마우스 골격근에서 유래한 기능성 미토콘드리아의 분리, 정제 및 특성 분석

Summary

트립신 소화와 차동 원심분리를 결합한 표준화된 프로토콜이 생쥐 골격근에서 미토콘드리아의 분리, 정제 및 기능적 특성 분석과 미토콘드리아 이식에서의 적용 평가를 위해 확립되었습니다.

Abstract

미토콘드리아는 진핵세포에서 에너지 대사, 신호 전달, 세포 항상성을 조절하는 필수 소기관입니다. 미토콘드리아 기능 장애는 수많은 질병의 발병 기전을 촉진하며, 재생 치료 전략으로서 미토콘드리아 이식의 발전을 촉진했습니다. 미토콘드리아 이식의 성공 적용은 고도로 정제되고 기능적으로 온전한 미토콘드리아의 가용성에 달려 있습니다. 골격근은 높은 미토콘드리아 함량, 대사 활동, 접근성 덕분에 적합한 기증 공급원입니다. 이 연구는 마우스 골격근에서 기능성 미토콘드리아를 분리, 정제 및 특성화하기 위한 표준화되고 재현 가능한 프로토콜을 확립하고, 미토콘드리아 이식에서의 사용을 평가하였습니다. 이 절차는 두 가지 주요 단계로 구성되었습니다. 먼저, 트립신 소화 후 차등 원심분리를 통해 C57BL/6 마우스의 골격근에서 미토콘드리아를 분리하였다. 둘째, 분리된 미토콘드리아를 특성화하여 순도, 초구조 및 기능적 활성을 평가하였습니다. 미토콘드리아 순도는 비신코닉산(BCA) 단백질 정량 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 평가하였다. 초구조적 완전성은 투과 전자현미경으로 조사되었습니다. 기능 활성은 JC-1과 미토콘드리아 형광 표지와 함께 고해상도 호흡계를 이용한 산소 섭취량, ATP 생산 능력, 호흡 조절 비율 측정을 통해 평가하였다. 분리된 미토콘드리아는 보존된 막 전위, 온전한 초구조, 안정적인 호흡 활동을 보여 하위 기능 연구와 미토콘드리아 이식 응용에 적합함을 나타냈다.

Introduction

미토콘드리아는 아데노신 삼인산(ATP) 생성의 주요 부위이며, 세포자멸사, 칼슘 항상성, 그리고 활성산소종(ROS) 대사에 중심적인 역할을 합니다. 따라서 미토콘드리아의 기능적 완전성은 세포 항상성 유지와 세포 운명 결정에 매우 중요합니다 ^1,2. 미토콘드리아 기능장애, 즉 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 돌연변이와 전자전달 사슬(ETC) 이상은 에너지 대사 저하, 산화 스트레스, 세포자사멸사 조절 장애를 초래합니다 ^3,4. 이러한 이상은 유전성 미토콘드리아 질환, 신경퇴행성 질환, 심혈관 질환 등 다양한 질병과 관련이 있습니다 ^5,6. 항산화제나 대사 보조인자와 같은 미토콘드리아 기능 장애에 대한 기존 치료 전략은 미토콘드리아 기능을 직접적으로 회복시키지 않고 증상을 완화하기 때문에 일반적으로 효과가 제한적입니다 ^7,8. 그 결과, 미토콘드리아 이식은 재생 의학에서 유망한 치료법으로 부상했습니다. 이 전략은 손상되거나 기능 장애가 있는 세포에 온전한 외인성 미토콘드리아를 전달하여 미토콘드리아 활동과 세포 에너지 대사를 회복하는 것을 포함합니다 ^9,10. 이전 연구들은 외부 미토콘드리아가 수용 세포에 의해 내화되어 내인성 미토콘드리아 네트워크에 통합될 수 있음을 보여주었으며, 이는 생체에너지 기능 향상과 세포 생존율 향상으로 이어진다 11,12,13.

골격근은 높은 미토콘드리아 함량, 대사 활성, 접근성 때문에 미토콘드리아 분리에 적합한 기증체로 간주됩니다 14,15,16. 미토콘드리아 이식은 미토콘드리아 분리, 정제, 기능적 특성 분석, 그리고 수혜자 세포로의 효율적인 전달 등 여러 중요한 단계를 필요로 합니다. 그러나 지금까지 보고된 프로토콜들 사이에는 상당한 방법론적 변동성이 남아 있으며, 특히 조직 균질화, 효소 소화, 온도 조절 및 정제와 관련된 절차에서 그러합니다. 이러한 변동성은 미토콘드리아의 수율, 순도, 기능적 완전성에 영향을 미쳐 실험적 재현성을 제한할 수 있습니다.

방법론적 일관성과 재현성을 향상시키기 위해, 본 연구는 트립신 소화와 차등 원심분리를 이용해 마우스 골격근에서 기능적 미토콘드리아를 분리하고 특성화하는 표준화된 프로토콜을 제시합니다. 분리된 미토콘드리아는 비신코닉산(BCA) 단백질 정량화, 웨스턴 블롯팅, 투과 전자현미경, 형광 기반 막 전위 분석, 고해상도 호흡술을 통해 순도, 초구조적 완전성, 기능 활성을 평가하였습니다. 또한, 수혜자 세포가 분리된 미토콘드리아를 흡수하여 미토콘드리아 이식 적용에 적합한지 평가하였습니다. 이 프로토콜은 후속 실험 연구를 위한 기능적 골격근 유래 미토콘드리아를 얻기 위한 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다.

Protocol

모든 동물 실험은 특정 병원체가 없는 시설에서 수행되었으며, 공군 의과대학 제3부속병원 동물윤리 및 이용 위원회(승인 번호: IACUC-2024kq-065)의 승인을 받았습니다.

수컷 C57BL/6 마우스(6-8주, 18-20g)는 공군 의과대학 실험동물센터(생산 허가: SCXK (Shaanxi) 2024-002)에서 구입하였습니다. 쥐들은 개별 환기된 케이지(IVC)에 양압과 청결한 환경에서 수용되었으며, 온도는 20-26°C, 상대습도는 40%-70%, 12시간의 밝은 어둠 주기, 시간당 최소 15회의 공기 교환이 이루어졌습니다. 멸균된 식단, 식수, 환경 보충이 제공되었습니다.

프로토콜에서 사용되는 시약, 화학물질 및 실험 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 동물 희생 및 조직 채취

1. 쥐를 밀폐된 안락사 챔버에 넣고, 분당 30%-70% 챔버 부피로 점진적으로 이산화탄소(CO₂) 흡입을 통해 안락사시킵니다.
2. 자발적 호흡과 심장 박동 중단, 동공 반사 상실, 기계적 자극에 대한 반응 없음으로 사망을 확인하세요.
3. 안락사된 C57BL/6 쥐를 75% 에탄올에 5분간 담가 소독하세요.
   참고: 알코올로 인한 조직 고정과 세포 손상을 방지하기 위해 담그는 시간을 10분으로 제한하세요. 프로토콜 내내 신선한 조직을 사용하세요. 냉동은 미토콘드리아의 생존력과 기능적 완전성을 저해하기 때문입니다.
4. 쥐를 층류 후드 안에 무균 페트리 접시에 넣고, 복부가 위를 향하게 하여 복부와 뒷다리 부위를 완전히 노출시킵니다.
5. 겸자로 생식기 근처 하복부 피부를 들어 올린 후 작은 절개를 하세요. 피부를 밑 조직에서 분리하기 위해 둔한 해리를 시행하세요. 절개를 중앙선을 따라 발목까지, 그리고 양쪽 뒷다리 쪽으로 측면으로 확장하여 하지근을 완전히 노출시킵니다.
6. 허벅지 앞쪽에 있는 대퇴사두근을 식별하고, 둔한 해리를 사용해 근섬유 방향에 따라 근육을 조심스럽게 분리하세요. 근육 조직을 완전히 분리하기 위해 말위 슬개골 인대와 근위 힘줄을 절단하세요.
   참고: 조직을 미리 냉각된 인산염 완충 생리식염수(PBS)에 2% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하여 세척할 때마다 신선한 페트리 접시를 사용해 오염을 최소화하세요.
7. 분리된 근육 조직을 즉시 미리 냉각된 PBS에 넣고 깨끗이 헹구어 조직 표면의 털과 혈액을 제거합니다.
8. 멸균 거즈로 조직의 과도한 수분을 부드럽게 닦아내세요. 조직을 1.5mL 마이크로 원심분리관에 나누고 샘플을 무게로 재세요. 제제 간 일관성을 유지하기 위해 샘플당 약 100mg의 조직을 사용하세요.

2. 조직 다짐 및 균질

1. Step 1.8 의 조직이 담긴 마이크로 원심분리관을 얼음 위에 올려놓으세요. 멸균 가위를 사용해 조직을 약 1-2 mm³ 크기의 작은 조각으로 갈아냅니다.
2. 0.25% 트립신을 미리 냉각해 8용량을 추가하고, 조직 조각을 얼음 위에서 15분간 소화합니다.
   참고: 조직 질량(1 mg ≈ 1 μL)에 따라 필요한 트립신 부피를 계산하세요. 예를 들어, 조직 80mg에 0.25% 트립신 640 μL을 추가합니다.
3. 혼합물을 1,000 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 상정액은 버리고 조직 펠릿을 남겨두세요. D-만니톨(215 mM), 자당(75 mM), HEPES(20 mM), EGTA(1 mM), 지방산 없는 소 혈청 알부민(0.5% w/v)을 포함한 1 mL 미리 냉각된 미토콘드리아 분리 완충제에 재현탁합니다.
4. 현탁을 얼음 위에 유지되는 유리 균질기로 옮기세요. 부탁액이 탁해질 때까지 10-12번의 부드러운 위아래로 스트로크를 사용해 조직을 균질화합니다.
   참고: 균질기 바닥에서 유리 공을 옆으로 회전시키지 마세요. 과도한 기계적 힘은 미토콘드리아 막을 손상시키고 미토콘드리아 기능을 저해할 수 있습니다.

3. 차동 원심분리

1. 균질액을 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 옮기고, 1,000 × g 온도에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
2. 상원액을 신선한 1.5mL 마이크로 원심분리관에 옮기고 , 12,000 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리기를 통해 조미건조 미토콘드리아 펠릿을 얻습니다.
   참고: 1mL 주사기로 상정액을 조심스럽게 채취하며, 펠릿과 잔류 조직 이물질의 교란을 피하십시오.

4. 미토콘드리아 정제 및 저장

1. 조잡한 미토콘드리아 펠릿을 자당(250 mM), HEPES(10 mM, pH 7.4), EGTA(1 mM), 소 혈청 알부민(0.15% w/v)이 포함된 사전 냉각 세척 버퍼에 부드럽게 재현탁합니다. 서스펜션을 1,000 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
2. 상청액을 신선한 원심분리관으로 옮기고, 12,000 × g 에서 4°C에서 10분간 원심분리기를 통해 정제된 미토콘드리아 펠릿을 얻습니다.
   참고: 가능한 한 즉시 신선한 미토콘드리아를 사용하세요. 자당(0.25 M), Tris-MOPS(10 mM, pH 7.4), EGTA(0.1 mM)를 포함한 미토콘드리아 저장 완충 내에서는 4 °C에서의 단기 저장 또는 −80 °C의 장기 저장이 가능합니다. 하지만 냉동은 미토콘드리아 효소 활동과 호흡 기능을 저해할 수 있습니다. 냉동 샘플은 주로 단백질 분석에 사용하세요.

5. 미토콘드리아 및 세포질 단백질 추출 및 BCA 정량

1. 미토콘드리아 단백질 추출
   1. 정제된 미토콘드리아 펠릿을 시작 조직 100mg당 50 μL RIPA 용해 완충제에 재현탁하고, 현탁액을 얼음 위에 15분간 배양합니다.
   2. 용해액을 약 14,000 × g 에서 4 °C에서 15분간 원심분리합니다. 상청액을 신선한 1.5mL 미세원심분리관으로 옮겨 미토콘드리아 단백질 분획을 얻습니다.
2. 세포질 단백질 추출
   1. 4.2단계에서 12,000 × g에서 4°C에서 15분간 얻은 세포질 상청액을 원심분리합니다. 상청액은 버리고 농축된 세포질 분획으로 펠릿을 유지합니다.
   2. 세포질 펠릿을 50 μL RIPA 용해 버퍼에 재현탁한 후 5.1.1-5.1.2 단계에 설명된 대로 샘플을 처리합니다.
      참고: 용해 완충제는 프로테아제 억제제로 신선히 준비하고, 단백질 분해를 최소화하기 위해 모든 절차를 얼음 위에서 수행하세요. 이 단계에서 사용되는 미토콘드리아는 신선하거나 냉동된 것일 수 있습니다.
3. BCA 단백질 정량
   1. 시약 A와 시약 B를 50:1(v/v) 비율로 혼합하여 BCA 작업 용액을 준비합니다. 96웰 플레이트의 각 웰에 200 μL의 작업 용액을 추가합니다.
      참고: 사용 직전에 BCA 작동 용액을 준비하여 상온에서 1시간 이내에 사용하세요.
   2. 소 혈청 알부민(BSA) 정액(2 mg/mL)을 0.5 mg/mL로 희석한 후 사용 전까지 얼음에 보관하세요.
   3. 표준 곡선을 준비하려면 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4 또는 0 μL의 BSA 용액을 별도의 우물에 첨가합니다. 최종 부피를 NaCl 용액을 사용해 20 μL로 조절합니다.
   4. 한 세트의 웰에 미토콘드리아 단백질 4 μL과 NaCl 용액 16 μL을 추가합니다. 또 다른 웰 세트에 세포질 단백질 4 μL과 NaCl 용액 16 μL을 추가합니다.
   5. 각 웰에 200 μL BCA 작업 용액을 추가하고, 37°C에서 어두운 환경에서 30분간 배양합니다. 마이크로플레이트 리더기를 사용해 562nm에서 흡광도를 측정합니다.
   6. 상관계수 (R²)가 0.999≥ 단백질 표준 곡선을 구성합니다. 표준 곡선에서 흡수 값을 보간하여 단백질 농도(μg/μL)를 계산합니다.

6. 골격근 유래 미토콘드리아의 순도 평가

1. 미토콘드리아 및 세포질 단백질 샘플을 최종 농도인 1.5 μg/μL로 희석합니다. 단백질 30 μg와 × 로딩 버퍼 4개를 포함한 20 μL 반응 혼합물을 준비합니다. 남은 양은 NaCl 용액으로 조절하세요. 샘플을 10분간 끓인 후 −80 °C에서 보관하다가 사용하세요.
2. 단백질 샘플은 4%-20% 그라디언트 프리캐스트 젤을 사용해 분리합니다. 140-150V에서 50분간 전기영동을 수행하세요.
3. PVDF 막(0.22 μm)을 메탄올에 1분간 활성화합니다. 400 mA의 빠른 전달 버퍼를 사용하여 30분간 단백질을 전달합니다.
4. 전이 샌드위치에서 PVDF 멤브레인을 제거하고 TBST에 5분간 세척하세요. 멤브레인을 5% 탈지유로 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들며 막을 막으세요.
5. 1차 항체(COX IV, 사이토크롬 c, β-액틴)를 1:1,000 비율로 희석하여 항체 희석 완충액에 넣습니다. 막을 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양하세요.
6. 멤브레인을 TBST로 세 번, 한 번 10분씩 세척하세요.
7. 2차 항체를 1:10,000 희석한 상태로 실온에서 1시간 배양하세요.
8. 멤브레인을 TBST로 세 번씩 각각 10분씩 세척하세요. 블롯을 현상하고 이미지를 캡처하세요.

7. 골격근 유래 미토콘드리아의 미토트래커 염색

1. 사용 직전에 염색 작업 용액을 미리 가열된 매체에서 최종 농도인 200 nM로 희석하세요.
2. 미토콘드리아 펠릿을 작업 용액 100 μL에 다시 현탁한 후 37 °C에서 어두운 곳에서 20분간 배양합니다.
3. 배양 후 5용량의 미리 냉각된 저장 버퍼를 추가하세요. 현탁액을 12,000 × g에서 4 °C에서 10분간 원심분리하고, 결합되지 않은 염료가 포함된 상청액을 버립니다.
4. 염색된 미토콘드리아 현탁액의 알리코트를 유리 슬라이드에 옮기고 샘플을 커버슬립으로 덮습니다.
5. 적색 형광 미토콘드리아 염료 검출을 위해 적절한 여기 및 방출 설정을 갖춘 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하여 형광 이미지를 포착합니다.

8. JC-1 염색을 이용한 미토콘드리아 막 전위 평가

1. CCCP(카보닐 시안화물 m-클로로페닐 하이드라존) 처리 그룹
   1. 미토콘드리아 현탁액을 CCCP로 최종 농도 10 μM로 처리하고 20분간 인큐브하여 미토콘드리아 막 전위를 소산시킵니다.
   2. CCCP 처리된 미토콘드리아 현탁액을 37°C에서 250μL JC-1 염색액과 함께 20분간 부드럽게 교반하여 인큐베이팅합니다.
2. JC-1 처리 그룹
   1. 미토콘드리아 펠릿을 100 μL JC-1 작업 용액에 재현탁한 후 37°C에서 빛을 차단한 상태로 20분간 배양합니다.
   2. 5× 정액을 증류수와 2:8(v/v) 비율로 희석하여 1× JC-1 착색 버퍼를 준비하고, 얼음 위에 유지하세요.
   3. 염색 용액을 제거하고 미토콘드리아 펠릿을 미리 냉각된 1× JC-1 염색 버퍼로 두 번 세척합니다.
   4. 염색된 미토콘드리아를 PBS에 재현탁하고 레이저 스캐킹 공초점현미경으로 영상을 찍습니다. 녹색 형광 JC-1 단량체와 적색 형광 JC-1 집합체를 검출하기 위해 적절한 여기 및 방출 설정을 사용하세요.

9. 투과 전자현미경을 이용한 분리된 골격근 미토콘드리아의 초구조적 분석

1. 갓 분리된 미토콘드리아를 0.2M 인산염 완충제(pH 7.4)에 2.5% 글루타알데히드에 고정하고, 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
2. 샘플을 0.1M 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 세척한 후, 1% 오스뮴 테트록사이드에 실온에서 1시간 동안 고정합니다.
3. 샘플을 등급 에탄올 시리즈로 탈수한 후 에폭시 수지에 침투, 임베딩, 중합합니다.
4. 울트라미세톰을 사용해 50-70 nm 두께로 삽입된 샘플을 절개합니다.
5. 구간은 우라닐 아세테이트와 시트레이트 납으로 이중 염색하세요. 투과 전자현미경을 사용해 샘플을 관찰하고 영상으로 촬영하세요.

10. 골격근 유래 미토콘드리아의 세포 흡수

1. 문화 NCTC 클론 929 (L929; RRID: CVCL_0462상업 공급자로부터 얻은 세포, MEM 알파 함유 배지에 태아 소 혈청 10%와 페니실린-스트렙토마이신 1%를 보충한 상태입니다.
2. 세포가 80%-90% 합류에 도달하면 배지를 흡입하고 미리 가열한 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 트립신-EDTA를 추가하고 세포가 분리될 때까지 배양합니다.
3. 완전한 배지를 첨가하여 소화를 종료하고 부드러운 피펫팅으로 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 현탁액을 1,000 × g에서 5분간 원심분리한 후 상상액을 버립니다.
4. 세포 펠릿을 신선한 완전 배지에 재현탁한 후 적절한 밀도로 새로운 배양 접시에 씨앗을 심습니다. 세포를 5% CO₂가 포함된 가습 환경에서 37°C에서 배양합니다.
5. 씨앗 통과 5(P5) 세포를 35mm 유리 바닥 접시에 넣고 밤새 배양합니다.
6. 분리된 미토콘드리아를 37°C의 어두운 환경에서 미토콘드리아 특이적 적색 형광 염료로 표지하고, PBS로 미토콘드리아를 세척하여 결합하지 않은 염료를 제거합니다.
7. 적색 형광 염료 표지된 미토콘드리아(각 배시당 20 μg 미토콘드리아 단백질)를 세포에 첨가하고, 5% CO₂를 함유한 가습 환경에서 37°C에서 24시간 배양합니다.
8. 형광 액틴 프로브로 세포를 30분간 염색하여 액틴 세포골격을 시각화하고, 형광 핵염료로 핵을 반염색합니다.
   참고: 동복 기간 동안 혈청 농도를 신중히 조절해야 하며, 과도한 혈청은 미토콘드리아 흡수 효율을 저하시킬 수 있습니다. 이 단계에서 사용되는 미토콘드리아는 신선합니다.

11. 고해상도 호흡계를 이용한 미토콘드리아 호흡 기능 측정

1. 기기 준비
   1. 호흡실, 전극 구획, 마개를 청소하세요.
   2. 각 챔버에 자기 교반봉을 넣고 산소 전극막의 무결성을 확인하세요.
2. 계측기 교정
   1. 각 호흡실에 미토콘드리아 호흡 완충제(MiR05, pH 7.10)를 2.1mL 넣고 기포가 없도록 하세요.
   2. 산소 기준선이 안정화된 후 37°C에서 30분간 고해상도 호흡계를 평형으로 유지하고, 매일 공기 보정을 수행합니다.
      참고: 산소 전극 신호를 방해하고 데이터 품질을 저하시킬 수 있으므로 공기 방울을 호흡실에 주입하는 것을 피해야 합니다. 이 단계에서 사용되는 미토콘드리아는 신선합니다.
3. 시료 부하와 평형
   1. 약 30 μg의 단백질을 포함한 갓 분리된 미토콘드리아를 호흡실에 넣고 챔버를 밀봉합니다.
   2. 챔버를 5-8분간 평형으로 유지하고 기초 산소 소비량을 기록하세요.
      참고: 미토콘드리아를 얼음 위에 보관하고 격리 직후 호흡 측정을 수행하여 활성을 유지하세요.
4. SUIT 프로토콜
   1. 피루브산 5 μL (2 M), 글루타메이트 10 μL (2 M), 말레이트 10 μL (400 mM)를 순차적으로 첨가합니다. 반응을 5분간 안정시키고 CI 누출 호흡을 기록하세요.
   2. 10 μL ADP(500 mM)를 첨가하여 산화적 인산화를 유도하고 CI OXPHOS 호흡을 기록합니다. 10 μL 염화마그네슘(0.3 M)을 추가합니다.
   3. 20 μL 석시네이트(1 M)를 추가하고 안정화 후 CI+CII OXPHOS 호흡을 기록합니다.
   4. 2 μL ATP 합성효소 억제제(0.01 mM)를 추가하고 양성자 누출 호흡을 기록합니다.
   5. CCCP(1 mM)를 2분 간격으로 3회 2 μL 단위로 점진적으로 추가하여 산소 소비량이 정체에 도달할 때까지 추가합니다. 최대 전자 전달 시스템 용량을 기록하세요.
   6. 복합체 I 활성을 억제하기 위해 1 μL 로테논(1 mM)을 추가합니다.
   7. 복합체 III 활성을 억제하고 잔류 산소 소비량을 기록하기 위해 1 μL 항마이신 A(5 mM)를 추가합니다.
   8. 5 μL 아스코르베이트(800 mM)와 5 μL N,N,N',N'-테트라메틸-p-페닐렌디아민(200 mM)을 추가합니다. 안정화 후 최대 복합 IV 호흡 활동을 기록합니다.
      참고: 냉동 전에 모든 시약을 분리해 반복적인 냉동-해동 과정을 피하세요. 과도한 분리는 미토콘드리아 호흡을 억제하므로 CCCP를 점진적으로 추가하세요.
5. 데이터 분석
   1. 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 CI 누출, CI OXPHOS, CI+CII OXPHOS, CI+CII 누출, CI+CII ET, CII ET, CIV 등 미토콘드리아 호흡 매개변수를 얻습니다.
   2. 호흡 조절 비율(RCR; 상태 3 호흡/상태 4 호흡) 및 ATP 생산 능력. 통계 분석을 위해 모든 값은 세 개의 유의한 숫자까지 유지하세요. 데이터 분석에 사용된 소프트웨어는 Oroboros Datlab 8(Oroboros Instruments)이었습니다.

Results

미토콘드리아 분리 및 정제 작업 흐름의 개략 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 모든 시술은 미토콘드리아의 완전성과 기능 기능을 유지하기 위해 4 °C에서 시행되었습니다. 신선하게 분리된 골격근 조직은 트립신과 함께 잘게 썰어 조직 해리를 촉진한 후, 유리 호모제이저를 이용해 등장성 격리 완충제에서 균질화했습니다. 이후 미토콘드리아를 조직 잔해 및 세포질 오염물질에서 분리하기 위해 차별 원심분리가 시행되었습니다. 초기 원심분리는 1,000 × g에서 핵과 큰 잔해를 제거했으며, 이후 12,000 × g에서의 원심분리는 조잡한 미토콘드리아 펠릿을 얻었다. 추가적인 세척 및 원심분리 단계를 통해 세포질 오염이 더욱 줄어들어 정제된 미토콘드리아가 생성되었으며, 이는 하위 구조 및 기능 분석에 적합한 것입니다(그림 1).

그림 1: 미토콘드리아 분리 및 정제의 개략도. 고순도의 미토콘드리아는 통제된 트립신 소화와 차동 원심분리의 결합 접근법을 통해 분리되었습니다. 모든 시술은 미토콘드리아의 구조적·기능적 완전성을 유지하기 위해 4 °C에서 시행되었습니다. 갓 분리된 골격근 조직은 효소 소화, 균질화, 순차적 원심분리 과정을 거쳐 기능 및 구조 분석에 적합한 정제된 미토콘드리아를 얻었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

분리된 미토콘드리아의 기능적 활성은 JC-1 염색과 형광 미토콘드리아 표지(그림 2)를 사용하여 평가하였습니다. JC-1 염색은 기저 조건에서 갓 분리된 미토콘드리아에서 강한 적색 형광을 나타내어 미토콘드리아 막 전위가 보존되었음을 나타냈다. 카보닐 시안화물 m-클로로페닐 하이드라존(CCCP) 처리 후 적색 형광은 감소하고 녹색 형광은 증가하여 미토콘드리아 막 탈분극과 일치하였다. 이 발견들은 분리된 미토콘드리아가 세포막 잠재 반응성을 유지하며 분리 후에도 기능적으로 활성을 유지함을 확인시켜 주었습니다. 형광 표지 분석 결과, 미토콘드리아는 명확한 응집이나 염료 침전 없이 필드 전역에 걸쳐 균일하게 분포된 점형 구조로 나타난다는 점이 나타났습니다. 낮은 배경 형광과 균일한 염색 패턴은 분리 후 미토콘드리아의 완전성과 막 전위가 보존되었음을 시사합니다.

그림 2: 분리된 미토콘드리아의 기능적 활성의 특성 분석. (A) JC-1 염색을 통한 미토콘드리아 막 잠재력 평가. 정제된 미토콘드리아는 JC-1로 염색되어 형광 현미경으로 관찰되었습니다. 대조군 미토콘드리아 그룹에서는 뚜렷한 붉은 형광 집합체가 관찰되어 미토콘드리아 막 전위가 보존됨을 나타냈습니다. 분리 CCCP로 처리한 후 형광은 주로 녹색 JC-1 단량체 쪽으로 이동했으며, 이는 막 탈분극과 막 전위 붕괴를 나타냈습니다(스케일 바 = 50 μm). (B) 정제된 미토콘드리아의 미토콘드리아 형광 표지. 형광 표지된 미토콘드리아는 명확한 집합 없이 흩어진 점형 구조로 나타나며, 배경 형광도 최소화되어 미토콘드리아 완전성과 안정적인 막 전위(스케일 바 = 100 μm)를 나타냅니다. (C) JC-1 염색 후 다양한 그룹의 JC-1 형광 강도 비율에 대한 정량적 분석. 데이터는 SEM ± 평균 (n = 3)로 제시됩니다. 통계적 유의성은 비쌍 t-검정(****P < 0.0001)을 사용해 분석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

분리된 미토콘드리아의 초구조적 완전성은 투과 전자현미경을 사용해 조사되었습니다(그림 3). 저배율 영상에서는 주로 타원형 형태를 가진 정제된 미토콘드리아가 확인되었고, 고배율 영상에서는 온전한 외막과 명확하게 정의된 크리스테 구조가 확인되었습니다. 명확한 부기, 파열, 구조적 손상은 관찰되지 않았습니다. 정량적 평가를 위해 약 40-60개의 미토콘드리아를 포함하는 무작위로 선정된 5개 필드가 분석되었습니다. 이 관찰들은 분리 절차가 미토콘드리아 초구조를 효과적으로 보존하고 하위 기능 연구에 적합한 미토콘드리아를 생성함을 입증했습니다.

그림 3: 투과 전자현미경으로 평가한 고립된 골격근 미토콘드리아의 초구조적 완전성. (왼쪽) 저배율(4,000×; 스케일 바 = 2 μm)에서의 대표적인 TEM 이미지로, 주로 타원형 형태를 가진 정제된 미토콘드리아를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

(오른쪽) 고배율 TEM 이미지(40,000×; 스케일 바 = 200 nm)는 매끄럽고 연속적인 외부 미토콘드리아 막과 명확하게 정의된 크리스테 구조를 보여줍니다. 노란색 화살표는 온전한 외부 미토콘드리아 막을 나타내며, 흰색 화살표는 잘 조직된 미토콘드리아 크리스타를 나타냅니다. 부기, 파열, 구조적 파열의 증거는 관찰되지 않았습니다. 각 필드마다 약 40-60개의 미토콘드리아를 포함하는 5개의 무작위 선정 필드가 분석되었습니다. 이 발견들은 분리 프로토콜이 미토콘드리아 초구조적 완전성을 보존하고 후속 기능 분석에 신뢰할 수 있는 구조적 기반을 제공했음을 보여준다.

이후 미토콘드리아 수율과 순도는 단백질 정량화와 면역블롯 분석을 통해 평가되었습니다(그림 4). 트립신 소화법(TD)과 일반 추출법(NE) 방법을 비교한 결과, TD 방법은 조직당 약 2.3-2.4 μg의 미토콘드리아 단백질을 얻는 반면, NE 방법은 약 1.7-1.8 μg/mg 조직을 생산하였습니다. 면역블롯 분석 결과, 미토콘드리아 분획에서 미토콘드리아 표지자인 시토크롬 c 산화효소와 COX IV가 강한 농축을 보였으나, 세포질 분획에서는 최소한의 검출이 이루어졌습니다. 반면, 세포질 마커 β-액틴은 미토콘드리아 분획에서 약한 신호만 보였으며, 이는 제한된 세포질 오염을 나타냈다. TD군과 NE 그룹 간의 비교 결과, 트립신 소화가 미토콘드리아 수율과 순도를 개선하는 것으로 나타났습니다. 이 결과들은 프로토콜이 분자 및 기능 분석에 적합한 미토콘드리아를 생성함을 입증했습니다.

그림 4: 정제 미토콘드리아의 수율과 순도 비교. (A) 트립신 소화(TD) 및 정상 추출(NE) 방법을 사용하여 얻은 단위 조직 질량당 미토콘드리아 단백질 수율 비교. TD 그룹은 약 2.3-2.4 μg/mg 조직을 얻었고, NE 그룹은 약 1.7-1.8 μg/mg 조직을 얻었습니다. 데이터는 SEM ± 평균 (n = 3)로 제시됩니다. 통계적 유의성은 비쌍 t-검정(*P < 0.05)을 사용하여 분석하였습니다. (B) TD 및 NE 방법을 사용하여 분리한 미토콘드리아 분획 내 미토콘드리아 및 세포질 마커 단백질의 면역블롯 분석. (C-D) 미토콘드리아 마커 단백질, 사이토크롬 c 산화효소, COX IV의 정량적 분석. 미토콘드리아 마커는 미토콘드리아 분획에서 강하게 풍부했으나 세포질 분획에서는 거의 발현되지 않았습니다. 세포질 마커 β-액틴은 미토콘드리아 분획에서 약한 발현만을 보였으며, 이는 세포질 오염물질의 효율적인 제거를 나타냈다. NE 그룹과 비교했을 때, TD 그룹은 미토콘드리아 순도가 개선되었습니다. 데이터는 SEM ± 평균 (n = 3)로 제시됩니다. 통계적 유의성은 쌍이 없는 t-검정(*P < 0.05; **P < 0.01)을 사용해 분석하였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

미토콘드리아 호흡 기능을 추가로 평가하기 위해 고해상도 호흡계(그림 5)를 사용해 산소 소비량을 측정하였습니다. TD 방법으로 분리한 미토콘드리아는 호흡 조절 비율(RCR) 값이 약 9-10이었고, NE 방법으로 분리된 미토콘드리아는 약 8-9의 RCR 값을 보였습니다. RCR 값이 4 이상이면 일반적으로 미토콘드리아의 호흡 활동이 보존된 것으로 간주되므로, 이 결과는 두 방법 모두로 분리된 미토콘드리아가 기능적 완전성을 유지함을 보여주었습니다. TD 그룹에서 관찰된 높은 RCR 값은 NE 그룹보다 미토콘드리아 호흡 기능이 더 잘 보존되었음을 시사하였다. 생화학적 결합 효율도 방정식 1−(누출 호흡율/전자 전달 호흡률)를 사용하여 평가했으며, 값이 1에 가까워질수록 호흡 결합이 더 밀려 있고 ATP 생성이 더 효율적임을 나타냈습니다. 두 그룹 모두 결합 효율이 1에 근접하여 분리 후에도 미토콘드리아 생체에너지 기능이 보존되었음을 나타냈다.

그림 5: 정제 미토콘드리아에서 호흡 기능 분석. (A) 트립신 소화(TD)군과 정상 추출(NE) 그룹 간 미토콘드리아 호흡 조절 비율(RCR) 비교. 두 그룹 모두에서 RCR 값이 4 이상이었으며, 이는 격리 후 미토콘드리아 호흡 활동이 보존되었음을 나타냈다. TD 그룹은 NE 그룹보다 약간 더 높은 RCR 값을 보였으며, 이는 호흡 기능이 더 잘 보존되었음을 시사합니다. 데이터는 SEM ± 평균 (n = 3)로 제시됩니다. 통계적 유의성은 비짝 t-검정(**P < 0.01)을 사용하여 분석하였다. (B) TD와 NE 그룹 간 미토콘드리아 생화학적 결합 효율과 ATP 합성 능력 비교. 두 그룹 모두에서 결합 효율 수치는 1에 근접하여 고도로 결합된 호흡과 효율적인 ATP 생성을 나타냈다. 데이터는 SEM ± 평균 (n = 3)로 제시됩니다. 통계적 유의성은 비쌍 t-검정(*P < 0.05)을 사용하여 분석하였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

수용 세포가 분리된 미토콘드리아를 흡수하는 현상은 L929 세포를 사용하여 평가되었습니다(그림 6). 세포는 적색 형광 염료 표지된 골격근 유래 미토콘드리아와 공동 배양되었고, 형광 액틴 프로브를 사용해 액틴 세포골격을 시각화하였다. 공초점 현미경 검사에서는 세포질 전체에 분포한 점상 붉은 형광 구조가 발견되어 L929 세포가 외인성 미토콘드리아를 흡수했음을 나타냈다. 정량적 분석 결과, 12, 24, 48시간마다 미토콘드리아 흡수가 시간에 따라 증가하는 것으로 나타났습니다. 그러나 24시간에서 48시간 사이에는 소폭의 증가만이 관찰되었고, 이는 24시간 이후 흡수 효율이 포화 상태에 가까워졌음을 시사합니다. 또한, 수용자 L929 세포는 미토콘드리아 흡수 후 미토콘드리아 막 전위가 증가하여 미토콘드리아 기능이 개선되었음을 나타냈다. 이 발견들은 이 프로토콜을 통해 분리된 골격근 유래 미토콘드리아가 수용 세포에 의해 기능적 활동을 유지하면서 효과적으로 내화될 수 있음을 입증했습니다.

그림 6: L929 세포가 골격근에서 유래한 미토콘드리아를 세포 흡수하는 모습. (A) 정제된 미토콘드리아가 L929 세포에 의해 서로 다른 잠복 시간(12시간, 24시간, 48시간)에서 흡수됨. 미토콘드리아-형광 염료 표지된 미토콘드리아(빨간색)가 수용 세포의 세포질 내에서 검출되었고, 팔로이딘 염색(녹색)을 사용해 액틴 세포골격을 시각화하였다. 핵 염색은 DAPI(파란색)를 사용하여 수행되었습니다. 공초점 현미경 검사는 L929 세포에 의한 외인성 미토콘드리아의 내화를 확인했습니다(스케일 바 = 50 μm). (B) L929 세포에 의한 다양한 시점에서의 미토콘드리아 흡수 효율에 대한 정량적 분석. (C) 골격근 유래 미토콘드리아 흡수 후 L929 세포에서 미토콘드리아 막 전위를 JC-1 염색 분석. (D) 미토콘드리아 흡수 후 수혜자 L929 세포에서 JC-1 집합체 대 단량체 형광 비율의 정량적 분석. 활성 골격근 유래 미토콘드리아가 내화된 후 미토콘드리아 막 전위가 유의하게 증가했습니다. 데이터는 SEM ± 평균 (n = 3)로 제시됩니다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA를 사용해 분석되었습니다(*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

Discussion

미토콘드리아 이식은 세포 치료와 재생의학에서 신흥 전략으로, 기능적으로 온전한 미토콘드리아를 전달하여 에너지 대사가 저하된 세포의 생리적 기능을 회복합니다. 세포 에너지 대사를 조절하는 것 외에도, 이 기술은 세포자멸사(apoptosis)와 산화 스트레스(oxiative stress)와 같은 주요 생물학적 과정을 조절하여 다양한 질병에 대한 새로운 치료 기회를 제공합니다. 그러나 미토콘드리아 이식의 임상 번역은 여전히 여러 도전에 직면해 있는데, 그중 하나는 표준화되고 효율적이며 재현 가능한 미토콘드리아 분리 프로토콜의 부재로, 이는 여전히 주요 병목 현상입니다.

이 문제를 해결하기 위해, 본 연구는 차등 원심분리를 기반으로 한 표준화 및 시각화된 실험 프로토콜을 마련하여 C57BL/6 마우스 골격근에서 기능적 자유 미토콘드리아를 효율적으로 분리하는 데 성공했습니다. 정제 절차를 최적화하고 트립신의 소화, 세척, 정제 단계를 통합함으로써 이 방법은 조직 해리를 효과적으로 개선하고, 미토콘드리아 구조적 완전성을 유지하며, 비표적 세포 구성 요소에 의한 오염을 줄입니다.

제안된 프로토콜은 미토콘드리아 순도와 수율 사이에서 적절한 균형을 이룹니다. 기존의 분쇄 기반 추출 방법과 비교할 때, 본 방법은 더 빠르고 실용적이며 비용 효율적이어서 일상적인 실험실 응용과 기증자 미토콘드리아 준비에 적합합니다. 기존의 미토콘드리아 분리 방법들은 각각 특정 한계를 가지고 있습니다. 예를 들어, 밀도-구배 원심분리와 면역친화 정제는 더 높은 순도를 달성할 수 있지만 시간과 비용이 많이 드는 반면, 나노스케일 프로브 기반 접근법은 일상적인 사용에 아직 충분히 개발되지 않았습니다^20,21. 골격근과 같은 밀집 조직의 경우, 최적화된 트립신 사전 단계(37°C에서 0.25% 트립신 10-15분)와 부드러운 균질화가 결합되어 기존의 차동 원심분리보다 미토콘드리아 무결성을 더 잘 보존합니다.

본 연구에서는 상업적으로 구할 수 있는 차동 원심분리 키트를 낮은 온도 조건에서 표준 워크플로우에 따라 시술 내내 사용하여, 구조적으로 온전한 미토콘드리아를 신속하게 획득할 수 있게 했습니다. 추출 과정에서 발생할 수 있는 문제들, 예를 들어 낮은 수율, 단백질 오염, 비정상적인 막 잠재적 가능성을 해결하기 위해 여러 가지 문제 해결 전략이 제안됩니다.

낮은 미토콘드리아 수율은 흔히 균질화 부족, 조직 양 부족, 원심 손실 때문이다. 이러한 문제들은 적절한 소화 전을 확보하고, 부드러운 균질화(밀착 균질제를 사용해 10-15회 통과), 최소 100-150mg의 신선한 골격근 조직 사용, 원심분리 조건(잔해 제거용 1,000 × g, 미토콘드리아 펠릿을 위한 10,000-12,000 × g)을 엄격히 조절함으로써 최소화할 수 있습니다. 또한 광경 피펫 팁을 사용해 샘플을 재현탁합니다. 단백질 오염은 주로 불완전한 이물질 제거나 지질 간섭에서 발생합니다; 따라서 1,000 × 원심분리 단계를 반복하고, 두 번의 12,000 × g 세척 단계를 추가하며, 지방 조직을 신중하게 제거하는 것이 권장됩니다. 비정상적인 미토콘드리아 막 전위는 기계적 손상이나 온도 변화와 종종 관련이 있습니다. 따라서 과도한 균질화는 피해야 하며, 전체 절차는 얼음 위에서 60-90분 이내에 완료해야 하며, 격리 완충제에는 EGTA와 0.5% BSA를 보충해야 합니다. 불완전 균질화는 적절한 효소 소화를 보장하고, 적절한 균질제를 선택하며, 균질화 후 여과를 수행함으로써 개선할 수 있습니다.

현재 프로토콜은 미토콘드리아 분리의 효율성과 순도를 크게 향상시키지만, 여전히 몇 가지 한계가 남아 있습니다. 첫째, 이 절차는 조직의 신선도에 크게 의존합니다; 이상적으로는 조직 샘플을 사후 1시간 이내에 처리해야 합니다. 둘째, 잔류 트립신은 세척 시 적절히 제거되지 않으면 트랜스로케이스 관련 단백질을 포함한 미토콘드리아 표면 단백질을 분해하여 이후 세포 흡수 효율에 영향을 줄 수 있습니다. 셋째, 미토콘드리아 저장 시간은 제한적입니다. 4 °C에서의 장기간 보관이나 냉동 보존은 미토콘드리아 활성을 크게 감소시킵니다.

번역 수준에서는 생 체 내 전달 효율성 향상, 미토콘드리아 통합 장기전 이해, 이식 미토콘드리아와 숙주 게놈 간 잠재적 상호작용 명확화 등 추가적인 과제가 남아 있습니다. 미토콘드리아 분리 및 정제 기술의 지속적인 발전에 따라, 미토콘드리아 이식 치료의 임상 번역을 가속화할 수 있는 추가 방법론적 혁신이 기대됩니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Cytochrome C antibody	Abcam	EPR1327	미토콘드리아 특성화
Anti-fade mounting medium	PlantChemMed	PC-90016	형광 염료의 광 퇴색 감소
BCA Protein Assay Kit	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PQ003	단백질 농도 분석
Beta-actin antibody	Cell Signaling technology	3700s	분리된 미토콘드리아의 순도 검출에 사용된 Beta-actin antibody
BSA	Sigma	A6003	분리 과정에서 미토콘드리아 활성을 보호하기 위해 자유 지방산을 결합합니다.
Centrifuge	Eppendorf	5418R	4 °C 원심분리
CCCP	Solarbio	C6700	미토콘드리아 산화 인산화의 얽힘을 해제하고 최대 양성자 누출을 유도
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	FV4000	면역형광 염색 관찰
COX IV polyclonal antibody	Proteintech	11242-1-AP	미토콘드리아 특성화
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	핵 반염색
D-mannitol	Solarbio	IM00402	분리 중 삼투압 균형 유지 및 미토콘드리아 부종 방지
EGTA	Sigma	E4378	미토콘드리아 분리 완충액에서 일반적으로 사용되며 특히 Ca2+를 결합하여 미토콘드리아 기능을 보호
Fetal bovine serum	Every Green	11011-08611	L929 세포 배양
Forceps	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	조직을 잡고, 보유하고, 들어 올리는 데 사용
Glass homogenizer	Beyotime	FGH005	조직 균질화 및 미토콘드리아 분리에 사용
Glutaraldehyde	LEAGENE	DF0151	단백질을 가교하여 세포 초미세 구조를 빠르게 고정하고 안정화하여 자가분해를 방지하고 소기관의 자연 형태를 보존
HEPES	Thermo Fisher	J67485	안정된 pH 환경 제공
Incubator	Thermo Fisher	51032874	L929 세포 배양
JC-1	Solarbio	M8650	정제된 미토콘드리아의 막 전위 변화 검출.
L929 cell line	Procell	CL-0137	미토콘드리아 내이동 분석용
Lead citrate	Sigma	15326	미세 세포 하부 구조 관찰을 위한 초박 단면의 염색
MEM Alpha basic (1x)	Gibco	6125510	L929 세포 배양
Methanol	Fuyu Chemical (China)	67-56-1	전이 버퍼의 구성 요소로서, SDS를 제거하고 젤에서 고체 상태 멤브레인으로의 단백질 전이를 용이하게 하는 데 사용
Microplate Reader	Thermo Fisher	Varioskan LUX	JC-1 염색된 미토콘드리아의 흡광도 측정
Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit	Solarbio	M8650	골격근의 미토콘드리아 막 전위 검출
Mitochondrial isolation Buffer	Solarbio	SM0020	차등 원심분리 기반 추출용 키트
Mitochondria Storage Buffer	Solarbio	SM0020	미토콘드리아 보존용
Mito Tracker  Red CMXRos	Yeasen Biotechnology	40741ES50	미토콘드리아 특성화
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	용액 준비 시 완충액으로 사용
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAM001	RGAM001은 웨스턴 블롯에서 마우스 IgG (H+L)를 표적으로 함
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAR001	RGAR001은 ELISA 및 웨스턴 블롯에서 토끼 IgG (H+L)를 표적으로 함
Non-fat dry milk	NCM Biotech	WB6503	주로 막의 비특이적 결합 부위를 차지하여 배경 신호를 감소시키는 차단제로 사용
O2k-FluoRespirometer	Oroboros Instruments	O2K	미토콘드리아 호흡 기능 및 산소 대사 결정
Osmium tetroxide	Sigma	75633	지질을 보존하고 TEM 샘플에서 멤브레인 대비를 향상시키는 후 고정
PBS (1x)	Plant Chem Medicine	PC-00003	근육 조직 세정
Penicillin-Streptomycin	Procell	PB180120	L929 세포 배양
Phalloidin-488	Beyotime	C1035	형광 현미경 이미징을 위한 세포골격 F-actin