dual-luciferase 리포터 분석과 함께 회복 실험이 필요할 것이다. 마찬가지로, BCL-2 풍부도의 감소는 생존 관련 단백질의 변화를 나타내지만, 검증된 세포 사멸 분석 없이는 이를 세포 자멸사 증가의 증거로 해석할 수 없다.
기능적 분석 또한 분석법 고유의 한계가 있습니다. CCK-8은 세포 수를 직접적으로 결정하기보다 세포의 대사 활성을 측정하므로, 흡광도의 변화는 증식, 대사 또는 생존율의 변화를 반영할 수 있습니다. 콜로니 형성 분석은 클론 형성 능력을 장기적으로 측정할 수 있게 해주지만, 그 효과의 크기는 두 세포주 간에 차이가 있었으며 A549 세포에서는 완만한 감소를, H358 세포에서는 더 큰 감소를 보였습니다. 이러한 차이는 강제적인 miR-486-3p 발현에 대한 반응이 분자 및 세포적 환경에 따라 달라질 수 있음을 시사합니다.
두 세포주 모두에서 상처 폐쇄(wound closure)가 감소한 것이 관찰되었으나, 분석 과정에서 증식 억제제는 사용되지 않았습니다. 강제적인 miR-486-3p 발현이 성장 관련 측정치에도 영향을 미쳤으므로, 증식 감소가 상처 폐쇄 표현형에 기여했을 가능성이 있습니다. 따라서 이러한 결과는 이동(migration) 특이적 효과라기보다 상처 폐쇄의 감소로 해석해야 합니다. 마찬가지로, 48시간 동안 진행된 Matrigel 코팅 Transwell 분석은 막 통과, 증식, 생존 또는 부착의 차이에 의해 영향을 받았을 수 있습니다. 결과적으로 하단 막 표면에서 관찰된 세포 감소는 테스트 조건 하에서 통과 능력이 저하되었음을 뒷받침하지만, 특정 침습 메커니즘만을 분리하여 보여주지는 않습니다.
추가적으로 고려해야 할 사항은 miR-486-3p 과발현의 정도입니다. 렌티바이러스 형질전환을 통해 A549 세포에서는 대조군 대비 miR-486-3p의 발현량이 약 1,470배, H358 세포에서는 약 220배 증가했습니다. 이러한 초생리학적 발현은 시드 서열 의존적인 오프타겟 억제를 증가시키거나, RNA 유도 침묵 복합체(RISC) 구성 요소의 가용성에 영향을 주거나, 비특이적인 세포 스트레스를 유발할 수 있습니다. 용량-반응 시리즈 실험을 수행하지 않았기 때문에, miR-486-3p의 발현량과 관찰된 표현형 사이의 관계를 정의할 수 없었습니다. 또한, 억제제를 이용한 기능 상실(loss-of-function) 실험이 부재하여 LUAD 세포 내 miR-486-3p의 내인성 생리학적 역할에 대한 결론을 내릴 수 없습니다. 따라서 본 결과는 안정적인 강제 과발현의 결과로 구체적으로 해석되어야 합니다.
몇 가지 제한 사항을 고려해야 합니다. 두 종류의 KRAS 변이 LUAD 세포주만 조사되었으며, 서로 다른 일반 배지를 사용했기 때문에 Beas-2b 세포와의 비교 해석에 한계가 있습니다. 연구 기간 동안 세포주 인증 및 마이코플라스마 검사를 수행하지 않았으며, miR-486-3p 정량을 위해 U6만을 단일 참조로 사용했습니다. 또한 본 연구에서는 기능 상실, 용량 반응, 리포터, 레스큐 및 기능적 Wnt 경로 분석이 부족했습니다. 더욱이, 상처 폐쇄(wound-closure) 및 Transwell 결과는 증식, 생존력 또는 부착력의 차이에 의해 영향을 받았을 수 있습니다. 마지막으로, 동물 모델, 환자 검체 또는 임상 검증 코호트가 포함되지 않았습니다. 따라서 본 결과는 이러한 강제 발현 in vitro 시스템에 국한되며, 직접적인 표적화, 경로 인과 관계 또는 임상적 유용성을 입증하는 것은 아닙니다.
결론적으로, 안정적인 강제 miR-486-3p 발현은 A549 및 H358 LUAD 세포에서 성장 및 운동성 관련 측정 수치들을 감소시켰으며, 이는 WNT5B, DVL1, 총 β-catenin 및 BCL-2 발현의 감소와 동반되었습니다. 이러한 결과는 향후 기전 연구를 위한 기초를 제공하지만, WNT5B 또는 DVL1이 직접적인 표적이라는 점, 선형적인 WNT5B/DVL1/β-catenin 경로의 존재, 또는 miR-486-3p의 임상적 가치를 확립하는 것은 아닙니다.
공개 사항
저자들은 선언할 이해상충 관계가 없습니다.
감사의 글
본 연구는 절강성 의료 및 보건 과학 기술 계획(2025KY349)과 가흥시 중점 지원 학과(2023-zc-014)의 재정적 지원을 받아 수행되었습니다.
재료
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| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | SDS-PAGE 분리 겔 제조 |
| 20× TBS 버퍼 | Solarbio | 71080 | 웨스턴 블롯 세척 및 항체 희석용 스톡 버퍼 |
| 30% acrylamide/bis-acrylamide 용액 (29:1) | Solarbio | A1010 | SDS-PAGE 겔 제조 |
| 4% 파라포름알데히드 고정액 | Servicebio | G1101 | 콜로니 형성 및 Transwell 분석을 위한 고정 |
| 5× 단백질 로딩 버퍼 | Beyotime | P0015 | SDS-PAGE용 단백질 시료 준비 |
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| β-catenin 항체 | Signalway Antibody | 21725 | 토끼 1차 항체; 웨스턴 블로팅 1:5,000 희석 |
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