Caenorhabditis elegans의 배아 치명률 정량화

요약

이 프로토콜은 Caenorhabditis elegans의 배아 치명률을 정량화하는 간단하고 저비용의 절차를 제공합니다. 전문 장비나 벌레 제거 전문성 없이도 집단 전체에서 배아 이상을 쉽게 감지할 수 있게 해줍니다. 이 프로토콜은 유전적 돌연변이, RNA 간섭 매개 유전자 노크다운, 식이의 효과를 정량화하는 데 사용될 수 있습니다.

초록

배아 치명성은 Caenorhabditis elegans 연구에서 독성 노출과 유전적 돌연변이와 같은 요인에서 발생하는 발달 결함을 특성화하기 위해 사용되는 핵심 표현형입니다. 따라서 배아 치명성의 침투율을 정확히 정량화하는 것은 이러한 교란이 동물 발달에 미치는 메커니즘과 영향을 이해하는 데 매우 중요합니다. 자동화된 채점 플랫폼이 존재하지만, 이러한 접근법은 상당한 재정 투자와 전문 하드웨어 또는 소프트웨어가 필요한 경우가 많습니다. 이 글은 배아가 부화하지 못하는 비율을 측정하여 배아 치명성을 정량화하는 저기술, 저비용 검사법에 대해 설명합니다. 특히, 이 버전의 분석법은 웜 픽이 필요 없어서 초보자에게 매우 적합합니다. 이 접근법의 또 다른 장점은 각 기술적 분석이 여러 동물로부터 자손을 복제하여 단일 웜 분석의 잠재적 편향을 피한다는 점입니다. 이 프로토콜에는 표현형 투견도를 정확히 포착하기 위해 필요한 최소 자손 수와 방법론의 근거와 같은 중요한 매개변수에 대한 논의가 포함되어 있습니다. 마지막으로, RNA 간섭, 약물 치료, 영양 보충을 통한 유전자 녹다운 효과를 평가하기 위한 분석법 적응에 대한 지침을 제공하여 C. elegans 연구진의 도구 상자에 다재다능하고 접근하기 쉬운 도구를 추가합니다.

서론

배아 치사율은 초기 발달에서 유전자와 환경 요인의 역할을 평가하는 데 중요한 표현형입니다. C. elegans는 불변 세포 계통, 투명한 몸체, 빠른^{생활사 1} 덕분에 발달 과정을 연구하는 강력한 모델입니다. C. elegans의 배아 치명성은 화학적, 약리학적, 영양적, 유전적 교란 ^2,3,4,5 하에서 발달 완전성을 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 따라서 배아 치명률을 정확히 정량화할 수 있는 접근성 높고 다재다능한 방법은 연구 커뮤니티에 이익이 될 것입니다.

배아 발생을 연구하는 고급 고처리량 및 고함량 방법은 특수 영상 시스템과 소프트웨어에 의존하며, 종종 상당한 재정 투자가 필요하다 ^4,6,7 반면, 단순한 고처리량 접근법은 주로 정성적 측정을 제공합니다 ^8,9. 반면 고전적 방법은 일반적으로 개별 양성체를 벌레 발톱으로 반복적으로 옮겨 전체 번식의 배아 치명성을 평가하는 수작업적이고 저비용의 방식을 사용합니다 ^2,10. 하지만 이 방법은 초보자에게 기술적으로 도전적일 수 있고 확장성도 제한적입니다. 또한, 고전적인 번식 크기 기반 검사는 단일 어미의 자손에서 배아 생존 가능성을 정량화하는데, 이는 의도치 않은 편향을 초래할 수 있습니다.

이 방법의 전반적인 목표는 중간 처리량에서 배아 생존 가능성을 정량화하기 위한 대안적이고 단순하며 비용 효율적이며 다재다능한 접근법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 복제당 여러 동물의 자손에서 배아 치사율을 측정하며, 벌레 발톱 사용이 필요 없고, 특수하거나 비용이 많이 드는 장비를 사용하지 않습니다. 또한 이 연구는 이 방법이 RNA 간섭, 약물 또는 영양소 검사와 같은 일반적인 교란에도 적용될 수 있음을 보여줍니다.

프로토콜

1. C. elegans 유지

참고: C. elegans 의 사육에 관한 자세한 지침은 WormBook¹¹에서 확인할 수 있습니다.

1. 유지보수용 선충 성장 배지(NGM) 플레이트를 준비하세요.
   1. NGM 1L을 만들기 위해 2L 병에 3g NaCl, 2.5g 세균학적 펩톤, 17g 한천을 섞어 넣으세요. 증류수 975mL와 교반대를 넣은 후 121°C에서 20분간 오토클레이브합니다.
   2. 매체를 물욕에서 55°C까지 식히세요. 병을 교반판에 올리고 무균 기법을 사용해 1M 인산칼륨 완충제 25mL와 다음 1mL씩 1mL를 추가하세요: 1M MgSO₄, 1M CaCl₂, 5 mg/mL 콜레스테롤. 각 100mm 플레이트에 약 25mL를 부어줍니다.
2. 밤새 대 장균 OP50 배양을 준비하세요.
   1. 무균 기법을 사용해 1L 얼렌마이어 플라스크에 1/5(200 mL)까지 LB 배지를 채웁니다. 멸균 접종 루프를 사용하여 단일 콜 로니 대장 균 OP50으로 배지를 접종합니다. 37°C에서 200rpm의 궤도 셰이커에서 하룻밤 동안 인큐베이션합니다.
3. 대 장균 OP50이 포함된 NGM 유지용 종자 플레이트(그림 1A).
   1. 대 장균 OP50 배양물을 오토클레이드 원심분리기 병에 옮겨 3,500 x g , 실온에서 30분간 원심분리합니다. 박테리아 펠릿을 원래 부피의 20분의 1에 다시 부유시키세요. 각 100mm NGM 플레이트마다 1–1.5mL의 농축 배양액을 사용해 씨앗을 넣으세요.
   2. 박테리아가 자랄 수 있도록 플레이트를 실온에서 하룻밤 배양하세요.
      참고: 이 유지 플레이트는 한 플레이트당 최대 4,000마리의 벌레를 지원할 수 있을 만큼 박테리아 밀도가 높아, 많은 검사를 수행하거나 느리게 성장하는 C. elegans 균주를 다룰 때 바람직합니다. 씨앗이 심은 유지 플레이트는 4°C에서 냉장고에 최대 1개월간 보관할 수 있습니다.
4. 주요 C. elegans 배양지를 확립하세요(그림 1A).
   1. 멸균 피펫 팁을 사용해 굶주린 유지용 플레이트에서 ~1,000마리의 벌레가 들어있는 작은 한천 조각을 잘라내세요. 한천 조각을 씨앗이 있는 NGM 플레이트 위에 올려놓습니다.
   2. 새 접시를 플라스틱 용기에 넣고 20°C에서 3일간 부화시키며, 지렁이가 임신하고 알을 낳을 때까지 보관합니다. 박테리아 잔디가 충분한지 확인하고, 지렁이 개체수가 굶주리지 않도록 하세요. 이 시점에서 벌레 개체군은 실험을 위한 준비가 되었습니다.

2. 실험용 배지 및 박테리아 배양물 준비

참고: 이 단계에서는 RNAi 매개 유전자 넉다운 효과를 테스트하기 위해 방법 1을, 건강기능식품을 조사하기 위해 방법 2를 선택하세요.

1. 방법 1: RNAi용 실험용 NGM 플레이트를 급여하여 준비합니다.
   1. 1.1단계에서 설명한 대로 NGM 1L을 준비한 후, 무균 기법을 사용해 1mL 1M IPTG와 50 mg/mL 암피실린 1mL를 추가합니다. 각 35mm 플레이트에 약 5mL를 부어줍니다.
   2. 원하는 수의 대장균 HT115 RNAi 섭식 클론을 대상으로 C. elegans 유전자를 표적으로 하는 L4440 플라스미드를 주입하며, 빈 벡터 대제도 함께 접종합니다. 접종 루프가 있는 단일 콜로니를 선택해 50 μg/mL 암피실린이 포함된 1.5 mL의 LB에 옮깁니다. 궤도 셰이커에서 37°C, 200rpm에서 18시간 인큐베이션을 진행합니다.
   3. 암피실린과 IPTG를 포함한 35mm NGM 플레이트를 100 μL 100 μL 1야간 대장 균 HT115 배양 시자로 시딩하여 각 조건별로 두 번의 기술적 복제를 준비했습니다. 플레이트를 실온에서 하룻밤 배양하여 박테리아 성장과 이중 가닥 RNA 생성을 유도합니다. 씨앗이 없는 플레이트를 4°C에 같은 수량으로 보관하여 나중에 난자 이식 시 사용하세요.
2. 방법 2: 실험용 NGM 플레이트를 영양 또는 약물 보충제와 함께 준비합니다.
   1. 1.1단계의 지침을 따라 1.5배 농축 NGM을 준비하되, 975 mL 대신 642 mL의 증류수를 추가하세요. 준비된 배지를 55°C 물에 넣어 보관하세요.
   2. 목표 농도의 3배로 관심 보충제를 수성 육즙으로 준비하세요(예: 40 mM 나트륨 포마트를 포함한 플레이트를 준비하려면 120 mM 스톡을 만듭니다). 필요한 재고 부피는 실험판 수에 1.666 mL(판 부피의 3분의 1)를 곱하여 계산합니다. 주사기 필터를 사용해 육수를 여과하고 멸균한 후, 물욕에서 55°C까지 데우세요.
   3. 50mL 원뿔형 튜브에 1.5x NGM 2부와 보충제 1부를 섞습니다. 보충제 조절 없이 사용할 때는 1.5x NGM 2부와 뜨거운 멸균수 1부를 섞으세요. 튜브를 10번 뒤집어 부드럽게 섞은 후, 무균 기법으로 각 35mm 플레이트에 약 5mL의 배지를 빠르게 부어줍니다.
      참고: 1.5배 NGM은 보충제를 다량 첨가할 때 중간 희석을 보상하기 위해 사용됩니다. 하지만 약물이나 대사산물이 최종 농도의 100× 이상으로 농축되면 일반 NGM을 1.5× NGM 대신 사용할 수 있습니다. 유기산을 보충할 때는 나트륨 염 형태를 사용하면 중간 pH 하락을 방지하는 데 도움이 됩니다.
   4. 무균 기법을 사용해 50 mL 에를렌마이어 플라스크에 10 mL 부피의 1/5까지 LB 배지를 채웁니다. 대 장균 OP50 군락으로 접종하고, 37°C에서 200rpm 궤도 셰이커에서 하룻밤 배양합니다.
   5. 35mm NGM 플레이트에 100 μL 100 μL 100 대 장 균 OP50 배양을 시딩하여 각 조건당 두 번의 기술 복제를 준비합니다. 플레이트를 실온에서 하룻밤 부양하세요. 씨앗이 없는 플레이트를 4°C에 같은 수량으로 보관하여 나중에 난자 이식 시 사용하세요.

3. L1 유충의 동기화된 개체군 확보

1. 멸균수 7mL, 5% 차아염소산나트륨 용액 2mL, 5N NaOH 1mL를 혼합하여 알칼리성 표백제 용액을 준비합니다.
2. 증류수 1L에 KH₂PO₄ 3g, Na₂HPO₄ 6g, NaCl 5g을 녹여 M9 버퍼를 준비한 후 pH를 6.5로 조절합니다. 121 °C에서 20분간 오토클레이브하여 용액을 식힌 후, 무균적으로 1 M MgSO4 1mL를 추가합니다.
3. 임신한 성충(단계 1.4.2)을 M9 버퍼로 플레이트에서 세척한 후 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 350 x g 에서 2분간 원심분리기를 하고, 상원액을 흡인한 후 튜브에 신선한 M9 버퍼를 채웁니다. 세척을 두 번 반복하세요.
4. 웜 펠릿에 M9 버퍼 2mL와 알칼리성 표백제 용액 2mL를 추가하세요. 소용돌이와 격렬한 흔들기, 현미경으로 주기적으로 확인하여 거의 모든 벌레가 녹아버릴 때까지 반복합니다.
5. 튜브에 M9 버퍼를 채우고 350 x g 에서 원심분리기를 2분간 넣으세요. 튜브를 뒤집어 상정액을 제거한 후 M9 버퍼로 네 번 세척하세요. 벌레가 용해된 직후에 첫 세척을 해야 과백을 방지할 수 있습니다. 마지막 세척 후에는 튜브에 8mL의 M9 완충제를 채우고 록커 위에서 18–20시간 동안 부화시켜 알이 부화할 때까지 보관합니다.

4. 모성 개체군 육성

1. 유리 슬라이드에 3μL 벌레 현탁액 5방울을 놓고 현미경으로 부화한 L1 유충 수를 세어보세요. 총 수치를 15로 나누면 마이크로리터당 농도를 구합니다.
2. 30마리의 L1 유충을 씨앗이 박힌 35mm 플레이트에 배열하고 20°C에서 72시간 배양합니다. 실험 조건이 발달 지연을 유발한다면, 육충이 임신하고 알을 낳기 시작할 때까지 부화 시간을 연장하세요(그림 1B).

5. 배아를 부화 플레이트로 옮기기

1. 씨앗이 없는 35mm 플레이트를 냉장고에서 꺼내 실온에 맞게 두세요.
2. 현미경으로 벌레 판을 검사해 100개 이상의 배아가 포함되어 있고 부화한 L1 유충이 없음을 확인하세요.
3. 플레이트를 조심스럽게 M9 버퍼로 채우세요. 진공 라인을 사용해 액체를 흡입하고 모성 개체군을 제거하세요. 성충 벌레가 접시에 남아 있지 않도록 주의하세요.
4. 마이크로피펫 팁에 200 μL M9 버퍼를 채우고 피펫을 위아래로 강하게 움직여 박테리아 잔디에서 배아를 분리합니다. 현미경으로 볼 때는 피펫 끝을 배아 밀집 부위 쪽으로 유도하세요.
5. 씨앗이 없는 플레이트를 꺼내 배아 현탁액 한 방울을 중앙에 피펫으로 떨어뜨립니다. 현미경으로 방울을 살펴보세요. 만약 100–300개의 배아가 아니라면, 이 범위에 도달할 때까지 더 많은 배아 현탁을 추가하세요. 부모 집단의 벌레가 배아와 함께 옮겨지지 않도록 하세요.
6. 액체가 건조될 때까지 기다린 후, 20°C에서 최소 24시간 동안 배양합니다.
   참고: 실험 배지에 이미 L1 유충이 있다면, M9 세척 대신 진공라인을 사용해 모성 개체군 전체를 하나씩 제거하세요. 이로 인해 L1 새끼가 배아처럼 박테리아 잔디에 달라붙지 않아 씻겨 나가는 것을 방지합니다. 이제 배아와 L1 유충 모두를 포함하는 자손 이식을 진행하세요. 모든 조건에 동일한 접근법이 적용되도록 하세요.

그림 1: 배아 치사성 분석의 주요 단계에 대한 실험적 연대표와 도식. (A) 유지보수 매체 준비부터 해칭판 점수 채점까지 실험 프로토콜의 전체 기간을 나타내는 흐름도 타임라인. 주요 절차는 실험의 해당 날짜에 표시되어 있습니다. (B) 배아 치명성 분석의 도식(4–6단계). 4일 째에는 동기화된 L1 유충을 실험용 RNAi 또는 보충 플레이트에 추가하여 모체 개체군을 확립합니다. 72시간이 지난 7일째, 벌레가 알을 낳으면 모체 개체군은 씻겨 나가고 배아는 박테리아 잔디에 붙어 있습니다. 배아는 피펫으로 잔디밭에서 씻어내어 부화 플레이트에 옮겨지며, 한 플레이트당 최소 100개의 배아가 필요합니다. 24시간 부화 후에는 부화한 유충과 부화하지 않은 배아를 집계합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

6. 점수판

1. 영구 마커로 35mm 페트리 접시 뚜껑에 대략 4mm × 4mm 격자를 그린 후 뚜껑을 플레이트 아래에 깔아주세요. 그리드를 가이드로 삼아 현미경 아래에서 손에 들고 클릭 카운터로 L1 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 세어보세요.
2. 기술 복제의 개체 수를 결합하여 각 복제의 자손 수를 기준으로 적절한 가중치를 부여합니다. 구체적으로, 기술 복제 전체에서 부화하지 않은 배아와 부화한 유충의 수를 합산하세요.
3. 생물학적 복제당 1배아 치명률을 계산하는데, 배아(부화하지 않은 벌레) 수를 벌레와 배아의 총 수로 나누고, 100을 곱하여 백분율로 표현합니다.
   참고: 한 판에 부화한 유충만 또는 배아만 포함된 경우, 배아 치사율이 각각 0(0%), 1(100%)이므로 이 계산 단계를 건너뛸 수 있습니다.

7. 통계 분석

1. 독립적인 생물학적 복제체를 얻기 위해 전체 실험을 최소 세 번 반복하세요. 각 생물학적 복제마다 최소 100개의 배아를 사용하여 각 조건당 두 개의 기술적 복제판을 사용합니다.
2. 일방향 ANOVA를 사용해 조건별로 배아 치사율이 유의미하게 다르는지 확인하고, 이후 Benjamini-Hochberg 방법과 같은 다중 검정 보정을 적용한 사후 쌍별 학생 t-검정 을 수행합니다.
   참고: 두 개의 기술적 복제를 결합하면 생물학적 복제당 최소 200개의 배아가 생성됩니다. 이는 90% 검정력과 유의수준 α = 0.05의 유의성을 가진 R-base function power.prop.test가 추정한 표본 크기 요구사항(~184 배아/상태)을 충족합니다.

결과

배아 치명성 검사는 야생형 N2와 RNAi 고민 균주 rrf-3(pk1426) 두 가지 균주에서 수행되었습니다. RNAi를 이용해 섭식을 통해 고처리량 스크리닝에서 배아 치명성을 유발한다고 보고된 유전자들을 다운시켰습니다 ^9,12. 그림 2는 분석 성능을 대표적으로 보여줍니다. T04G9.4 노크다운은 rrf-3(pk1426)와 N2 동물 모두에서 거의 완전한 관통 배아 치명성을 보였으며(그림 2A, B), 따라서 강한 배아 치명성 표현형에 대한 신뢰할 만한 양성 대조군으로 작용할 수 있다. 배아 치명률이 비율로 측정되기 때문에, 분산은 범위 중간에서 가장 크고 경계 근처에서는 더 낮아지는 이항 결과 범주에 속한다¹³

토론

분석의 재현성과 정확성을 위해서는 여러 단계가 매우 중요합니다. 먼저, 표백 단계는 배아를 손상시키지 않고 성충을 녹일 수 있도록 신중하게 타이밍을 맞춰야 합니다. 또 다른 중요한 점은 집계에 필요한 배아를 충분히 옮기는 것입니다. 너무 적으면 정밀도가 떨어지고, 너무 많으면 집계가 불필요하게 번거로워집니다. 다음으로, 배아가 부화하기 전에 배아 이식을 시행해야 합니다. 그렇지 않으면 새끼가 성체와 함께 씻겨 나가게 되어, 부화율이 더 높은 배아 치명성으로 기울어질 수 있습니다. 마지막으로, 배아와 L1 개체수의 일관성을 유지하기 위해 초보 실험자들은 배아를 정확히 식별하고 모든 새끼를 감지하도록 훈련받아야 합니다. 이 겉보기에는 단순한 작업은 특정 보충제에서 발생할 수 있는 박테리아 잔디의 이물질과 질감 변화로 인해 복잡해질 수 있습니다.

진정한 배아 치명성과 발달 지연을 구분하는 것도 중요합니다. 표준 조건 하에서 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
암피실린 나트륨 염	Sigma-Aldrich	A9518
박테리올로지 펩톤	Fischer Scientific	DF0118-17-0
C. elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center	N2	야생형
C. elegans NL2099	Caenorhabditis Genetics Center	NL2099	rrf-3(pk1426) II. RNAi 과민성
무수 염화 칼슘	Sigma-Aldrich	746495
콜레스테롤	Sigma-Aldrich	C3045
15mL 원추형 튜브	VWR	60818-725
14mL 배양 튜브	VWR	470150-966
다이어프램 진공 펌프	Amazon	TC-100
해부 현미경	AmScope	SM-2
Escherichia coli HT115	Caenorhabditis Genetics Center		RNAse III 결핍, RNAi 먹이 실험에 사용
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center
과립 형 아가르	Fischer Scientific	BP97445
핸드헬드 탈리 카운터	LabDepot	HTCP01
IPTG, 디옥산 프리(아이소프로필-β-D-티오갈락토사이드)	US Biological	I8500
LB 브로스(밀러)	US Biological	L1520	LB 매체를 만들기 위해 25g의 LB 분말을 1L의 증류수에 용해합니다. 121.1 °C에서 20분 동안 오토클레이브합니다.
Luer Lok 일회용 주사기	BH Supplies	BH20LL
황산 마그네슘	Sigma-Aldrich	M2643
현미경 슬라이드	Sail Brand	7101
100mm 페트리 접시	Tritech Research	T3371
35mm 페트리 접시	Tritech Research	T3501
인산 칼륨 버퍼(PPB)			인산 칼륨 버퍼(1M)를 만들기 위해 인산 칼륨 모노 베이식 98g과 인산 칼륨 다이 베이식 48g을 1L의 증류수에 용해합니다. pH를 6으로 조정합니다. 121 °C에서 20분 동안 오토클레이브합니다.
인산 칼륨 다이 베이식	Sigma-Aldrich	795496
인산 칼륨 모노 베이식	Sigma-Aldrich	529568
로커(진동 믹서)	Corning LSE	6720
세럴로지컬 피펫, 25mL	Corning	4489
세럴로지컬 피펫, 5mL	Celltreat	229235
Infors Multitron 셰이킹 인큐베이터	INFORS HT	NA
염화 나트륨	Sigma-Aldrich	S9888
5N 염수 용액	Fisher Scientific	SS256-500
5% 염소 화 나트륨	LabDepot	LC246302
인산 나트륨 다이 베이식	Sigma-Aldrich	S9763
Sorvall ST1 Plus 원심분리기	Thermo Scientific	75016030
교반 플레이트	ONilab	ONi28-S
주사기 필터	Semmerfeld	JQP033022QE1
수조	FOUR E's Scientific	WB401